CN116568289A - 治疗勃起功能障碍的配方和方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开的配方具有增强伐地那非、西地那非和/或相关的磷酸二酯酶抑制剂或其他可电离化合物中的至少一种的溶解度和渗透性(通量)的有益特性。特别地，该配方赋予了化合物穿过黏膜的有益特性，从而导致有效的血浆药物浓度。在一些实施例中，该配方包括有机水性溶剂，该溶剂可以包括醇、聚醚、二乙二醇单乙醚、中链甘油酯、一种或多种饱和聚糖化C8‑C10甘油酯、和/或有机盐、或其任何组合中的至少一种。在一些实施例中，该配方的pH是约3.5至约8.0。本文中还公开了该配方在施用用于治疗勃起功能障碍或其他疾病的一种或多种化合物方面的用途，其中该一种或多种化合物经黏膜(鼻腔或舌下)给药。

Description

治疗勃起功能障碍的配方和方法
相关申请
本申请是2021年05月26日提交的国际申请No.PCT/US21/34334的部分继续申请。
技术领域
需要用于治疗勃起功能障碍的改进的配方和方法。本技术通常涉及用磷酸二酯酶抑制剂治疗勃起功能障碍的配方和方法，但能够被应用于使用经黏膜给药治疗不同疾病情况的其他药物，例如舌下或鼻腔给药。
背景技术
勃起功能障碍被认为是男性最常见的性功能障碍，并且随着年龄的增长越来越常见。据估计，大约50％的40-70岁男性和70％的70岁以上男性患有勃起功能障碍。由于勃起功能障碍可能由神经因素、血管因素、内分泌因素或心理因素中的一种或多种引起，这种情况不仅限于老年男性。其他风险因素，诸如心血管疾病、高血压、糖尿病、高胆固醇血症和吸烟，与勃起功能障碍的发病率增加密切相关联。因此，对有效治疗勃起功能障碍的需求日益增加。
发明内容
需要有能够充分溶解磷酸二酯酶抑制剂，包括例如伐地那非、西地那非和他达拉非，和允许其充分渗透的组合物和方法。在一些实施例中，本文中公开了相对安全的或人类受试者耐受性良好的，并且能够充分溶解磷酸二酯酶抑制剂的有机水性混合物。在一些实施例中，有机水性混合物基于磷酸二酯酶抑制剂的溶解度进行筛选和确认。在一些实施例中，磷酸二酯酶抑制剂是伐地那非。在一些实施例中，磷酸二酯酶抑制剂是西地那非。在一些实施例中，磷酸二酯酶抑制剂是他达拉非。在一些实施例中，确定了pH和渗透作用。
在一些实施例中，本文中描述了用于确定配方的方法，该配方用于提高一种或多种磷酸二酯酶抑制剂经黏膜的溶解度和渗透，该配方包括：(a)一种或多种磷酸二酯酶抑制剂；(b)有机水性溶剂，包括醇、二醇、二乙二醇单乙醚、中链甘油酯、一种或多种饱和聚糖化C8-C10甘油酯、或其组合；其中，该配方的pH为约3.5至约8.0，其中相对于该一种或多种磷酸二酯酶抑制剂在水中的溶解度，有机水性溶剂提高了该一种或多种磷酸二酯酶抑制剂的溶解度。在一些实施例中，有机水性溶剂包括醇。在一些实施例中，本文中描述的配方包括一种或多种弱盐。示例性弱盐包括例如柠檬酸盐、酒石酸盐、乙酸盐、富马酸盐、乳酸盐、氯化铵盐或类似的有机盐等。在一些实施例中，本文中描述的配方包括N-甲基吡咯烷酮(NMP)、吐温80或类似有机化合物。在一些实施例中，本文中描述的配方包括诸如柠檬酸盐、酒石酸盐、乙酸盐、富马酸盐、乳酸盐、氯化铵盐或类似的有机盐等弱盐，或N-甲基吡咯烷酮(NMP)、吐温80或类似有机化合物与一种或多种醇、聚醚、二乙二醇单乙醚、中链甘油酯、一种或多种饱和聚糖化C8-C10甘油酯、或其组合的组合。在一些实施例中，醇是乙醇或甘油。在一些实施例中，乙醇的浓度是5％至40％。在一些实施例中，乙醇的浓度是12％、25％或30％。在一些实施例中，有机水性溶剂包括聚醚。在一些实施例中，聚醚是聚乙二醇。在一些实施例中，聚乙二醇是PEG 6000或PEG 400。在一些实施例中，聚乙二醇的浓度是1％至20％。在一些实施例中，聚乙二醇的浓度是5％。在一些实施例中，该配方的pH是约3.5至约8.0。在一些实施例中，磷酸二酯酶抑制剂是伐地那非、西地那非、他达拉非、或其组合。在一些实施例中，磷酸二酯酶抑制剂是伐地那非。在一些实施例中，磷酸二酯酶抑制剂是西地那非。在一些实施例中，磷酸二酯酶抑制剂是他达拉非。
在一些实施例中，本文中描述了治疗有需要的受试者的勃起功能障碍的方法，其包括用本文所公开的配方接触受试者的黏膜，从而治疗受试者的勃起功能障碍。在一些实施例中，接触黏膜包括鼻腔给药。在一些实施例中，接触黏膜包括舌下给药。
在一些实施例中，本文中描述了用于治疗勃起功能障碍的配方的制备方法，其包括：(a)向包括醇、聚醚、二乙二醇单乙醚、中链甘油酯、一种或多种饱和聚糖化C8-C10甘油酯、或其组合的有机水性溶剂中添加一种或多种磷酸二酯酶抑制剂；(b)将包括该一种或多种磷酸二酯酶抑制剂的有机水性溶剂的pH调节至约3.5至约8.0，其中治疗勃起功能障碍包括用该配方接触受试者的黏膜。在一些实施例中，本文中描述的配方包括一种或多种弱盐。示例性弱盐包括例如柠檬酸盐、酒石酸盐、乙酸盐、富马酸盐、乳酸盐、氯化铵盐或类似的有机盐等。在一些实施例中，本文中描述的配方包括N-甲基吡咯烷酮(NMP)、吐温80或类似有机化合物。在一些实施例中，本文中描述的配方包括诸如柠檬酸盐、酒石酸盐、乙酸盐、富马酸盐、乳酸盐、氯化铵盐或类似的有机盐等弱盐，或N-甲基吡咯烷酮(NMP)、吐温80或类似有机化合物与一种或多种醇、聚醚、二乙二醇单乙醚、中链甘油酯、一种或多种饱和聚糖化C8-C10甘油酯、或其组合的组合。在一些实施例中，相对于该一种或多种磷酸二酯酶抑制剂在水中的溶解度，该一种或多种磷酸二酯酶抑制剂在有机水性溶剂中的溶解度增加。在一些实施例中，相对于在水中的该一种或多种磷酸二酯酶抑制剂穿过黏膜的渗透，在有机水性溶剂中的该一种或多种磷酸二酯酶抑制剂穿过黏膜的渗透增加。在一些实施例中，相对于在水中的该一种或多种磷酸二酯酶抑制剂体外穿过人工膜的渗透，在有机水性溶剂中的该一种或多种磷酸二酯酶抑制剂体外穿过人工膜的渗透增加。在一些实施例中，相对于在水中的该一种或多种磷酸二酯酶抑制剂的生物利用度，在有机水性溶剂中的该一种或多种磷酸二酯酶抑制剂的生物利用度增加。在一些实施例中，有机水性溶剂包括醇。在一些实施例中，醇是乙醇或甘油。在一些实施例中，乙醇的浓度是5％至40％。在一些实施例中，乙醇的浓度是12％、25％或30％。在一些实施例中，有机水性溶剂包括聚醚。在一些实施例中，聚醚是聚乙二醇。在一些实施例中，聚乙二醇是PEG 6000或PEG 400。在一些实施例中，聚乙二醇的浓度是1％至20％。在一些实施例中，聚乙二醇的浓度是5％。在一些实施例中，该配方的pH是约3.5至约8.0。在一些实施例中，磷酸二酯酶抑制剂是伐地那非、西地那非、他达拉非、或其组合。在一些实施例中，磷酸二酯酶抑制剂是伐地那非。在一些实施例中，磷酸二酯酶抑制剂是西地那非。在一些实施例中，磷酸二酯酶抑制剂是他达拉非。
附图说明
图1示出了纯水中伐地那非浓度的标准曲线(y＝0.00853x+0.006553，R2＝0.9962)；
图2示出了采用HPLC法测定的不同pH下盐酸伐地那非三水合物在水中的稳定可溶浓度(mg/ml)；
图3示出了同时测定盐酸伐地那非三水合物在水、12％醇和30％醇中的饱和溶液的溶解度；
图4示出了根据PAMPA研究，伐地那非在6小时和12小时的表观渗透系数(Papp)之间的关系；
图5示出了pH对各种配方的Papp的影响(图a)、pH对各种配方的Jss的影响(图b)的比较；
图6示出了使用PAMPA或Calu-3细胞系模型对不同溶液中的伐地那非Papp值的比较。空心圆代表水溶液。实心圆代表EtOH(12％)、PEG 400(15％)、NMP(10％)、乳酸钙(5％)EtOH/PEG 400(12％/15％)、EtOH/乳酸钙(12％/5％)。只有代表PEG 400(15％)的最低Papp(左下)显著低于水中的Papp(t检验p<0.05)；
图7示出了通过鼻腔(IN)或口服(PO)给药后受试者11(“S11”)血浆中伐地那非浓度的代表性曲线；
图8示出了基于PAMPA研究，pH对西地那非通量(Jss)的影响；
图9示出了使用PAMPA或Calu-3细胞系模型对不同溶液中的Papp值的比较。空心圆代表水溶液。实心圆代表乙酸/NMP/乳酸钙(5/10/3.5％)、乙酸/乳酸钙(5/3.5％)、乙酸/乳酸钙(1/3.5％)、NMP(10％)、乳酸钙(3.5％)；
图10示出了盐酸伐地那非三水合物在水(第1-5列)、12％乙醇-水溶液(第6-10列)和30％乙醇-水溶液(第11-15列)中24小时的渗透的比较。使用了饱和浓度。
图11示出了在甘油(丙三醇)、聚乙二醇(PEG)和PEG-乙醇(EtHO)混合物中的使用饱和浓度的伐地那非的渗透的比较；
图12示出了纯水中伐地那非浓度的标准曲线(y＝0481x+0.0033；R2＝0.9994)；
图13示出了25％乙醇-水混合物中伐地那非的标准曲线(y＝0.583x+0.0043，R2＝0.9945)；
图14示出了同时测定伐地那非活性药物成分(API)在水、12％乙醇(EtOH)和30％乙醇中的饱和溶解度。
具体实施方式
本发明涉及优化磷酸二酯酶抑制剂穿过黏膜的溶解度和渗透性的配方和方法。例如，本文中提供的配方和方法能够被用于治疗勃起功能障碍。本领域技术人员将理解，本文中公开的配方和方法能够适用于任何可电离的化合物，包括酸性和碱性化合物，以及不是磷酸二酯酶抑制剂的药物或其他化合物。可以通过本文中公开的配方经黏膜给药的可电离化合物的非限制性示例包括左旋多巴、氯噻嗪、呋塞米、布洛芬、左旋多巴、华法林、乙酰唑胺、苯妥英、茶碱、氯丙酰胺、布美他尼、地西泮、别嘌醇、阿普洛尔、安非他明、阿托品、可待因、可待因、利多卡因、美托洛尔、肾上腺素、丙咪嗪、美沙酮、甲基苯丙胺、吗啡、尼古丁、去甲肾上腺素和匹鲁卡品。
正常的阴茎勃起是由血液的流入和阴茎平滑肌的松弛引起的。该过程由脊髓反射、L-精氨酸-一氧化氮-鸟苷酸环化酶-环磷酸鸟苷(cGMP)途径以及感观和精神刺激介导。神经和内皮细胞在阴茎直接释放一氧化氮，刺激鸟苷酸环化酶产生cGMP，降低细胞内钙离子水平。这触发了动脉和小梁平滑肌的松弛，导致动脉扩张，静脉收缩和勃起。刺激收缩和松弛的因素之间的平衡决定了阴茎血管系统和阴茎海绵体平滑肌的张力。
磷酸二酯酶5(PDE5)是阴茎海绵体中主要的磷酸二酯酶。PDE5的催化位点通常会降解cGMP，而PDE5抑制剂诸如西地那非通过抑制其在催化位点的分解来增强cGMP的内源性增加。PDE5的磷酸化增加了其酶活性以及其变构(非催化/GAF结构域)位点对cGMP的亲和力。cGMP与变构位点的结合进一步刺激酶活性。因此，PDE5的磷酸化和cGMP与非催化位点的结合介导了cGMP途径的负反馈调节。
西地那非、他达拉非和伐地那非已经被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于治疗勃起功能障碍。这些药物都是磷酸二酯酶抑制剂。磷酸二酯酶抑制剂是阻断磷酸二酯酶(PDE)五种亚型中的一种或多种的药物，从而防止细胞内第二信使环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)失活。由于磷酸二酯酶负责环磷酸鸟苷(cGMP)的降解，而环磷酸鸟苷(cGMP)在性刺激过程中触发平滑肌松弛和勃起，因此通过这些药物抑制一种或多种磷酸二酯酶将通过增加cGMP来增强勃起功能。
西地那非(万艾可)
西地那非(万艾可)的有效剂量是25-100mg，每日1次，根据需要而定。活性成分是枸橼酸西地那非。其平均最大血药浓度是约60min(范围30-90min)，绝对生物利用度是约41％。药物多通过细胞色素P450 3A4(CYP3A4)代谢，半衰期为约4h(1)。
他达拉非(西力士)
他达拉非(西力士)的有效剂量是5-20mg，每日1次，根据需要而定。其活性成分是他达拉非。单次给药后达到最大血药浓度的平均时间(Tmax)是约2h(范围30min-6h)(2)。药物多通过CYP3A4代谢为儿茶酚代谢物，儿茶酚代谢物进一步被葡萄糖醛酸化。健康受试者的平均终末半衰期是约17.5h(2)。口服给药后绝对生物利用度尚未见报道超过80％(3)。
伐地那非(艾力达)
伐地那非(艾力达)的标准推荐剂量是10-20mg片剂，每日1次，根据需要而定。其活性成分是盐酸伐地那非三水合物。口服给药后达到最大血药浓度的平均时间(Tmax)是约60min(30min-2h)，其绝对生物利用度是约15％。药物多通过CYP3A4代谢，M1代谢物占总药理活性的约7％。伐地那非或M1代谢物的终末半衰期是约4-5h，起效时间是约30min(4)。
这三种磷酸二酯酶抑制剂药物中每种均被FDA批准用于勃起功能障碍，其达到最大浓度的平均时间(Tmax)是约60分钟或更长，早期Tmax为30min。因此，这些药物的起效时间通常为30min或更晚，在1h时达到最大效应。由于它们在pH 4.0-7(接近鼻黏膜和舌下黏膜处的生理pH范围)(5-7)下的水溶解度较低，因此在舌下或鼻腔给药以达到快速起效时，这些药物不适合以水溶液给药。
