CN115820671A

CN115820671A - 一个棉花籽指性状关联的基因及应用

Info

Publication number: CN115820671A
Application number: CN202211626158.0A
Authority: CN
Inventors: 关雪莹; 赵涌妍; 赵汀; 汪露瑶
Original assignee: Hainan Institute of Zhejiang University
Current assignee: Hainan Institute of Zhejiang University
Priority date: 2022-12-15
Filing date: 2022-12-15
Publication date: 2023-03-21

Abstract

本发明公开了一个棉花籽指性状关联的基因及应用，棉花籽指性状关联的基因为富含甘氨酸蛋白基因GhGRDP1，在四倍体陆地棉TM‑1中的cDNA序列为：SEQ ID NO.1，基因组序列为：SEQ ID NO.2；基因GhGRDP1受邻近SNP位点调控，该SNP位点碱基从A变为G；突变后的基因型籽指显著高于野生型。该基因在高效鉴定高籽指陆地棉品种、改良棉花籽指性状和培育棉花高产新品种中具有重要的研究价值和应用前景。

Description

一个棉花籽指性状关联的基因及应用

技术领域

本发明属于生物技术应用领域，涉及一个棉花籽指性状关联的基因及应用。

背景技术

棉花(Gossypium spp.)是世界上最重要的经济作物之一，不仅为纺织行业提供了大量的原材料，也是重要的食用油和蛋白来源。高产、优质始终是棉花育种的焦点。随着棉花种植面积减少和水资源减少，继续提高棉花单产和经济效益，进一步提高棉花的生产潜力是棉花育种工作者的重要任务。产量及其构成因素是复杂的数量性状，棉花籽指表示的是100粒正常成熟棉籽的重量，是棉花产量的重要指标之一。挖掘棉花品种资源中高产的优良基因对选育高产棉花品种具有重要的意义。

基因表达数量位点(Expression quantitative trait loci(eQTLs)是将基因的转录水平和基因组变异进行关联的常用方法，进而借助共定位分析，找到引起表型变异的基因。遗传变异可以通过引起基因表达变异进而引起表型的变异。因此eQTL是全基因组关联研究(GWAS:Genome-wide association studies)的重要补充。如油菜种子含油量基因BnPMT6s、棉花中热应答基因GhHRK1，玉米中鉴定到含油量的基因FADD、GLTP1和GPI，均是通过上述方法鉴定的。因此，通过整合GWAS和eQTL共定位获得性状关联的基因，实现数据的降维筛选，可以有效定位到因果基因。

富含甘氨酸结构域蛋白(Glycine-rich domain protein,GRDP)家族是2014年在拟南芥中被报道的新基因家族，主要特征是存在一个短的富含甘氨酸的结构域、一个功能未知的结构域(DUF1399)和一个潜在的RNA结合域。拟南芥中AtGRDP1和AtGRDP2与种子发育有关：AtGRDP1受非生物胁迫诱导和ABA处理诱导，并且AtGRDP1表达的改变将影响拟南芥的角果和种子的发育，通过分析拟南芥Atgrdp1突变体和35S::AtGRDP1过表达系产生的果实的表型，发现角果长度、种子数量、种子重量和形态都发生了重要的变化；还有研究表明，AtGRDP2在生长素介导的雌配子体发育中起着重要作用，过表达AtGRDP1使雌配子体发育不正常从而导致拟南芥败育；研究中还发现过表达AtGRDP1产生和AtGRDP2类似的表型，AtGRDP1和AtGRDP2在胚珠发育的调节中存在功能冗余。富含甘氨酸结构域蛋白(GRDPs)在其他植物中也有报道，如水稻，桉树。

发明内容

本发明的目的是提供一个与棉花籽指性状相关联的基因GhGRDP1，属于富含甘氨酸结构域蛋白(Glycine-rich domain protein,GRDP)家族。全基因组关联分析和eQTL共定位分析表明该基因表达影响棉花籽指产量，而GhGRDP1表达可以由SNP上邻近GhGRDP1A02染色体104023656bp的核苷酸序列进行鉴定。

本发明的另一目的是提供该基因的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

棉花籽指性状相关联的基因GhGRDP1，在所述的棉花籽指性状相关联的基因GhGRDP1在四倍体陆地棉TM-1中的cDNA序列为：SEQ ID NO.1，基因组序列为：SEQ ID NO.2；该基因表达由SNP(A02:104023656)控制，在基因组序列的chrA02 104023656位置上，该SNP位点碱基从A变为G，突变后基因表达量上升，基因型的产量上升。

