CN116574834A - 一种具有优异棉花衣分性状的棉花品种鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种具有优异棉花衣分性状的棉花品种鉴定方法，检测棉花中甲基化变异位点D08:2428447和D08:2428448是否发生甲基化变异，未发生甲基化变异的棉花品种为具有优异棉花衣分性状的棉花品种。本发明利用PCR即可鉴定，方法简单高效。
Description
技术领域
本发明属于生物技术应用领域，涉及一种具有优异棉花衣分性状的棉花品种鉴定方法。
背景技术
棉花(Gossypium spp.)是世界上最重要的经济作物之一，为纺织行业提供了大量的原材料。高产、优质始终是棉花育种的焦点。随着种植面积减少和水资源减少，继续提高棉花单产和经济效益，进一步提高棉花的潜力是棉花育种工作者的重要任务。产量及其构成因素和纤维品质性状是复杂的数量性状，棉花衣分指的是籽棉上纤维的重量与籽棉重量的比，通常用百分率来表示,是评定棉花品种优劣的一条重要标准，也就是皮棉占籽棉的比重。挖掘棉花品种资源中高产的优良基因对选育优质棉花品种具有重要的意义。
DNA甲基化是指经DNA甲基转移酶催化胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶，一般发生在CpG位点(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点，即DNA序列中胞嘧啶后紧连鸟嘌呤的位点)，具体可分成cg、chg、chh三种类型。DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，涉及基因表达调控、胚胎发育、细胞分化和基因组印迹等许多生物学过程，在植物的生长发育中起着重要作用。Shen(2012年)在单碱基对分辨率下比较了拟南芥亲本系与表现杂种优势的杂交种的DNA甲基化组，验证了DNA甲基化对全基因组的重塑可能在杂种优势中发挥作用。Song(2017年)发现了棉花进化过程中驯化性状的表观基因组特征，在野生种与栽培种间鉴定出了519个有助于棉花驯化如开花时间和种子休眠的甲基化差异基因。Zhang(2019年)对陆地棉及其近等基因维持株系进行了甲基组和转录组综合分析，说明了DNA甲基化在棉花细胞质雄性不育中的重要作用。另外，DNA甲基化还在水稻有性生殖(Wang,2022)、吸收砷元素(Chen,2017)、抵抗盐胁迫(Karan,2012)等方面发挥着重要作用。
表观基因组关联分析(EWAS:Epigenome-Wide Association Studys)，通过检测整个基因组成千上万特异DNA核苷酸上甲基的分布差异，在表观基因组层面鉴别出常见的表观突变。EWAS技术的出现为研究人员打开了一扇通往研究复杂性状的大门，可以找到许多从前未曾发现的与复杂性状相关的甲基化位点，为复杂性状的调控机制在表观层面上提供更多的线索。目前，EWAS技术在医学研究领域大放异彩，将表观遗传学变异和复杂疾病性状进行关联，对复杂疾病的形成原因进行解读，就可以找到疾病相关的表观遗传学变异位点，但在表观基因组层面探索如何实现作物的增产还有待研究。Cordeor(2020年)利用EWAS技术探讨了DNA甲基化可能影响HIV感染者的肺功能，使得HIV感染者有机会减轻免疫缺陷相关疾病的威胁。Xie(2021年)通过EWAS发现了与向心性肥胖相关的新DNA甲基化位点，将为解决肥胖对健康的影响提供新思路。Xu(2018年)在5000多个儿童样本中利用EWAS技术发现了与哮喘疾病相关的重要CpG位点，对帮助诊断、指导用药上具有临床应用前景。Hu(2015年)通过EWAS技术实现了非参数地预测拟南芥的植物高度，表明了EWAS技术可成功用于复杂性状的全基因组预测，有助于在表观层面增强对复杂性状的理解。
甲基化特异性PCR(MSP:methylation-specific PCR)是一种判断核苷酸位点是否发生甲基化变异的方法。其基本原理是重亚硫酸盐(或者亚硫酸氢盐)使DNA中未发生甲基化变异的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而发生甲基化变异的胞嘧啶保持不变。随后进行引物特异性的PCR，检测扩增产物，如果用甲基化特异性引物能扩增出片段，说明该被检测的位点存在甲基化变异；若用未甲基化特异性引物扩增出片段，说明被检测的位点不存在甲基化变异。