为了在舌下或鼻腔部位实现良好的渗透和/或吸收，药物必须具有小分子量(<1kD)、良好的膜分配系数(具有良好的logP)和良好的水溶解度(7-9)。当鼻腔给药或舌下给药时，薄的鼻腔和舌下黏膜比口服给药能提供更快的吸收(6、7)。此外，鼻腔和舌下给药途径能够绕过肝脏的首次代谢，并且能够产生比口服给药更高的生物利用度(10-11)。然而，这三种磷酸二酯酶抑制剂药物在pH 4.0-7.0时的水溶解度较低，这是在鼻腔或舌下部位有效渗透和/或吸收的主要障碍。为了优化经由舌下或鼻腔给药途径的黏膜渗透和/或吸收，需要一种能够提高溶解度，并且在这些部位实现与合适的pH下相似或更好的渗透合适的溶剂(诸如有机水性混合物)。然而目前还没有可靠的方法来预测在最佳pH下在这些溶剂中的溶解度和渗透性。
定义
在本说明书和所附权利要求书中，除非上下文有明确规定，否则单数形式的“一”和“该”包括复数指称。因此，例如，对“该方法”的提及包括一种或多种方法，和/或本文所描述类型的步骤，本领域的技术人员在阅读本公开等时将变得显而易见。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同。本文在提到诸如数量、时间长度等可测量值时所用的“约”是指包括与指定值相比的±20％或±10％，或±5％，甚至±1％的变化，因为这种变化对于所公开的组合物或执行所公开的方法是合适的。
在参考文献，包括Carey和Sundberg的“ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY 4TH ED.(《高级有机化学》第四版)”(Vols.A(2000)and B(2001),Plenum Press,New York)中可以找到标准化学术语的定义。除非另有说明，否则采用了本领域技术范围内的质谱学、核磁共振(NMR)、高效液相色谱(HPLC)、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。除非提供具体的定义，否则本文中描述的与分析化学、合成有机化学以及医药化学有关的术语及分析化学、合成有机化学以及医药化学的实验室程序和技术是本领域中已知的。标准技术能够被用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和输送以及对病人的治疗。反应和纯化技术可以例如使用制造商规格的试剂盒或如本领域通常完成的方法或如本文描述的方法进行。上述技术和程序通常能够按本领域已知的和在本说明书中引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所描述的方法进行。
如本文所使用的术语“渗透”或“吸收”，除非另有规定，是指药物的活性化合物通过黏膜的“渗透”。术语“渗透”和“吸收”可以互换使用。
如本文中所用，除非另有规定，否则术语“经黏膜”或“穿过黏膜”是指经由黏膜的任何给药途径。示例包括但不限于药物或药物的活性化合物的舌下、鼻腔、阴道和直肠给药。
如本文中所用，术语“磷酸二酯酶抑制剂”指的是阻断磷酸二酯酶(PDE)的一种或多种亚型的任何药物，从而防止细胞内第二信使环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)被各PDE亚型灭活。术语“磷酸二酯酶抑制剂”可以指的是PDE1、PDE2、PDE3、PDE4、PDE5、PDE6、PDE7、PDE8、PDE9、PDE10、PDE11和/或PDE12的抑制剂。磷酸二酯酶抑制剂包括选择性的和非选择性的抑制剂。
如本文所用，术语“受试者”指动物和人类。
术语“环境”或“给药环境”是指药物的活性化合物通过渗透穿过黏膜被吸收的环境。例如，当进行舌下给药时，环境是唾液，它含有药物并且“沐浴”着舌下黏膜。
提供具有一定的pH的环境的实施例的方法，包括在给药期间提供具有优选pH的环境，和以使药物本身能够提供具有所需pH的环境的方式来制作合适的药物配方。在一些实施例中，优选是后者。在这种情况下，缓冲剂最好被包括到配方中。
本文中描述的实施例能够包括计算需要溶解然后穿过黏膜被渗透或吸收以达到治疗有效浓度的伐地那非量的估计范围(从伐地那非活性药物成分的最小量到代表最小有效剂量的2倍量到最小剂量的2倍)。
本文描述的实施例能够包括取决于剂型或给药途径的各种配方或组合物。例如，如果包括药物的配方或组合物在舌下给药，它能够是片剂、丸剂、小丸剂、粉末、液体或喷雾剂的形式。其他合适的配方或组合物的示例包括但不限于软膏、胶囊、溶液、糖浆、滴剂、颗粒剂和栓剂。在任何配方或组合物中，药物可以包括治疗有效量的活性化合物或其药学上可接受的形式或其中任一整体和药学上可接受的载体。作为另一个示例，如果包括药物的配方或组合物在鼻腔给药，该配方或组合物能够是液体形式。例如，适合鼻腔给药的液体形式是鼻腔喷雾和鼻腔滴剂。
在一些实施例中，该一种或多种磷酸二酯酶抑制剂被舌下给药。对于该一种或多种磷酸二酯酶抑制剂的舌下给药，配方或组合物能够是上述的任何形式。能够使用制作用于舌下给药的片剂、丸剂、小丸剂、粉末、液体或喷雾剂的任何方法。为了制作片剂，例如将颗粒状的粉末压制成小片。片剂能够在与唾液混合时崩解，导致药物的溶解和吸收。为了获得药物渗透和/或吸收的理想pH范围，例如，片剂配方要考虑到与唾液的混合。
酒精粉能够被用于制作舌下给药的片剂。作为另一个示例，能够用聚乙二醇(PEG)来制作用于舌下给药的片剂。酒精粉和PEG都可与水混溶。能够使用的示例性液体PEG包括，但不限于，PEG 200、PEG 400和PEG 600。能够使用的示例性蜡状或固体PEG包括，但不限于，平均分子量大于约600g/mol(PEG 600)的PEG，诸如PEG 3000、PEG 3350、PEG 4000、PEG6000和PEG 8000。
在一些实施例中，该一种或多种磷酸二酯酶抑制剂被鼻腔给药。对于该一种或多种磷酸二酯酶抑制剂的鼻腔给药，配方或组合物能够是上述的任何形式，例如包括鼻腔喷雾剂或液滴。一种特殊的装置能够用于一定体积的鼻腔或舌下给药。这种装置的示例性容量能够在10μl至1.6ml的范围内，能够被递送到两个鼻孔中的每一个。另外的示例性容量能够在25μl至1.0ml、50μl至800μl、75μl至600μl、100μl至500μl或200μl至300μl范围内，用于至少一个鼻孔的每个鼻孔。例如，用于鼻腔给药的装置可从Aptar公司购得。
鼻腔给药，例如经由鼻腔喷雾，是一种方便的给药途径。相对于口服药物，这种给药途径可以实现以下优势：(a)产生更快的效果，(b)较少的药物接触量就能达到同等效果，和(c)给药时不需要用水吞咽。由于鼻黏膜的上皮渗漏(与肠上皮相比)、广泛的血管供应、相对较大的表面积(约9.6m2，包括微绒毛)和避免首过代谢，鼻腔给药的这些优点是可能的(3-9)。经由鼻腔途径吸收药物的表面积相对较大，这也是相对舌下途径的优势。虽然舌下途径也能够快速起效，但其较小的表面积(26cm2)是药物吸收的一个限制，会导致药物如伐地那非的治疗效果不足，除非多剂量给药。
为了在鼻腔部位实现良好的渗透和/或吸收，优选低分子量(<1kD)，具有良好的膜分配系数(良好的logP)，良好的水溶解度，以及能在鼻腔的生理pH下导致电离和有利的渗透作用的适合需要的pKa。由于鼻子的生理pH是6.4，一般建议将配方的pH保持在3.5-7.5之间，以避免对鼻黏膜的刺激(5，10-11)。然而，为了优化单个药物的溶解度和渗透性，可能有必要在配方中偏离生理pH。建议的目标pH是3.5-7.5(11)。
盐酸伐地那非三水合物的分子量是579.1(12)。伐地那非游离碱的分子量是488.6，其logP＝3.64，pKa＝7.15(基本上为碱性)和9.86(基本上为酸性)。作为碱性化合物，伐地那非的水溶解度与pH有关，据报道，在pH是4-7时，其水溶解度低于2mg/ml(12-13)。尽管盐酸伐地那非三水合物在水中的溶解度高于伐地那非碱，但伐地那非活性药物成分的溶解度仍需进一步提高。(图2-3)。由于药物必须以可溶形式存在，以便在发挥其治疗作用之前进行快速的鼻腔吸收，因此，获得需要量的药物的足够的溶解度和渗透性是伐地那非鼻腔配方的基本步骤。为了优化伐地那非活性药物成分的鼻腔配方，将需要通过实验测定其在pH为3.5-7.5时的溶解度和渗透性，因为没有可靠/准确的方法来预测药物的溶解度和渗透性，特别是在鼻腔给药方面(14-15)。
配方试剂
醇类
在某些实施例中，本文中描述的用于治疗勃起功能障碍、增加多种磷酸二酯酶抑制剂中的一种的溶解度和/或、增加多种磷酸二酯酶抑制剂中的一种的渗透性的配方和组合物包括至少一种醇。在一些实施例中，本文描述的用于治疗勃起功能障碍、增加多种磷酸二酯酶抑制剂中的一种的溶解度和/或、增加多种磷酸二酯酶抑制剂中的一种的渗透性的配方和组合物包括一种或多种弱盐。示例性弱盐包括例如柠檬酸盐、酒石酸盐、乙酸盐、富马酸盐、乳酸盐、氯化铵盐或类似的有机盐等。在一些实施例中，本文中描述的配方包括N-甲基吡咯烷酮(NMP)、吐温80或类似有机化合物。在一些实施例中，本文中描述的配方包括诸如柠檬酸盐、酒石酸盐、乙酸盐、富马酸盐、乳酸盐、氯化铵盐或类似的有机盐等弱盐，或N-甲基吡咯烷酮(NMP)、吐温80或类似有机化合物与一种或多种醇、聚醚、二乙二醇单乙醚、中链甘油酯、一种或多种饱和聚糖化C8-C10甘油酯、或其组合的组合。醇类是含有连接到烷基的碳原子的一个或多个羟基(-OH)基团的化合物家族。醇链能够有任何数量的碳原子。醇可以是伯醇、仲醇、或叔醇。一元醇和多元醇是已知的。示例性的一元醇包括甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇等。示例性的多元醇包括，例如，乙二醇、丙二醇、丙三醇(甘油)等。在一些实施例中，该醇是乙醇。在一些实施例中，该醇的浓度是约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％以及在中间的任何数字或范围。在一些实施例中，乙醇的浓度是约5％至约40％。在一些实施例中，乙醇的浓度是约12％、约25％或约30％。在一些实施例中，该醇是丙三醇(甘油)。在一些实施例中，该丙三醇的浓度是约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％。
聚醚
在某些实施例中，本文描述的用于治疗勃起功能障碍、增加多种磷酸二酯酶抑制剂中的一种的溶解度、和/或增加多种磷酸二酯酶抑制剂中的一种的渗透性的配方和组合物包括聚醚。聚醚是指含有不止一个醚官能团的聚合物。聚醚包括聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)、聚氧乙烯(POE)、聚丙二醇(PPG)、聚四氢呋喃二醇(PTMG)、聚四亚甲基醚二醇(PTMEG)、多聚甲醛等。芳香族聚醚包括，例如，聚苯醚(PPE)和聚对苯醚(PPO)。在一些实施例中，该聚醚是聚乙二醇(PEG)。聚乙二醇(PEG)的分子量可以从300g/mol到10,000,000g/mol。在一些实施例中，该聚醚是PEG 6000。在一些实施例中，聚乙二醇(PEG)的浓度是约0.5％、约1.0％、约2.0％、约3.0％、约4.0％、约5.0％、约6.0％、约7.0％、约8.0％、约9.0％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约25％、约30％以及在中间的任何数字或范围。在一些实施例中，聚乙二醇(PEG)的浓度是约1％至约20％。在一些实施例中，聚乙二醇(PEG)的浓度是约5％。
甘油酯
在某些实施例中，本文中描述的用于治疗勃起功能障碍、增加多种磷酸二酯酶抑制剂中的一种的溶解度和/或、增加多种磷酸二酯酶抑制剂中的一种的渗透性的配方和组合物包括至少一种或多种甘油酯。甘油酯是由丙三醇和脂肪酸形成的酯类。示例性甘油酯包括单甘油酯、双甘油酯和三甘油酯。在一些实施例中，本文中描述的配方和组合物包含中链甘油酯。在一些实施例中，本文中描述的配方和组合物包含聚糖化的C8-C10甘油酯。在一些实施例中，该聚糖化的C8-C10甘油酯是饱和聚糖化的C8-C10甘油酯。在一些实施例中，本文中描述的配方和组合物包含甘油酯混合物。混合物中的甘油酯可以是不饱和的或饱和的。在一些实施例中，该甘油酯混合物包括其他的化学品或化合物。在一些实施例中，该甘油酯包括聚氧甘油酯。在一些实施例中，该甘油酯包括辛酸己酰基聚氧化-8甘油酯或辛酸己酰基聚乙二醇-8甘油酯。在一些实施例中，该甘油酯包括辛酸/癸酸甘油酯类。在一些实施例中，例如辛酸/癸酸甘油酯类还包括聚乙二醇，诸如PEG-8。在一些实施例中，本文中描述的配方和组合物包含LABRASOL。
溶剂稳定剂/渗透促进剂
在某些实施例中，本文中描述的用于治疗勃起功能障碍、增加多种磷酸二酯酶抑制剂中的一种的溶解度和/或、增加多种磷酸二酯酶抑制剂中的一种的渗透性的配方和组合物可以包括作为溶剂、稳定剂或促进剂的其他化合物或化学品。举个例子，本文中描述的配方和组合物可以包含二乙二醇单乙醚。二乙二醇单乙醚也被称为2-(2-乙氧基乙氧基)乙醇，以品牌名称TRANSCUTOL出售。这种化合物可以作为高纯度的溶剂和稳定剂，并与局部剂型的皮肤渗透增强有关。其他合适的溶剂、稳定剂和渗透促进剂对于本领域的普通技术人员来说将是众所周知的。此类化合物的量能够根据所需配方而变化，诸如在0.1至99.9重量％、1.0至99重量％、5％至95重量％、10％至90重量％、或20％至80重量％的范围内。