本发明所述的富含甘氨酸蛋白基因GhGRDP1在鉴定高产量陆地棉品种中的应用。

进一步地，该应用具体为：检测陆地棉植株中的所述棉花籽指性状关联的基因，其中棉花籽指性状关联的基因中A02染色体上104023656bp位置上的碱基为G的棉花即为高产棉花植株。

进一步地，所述检测陆地棉植株中的所述棉花籽指性状关联的基因的引物为：

上游引物如SEQ ID NO.5所示，下游引物如SEQ ID NO.6所示。

本发明所述的富含甘氨酸蛋白基因GhGRDP1在改良棉花产量性状中的应用。

本发明所述的富含甘氨酸蛋白基因GhGRDP1在通过基因工程手段培育棉花高产新品种中的应用。

一种筛选高产棉花品种的方法，检测陆地棉植株中的所述棉花籽指性状关联的基因上的SNP位点，选择A02染色体上104023656bp位置上的碱基为G的棉花即为GhGRDP1高表达，高产棉花品种。

本发明的有益效果在于：

本发明利用258份棉花品种群体基因组重测序和开花后一天的胚珠转录组测序，通过全基因组关联分析和表达数量位点共分析，挖掘了一个与棉花产量性状籽指相关联的基因GhGRDP1。GhGRDP1由SNP位点(A02:104023656)调控表达，进而调控籽指表型。本发明提供的包含检测SNP的基因组序列由PCR技术获得，该技术具有起始模板量小，试验步骤简单易行而且灵敏度高的优点。

GhGRDP1在棉花不同组织和发育时期的表达水平分析由转录组测序所得。该基因在棉花茎、开花后10和20天的胚珠种子中优势表达，表明该基因与棉花籽指性状构成因子相关。

GhGRDP1在表达相对高产和低产品种群体中的SNP基因型通过PCR技术进行了验证(表1)，较易操作、灵敏度高和准确性好。

根据调控GhGRDP1的不同SNP基因型可以将品种群体分为两大类，统计学分析方法发现，这两类群体之间的籽指性状存在显著性差异(表1)，进一步证明该基因与棉花产量性状之间的相关性。

附图说明

图1棉花籽指性状GWAS关联分析结果。

SI07XJ、SI09XJ、SI07NJ、SI09NJ分别代表2007年库车、2009年库车、2007年南京、2009年南京的取样数据。箭头表示性状关联基因GhGRDP1上的SNP位点。横坐标表示染色体上的位置(Mb)，纵坐标表示SNP位点关联的显著性，用-log₁₀(P value)表示。

图2GhGRDP1在棉花不同组织和发育时期的表达水平。

横坐标代表不同组织，包括根(R)、茎(S)、叶(L)、胚珠(ovule)和纤维(fiber)。胚珠组织包括了开花前3和1天、开花当天、开花后1到35天。纤维组织包括开花后5到25天。纵坐标表示相对表达量FPKM(Fragments Per Kilobase of exon model per Millionmapped fragments，即每千个碱基的转录每百万映射读取的片段)。

图3GhGRDP1的相对表达水平与籽指水平与的回归分析。

将棉花籽指水平和表达水平进行回归分析。SI07XJ、SI09XJ、SI07NJ、SI09NJ分别代表2007年库车、2009年库车、2007年南京、2009年南京的取样数据。纵坐标表示棉花籽指水平，即100粒正常成熟棉籽的重量，单位为g。横坐标为1DPA胚珠中GhGRDP1的FPKM值(经正态中心化后)，表示GhGRDP1的相对表达水平。

图4GhGRDP1的不同单倍型之间籽指水平的比较分析。

箱图代表品种群体的产量性状的分布情况。含有AA和GG两种单倍型的品种分别是176和24个。方框内的横线代表性状分布的中值。

具体实施方式

实施例1棉花籽指性状关联的基因GhGRDP1的挖掘：

将258份现代品种或者品系的陆地棉群体，在2007到2009年，分别在江苏南京和新疆库车进行了种植，并对籽指水平进行了详细调查。同时，对这258份棉花品种进行了全基因组重测序，获得2.54Tb测序数据，平均测序深度2.5×。将这些序列比对到棉花陆地棉基因组序列，共挖掘了1,871,401个高质量的SNP，并最终获得71个棉花籽指性状关联位点。同时对258份材料对开花后一天的胚珠进行转录组测序，将SNP关联信号区域和基因表达进行关联分析，发现了A02染色体上的一个关联籽指性状SNP信号关联位点(A02:104023656)同时关联GhGRDP1(GH_A02G1719)基因的表达。与GWAS信号共定位分析显示，GhGRDP1，是富含甘氨酸结构域的蛋白基因是A02染色体上籽指信号的因果基因。