GH_D08G0275基因属于含P环的核苷三磷酸水解酶蛋白(P-NTPase:P-loopcontaining nucleoside triphosphate hydrolases superfamily protein)超家族。该家族是一类具有核苷酸磷酸化活性，通过多聚体的形式催化核苷酸和单磷酸核苷生成核苷的蛋白。植物中该蛋白家族一般被认为是植物免疫防御机制中的关键元件，目前被报道在防御机制的信号通路中起主要作用的是ATPase。Prrab(2018年)使用微阵列分析确定不同温度下蓖麻种子萌发过程中转录组的变化，发现该家族基因涉及到植物种子萌发过程热敏窗口的分子机制。Zhu(2014年)利用酵母双杂交技术筛选互作蛋白，发现该家族蛋白能与细胞色素f相互作用，不同程度参与调控植物PCD的发生。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有优异棉花衣分性状的棉花品种鉴定方法。
利用棉花品种群体表观基因组测序数据，通过表观基因组关联分析，挖掘了一个与棉花产量性状衣分相关联、属于含P环的核苷三磷酸水解酶蛋白超家族基因——GH_D08G0275，该基因的CDS序列为SEQ ID NO.1。GH_D08G0275在棉花不同组织和发育时期的表达水平分析由转录组测序所得。该基因在棉花开花后20和35天的胚珠种子中优势表达(图2)，表明该基因与棉花衣分性状构成因子相关。该基因由其上2个相邻的核苷酸位点(D08:2428447、D08:2428448)cg甲基化调控，这2个核苷酸位点甲基化变异后衣分显著下降，表明该基因与棉花衣分性状显著相关。
本发明采用的技术方案具体如下：
一种具有优异棉花衣分性状的棉花品种鉴定方法，具体为：
检测棉花中甲基化变异位点D08:2428447和D08:2428448是否发生甲基化变异，未发生甲基化变异的棉花品种为具有优异棉花衣分性状的棉花品种。
进一步地，所述检测棉花中甲基化变异位点D08:2428447和D08:2428448是否发生甲基化变异的方法具体为：
利用两对引物分别对棉花进行PCR扩增，两对引物中一对可以特异性结合甲基化变异位点DNA的甲基化特异性引物；一对是可以特异性结合未甲基化变异位点DNA的未甲基化特异性引物；若甲基化特异性引物能扩增出片段，说明棉花存在甲基化变异。
进一步地，所述甲基化特异性引物包括如SEQ ID NO.2所示的上游引物和如SEQID NO.3所示的下游引物。
进一步地，所述未甲基化特异性引物包括如SEQ ID NO.4所示的上游引物和如SEQID NO.5所示的下游引物。
本发明的有益效果表现在：
根据是否发生甲基化变异将品种群体分为两大类，统计学分析方法发现，甲基化变异与否的品种衣分性状存在显著性差异(图3)，且位点间甲基化变异对衣分性状具有加性效应(图4)，说明了该基因与棉花产量性状衣分之间的相关性，可用于鉴定或筛选具有优异棉花衣分性状的棉花品种。本发明利用PCR即可鉴定，方法简单高效。
附图说明
图1棉花衣分性状EWAS关联分析结果。关联分析的衣分性状数据来自于2007年安阳的取样数据。箭头表示性状关联基因GH_D08G0275上的甲基化变异位点。横坐标表示D08染色体上的位置(Mb)，纵坐标表示甲基化变异位点关联衣分性状的显著性，用-log10(P)表示。图2GH_D08G0275在棉花不同组织和发育时期的表达水平。横坐标代表不同组织，包括根(R)、茎(S)、叶(L)、胚珠(ovule)和纤维(fiber)。胚珠组织包括了开花前3和1天、开花当天、开花后1到35天。纤维组织包括开花后5到25天。纵坐标表示相对表达量FPKM(FragmentsPer Kilobase of exon model per Million mapped fragments，即每千个碱基的转录每百万映射读取的片段)。
图3是否发生甲基化变异与衣分性状的比较分析。箱图代表品种群体衣分性状的分布情况。横坐标表示是否发生甲基化变异，在D08:2428447位点，0/0和1/1两种类型的品种数量分别是54和113；在D08:2428448位点，0/0和1/1两种类型的品种数量分别是60和131。纵坐标表示衣分(LP)。箱图上部的符号表示显著性差异，一颗星代表显著(p<0.05)，两颗星代表非常显著(p<0.01)，三颗星代表极显著(p<0.001)。
图4位点间甲基化变异对衣分性状的加性效应分析。箱图代表品种群体衣分性状的分布情况。横坐标表示位点间甲基化变异的累加，0/0:0/0、0/0:1/1与1/1:1/1的品种数量分别是45、12和108。箱图上部的符号表示显著性差异，一颗星代表显著(p<0.05)，两颗星代表非常显著(p<0.01)，三颗星代表极显著(p<0.001)。
具体实施方式
实施例1：棉花衣分性状关联的基因GH_D08G0275的挖掘
针对258份现代品种或者品系，从2007到2009年，分别在河南安阳、江苏南京和新疆库车进行了纤维相关性状的详细调查。同时，对这258份棉花品种进行了表观基因组测序与全基因组测序。将测序结果比对到棉花陆地棉基因组序列上，最后和表型进行表观基因组关联分析，发现D08染色体基因GH_D08G0275上存在相邻的2个核苷酸cg甲基化信号关联位点(D08:2428447、D08:2428448)，如图1的箭头所示，可以关联衣分性状，GH_D08G0275基因的CDS序列为SEQ ID NO.1。