缓冲剂
能够在本文中描述的实施例中使用的缓冲剂将是本领域技术人员已知的。请参阅“Ainley Wade和Paul J W Weller编辑的“Handbooks Pharmaceutical Excipients(Second Edition)(《药用辅料手册(第二版)》)，伦敦制药出版社,1994”，该手册通过引用被并入本文。示例的缓冲剂包括，但不限于，磷酸盐，诸如磷酸钠；一元磷酸盐，诸如磷酸二氢钠和磷酸二氢钾；二元磷酸盐，诸如磷酸氢二钠和磷酸氢二钾；柠檬酸盐，诸如柠檬酸钠(无水或脱水)；碳酸氢盐，诸如碳酸氢钠和碳酸氢钾。本文中描述的配方和方法中使用的缓冲剂的量很容易由本领域的技术人员确定，这取决于优选的pH。本文考虑的某些实施例的特点是，配方或组合物的pH是约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约8.0、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9或约9.0，以及中间的任何数字或范围。在一些实施例中，该配方或组合物的pH是约3.5至约8.0。在一些实施例中，该配方或组合物的pH是约3.5至约6.5。在一些实施例中，该配方或组合物的pH是约4.0至约5.0。
载体
在本文中描述的实施例中，适当使用的载体取决于药物的具体配方或组合物。载体包括，但不限于，填充剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、甜味剂和调味剂、防腐剂、崩解剂、研磨剂、渗透促进剂。载体的示例包括淀粉、明胶、天然糖、玉米、天然和合成胶诸如阿拉伯胶、海藻酸钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡、硼酸、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、琼脂、膨润土、琼脂胶、硬脂酸盐诸如硬脂酸钠、HPMC、棕榈酸、二甲基亚砜、N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、2-吡咯烷酮、1-甲基-2-吡咯烷酮、1,5-二甲基-2-吡咯烷酮、1-乙基-2-吡咯烷酮、2-吡咯烷酮-5-羧酸、N,N-二甲基间甲苯酰胺、尿素、乙酸乙酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮()、油酸、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、聚氯乙烯、聚乙烯、聚二乙基邻苯二甲酸酯。
各实施例的一般说明
用于提高一种或多种磷酸二酯酶抑制剂经黏膜的溶解度/渗透的示例配方
在一些实施例中，本文中描述了用于提高一种或多种磷酸二酯酶抑制剂经黏膜的溶解度和渗透的配方，其包括：(a)一种或多种磷酸二酯酶抑制剂；(b)有机水性溶剂，包括醇、二醇、二乙二醇单乙醚、中链甘油酯、一种或多种饱和聚糖化C8-C10甘油酯、或其组合；其中，该配方的pH为约3.5至约8.0，其中相对于该一种或多种磷酸二酯酶抑制剂在水中的溶解度，有机水性溶剂提高了该一种或多种磷酸二酯酶抑制剂的溶解度。在一些实施例中，有机水性溶剂包括醇。在一些实施例中，醇是乙醇或甘油。在一些实施例中，乙醇的浓度是5％至40％。在一些实施例中，乙醇的浓度是12％、25％或30％。在一些实施例中，有机水性溶剂包括聚醚。在一些实施例中，聚醚是聚乙二醇。在一些实施例中，聚乙二醇是PEG 6000或PEG 400。在一些实施例中，聚乙二醇的浓度是1％至20％。在一些实施例中，聚乙二醇的浓度是5％。在一些实施例中，本文中描述的配方包括弱盐。弱盐的非限制性示例包括柠檬酸盐、酒石酸盐、乙酸盐、富马酸盐、乳酸盐、氯化铵、类似有机盐、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、吐温80或类似有机化合物。在一些实施例中，本文中描述的配方包括一种多种醇类、聚醚、二乙二醇单乙醚、中链甘油酯、一种或多种饱和聚糖化C8-C10甘油酯、或其组合。在一些实施例中，该配方的pH是约3.5至约8.0。在一些实施例中，该配方的pH是约3.5至约5.0。在一些实施例中，磷酸二酯酶抑制剂是伐地那非、西地那非、他达拉非、或其组合。在一些实施例中，磷酸二酯酶抑制剂是伐地那非。在一些实施例中，磷酸二酯酶抑制剂是西地那非。在一些实施例中，磷酸二酯酶抑制剂是他达拉非。在一些实施例中，磷酸二酯酶抑制剂是伐地那非与西地那非和/或达拉非的组合。
治疗勃起功能障碍的示例性方法
在一些实施例中，本文中描述了治疗有需要的受试者的勃起功能障碍的方法，其包括用本文所公开的配方接触受试者的黏膜，从而治疗受试者的勃起功能障碍。在一些实施例中，接触黏膜包括鼻腔给药。在一些实施例中，接触黏膜包括舌下给药。
用于治疗勃起功能障碍的配方的示例性制备方法
在一些实施例中，本文中描述了用于治疗勃起功能障碍的配方的制备方法，其包括：(a)向包括醇、聚醚、二乙二醇单乙醚、中链甘油酯、一种或多种饱和聚糖化C8-C10甘油酯、或其组合的有机水性溶剂中添加一种或多种磷酸二酯酶抑制剂；(b)将包括该一种或多种磷酸二酯酶抑制剂的有机水性溶剂的pH调节至约3.5至约8.0，其中治疗勃起功能障碍包括用该配方接触受试者的黏膜。在一些实施例中，相对于该一种或多种磷酸二酯酶抑制剂在水中的溶解度，该一种或多种磷酸二酯酶抑制剂在有机水性溶剂中的溶解度增加。在一些实施例中，相对于在水中的该一种或多种磷酸二酯酶抑制剂穿过黏膜的渗透性，在有机水性溶剂中的该一种或多种磷酸二酯酶抑制剂穿过黏膜的渗透性增加。在一些实施例中，相对于在水中的该一种或多种磷酸二酯酶抑制剂的生物利用度，在有机水性溶剂中的该一种或多种磷酸二酯酶抑制剂的生物利用度增加。在一些实施例中，有机水性溶剂包括醇。在一些实施例中，醇是乙醇或甘油。在一些实施例中，乙醇的浓度是5％至40％。在一些实施例中，乙醇的浓度是12％、25％或30％。在一些实施例中，有机水性溶剂包括聚醚。在一些实施例中，聚醚是聚乙二醇。在一些实施例中，聚乙二醇是PEG 6000或PEG 400。在一些实施例中，聚乙二醇的浓度是1％至20％。在一些实施例中，聚乙二醇的浓度是5％。在一些实施例中，本文中描述的配方包括弱盐。弱盐的非限制性示例包括柠檬酸盐、酒石酸盐、乙酸盐、富马酸盐、乳酸盐、氯化铵、类似有机盐、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、吐温80或类似有机化合物。在一些实施例中，本文中描述的配方包括一种多种醇类、聚醚、二乙二醇单乙醚、中链甘油酯、一种或多种饱和聚糖化C8-C10甘油酯、或其组合。在一些实施例中，该配方的pH是约3.5至约8.0。在一些实施例中，该配方的pH是约3.5至约5.0。在一些实施例中，磷酸二酯酶抑制剂是伐地那非、西地那非、他达拉非、或其组合。在一些实施例中，磷酸二酯酶抑制剂是伐地那非。在一些实施例中，磷酸二酯酶抑制剂是西地那非。在一些实施例中，磷酸二酯酶抑制剂是他达拉非。
在一些实施例中，本文中描述的配方包括有机水性溶剂，该有机水性溶剂包括不止一种有机溶剂或成分。示例性有机溶剂或成分混合物包括例如水中的PEG和乙醇。在一些实施例中，水性有机溶剂混合物中的PEG是PEG 400。在一些实施例中，水性有机溶剂混合物中的乙醇的浓度是约5％至约40％。在一些实施例中，水性有机溶剂混合物中的乙醇的浓度是约12％。在一些实施例中，水性有机溶剂混合物中的PEG的浓度是约1％至约40％。在一些实施例中，水性有机溶剂混合物中的PEG 400的浓度是约1％至约40％。在一些实施例中，水性有机溶剂混合物中的PEG 400的浓度是约10％、约15％或约20％。在一些实施例中，配方包括在12％乙醇中的10％ PEG 400。在一些实施例中，配方包括在12％乙醇中的15％ PEG400。在一些实施例中，配方包括在12％乙醇中的20％ PEG 400。包括在水中的不止一种有机溶剂或组分的配方能够被用于本文中描述的任何方法中。
在一些实施例中，有机水性溶剂包括不止一种有机溶剂或成分，选择第二有机成分是为了提高选自溶解度、稳定性、渗透性和安全性中的至少一种性质。在一些实施例中，该配方的pH是约3.5至约8.0。
虽然本文中公开的许多示例涉及用于治疗勃起功能障碍的配方，但应当理解，该配方可以与任何可电离药物中的一种或多种组合，因此可以设想，此配方的效用是用于治疗该一种或多种可电离药物靶向的任何疾病、障碍或症状。
配方的示例方法
如本文中公开的，新的黏膜配方(例如，鼻腔、舌下配方)有助于实现(a)良好的治疗效果或有效的体内药物浓度(例如，血浆药物浓度)，以及(b)与既定的口服给药途径相比，快速起效或快速的体内药物浓度峰值(Tmax)，或达到与既定的注射给药途径(例如，静脉或皮下途径)类似的效果。在一些替代方案中，使用以下方法为给定的可电离化合物优化配方：
步骤1：估算黏膜配方的有效药物剂量
估算有效药物剂量的目标是使其达到与口服或注射途径相当的效果或浓度-时间曲线下面积(AUC)。在一些替代方案中，这包括初步审查既定口服药物的口服给药的生物利用度或可注射药物的注射给药的生物利用度，以计算有效黏膜剂量。例如，如果药物X由于肝脏的首过代谢，与静脉给药相比，其口服生物利用度是0.5。鼻腔途径将避免肝脏首过代谢并且其鼻腔剂量能够被估算为口服剂量的一半。因此，如果药物X的口服剂量为10mg，其鼻腔剂量能够被估算为约5mg。
步骤2：估算黏膜给药所需的最小可溶性药物浓度或Solmin。
某些黏膜给药具有有限的体积，可以给药到该部位。例如，对于鼻腔给药，鼻喷雾剂的最佳用量不超过0.2ml，通常每个鼻孔0.1-0.15ml，以防止“滴出”。因此，给予两个鼻孔的溶液体积是约0.2-0.3ml。因此，当对2个鼻孔中的每一个使用0.1ml喷雾或0.15ml喷雾时，上述鼻腔5mg药物X(来自步骤1)的示例所需的Solmin被估算分别为5mg/0.2ml或5mg/0.3ml＝25mg/ml或17mg/ml。同样地，对于舌下喷雾，使用所选择的所需体积，可以同样地计算此Solmin。
步骤3：确定参考药物通量或Jss(ref)
药物通量或Jss(ref)被定义为在特定pH下从给药于黏膜的水溶液中的药物每次穿过黏膜的单位面积的参考药物量。众所周知，药物通量或Jss由溶解度乘以表观渗透率(Papp)组成，药物穿过生物膜的Papp主要取决于未扰动水层(UWL)和膜对药物的渗透性。黏膜(诸如鼻黏膜)的UWL被黏液覆盖，黏液是一种主要由水组成的凝胶状液体。鉴于这种结构，本专利假设药物在纯水溶液中的Jss能够作为药物在有机水性溶液(其是用于黏膜给药的药物的新配方)中Jss的参考。由于Jss＝(Papp)(溶解度)，Papp能够通过人工膜、PAMPA(其中膜的两侧与UWL接触)来测定(16-19)。来自PAMPA的Papp能够是估算Jss(ref)的有用方法，该方法被提议作为药物的有机-水性配方的指南。因此，本专利进一步提出：
Jss(ref)＝(JsspHmax)(Solmin/Drug(ssol)pHmax)
其中，对于饱和水溶液中的可电离药物，JsspHmax是由PAMPA确定的Jss与pH图表中的Jss最大值，与最大Jss相对应的pH是pHmax，Solmin已经在步骤2中定义，Drug(ssol)pHmax是药物在pHmax下的饱和溶解度。Drug(ssol)pHmax和Papp通常在室温和大气压下测定。
步骤4：测定药物在有机水性溶液中的JsspHmax
分别使用常用的“摇瓶”法(溶解度测定)(20-22)和PAMPA(渗透率测定)筛选药物在有机水性溶液中的Drug(ssol)pHmax和在pHmax下的Papp或PapppHmax。如果Drug(ssol)pHmax≥Solmin(如步骤2中所定义的)并且结合药物在给定有机水性溶液(或用于黏膜给药的特定配方)中的(Drug(ssol)pHmax)(PapppHmax)或JssPHmax等于或超过Jss(ref)，则该特定配方能够具有资格作为待给药(例如，通过鼻腔或舌下途径)的药物的合适黏膜配方，能够获得与口服给药相同的治疗效果以及较短的Tmax，如步骤1中的计算。
步骤5：使用适当的细胞系模型确定JssPHmax
尽管通过PAMPA获得的Papp相对简单明了，但采用更多的生理学方法来确定药物在水溶液和各种有机水溶液中的Papp将提供对上述步骤1-4中描述的所选配方的进一步确认。对于鼻腔配方，能够使用Calu-3细胞系模型来确定适当的Papp确认(23-24)。对于舌下配方，能够使用HO-1U-1细胞系(25)。任何有机水性溶液配方，如果在pHmax时，与水溶液相比，Papp明显较低，则应排除。