实施例2基因GhGRDP1的获得：

从陆地棉基因组序列中获取了GhGRDP1(GH_A02G1719)的cDNA序列和基因组序列，见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。根据cDNA两端设计基因全长引物，进行PCR扩增，引物序列为F1：SEQ ID NO.3和R1：SEQ ID NO.4。PCR反应程序如下：95℃预变性5min；95℃变性15sec，58℃退火15sec，72℃延伸3min，34个循环；最后72℃延伸5min。PCR扩增产物进行测序，与cDNA进一步比对确定序列的准确性。

实施例3GhGRDP1在棉花不同组织和发育时期的表达水平分析：

本实验采取了棉花不同组织和不同发育时期的组织样本进行转录组测序。样本材料包括了根、茎、叶、胚珠和纤维。胚珠组织包括了开花前3和1天、开花当天、开花后1到35天。纤维组织包括开花后5到25天，共计35个组织。转录组测序采用二代测序PE150策略。基因表达水平的计算是利用Hisat2和Stringtie软件将测序得到的reads与陆地棉基因组进行比对，计算出每个基因的表达水平，基因表达水平进行归一化，用每百万测序碱基中每千个转录子测序碱基中所包含的测序片断数(FPKM)表示。组织表达分析的实验结果表明，GhGRDP1基因在棉花茎、开花后10和20天的胚珠种子中优势表达(图2)，表明该基因与棉花籽指性状构成因子相关。

实施例4富含甘氨酸结构域蛋白基因GhGRDP1在鉴定高产量棉花品种和改良产量性状中的应用：

基于SNP位点(A02:104023656)在染色体A02上的位置，该SNP的变异关联GhGRDP1的表达。在其两端设计基因组扩增引物，引物序列为F2：AGGTCGTGGGTCGGTTA(SEQ ID NO.5)和R2：GCTCCCTCTGAGGAGTTATC(SEQ ID NO.6)。利用这对引物，在258个品种的DNA中进行PCR扩增并测序。PCR反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30sec，58℃退火1min，72℃延伸45sec，30个循环；最后72℃延伸7min。根据测序结果分析该SNP位点上每个品种群体的基因型。本发明证实了富含甘氨酸结构域蛋白基因GhGRDP1在A02染色体上104023656bp位置上的第一个SNP位点碱基从A变为G，根据两个SNP位点碱基信息，其中SNP位点碱基为A的品种材料GhGRDP1表达量低，籽指水平低，将低籽指品种材料标记为GhGRDP1(A)；SNP位点碱基为G的品种材料GhGRDP1表达量高，籽指水平高，将高籽指品种材料标记为GhGRDP1(G)(图3)。根据SNP基因型，本发明鉴定出单倍型GhGRDP1(G)材料24个，单倍型GhGRDP1(A)材料176个(图3和表1)。利用t-test检测方法，计算了两组单倍型之间产量性状的相关性(图4)。结果显出，相比GhGRDP1(G)，GhGRDP1(A)籽指减少了13.95％(P<0.001).

通过以上结果可以看出，基因GhGRDP1在改良棉花籽指性状和培育棉花高产新品种中具有重要的研究价值。一方面可以根据基因GhGRDP1的两种单倍型设计分子标记，可以有效的鉴定棉花籽指性状，其中，籽指水平越高，棉花越高产，因此基因GhGRDP1在高产棉花品种选育研究中有很好的应用价值。另一方面，可以通过基因工程的手段将含有高产单倍型GhGRDP1(G)的基因转入棉花品种中提高棉花产量，也可以将低产单倍型GhGRDP1(A)中的SNP位点进行定点突变，改造成高产单倍型从而培育高产棉花新品种。

表1高产和低产单倍型在群体品种材料中的鉴定

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法把所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围。

Claims

1.一个棉花籽指性状关联的基因，其特征在于，所述基因为富含甘氨酸结构域蛋白基因GhGRDP1，基因组序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的棉花籽指性状关联的基因在鉴定高籽指陆地棉品种/植株中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，具体为：检测陆地棉植株中的所述棉花籽指性状关联的基因的表达量或棉花籽指性状关联的基因中A02染色体上104023656bp位置上的碱基，其中棉花籽指性状关联的基因的表达量高、棉花籽指性状关联的基因中A02染色体上104023656bp位置上的碱基为A的棉花即为高产棉花植株。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测棉花籽指性状关联的基因中A02染色体上104023656bp位置上的碱基的引物包括：

上游引物如SEQ ID NO.5所示，下游引物如SEQ ID NO.6所示。

5.权利要求1所述的棉花籽指性状关联的基因在改良棉花籽指性状中的应用。

6.权利要求1所述的棉花籽指性状关联的基因在通过基因工程手段培育棉花高产新品种中的应用。