采取了陆地棉TM-1品种不同组织和不同发育时期的RNA样本进行转录组测序。样本材料包括了根、茎、叶、胚珠和纤维。胚珠组织包括了开花前3和1天、开花当天、开花后1到35天。纤维组织包括开花后5到25天。结果如图2所示，GH_D08G0275基因在棉花开花后20和35天的胚珠组织中优势表达，表明该基因与棉花衣分性状构成因子相关。
实施例2：GH_D08G0275甲基化变异对品种群体衣分性状的影响
基于2个相邻的甲基化变异位点(D08:2428447、D08:2428448)在染色体D08上的位置，分别设计两对引物。一对是甲基化特异性引物，序列为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3，可以特异性结合甲基化DNA，另一对是未甲基化特异性引物，序列为SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5，可以特异性结合未甲基化DNA。利用这两对引物进行甲基化特异性PCR扩增。
PCR反应体系为：
PCR反应条件为：
PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的条带，纯化后进行测序。如果用甲基化特异性引物能扩增出片段，说明基因存在甲基化变异；若用未甲基化特异性引物扩增出片段，说明基因不存在甲基化变异。将测序结果与GH_D08G0275序列进行比对进而判断甲基化变异类型。
根据是否发生甲基化变异将品种群体分为两大类，0/0表示杂合位点均无甲基化变异，1/1表示杂合位点均发生甲基化变异，利用统计学分析方法发现，如图3所示，两种类型的群体在衣分性状上存在显著性差异，核苷酸位点甲基化变异化后衣分显著下降。根据位点间甲基化变异的累加将品种群体分为三大类，0/0:0/0表示两个核苷酸位点均无甲基化变异、0/0:1/1表示只有一个核苷酸位点发生甲基化变异，1/1:1/1表示两个核苷酸位点均发生甲基化变异，利用统计学分析方法发现，如图4所示，位点间甲基化变异对衣分性状的影响具有加性效应。证明了该基因与棉花衣分性状之间的相关性，未发生甲基化变异的棉花品种为具有优异棉花衣分性状的棉花品种，因此通过鉴定GH_D08G0275甲基化的变异，即可鉴定或筛选具有优异棉花衣分性状的棉花品种。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法把所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种具有优异棉花衣分性状的棉花品种鉴定方法，其特征在于，具体为：
检测棉花中甲基化变异位点D08:2428447和D08:2428448是否发生甲基化变异，未发生甲基化变异的棉花品种为具有优异棉花衣分性状的棉花品种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测棉花中甲基化变异位点D08:2428447和D08:2428448是否发生甲基化变异的方法具体为：
利用两对引物分别对棉花进行PCR扩增，两对引物中一对可以特异性结合甲基化变异位点DNA的甲基化特异性引物；一对是可以特异性结合未甲基化变异位点DNA的未甲基化特异性引物；若甲基化特异性引物能扩增出片段，说明棉花存在甲基化变异。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述甲基化特异性引物包括如SEQ IDNO.2所示的上游引物和如SEQ ID NO.3所示的下游引物。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述未甲基化特异性引物包括如SEQ IDNO.4所示的上游引物和如SEQ ID NO.5所示的下游引物。
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| CN109628630A (zh) * | 2018-12-20 | 2019-04-16 | 中国农业科学院棉花研究所 | 与棉花衣分性状显著相关的基因、snp标记及其应用 |
| CN112322775A (zh) * | 2020-12-07 | 2021-02-05 | 河北省农林科学院粮油作物研究所 | 一个鉴定陆地棉衣分的snp分子标记 |
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2023
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