实施例
进一步详细公开了其他实施例，其涉及实现磷酸二酯酶抑制剂的有效鼻腔或舌下给药的具体的配方和方法的确定。这些并未旨在以任何方式限制权利要求的范围。此外，本文中描述的实现有效的鼻腔或舌下给药的具体配方和方法的确定可以适用于任何其他可电离的化合物。以下包括具体的示例A1、A2、B1、B2和D1-D4，它们代表了根据伐地那非和西地那非的综合溶解度和渗透性曲线以及实现体内快速和有效浓度所需的剂量来确定理想的鼻腔配方的方法的顺序步骤。具体示例C1、C2、C3和D5是确认由上述分步法确定的鼻腔给药的配方和方法的适当性的体内证据。
实施例A1
鼻腔(IN)剂量和配方
使用具体的计算估算磷酸二酯酶抑制剂，例如伐地那非/西地那非达到相当于本文中描述的批准口服给药的治疗效果所需的最小鼻腔有效剂量的实施例。此计算假设可以确定足够的伐地那非/西地那非和鼻腔渗透性，鼻腔能够导致所需的血浆浓度和生物利用率。
所需的剂量进一步要求伐地那非活性药物成分或西地那非活性药物成分的鼻腔配方提供一定量的盐酸伐地那非三水合物，以达到与口服途径相似但明显更早的有效浓度。例如，如果FDA批准了10-20mg的口服伐地那非剂量，那么用合适的配方进行鼻腔给药应该能达到与口服途径相似的生物利用度，但达到峰值的时间(Tmax)要早得多。由于鼻腔剂量是经由鼻腔喷雾或滴鼻剂给药，鼻腔剂量的量可以从鼻腔给药的伐地那非配方溶液的体积乘以其相对生物利用度调整后的浓度来估算。下面提供计算的示例。
由于鼻腔给药通常使用50-200μl/喷洒到每个鼻孔(大于200μl的喷洒量很可能导致一些量从鼻腔滴出)，因此理想的喷洒量可以被设定为100μl/鼻孔或2×100μl为2个鼻孔的鼻腔剂量，以相当于10mg伐地那非口服剂量。将鼻腔喷雾剂的量增加一倍应提供相当于20mg口服剂量的鼻腔剂量。其他磷酸二酯酶抑制剂诸如他达拉非或西地那非的鼻腔量/剂量也可类似地计算为相当于其口服剂量。
假设伐地那非水溶液经由口服的吸收与其合适配方的鼻腔给药有关，并且基于伐地那非口服给药的已知生物利用度/药代动力学，可以假设其鼻腔给药达到当于0.4-0.8倍口服剂量的生物利用度，但可以达到更早的峰值浓度。这是基于已知的鼻腔给药的优势，它可以避免首过肝脏代谢，并且经由鼻黏膜实现快速渗透，与之前公布的肺部吸入的生物利用度相似(26)。这就要求最低浓度为2mg/100μl或最低溶解度为20mg/ml的盐酸伐地那非三水合物作为鼻腔配方。其他磷酸二酯酶抑制剂，诸如西地那非或他达拉非，能够用类似的方法计算。能够使用特殊的装置进行鼻腔给药，并且能够分别向两个鼻孔中输送。例如，用于鼻腔给药的装置可从Aptar公司购得。
实施例A2
筛选伐地那非在有机水性混合物中的溶解度和稳定性特征
本文所述的伐地那非的溶解度和稳定性的实施例是在各种有机水性混合物中确定的。
活性药物成分盐酸伐地那非三水合物的分子量为579.1g/mol，相应的游离碱为488.6g/mol(12)。伐地那非基的pKa＝7.15和9.86，logP＝3.64。伐地那非的溶解度在pH为1时是约8.8g/L，pH为2时是3g/L，pH为3时是1.6g/L，pH为4时是0.88g/L，pH为5时是0.16g/L，pH为6时是0.019g/L(13)。活性药物成分(API)盐酸伐地那非三水合物在水中的溶解度要好得多(图3)。然而，这种溶解度仍然很低，而且其水溶解度随着pH的增加而降低，是经由舌下和鼻腔给药实现快速和充分渗透和/或吸收的一个重大障碍。因此，尽管伐地那非碱的膜分配系数(logP＝3.64)很好，但使用伐地那非水溶液的舌下或鼻腔给药与口服给药相比，在接近或在鼻腔或舌下部位合适的生理pH值下给药，不能产生足够的生物利用度(参见实施例A1的计算)。
然而，伐地那非活性药物成分在某些溶剂中能够获得提高的溶解度，例如醇(13)或其他有机水性混合溶剂。由于潜在的膜刺激和损害，使用伐地那非的纯醇溶液是一个问题。因此，相对安全或人类受试者可忍受的醇-水混合物或其他有机水性混合物，诸如“普遍认为安全”或“GRAS”类别下的那些有机化合物(浓度相对较低)是优选的。由于这些原因，在鼻腔产品中使用12％的醇溶剂被FDA认定为人类可容许的浓度(27，28)。尽管12％的醇能够迅速溶解伐地那非活性药物成分，但它会在24小时内沉淀。因此，利用3天的“摇瓶”法来测定饱和溶解度(20-22)。
作为示例，首先筛选了不同pH下饱和伐地那非在水中的溶解度，然后再筛选不同pH下的渗透性。这些信息将被用于生成水系统中的最佳组合溶解度和渗透性(即Jss)，这将用于为有机水性溶液提供理想的pH、溶解度和渗透性的初始线索，以用作所需的合适的鼻腔伐地那非配方和剂量。
此外，任何溶剂的混合物必须能够溶解伐地那非，以便在舌下或鼻腔给药时快速和充分吸收。
作为示例，首先筛选了伐地那非活性药物成分在醇-水混合物中的溶解度，然后筛选了不同pH下的渗透性，以确定能够适用于舌下和鼻腔给药的最佳溶解度和渗透性。
材料
盐酸伐地那非(CAS号：224785-91-5)购自印度Alembic Pharmaceutical Ltd，Gujarat-391450India(批号：1704002361)。
他达拉非(TAD)5mg片剂购自Polpharma(Poland)。
乙腈≥99.5％ ACS(CAS号：75-05-8)购自VWR Chemicals
甲醇(“MeOH”)购自VWR Chemicals
乙醇190-Proof(CAS号：64-17-5)购自EMD Millipore(Burlington,MA,USA)。
注射器式过滤器w/0.2μm孔径的醋酸纤维素膜(Cat#28145-475)购自VWR(Radnor,PA,USA)。
聚乙二醇400(批号52081314)购自EMD Millipore(Burlington,MA,USA)。
甘油或丙三醇(批号70K0044)购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。
五水乳酸钙(批号SLCB7173)购自Sigma-Aldrich公司(St.Louis,MO,USA)。
冰醋酸(批号B21R026)购自Alfa Aesar(Haverhill,MA,USA)。
NMP(1-甲基-2-吡咯烷酮)(批号51K3683)购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。
设备
Accumet Basic pH计购自Fisher Scientific(Leicestershire,UK)。
Agilent 1260Infinity高效液相色谱系统，由G1311B 1269Quat Pump、G71291260小瓶采样器和G1315D 1260DAD VAL检测器组成，购自Agilent(Santa Clara,CA)。
分析天平购自Mettler-Toledo,LLC(Columbus,OH)。
程序
为了筛选各种有机溶剂，首先研究了伐地那非活性药物成分在不同比例的醇-水混合物中的溶解度，并且与纯水中的溶解度进行比较。正如本文所公开的，这些溶液是通过“摇瓶”法制备的。简而言之，将增加量的伐地那非活性药物成分加入不同的混合物中，直至饱和。使用pH计调整饱和的有机水混合物的pH(在pH 3.5-7.5范围内)。在室温下用磁力搅拌器缓慢摇动饱和溶液，或一天快速摇动数次，持续24小时或更长时间，最长3天。之后，使用VWR 0.2微米过滤器过滤这些溶液。然后将滤液用于检查透明度，并且通过HPLC测定浓度。此外，研究了伐地那非在各种有机水性溶液，例如在甘油(丙三醇)、聚乙二醇400(PEG)和两种有机溶剂的组合中的饱和溶解度。还研究了伐地那非在一些其他有代表性的有机含水溶液中的溶解度。
(a)高效液相色谱法测定伐地那非的浓度
为了进行溶解度研究以及从渗透性研究中测定浓度(参见实施例B1和B2)，样品通过与MeOH 1:1混合来制备用于HPLC分析。标准曲线在MeOH中制备并且与PBS混合，以便分析基质是相同的。HPLC分析通过Agilent 1260Hypersil BDS-C8,5μm,4.0×250mm柱(PN79926B8-584,SN USUE000480,LN 512010961)运行，使用乙腈:0.02M磷酸钠缓冲液pH 4(35:65v/v)等度流，1mL/min，10分钟。
结果
根据FDA的指导意见，对试验的有效性进行了评估，包括线性度、灵敏度、重复性、稳定性、精度和准确性。伐地那非的标准曲线在0.2-200μg/ml的浓度范围内呈线性。在3次不同的运行中，相关系数(r2)都大于0.99。对于0.5、10和200μg/ml的质量控制样品，精准度的相对标准偏差(RSD)值为1.8至6.1％(日间)和0.07至4.1％(日内)。准确度(％偏差)范围为-4.2％至2.2％(日间)和-0.9至3.4％(日内)。定量的下限是0.2μg/ml。
表1示出了不同pH下伐地那非在几种有机水性溶剂中的饱和溶解度比较。表2示出了含有6种不同溶液和2种不同pH的溶液的日间准确性和精准度，每种溶液使用标准曲线测量，然后与50％甲醇标准曲线进行比较。表3示出了伐地那非活性药物成分在不同溶剂中pH为4.0时的饱和溶解度的比较。
表1：在指示的有机水性溶剂中的饱和溶解度的比较
缩写：PEG＝聚乙二醇
表2：在指示的有机水性溶剂分析中稀释准确度和偏差的比较
通过比较20mg/ml的各种溶液来确定稀释的准确性。RSD为3.1％。通过在重构后的0、9、18和24h内重新注射样品，并且在200℃的自动取样器中储存，测试质量控制样品的稳定性。RSD值在2.8-7.8％之间。
表3：伐地那非活性药物成分在不同溶剂中在pH 4下的溶解度*
*在室温下测定，平均pH为4.0(3.9-4.1)，Sat Conc-饱和浓度，SD-标准偏差。
结论
如本文所公开的，与在纯水溶液中的溶解度相比，有机水性混合物，诸如乙醇-水混合物，能够显著提高伐地那非的溶解度(图3和表3)。伐地那非活性药物成分的溶解度与pH有关，pH较低时溶解度较高。与在水中的溶解度相比，有机水性混合物，诸如乙醇-水混合物，可以显著提高伐地那非的溶解度。例如，通过增加有机溶剂诸如乙醇的百分比浓度，能够进一步提高伐地那非的溶解度。此外，与PEG 15-水溶液相比，某些有机溶液混合物的组合例如15％ PEG-12％ EtOH-水混合物可以提高伐地那非的溶解度。
本文公开的结果表明，使用甲醇标准曲线进行测定，能够在不同的溶剂或溶剂混合物以及不同的pH下产生准确和精确的伐地那非浓度测定。从20mg/mL浓度稀释100倍也可以在+/-15％范围内准确/精确测定。
如果鼻腔配方需要伐地那非活性药物成分在pH 4下的最小溶解度为20mg/ml，那么在pH 4下平均饱和溶解度低于20mg/ml的水不适合作为伐地那非鼻腔配方的溶剂。然而，已经确定了GRAS类别下的一些其他的有机水性溶剂，在pH为4时具有比20mg/ml更高的溶解度(见表3)，如本文所公开的，这些溶液的进一步混合可能适用于伐地那非鼻腔配方。
实施例B1
使用PAMPA筛选渗透性和通量以选择伐地那非鼻腔配方
本示例描述了使用平行人工膜渗透性试验(PAMPA)测定伐地那非的渗透性。
如本文所公开的，使用体外PAMPA筛选了室温和大气压下不同溶剂中伐地那非活性药物成分的渗透性。PAMPA预测药物的被动吸收，并且适用于包括乙醇(高达30％浓度)的许多溶液的研究(22-24)。计量单位是稳定状态下获得的表观渗透率(Papp)，以cm/秒表示。另外，另一个相关的计量是在特定的pH下的最大通量(Jss)，表示为每秒钟穿过单位面积的药物量，由Papp和饱和溶解度计算得出。
如本文所公开的，确定了乙醇-水溶液对改善药物穿过黏膜的渗透性/吸收的效果。鉴于12％的乙醇-水溶液和30％的乙醇-水溶液能够明显改善溶解度，进一步研究了不同pH下的渗透性。在我们的研究之前，不同乙醇-水溶液浓度下的pH对渗透的影响是未知的，无法准确预测。
材料和设备
运输接收板(Cat#MATRNPS50)和MultiScreen-IP过滤板(Cat#MAIPN4550)购自Millipore(Burlington,MA,USA)。
盐酸伐地那非(CAS号：224785-91-5)；Alembic Pharmaceutical Ltd，Gujarat-391450India(批号：1704002361)。
乙醇190-Proof(CAS号：64-17-5)购自EMD Millipore(Burlington,MA,USA)。
乙腈(Cat#BDH83639.400)购自BDH Chemicals(Radnor,PA,USA)。
十二烷(Cat#D221104)、磷酸二氢钠(Cat#S0751)、磷酸一氢钠(Cat#S0876)和聚乙二醇6000(Cat#8.07491)购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。
卵磷脂，精制固体(Cat#36486)购自Alfa Aesar(Haverhill,MA,USA)。
注射器式过滤器w/0.2μm醋酸纤维素膜(Cat#28145-475)购自VWR(Radnor,PA,USA)。
聚乙二醇400(批号52081314)购自EMD Millipore(Burlington,MA,USA)。
程序
(a)溶液制备
通过使用增加量的伐地那非制备不同溶剂中的伐地那非盐酸盐三水合物饱和溶液(5ml)，并且将其调整到所需的pH值(使用pH计，范围为3.5-6.0)，如上文实施例A2中所述。将饱和溶液在室温下缓慢摇动24h，或快速摇动数次并且在室温下保持24h或更长时间。之后，用0.2μm的过滤器过滤这些溶液。然后将滤液用于渗透研究。
(b)使用PAMPA的渗透研究
使用平行人工膜渗透性试验(PAMPA)与接收板和MultiScreen-IP过滤板进行伐地那非渗透研究。PAMPA试验预测药物的被动吸收，并且适用于研究乙醇溶液(22-23)。稳定状态渗透试验以一式三份或更多份进行，持续时间为6h或24h以代表稳定状态。对于一些溶液，6h和24h的时长都要进行，以建立这两种时长的一致性。在将150μL所需的样品转移到供体室之前，供体室首先被涂上5μl的3％(w/v)十二烷中的卵磷脂。然后将300μL的磷酸盐缓冲液转移到接受孔中。渗透6或24h后，从供体和接收室收集样品，使用HPLC进行浓度分析。
表观渗透系数(Papp)的测定，以cm/秒表示，在稳定状态下根据以下公式计算(24)
其中
VD＝供体室的体积
VA＝接受室的体积
A＝膜的有效面积(PAMPA：0.3cm2)
t＝渗透性研究的时长
CA＝研究结束时接受体孔中的药物浓度
CE＝两孔中的平衡浓度，和
稳态通量(Jss)。Jss，以μg/sec/cm2表示，根据以下公式计算
Jss＝papp×CD
其中
CD＝供体室中的装载浓度
表4示出了伐地那非在不同溶剂中在pH 4下的Papp和Jss的比较。
表4：溶剂对伐地那非活性药物成分渗透性和通量的影响*
*由PAMPA在室温和24h内平均pH 4.0(3.9-4.1)下测定；#伐地那非有机水性混合物(饱和溶解度>20mg/ml)的Jss远高于水中Jss或Jss(ref)(见下文)，P<0.05(-检验)；SD＝标准偏差。
在pH 3.5-8.0下，伐地那非水溶液的pH-溶解度乘以pH-Papp曲线成为pH-通量或pH-Jss曲线(见图10b的曲线)。与其最高Jss对应的pH是pHmax，其对应的伐地那非水溶液饱和溶解度被指定为V(ssol)pHmax。因此，pHmax下的Jss或JsspHmax能够被用于计算对应于指定为Solmin(根据先前[0061]中的计算，其对于最小鼻腔剂量2mg/鼻孔是20mg/ml)的所需最小溶解度的参考Jss或Jss(ref)：
Jss(ref)＝JsspHmax(Solmin/V(ssol)pHmax)
其中Solmin是所需的最小溶解度(对于最小鼻腔剂量为2mg/鼻孔的伐地那非来说是20mg/ml，或与更高鼻腔剂量相对应的更高数值)；V(ssol)pHmax)是pHmax(即，图10b中的pH 4)时的伐地那非水溶液饱和溶解度，为18.19(来自表3)。使用Solmin＝20，V(ssol)pHmax＝18.19，JsspHmax＝7.74E-05μg/s/cm2(来自表4)，对于2mg/鼻孔的要求伐地那非鼻腔剂量，Jss(ref)＝8.5E-05μg/s/cm2。
在任何pH(pH 3.5-7.5范围内)下溶解度>20mg/ml，相应的Jss值>Jss(ref)的伐地那非有机水性混合物，都能够符合鼻腔伐地那非配方的要求。
(c)HPLC分析
将100μL供体或接收室样品与100μL MeOH和10μL内部标准混合2分钟后，样品在HPLC注入前以10,000rpm离心10min。在HPLC进样前，用50％的MeOH稀释加载的储备液。高效液相色谱法按示例A2中所述进行。
结果
表4中示出了比较渗透研究的结果。观察到这些6h和24h时长的渗透研究之间的Papp结果有很好的相关性，表明Papp实验的一致性。使用例如纯水溶液和其他乙醇-水混合物的其他个别研究也支持pH对渗透性影响的类似趋势，如图5所示。
结论
正如本文所公开的，伐地那非活性药物成分的溶解度随着pH的降低而增加。然而，伐地那非的渗透性(Papp)随着pH的增加(对应于更高的未电离物百分比)而增加，理论上预计pH从3.5增加到5.0(图5)。对于伐地那非水溶液中，药物通量或Jss(由Papp乘以饱和溶解度组成的参数)在pH 4.0下显得最佳(图5b)。有代表性的伐地那非有机水性溶液(EtOH(12％)-水溶液)也显示出类似的趋势(图5B)。根据这些数据，Jssmax被选为在pH 4。
已经发现一些在pH 4时溶解度大于等于20mg/ml的有机溶剂也超过了水溶液的平均伐地那非Jss或Jss(ref)(8.5E-05μg/s/cm2)，并且能够被视为适合鼻腔伐地那非的配方(表4)。
许多有机水性混合物或有机-有机水性混合物，能够改善盐酸伐地那非三水合物的溶解度和渗透性，盐酸伐地那非三水合物是目前伐地那非的活性药物成分。另一方面，两种不同的有机溶剂在水中的组合可以改善渗透性，即使与单一的有机水性混合物诸如12％的EtOH-水相比，该组合可能不会提高溶解度。在不受任何理论限制或约束的情况下，相信本文中描述的溶剂和在接近鼻腔或舌下部位生理pH的pH范围内能够改善不同的磷酸二酯酶抑制剂的溶解度的其他合适的有机水性溶剂，也能够改善其渗透性，并且适用于鼻腔和舌下给药。
实施例B2
使用Calu-3细胞系模型测定选定溶液中伐地那非的渗透性
本实施例描述了使用Calu-3细胞系模型测定伐地那非的渗透性。
本文采用体内细胞系模型Calu-3(非小细胞肺癌细胞系)对伐地那非药物活性成分在不同溶剂中的渗透性进行了筛选。尽管使用PAMPA方法可以高效地筛选不同溶剂对伐地那非渗透性的影响，但如果使用生理模型诸如与靶膜相似的细胞系进行确认，则可以提高该方法的可靠性。因此，本研究采用Calu-3细胞系作为鼻腔渗透的适用模型，来确认渗透性的PAMPA研究结果。
Calu-3细胞系模型测定的水溶性药物的Papp被证明与动物研究中在pH 7.4下测定的鼻腔吸收有关(23-24)。如本文所公开的，利用Calu-3细胞系模型来确认各种有机水性溶液与pH 4.0的水中(模拟伐地那非配方的鼻腔给药)的Papp的相对值。
材料
冰醋酸(纯度>99％，CAS 64-19-7)购自Alfa Aesar(Haverhill,MA,USA)。
乙腈≥99.5％ ACS(CAS号：75-05-8)购自VWR Chemicals
磷酸二氢钠一水合物(磷酸盐缓冲液)购自购自BDH Chemicals(Radnor,PA,USA)。
NaOH(氢氧化钠)购自Biobasic Canada Inc.(Markham,Ontario,Canada)。
磷酸一氢钠，七水合物(磷酸盐缓冲液)购自EMD Millipore(Burlington,MA,USA)。
盐酸伐地那非(USP)购自SMS Pharmaceuticals Ltd.(India)。
Gibco的Hank's平衡盐溶液(HBSS),磷酸，85％(HPLC),具有可渗透的聚碳酸酯膜插入物三乙胺的TranswellTM多孔板购自Thermo Fisher Scientific(Waltham,MA,USA)。
注射器式过滤器w/0.2μm醋酸纤维素膜购自Avantor的VWR(Radnor,PA,USA)。
设备
Accumet Basic pH计购自Fisher Scientific(Leicestershire,UK)。
Agilent 1260Infinity高效液相色谱系统，由G1311B 1269Quat Pump、G71291260小瓶采样器和G1315D 1260DAD VAL检测器组成，购自Agilent(Santa Clara,CA)。
分析天平购自Mettler-Toledo,LLC(Columbus,OH)。
使用的水来自Nanopure水过滤系统(Barnstead Nanopure Diamond Life SciUV/UF系统(Cat#D119310，购自APS Water Servives公司(Lake Balboa,CA,USA))。
经上皮电阻(TEER，单位：Ohm·cm2)测定设备。
程序
(a)溶液制备
如上文示例A2和B1描述的，制备不同溶剂中的伐地那非饱和溶液(2mg/mL)，并且将其调整到所需的pH(使用pH计，范围为3.9-4.1)。通过涡旋充分溶解每种粉末，然后在旋转平台上过夜混合，制备含有2mg/ml的伐地那非的各种溶液。之后，用0.2μm的过滤器过滤这些溶液。然后将滤液用于渗透/渗透性研究。
(b)Calu-3的培养和单层的制备
该研究的进行与之前描述的类似(26-27)。Calu-3，一种人支气管黏膜下腺癌细胞系，在DMEM:Ham's F-12(1:1)混合物中生长中，补充有10％的FBS和1％的青霉素/链霉素溶液。用0.25％的胰蛋白酶-EDTA收获细胞，并且以5×105个细胞/孔的密度在聚碳酸酯过滤器(孔径：0.4μm，生长面积：1.12cm2，12孔/板，Corning)上播种。在实验过程中，每2天更换一次培养基。播种9-10天后，单层用于体外的输送研究。
(c)使用Calu-3细胞系模型进行体外渗透/渗透性研究
在测量单层的TEER并且发现在约500Ohm·cm2后，吸出生长介质，用输送介质(TM：Hank's平衡盐溶液，补充15mM葡萄糖和10mM HEPES缓冲液，pH 7.4)清洗上下室。
孵化10分钟后，顶端室的溶液被替换为pH 4.0的研究过的伐地那非溶液。在BSL2罩下，于15、30、45、60、90、120min从基底侧取等量样品(50μL)。每次加入50μL等量的输送介质以补充体积，并且定期测定TEER测量。
(d)HPLC试验的准备和测量
来自接收室和顶端室的50μL样品与50μL 50％的MeOH和10μL内部标准混合，或用50μL培养基和内部标准稀释。离心后取上清液进行HPLC分析。HPLC按示例A2和B1中所述进行。
(e)计算Papp
Papp，以cm/秒为单位，使用以下公式从HPLC分析的样品中计算得出：
Papp＝dQdt/(AC)；其中
dQdt是药物在接收室的出现(nmol/秒)，A是单层的表面积(1.12cm2)，C是药物在顶端室的初始浓度。
结果
表5列出了不同伐地那非溶液的算得的平均Papp。除了在15％ PEG 400溶液中的伐地那非的Papp值外，大多数Papp都接近于在水中的伐地那非的Papp。对于15％的PEG400溶液中的伐地那非，TEER值增加到比初始基线值高约1200Ohm·cm2，在120min时逐渐下降到与基线值相似的水平(约500Ohm·cm2)。加入EtOH/PEG(12％/15％)也使最初的TEER增加了约1200Ohm·cm2，但在40min时更快地恢复到与基线相似的水平。大多数其他溶液通常导致TEER迅速下降到低于500Ohm·cm2的基线值，时间不到20-40min。
表5：使用Calu-3细胞系模型的伐地那非药物活性成分的渗透性*
数量 平均Papp(cm/s) Papp(cm/s)的SD
水 3 3.04E-05 4.17E-06
醋酸(2％) 2 3.57E-05 1.62E-06
乳酸钙(5％) 2 2.22E-05 2.77E-06
EtOH(12％) 2 2.08E-05 5.73E-06
NMP(10％) 2 3.16E-05 2.69E-06
PEG 400(15％) 2 1.36E-06* 6.10E-07
醋酸/NMP(2％/10％) 3 4.99E-05 1.43E-05
EtOH/乳酸钙(12％/5％) 3 2.95E-05 1.06E-05
EtOH/NMP(12％/10％) 3 2.60E-05 3.86E-06
EtOH/PEG 400(12％/15％) 3 2.08E-05 4.86E-06
HBSS(pH 4) 1 3.60E-05 n/a
*在37℃，pH 4.0(3.9-4.1)下测定；Papp＝表观渗透率；SD＝标准偏差；渗透时长≤2小时。*与水相比，P<0.01(t检验)。
结论
在本实验中，由于每种溶液的浓度为2mg/ml，所以溶液的相对Papp值也直接反映了相对Jss值。对于大多数溶液，伐地那非药物活性成分在不同有机水性溶液中的Papp值与伐地那非在水中的Papp值大致相同，但15％的PEG 400溶液除外，后者比前者低20倍(P<0.001，2次样本t检验)。这可能与含有15％ PEG 400溶液的伐地那非的有机水性溶液的TEER增加(高于介质的初始TEER，或500Ohm·cm2)相对应。TEER的增加可能表明细胞膜的紧密连接功能在增加。为了支持这一假设，在PEG 400中加入乙醇--已知乙醇可增强膜的渗透性--其TEER值明显降低。因此，使用Calu-3模型来进一步筛选最初由PAMPA确定的伐地那非配方，能够作为消除不可取配方的一个有用步骤。
实施例C1
磷酸二酯酶抑制剂的给药方法
本示例描述了磷二酯酶抑制剂的鼻腔和舌下给药的方法。
将磷酸二酯酶抑制剂添加到有机水性混合溶剂中，并且调整溶剂的pH值。任何磷酸二酯酶抑制剂都可以使用，例如包括伐地那非(艾力达)、西地那非(万艾可)和他达拉非(西力士)等。在给定的pH下，将磷酸二酯酶抑制剂加入到有机水性溶剂中，能够导致磷酸二酯酶抑制剂的溶解度和/或渗透性增加。任何有机水性混合物或溶剂都可以使用，包括任何相对安全或人类受试者能容忍的、能够充分溶解和提高磷酸二酯酶抑制剂的渗透性的有机水性溶剂。
磷酸二酯酶抑制剂溶解度的提高能够导致磷酸二酯酶抑制剂，诸如伐地那非、西地那非或他达拉非等穿过黏膜的通量(溶解度乘以渗透性或Jss)的提高。有机水性混合物中的磷酸二酯酶抑制剂的黏膜通量适合在约4.0至约8.0的pH范围内。由于改善了穿过黏膜的通量，与相同的磷酸二酯酶抑制剂的口服给药相比，磷酸二酯酶抑制剂的Cmax和生物利用度能够提高，Tmax能够被缩短。与口服给药相同剂量的磷酸二酯酶抑制剂相比，这将在鼻腔或舌下给药时转化为更高的血浆浓度和更快的起效时间。
磷酸二酯酶抑制剂能够经由鼻腔或舌下膜以任何剂型给药，但与其他剂型相比，溶液配方，诸如使用喷雾剂，可能导致最快起效。作为示例，能够将一定量的磷酸二酯酶抑制剂加入到混合的有机水性溶剂中，在鼻腔或舌下以每次喷雾100μl的体积提供所需量的磷酸二酯酶抑制剂。
例如，如上描述的具有提高的溶解度和渗透性的磷酸二酯酶抑制剂被用于治疗勃起功能障碍。
除磷酸二酯酶抑制剂外，这个方法还能够被应用于任何可电离的化合物。
实施例C2
大鼠鼻腔与口服给药伐地那非的比较
本示例描述了伐地那非口服或鼻腔给药后的生物利用度测定，以及配方的变化对药物动力学的影响。
鼻腔给药允许化合物绕过肝脏代谢。此外，由于鼻黏膜薄层，如果给予适当的药物形成，与口服给药相比，鼻腔给药可以更快地吸收、更高的生物利用度和更快的药物峰值浓度时间(Tmax)。已经发现某些配方在体外具有不同的伐地那非Jss或Papp。因此，当经由鼻腔途径给药时，这些配方差异可能会影响上述药代动力学参数。在我们的研究之前，估算适当的剂量/药物浓度，和确定和确认具有用于鼻腔给药的所需溶解度和渗透性的特定配方，以实现相对于口服给药剂量的改善和适当的伐地那非血浆浓度的逐步方法尚不清楚。
程序
伐地那非的水溶液和有机-水性溶液的制备使用与实施例A2中描述相同的方案。插入颈静脉插管的斯普拉格-杜勒大鼠(Sprague Dawley rat)是从Envigo RMS，Inc.(Indianapolis,IN)订购。抵达后，在药代动力学研究之前，将大鼠调整到卫生科学西部大学(the Western University of Health Sciences)的动物饲养场环境中一周。麻醉和研究程序与之前发表的研究类似(29)。测试了总共6种配方的鼻腔给药和一种配方的经由灌胃的PO给药(见下表6)。
给一小组大鼠口服(PO，经口)含有伐地那非(5.6mg/kg)的配方。对另一小组大鼠经鼻腔(IN)给予含有伐地那非(2.8mg/kg)的配方。鼻腔给药大鼠组通过微量移液管给药，每鼻孔给药约12.5μl。通过鼻腔途径给予水和PEG配方的大鼠分别为1.7mg/kg和2.0mg/kg。大鼠被随机分配接受6种配方(见表6)。
在给予配方后，在0、2、5、10、15、20、30、45、60、120、180min时从大鼠获得200μL的血液。治疗一周后，大鼠的血细胞比容水平恢复正常，这一点通过研究中随机选择的大鼠的血浆进行了验证。基于这种红细胞比容反应、一般身体活动和套管的通畅性，一周后将大鼠交给不同的配方治疗，并且收集相同的血液样本。在完成所有血液取样后，离心样品，收集血浆并且储存，以使用液相色谱-串联质谱法(LC/MS/MS，Sciex API4000和安捷伦HPLC1200系统)进行分析。试验使用大鼠血浆构建标准曲线，西地那非用作内部标准(IS)。试验程序类似于如下所述的人体研究(参见实施例C3下伐地那非血浆浓度的测定)。
结果
大鼠血浆中伐地那非浓度试验的标准曲线显示了良好的相关系数(对于浓度0.1-1000ng/ml，R2＝0.9981)。表6示出了伐地那非的配方和接受鼻腔剂量和口服剂量的大鼠数量。表7示出了乙醇/PEG 400(12％/15％)口服与鼻腔给药配方的药代动力学参数。表8示出了鼻腔给药配方2至6的药代动力学。
表6：包含伐地那非的配方对大鼠进行经口或鼻腔给药
表7：鼻腔和口服给药乙醇/PEG 400(12％/15％)后伐地那非的药代动力学参数
*按mg/kg剂量进行归一化
表8：5种配方鼻腔给药后伐地那非的药代动力学*
参数 单位 F2 F3 F4 F5 F6
T1/2 min 59±13 46±45 55±20 48±79 54±201
Tmax min 7±3 12±3 16±20 6±3 4±2
Cmax ng/mL 31±17 40±13 13±2 10±3 33±14
AUC0-inf ng/mL·min 1622±712 2262±567 812±42 508±187** 1728±656
F＝配方，*按mg/kg剂量进行归一化。**与F6(水配方)相比，P<0.01(t检验)。
讨论和结论
相对生物利用度(AUC)、Cmax(峰值浓度)和Tmax(Cmax的时间)的结果与实施例A2、B1、B2和C1中确定的配方的预期结果一致。相对于在水中Papp/通量较低的溶剂，例如在体外PAMPA和/或Calu-3研究中伐地那非在15％ PEG 400或15％ PEG-10％ NMP中，可能在通过鼻腔途径给药时导致相对低的生物利用度。与水配方(F6)相比，F5的AUC明显更低。与F6配方相比，4号配方的AUC和Cmax也大大降低，但由于完成研究的大鼠数量较少，这些数值在P<0.05时没有统计学意义。然而，具有与水中相似/更好的Papp/通量的溶剂，例如伐地那非在12％的乙醇和乙醇/PEG 400(12％/15％)中，能够导致与水相似/更好的生物利用度。因此，这些大鼠数据证实了使用实施例A1、A2、B1和B2中展示的分步法筛选和选择所需配方的本方法。
实施例C3
选择的磷酸二酯酶抑制剂在人类中鼻腔与口服给药的比较
本示例描述了在人类中口服或鼻腔给药伐地那非后的生物利用度测定，以及配方的变化对药物动力学的影响。
如本文所公开的，本研究比较了SDS-089溶液(由溶解在12％ EtOH/15％ PEG 400中的20mg/ml的伐地那非组成)作为鼻腔喷雾剂(鼻腔给药)与艾力达口服片10mg(口服，或PO给药)。实施例A1、A2、B1、B2和C1中描述了选择>20mg/ml的伐地那非的溶解度，其在12％乙醇-15％ PEG 400中的溶液用于鼻腔给药的步骤。
材料
根据主要研究人员的处方，为参与研究的每个人类受试者准备了伐地那非鼻腔喷雾液(SDS-089鼻腔喷雾)。
该活性药物成分来自Alembic Pharmaceutical Ltd.,India(批号1704002361)，符合USP标准。
鼻腔喷雾液由在pH约4.0下溶于12％的乙醇和15％的PEG 400的20mg/ml的伐地那非活性药物成分组成。SDS-089鼻腔喷雾液经过过滤(0.22μm的过滤器)，转移到5mL的小容量琥珀瓶中，该琥珀瓶配备有每次喷雾量为100μL的鼻腔喷雾装置(由Aptar,Pharma,Franc制造)。在试验性临床研究之前，验证了Aptar鼻腔喷雾装置每次喷雾100μL的能力。该喷雾剂每一喷递送了溶于12％的乙醇和15％的PEG 400溶液中的2mg盐酸伐地那非。
盐酸伐地那非(艾力达)10mg口服片剂，由Bayer Pharmaceutical(NDC:D173-0830-13,Lot#:5930248)生产，购自药店。
SDS089由卫生科学西部大学(Pomona,California,USA)医疗中心的执业药品技术员在执业药师的监督下在病人护理中心制备。
程序
为研究而招募的12名人类受试者是年龄在21至45岁之间的健康志愿者。每个受试者都接受了两种研究治疗：SDS-089溶液作为鼻腔喷雾剂(4mg盐酸伐地那非三水合物)和艾力达口服片剂(10mg)，以随机顺序进行，间隔时间为7±1天。
在研究当天，受试者被插入了静脉导管。所有受试者经口服(PO)给药10mg艾力达口服片剂或通过鼻腔给药4mg SDS-089溶液(2mg/喷/鼻孔)鼻腔喷雾。给药后用240ml水。1周后，每个受试者的治疗被交叉进行(使得之前鼻腔给药的受试者现在经口给药，而之前经口给药的受试者现在鼻腔给药)。每个受试者在给药时服用240ml水，并且在单剂量治疗2h后允许喝水和清澈液体。提供膳食，并在用药后至少4h内给予膳食。
药物配方给药后，共收集了17份血样(每份2cc)。血液样本在0(服药前)、2min、5min、10min、15min、30min、45min、60min、90min、2h、3h、4h、6h、8h和10h时采集。所有血液样本立即以3000rpm离心10分钟，并且储存在-80℃，直到准备好进行生物分析。
在研究期间，安全评估包括不良事件监测、生命体征，以及根据医疗主管的判断，根据需要进行有针对性的病史和身体检查。
(a)测定伐地那非的血浆浓度
经由南加州大学药学院分析认证实验室的Stan Louie博士提供的合同服务，使用液相色谱串联质谱法(LCMS)(LC/MS/MS，Sciex API 4000和Agilent HPLC 1200系统)对血浆中的伐地那非浓度进行分析。在验证实验中，每个校准标准品和质量控制样品都是通过在空白人血浆中加入指定量的作为内部标准的盐酸伐地那非(来自USP)和西地那非(来自LETCO)来制备。50μl等分的分析物使用850μl甲醇提取，离心，并且将上清液干燥。然后粉末用60μl 50％的甲醇进行还原，过滤后将30μl注入LCMS。分离出的分析物使用反相高性能Eclipse plus C18柱(Agilent)进行分离，其尺寸如下：4.6×100mm，颗粒度3.5μm。使用三重四极杆串联质谱仪在电喷雾电离模式(ESI)的正向模式下运行，对每个标准中的分析物浓度进行了量化。使用多重反应监测(MRM)检测伐地那非和西地那非各自的分析物中的每一个。平均检测准确度在92-110％之间。标准曲线的R2在0.9977到0.9998之间。精度，定义为变异系数(CV)＝(标准偏差/重复测量的平均值×100％)，范围为4-8％。定量的下限是0.2ng/ml。
结果
有代表性的伐地那非浓度时间曲线见图12，平均比较药代动力学参数见表9。根据浓度-时间曲线下的面积(AUC0-inf)从0到无穷大，计算出SDS鼻腔喷雾剂的总生物利用度为口服伐地那非的约1.4倍。SDS089鼻腔喷雾剂的最大浓度时间(Tmax)发生的中位时间是10分钟，而口服片剂为58min。(85％接受鼻腔给药的受试者的Tmax为6-15min，而92％接受口服给药的受试者的Tmax为45-60min)SDS089给药后的最大浓度(Cmax)在口服给药后Cmax的范围内。这些数据表明，SDS089鼻腔喷雾剂4mg的生物利用度与10mg口服剂量的生物利用度接近，但其Tmax短得多。
表9：鼻腔喷雾剂与口服片剂的平均药代动力学参数的比较
注意：除Tmax是代表Tmax更有意义的表征的中位值外，以上药代动力学参数的平均值都是均值。
在2个治疗周期中，共有47例不良事件(AE)发生。47例不良反应中，42例记录为药物不良反应(ADR)，其中33例ADR与鼻腔喷雾剂相关联，9例ADR与口服片剂相关联。观察的不良反应包括头痛、打喷嚏、流涕、流眼泪、鼻部刺激和咽喉刺激。尽管SDS-089鼻腔喷雾剂会导致更多的鼻部症状发生，但总体来说不良反应是短暂的，受试者耐受性良好。当轻度和中度头痛与Cmax和AUC0-inf相关时，报告的头痛没有相关性。
结论
正如本文所公开的，该研究在12名健康志愿者中比较了伐地那非的鼻腔给药和口服给药。鼻腔给药的不良反应更常见，然而，这些影响似乎是短暂的，可以容忍的。这项研究的总体结果与大鼠的研究结果一致，其中鼻腔给药的Tmax更早，生物利用度更好。这些人体研究进一步证实了使用实施例A1、A2、B1和B2中描述的分步法能够确定适当的配方和剂量。
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以下每一个参考文献在此通过引用的方式被全部并入本文中。
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实施例D1
西地那非鼻腔(IN)给药和配方
确定了西地那非的特性，包括其在各种有机水性混合物中的溶解度和稳定性。
西地那非被FDA批准为用于治疗ED的口服片剂，常用剂量为25至100mg(1)。其活性药物成分枸橼酸西地那非的分子量为666.7g/摩尔，西地那非碱的分子量为474.6g/摩尔(1)。西地那非碱的pKa＝7.2，logP＝2.7(12)。其在水中的溶解度在pH 3-4时是约7.0mg/ml，在pH 5时是2.1mg/ml，pH 6时为0.11mg/ml，pH 7时为0.03mg/ml(7)。这种在水中的溶解度太低，无法开发出合适的鼻腔配方。(假设鼻腔给药的生物利用度比口服给药的生物利用度好2倍，要达到相当于至少25mg口服剂量的有效浓度，就需要西地那非基的溶解度达到约42mg/ml。此浓度是根据每个鼻孔0.150ml的理想喷雾量计算的，因此两个鼻孔需要的浓度为12.5mg/0.3ml＝42mg/ml)。因此，尽管有很好的膜分配系数(logP＝2.7)，但即使在最易溶解的pH范围内(pH 3-4)，使用水基西地那非的鼻腔给药也不可能达到有效的鼻腔剂量(相当于至少25mg口服剂量)。
然而，枸橼酸西地那非在某些油(例如，油酸、红花油)或表面活性剂(例如，吐温20)、聚氧乙烯蓖麻油(cremophor)RH60、聚氧乙烯蓖麻油EL或辅助表面活性剂(例如，PEG200)中可以达到更好的溶解度(30)。发现由40％的油酸、10％的H2O和50％的吐温80乙醇(重量比为1:4)组成的微乳系统用于鼻腔西地那非的制备，能产生快速作用(30)。然而，这种油性溶液不太可能适合具有鼻腔喷雾正常使用。因此，一种由简单的有机水性混合物组成的不含油的新配方，既安全又能达到合适的溶解度和渗透性，将是最理想的。
实施例D2
各种有机水性混合物溶解度和稳定性特征的筛选：西地那非
作为示例，使用描述的伐地那非鼻腔喷雾配方的方法，首先筛选不同pH下饱和西地那非在水中的溶解度，然后筛选不同pH下的渗透性。这些信息将被用于生成水系统中的最佳组合溶解度和渗透性(即Jss)，这将用于为有机水性溶液提供理想的pH、溶解度和渗透性的初始线索，以用作所需的合适的舌下和鼻腔西地那非配方和剂量。此外，在约pH 4.0-6.0下测定西地那非在各种溶剂中的饱和溶解度。
材料
枸橼酸西地那非购自Assian Chemical Industries Ltd(Israel)，由Teva API(Israel)制造。
使用的水来自Nanopure水过滤系统(Barnstead Nanopure Diamond Life SciUV/UF系统(Cat#D119310，购自APS Water Servives公司(Lake Balboa,CA,USA))。
他达拉非(TAD)5mg片剂购自Polpharma(Poland)。
乙腈≥99.5％ ACS(CAS号：75-05-8)购自VWR Chemicals
甲醇(“MeOH”)购自VWR Chemicals
乙醇190-Proof(CAS号：64-17-5)购自EMD Millipore(Burlington,MA,USA)。
甘油或丙三醇(批号70K0044)购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。
五水乳酸钙(批号SLCB7173)购自Sigma-Aldrich公司(St.Louis,MO,USA)。
冰醋酸(批号B21R026)购自Alfa Aesar(Haverhill,MA,USA)。
NMP(1-甲基-2-吡咯烷酮)(批号51K3683)购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。
磷酸二氢钠一水合物(磷酸盐缓冲液)(Cat#BDH9298，批号19E0356407)购自购自BDH Chemicals(Radnor,PA,USA)。
NaOH(氢氧化钠)(Cat#SB0617，批号C26S617R0S)购自Biobasic Canada Inc.(Markham,Ontario,Canada)。
二乙二醇单乙醚(卡毕醇)(Cat#8.03127，批号S7591827 831)
MultiScreen-IP过滤板(Cat#MAIPN4550)
磷酸一氢钠，七水合物(磷酸盐缓冲液)(Cat#8210，批号BB-0680R)。
聚乙二醇400(Cat#PX1286B-2，批号60297045)购自EMD Millipore(Burlington,MA,USA)。
HCl(盐酸)(Cat#320331；批号SHBG2435V)
磷酸盐缓冲盐水(PBS，片剂)(Cat#P4417；批号SLCD5938)购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。
磷酸,85％(HPLC)(Cat#A260)
三乙胺(Cat#04884；批号011464)购自Thermo Fisher Scientific(Waltham,MA,USA)。
注射器式过滤器w/0.2μm孔径的醋酸纤维素膜(Cat#28145-475)购自VWR(Radnor,PA,USA)。
吐温20和吐温80来自EMD Millipore(Burlington,MA,USA)。
设备
以下实验中使用的设备与实施例A2中描述的相同。
程序
对西地那非水溶液和多种有机水性西地那非溶液进行了饱和溶解度筛选。为了确定西地那非在不同pH下的水溶液饱和溶解度，使用过量的枸橼酸西地那非药物活性成分，在室温下用“摇瓶”法制备溶液，用pH计调整pH值(在3.5-7.5之间)。之后，使用VWR 0.2微米过滤器过滤该溶液。滤液随后用HPLC测定西地那非的浓度，使用方法与实施例A2和B1中描述的伐地那非HPLC测定方法相似，使用他达拉非作为内标。
结果
西地那非HPLC检测的有效性是参照已验证的伐地那非试验(示例A2)，相对于质量控制样品和标准曲线进行评估。获得类似的结果，定量的下限是0.2μg/ml。
表10示出了西地那非在pH 3.5-7.5范围内在几种溶剂中的相关比较饱和溶解度。较低的pH值会出现较高的溶解度，而pH超过4.5时，其溶解度会大大降低。西地那非在不同pH的水溶液中的Jss比较见图8。根据这些数据，西地那非在水中的JsspHmax在pH 4.6下进行估算。然而，有代表性的有机水溶液在pH 4.2-4.5时的溶解度似乎是最佳的，这相当于在西地那非JsspHmax的范围(pH 4.2-5.2，如图8所示)。出于工业应用的实际考虑，表11和表12示出了西地那非在不同溶剂中在约pH 4.2和pH 4.5时的饱和溶解度。
表10：西地那非在不同溶剂中不同pH下的饱和溶解度*
*在室温和大气压下测定
表11：西地那非在约pH 4.2下在不同溶剂中的饱和溶解度*
溶液 饱和浓度 SD N
水 3.54 0.63 28
乳酸钙(3.5％) 8.62 4.37 2
醋酸/乳酸钙(1％/3.5％) 31.69 7.16 4
醋酸/乳酸钙(5％/3.5％) 47.27 1
NMP(10％) 6.98 1
醋酸/NMP/乳酸钙(1％/10％/3.5％) 49.20 2.25 4
醋酸/NMP/乳酸钙(5％/10％/3.5％) 37.21 5.46 8
醋酸/NMP/乳酸钙(20％/20％/3.5％) 90.89 12.66 2
醋酸/NMP/乳酸钙/吐温20/EtOH(5％/10％/3.5％/5％/10％) 55.77 1
醋酸(1％) 4.57 1
醋酸(5％) 12.86 0.91 2
醋酸/乳酸钙/四甘醇(1％/3.5％/20％) 51.22 1
醋酸/NMP/乳酸钙/吐温20(5％/10％/3.5％/10％) 43.89 1
醋酸/NMP/乳酸钙/吐温20(5％/10％/3.5％/20％) 46.40 1
醋酸/NMP/乳酸钙/吐温20/EtOH(5％/10％/3.5％/10％/10％) 48.26 1
醋酸/NMP/乳酸钙/吐温20/EtOH(5％/10％/3.5％/20％/10％) 44.83 1
乳酸钙/吐温20/EtOH(3.5％/5％/10％) 32.62 1
NMP/乳酸钙/吐温20/EtOH(10％/3.5％/5％/10％) 37.42 1
聚乙二醇/乳酸钙/吐温20/EtOH(10％/3.5％/5％/10％) 44.53 1
吐温20/EtOH(20％/10％) 7.59 1
吐温80/EtOH(20％/10％) 6.33 1
*在室温和大气压下测定
表12：西地那非在约pH 4.4下在不同溶剂中的饱和溶解度*
*在室温和大气压下测定
结论
如本文所公开的，与在纯水溶液中的溶解度相比，某些有机水性溶剂混合物，诸如乙酸/NMP/乳酸钙-水混合物，可以显著提高西地那非的溶解度(表11和表12)。西地那非的溶解度与pH值有关。根据我们的研究结果，饱和西地那非的溶解度可以通过增加有机溶剂浓度％来进一步提高。
如果鼻腔配方所需的西地那非的最小溶解度为42mg/ml(计算如实施例D1所示)，则西地那非水溶液的饱和溶解度在pH 4时低于5mg/ml，这不是西地那非鼻腔配方的合适溶剂。然而，已经确定了一些其他的有机水性溶剂或混合物，其溶解度在约pH 4时至少为42mg/ml(见表11和表12)，如果它们的渗透性值相似或高于西地那非水溶液的渗透性，则可能适用于西地那非鼻腔配方(见下文实施例D3的表13和表14)。
实施例D3
使用PAMPA筛选西地那非的渗透性和通量
本实施例描述了使用平行人工膜渗透性试验(PAMPA)测定西地那非的渗透性。
如本文所公开的，使用体外PAMPA筛选了室温和大气压下不同溶剂中西地那非的渗透性。AMPA预测了药物的被动吸收(22-24)。计量单位是稳定状态下获得的表观渗透率(Papp)，以cm/s表示。另外，另一个相关的计量是在特定的pH下的通量(Jss)，表示为每秒钟穿过单位面积的药物量，由Papp和饱和溶解度计算得出。
如本文所公开的，确定了pH对西地那非饱和水溶液的渗透性的效果。此外，也确定了在约pH 4.2和4.6下不同的有机水性溶液对提高饱和西地那非的渗透性的影响。在我们的研究之前，pH对不同有机水性溶液中的西地那非的渗透的影响是未知的，无法准确预测。
材料和设备
材料和设备与实施例B1中描述的相似，西地那非和溶剂与实施例D2中描述的相同。
程序
(a)溶液制备
通过使用增加量的西地那非制备不同溶剂中的西地那非盐酸盐三水合物饱和溶液(3ml)，并且将其调节到所需的pH(使用pH计，范围为3.5-6.0)，如上文实施例E2中所述。
(b)使用PAMPA的渗透研究
使用PAMPA与接收板和MultiScreen-IP过滤板进行西地那非的渗透研究，如在实施例B2下对伐地那非的描述。表13和表14示出了在pH 4.2和4.5下的不同溶剂中的西地那非。
(c)HPLC分析
供体或接收室中西地那非的浓度的制备与伐地那非的制备相似，HPLC测定的进行与实施例D2中描述的相似。
结果
表13和表14示出了在pH 4.2和4.5下的不同西地那非溶液中西地那非的平均Papp和Jss。
表13：在约pH 4.2下溶剂对西地那非渗透性和通量的影响*
*在室温和大气压下测定。#高于水中的Jss，或Jss(ref)和溶解度>42mg/mL。
表14：在约pH 4.5下溶剂对西地那非渗透性和通量的影响*
*在室温和大气压下测定。#高于水中的Jss，或Jss(ref)和溶解度>42mg/mL。
结论
正如本文所公开的，伐地那非的溶解度与pH有关。西地那非的渗透/渗透性会随着pH的增加(对应于理论上预计pH从2.25增加到7.0，更高的未电离物百分比)而增加(图8)。西地那非水溶液的药物通量在pH 4.5左右或pH 4.6左右看上去最佳。
根据每个鼻孔150μl或0.15ml或两个鼻孔0.3ml的鼻腔喷雾量，估计一个鼻腔西地那非剂量所需的Solmin为42mg/ml(12.5mg/0.3ml＝42mg)(见示例D1的计算)。
由于Jss(ref)＝JsspHmax(Solmin/Sil(ssol)pHmax)(见实施例B1中的公式推导)，在pHmax为4.5-4.6时，西地那非的水溶解度是3.34mg/ml(表10)，JsspHmax是1.83E-04μg/s/cm2，
Jss(ref)＝(1.83E-04)(42/3.34)＝2.3E-03μg/s/cm2。
同样地，如果在pHmax为4.2时进行估算，则西地那非的水溶解度是3.54mg/ml(表9)，JsspHmax是1.08E-04μg/s/cm2，
Jss(ref)＝(1.08E-04)(42/3.54)＝1.3E-03μg/s/cm2。
根据实施例A1、A2、B1和B2中描述的配方和方法，任何溶解度>42mg/ml且相应的Jss值>Jss(ref)1.3E-03至2.3E-03μg/s/cm2的西地那非有机水性混合物应符合鼻腔西地那非配方的要求。
已经发现在约pH 4.2时溶解度大于42mg/ml的一些有机溶剂，满足或超过西地那非Jss(ref)1.28E-03μg/sec/cm2，并且能够被视为适合鼻腔西地那非的配方(见表11)。同样地，已经注意到在约pH4.5时溶解度大于42mg/ml的一些有机溶剂，满足或超过西地那非Jss(ref)2.3E-03μg/sec/cm2，并且如果合适的候选物经过Calu-3研究进一步确认，能够被认为是适合鼻腔西地那非的配方(见表14)。
实施例D4
使用Calu-3细胞系筛选西地那非的渗透性
本实施例描述了使用Calu-3细胞系模型测定西地那非的渗透性。
如本文中所公开的，使用体内细胞系模型Calu-3(非小细胞肺癌细胞系)在37℃和大气压下对西地那非在不同溶剂中的渗透性进行筛选。
Calu-3细胞系模型测定的水溶性药物的Papp被证明与动物研究中在pH 7.4下测定的鼻腔吸收有关(25-26)。如本文所公开的，利用Calu-3细胞系模型来确认与在水中相比，各种有机水性溶液的西地那非Papp值的一致性。
材料
所用的材料与实施例B2中描述的伐地那非研究和E2中描述的西地那非溶液相似。
设备
所用的设备与实施例B2中描述的伐地那非研究的相似。
程序
(a)溶液制备
如前所述，制备了西地那非(1.5mg/mL)在6种不同的选定溶剂中的饱和溶液，并且将其调节到约pH 4.2或pH 4.5。在西地那非粉末溶解后，溶液在旋转平台上进一步混合过夜。之后，用0.2μm的过滤器过滤这些溶液。然后将滤液用于渗透研究。
(b)Calu-3的培养和单层的制备
该培养的进行与之前描述的[25-26]和实施例B2中的类似。
(c)使用Calu-3细胞系模型进行体外渗透/渗透性研究
TEER测定、生长培养基和程序与实施例B2中描述的相似。
(d)HPLC试验的准备和测量
来自接收室和顶端室的50μL样品与50μL 50％的MeOH和10μL内标混合，或用50μL培养基和内标稀释。离心后取上清液进行HPLC分析。HPLC分析按D2中所述进行。
(e)计算Papp
Papp，以cm/s为单位，使用实施例B2中描述的公式从HPLC分析的样品中计算得出。
结果
图9示出了PAMPA测定的与Calu-3测定的西地那非Papp的比较。鉴于数据点的数量较少，在最佳拟合线周围观察到相当多的分散点。由于该图的目的是比较西地那非(在有机水性溶液中获得)的Papp和通过PAMPA和Calu-3方法在水溶液中获得的Papp，在左下象限可以很容易地确定明显低于西地那非水溶液的Papp的值。所有其他点代表与水溶液中获得的值相似或更好的Papp值。尽管图9在左下象限示出了一个低点，它对应于乳酸钙(3.5％)-水溶液，但幅度不大，而且通过PAMPA或Calu-3分别测定的水溶液中的西地那非Papp与乳酸钙(3.5％)-水溶液中的西地那非Papp没有统计上的显著差异。
结论
在本实验中，由于每种溶液的浓度为1.5mg/ml，所以各溶液的相对Papp值也直接反映了相对Jss值。
由于西地那非在pH 4.2时的PAMPA Papp与pH 4.5时的接近，预计pH 4.2时的PAMPA Papp与Calu-3 Papp的关系与pH 4.5(图9)所示的类似。根据目前方法提出的西地那非在有机水性溶液中的溶解度和Papp要求以及西地那非在各种有机-水性溶液中的溶解度和渗透性结果，西地那非在pH 4.2或pH 4.5下在醋酸/乳酸钙(1％/3.5％)-水溶液、醋酸/乳酸钙(5％/3.5％)-水溶液和醋酸/NMP/乳酸钙(5％/10％/3.5％)-水溶液有望成为合适的西地那非鼻腔配方，
实施例D5
选择的磷酸二酯酶抑制剂在大鼠中鼻腔与口服给药的比较
这个实施例描述了(1)与口服途径相比，通过鼻腔给药的适当的配方，西地那非的生物利用度得到了改善，和(2)用于确定鼻腔西地那非配方所需的特定溶解度、Papp和浓度方面的目前提出的方法的确定。
鼻腔给药允许化合物绕过肝脏代谢，再加上快速的经黏膜渗透(如果使用适当的配方)，与口服给药相比，能够导致更快的吸收(更快的峰值浓度时间或Tmax)、更高的峰值浓度(Cmax)和更大的生物利用率。西地那非的首过肝脏代谢率很高，可以从鼻腔给药中获益。适当的配方对于实现鼻腔给药的Cmax、Tmax和生物利用度的提高至关重要。因此，根据目前的方法，需要为鼻腔西地那非配方提供特定的溶解度、Papp和浓度。在该研究之前，某些有机水性配方(水含量大于50％)对适合鼻腔配方的西地那非溶解度和Papp的影响是未知的。D5项下的本项工作是为了确认所提出的用于西地那非的方法的应用，以取得鼻腔配方的优异的结果。
程序
西地那非的水溶液和有机水性溶液的制备使用如上描述相同的方案。插入颈静脉插管的斯普拉格-杜勒大鼠(Sprague Dawley rat)是从Envigo RMS，Inc.(Indianapolis,IN)订购。抵达后，在药代动力学研究之前，将大鼠调整到卫生科学西部大学(the WesternUniversity of Health Sciences)的动物饲养场环境中一周。麻醉和研究程序与之前发表的研究类似(29)。根据所提出的方法，基于其适合鼻腔配方的溶解度、渗透性和的浓度，总共选择了3种西地那非配方。所有的3种配方(见表)都通过鼻腔途径给药，其中一种经由灌胃的口服(PO)途径给药。
根据对伐地那非的大鼠研究(见实施例C2)，配方的给药是随机的，每一种治疗有2只大鼠接受，一周后交叉进行。在0、2、5、10、15、20、30、45、60、120、180min时从每只大鼠获得200μL的血液(接受口服配方的大鼠跳过2分钟时的样本)。在完成所有血液取样后，离心样品，收集血浆并且储存，以使用液相色谱-串联质谱法(LC/MS/MS，Sciex API4000和安捷伦HPLC 1200系统)进行分析。试验使用大鼠血浆构建标准曲线，他达拉非用作内标(IS)。试验程序类似于伐地那非试验(参见实施例C3下伐地那非血浆浓度的测定)。
结果
大鼠血浆中西地那非浓度测定试验的标准曲线显示了良好的相关系数(对于浓度2ng/ml–500ng/ml，R2＝0.9924-0.9976)。测试的4个质量控制(QC)，QC样品的准确度范围在 96-100％之间。精确度或CV在1.9-4.6％之间。表15示出了西地那非的配方和接受鼻腔剂量和经口剂量的大鼠数量。表16示出了鼻腔和口服给药配方的药代动力学。如表16所示，在归一化为mg/kg剂量时，与通过口服途径给药的一个配方相比，通过鼻腔途径给药的鼻腔配方的Cmax和AUC明显更高。对于同样的配方，通过鼻腔与口服途径给药，鼻腔给药的AUC高出6倍。与口服途径相比，鼻腔途径的Tmax也明显缩短。鼻腔与口服给药之间的Cmax或Tmax的平均差异超过10倍。在鼻腔途径给药的3种配方中没有观察到这些参数的明显差异。
表15：包含西地那非的配方对大鼠进行经口或鼻腔给药
# 配方 N 途径 剂量
F1 醋酸/乳酸钙(5％/3.5％) 5 IN 0.84mg
F1 醋酸/乳酸钙(5％/3.5％) 4 PO 1.69mg
F2 醋酸/NMP/乳酸钙(5％/10％/3.5％)； 6 IN 0.76mg
F3 醋酸/乳酸钙(1％/3.5％) 4 IN 0.76mg
表16：西地那非鼻腔喷雾剂和口服片剂在大鼠中的药代动力学参数(数据以平均值±SD表示)
F1＝乙酸/乳酸钙(5％/3.5％)；F2＝乙酸/NMP/乳酸钙(5％/10％/3.5％)；F3＝乙酸/乳酸钙(1％/3.5％)；*鼻腔治疗与口服治疗比较，P＜0.05
讨论和结论
鼻腔途径和口服途径的相对生物利用度(AUC)、Cmax(峰值浓度)和Tmax(Cmax的时间)的结果有明显不同，并且与实施例A1、A2、B1和B2中描述的通过该新方法确认的鼻腔配方的预期结果一致。因此，这些大鼠数据进一步证实了该识别所期望的鼻腔配方的方法的有效性和实用性。
实施例E
提高一种或多种磷酸二酯酶抑制剂和其他可电离碱性/酸性药物穿过黏膜的渗透 和通量的配方
本实施例描述了用于提高一种或多种磷酸二酯酶抑制剂经黏膜的溶解度和渗透(通量)的配方。
如本文所公开的，基于实施例A1、A2、B1、B2中描述的方法，所确定的配方包括在pH4.0下溶解于由乙醇和PEG 400组成的有机水性溶剂中的磷酸二酯酶抑制剂伐地那非，其中相对于磷酸二酯酶抑制剂在水中的溶解度，该有机水性溶剂增强了磷酸二酯酶抑制剂的溶解度。这个配方包括12％的乙醇作为成分。在其他替代方案中，该配方可以包括任何醇类，诸如甘油，并且可以具有5％至40％的任何浓度，包括25％和30％。如本文所披露的，该配方的有机水性溶剂包括另一种成分，15％的PEG 400。在其他替代方案中，该配方可以包括浓度1％至20％之间的任何聚醚或聚乙二醇诸如PEG 6000。正如本文所公开的，该配方的pH为4.0。在其他替代方案中，该配方可以具有3.5至7.5之间的任何pH。如本文中所公开的，该配方的磷酸二酯酶抑制剂是伐地那非。在其他替代方案中，该配方可以包括按类似于实施例A1、A2、B1和B2所描述的配方和方法确定的合适的有机水性溶液中的其他药物。然后，该配方将鼻内给药给受试者，用于治疗勃起功能障碍或其他适当的疾病。鼻内给药将允许配方接触受试者的黏膜。在其他替代方案中，通过对受试者进行舌下给药，使黏膜与配方接触。
关于本文中基本上任何复数和/或单数术语的使用，本领域的技术人员可以根据适合的环境和/或应用，将复数转化成单数和/或将单数转化成复数。为了清楚起见，各种单数/复数的排列组合可以在此明确提出来。
除非上下文另有要求，在本说明书和权利要求书中，词语“comprise(包括)”及其变体，如“comprises”和“comprising”，可与“includeing(包括)”、“containing(包含)”或“characterized by(以……为特征)”互换使用，是包括性的或开放式语言，不排除额外的、未提及的元素或方法步骤。
短语“由……组成”排除了权利要求中未指明的任何元素、步骤或成分。
短语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制在指定的材料或步骤以及那些不会对所要求的发明的基本和新颖特征产生实质性影响的材料或步骤。本公开内容设想了本发明配方、组合物和方法的与这些短语中的每个短语的范围相对应的实施例。因此，包括所提及的元素或步骤的配方、组合物或方法设想了特定的实施方案，其中该配方、组合物或方法基本上由或由这些元素或步骤组成。
凡是在本文中公开的组合物或配方的使用方法(例如，治疗勃起功能障碍的方法，包括给予配方或包括使黏膜与配方接触)，也明确考虑了供使用的相应的组合物或配方。例如，对于一种治疗勃起功能障碍的方法的公开，包括施用配方或包括使黏膜与一种包括有机水性溶剂中的一种或多种磷酸二酯酶抑制剂的配方接触，也考虑了用于治疗勃起功能障碍的相应组合物或配方。
在本说明书中提到“一个实施例”或“实施例”或“一个方面”是指与该实施例有关的描述的特定特征、结构或特性被包括在本发明的至少一个实施例中。因此，本说明书各处出现的短语“在一个实施例中”或“在实施例中”，不一定都是指同一个实施例。
此外，特定的特征、结构或特性可以以任何合适的方式组合在一个或多个实施例中。
上面描述的各种实施例可以组合起来，以提供另外的实施例。根据上述详细的描述，可以对实施例进行这些和其他的改变。一般来说，在以下权利要求中，所使用的术语不应解释为将权利要求限制于说明书和权利要求书中披露的具体实施例，而应解释为包括所有可能的实施例，以及这些权利要求享有的全部等同物的范围。因此，权利要求不受公开内容的限制。
虽然本文中已经公开了各个方面和实施例，但对于本领域的技术人员来说，其他方面和实施方案也是显而易见的。本文中公开的各个方面和实施例是为了说明目的，而不是为了限制，真正的范围和精神由以下的权利要求来表明的。

Claims (38)

1.一种用于增强伐地那非穿过鼻黏膜的渗透的配方，其包括
(a)伐地那非；和
(b)包括醇、聚醚、二乙二醇单乙醚、中链甘油酯、一种或多种饱和聚糖化C8-C10甘油酯、或其组合的有机水性溶剂；
(c)其中所述配方的pH是约3.5至约8.0，并且其中相对于伐地那非在水中的溶解度，所述有机水性溶剂增强伐地那非的溶解度。
2.如权利要求1所述的配方，其中所述有机水性溶剂包括醇。
3.如权利要求2所述的配方，其中所述醇是乙醇或甘油。
4.如权利要求3所述的配方，其中所述乙醇的浓度是5％至40％。
5.如权利要求4所述的配方，其中所述乙醇的浓度是12％、25％或30％。
6.如权利要求1所述的配方，其中所述有机水性溶剂包括聚醚。
7.如权利要求6所述的配方，其中所述聚醚是聚乙二醇。
8.如权利要求7所述的配方，其中所述聚乙二醇是PEG 6000或PEG 400。
9.如权利要求7-8中任一所述的配方，其中所述聚乙二醇的浓度是1％至20％。
10.如权利要求9所述的配方，其中所述聚乙二醇的浓度是5％。
11.如权利要求1-10中任一所述的配方，其中所述配方的pH是约3.5至约8.0。
12.如权利要求1-11中任一所述的配方，其中伐地那非与用于治疗勃起功能障碍的一种或多种其他活性成分组合提供。
13.如权利要求12所述的配方，其中所述一种或多种其他活性成分包括另一种磷酸二酯酶抑制剂。
14.如权利要求13所述的配方，其中所述其他磷酸二酯酶抑制剂是西地那非。
15.如权利要求13所述的配方，其中所述其他磷酸二酯酶抑制剂是他达拉非。
16.一种治疗有需要的受试者的勃起功能障碍的方法，其包括使所述受试者的鼻黏膜接触如权利要求1-15中任一所述的配方，从而治疗所述受试者的勃起功能障碍。
17.如权利要求16所述的方法，其中接触所述黏膜包括鼻腔给药。
18.如权利要求16所述的方法，其中接触所述黏膜包括舌下给药。
19.一种如权利要求1-15中任一所述的配方的制备方法，其包括：
将伐地那非添加到所述有机水性溶剂中；和
将包括伐地那非的所述有机水性溶剂的pH调节至约3.5至约8.0。
20.如权利要求19所述的方法，其中相对于伐地那非在水中的溶解度，伐地那非在所述有机水性溶剂中的溶解度增加。
21.如权利要求19所述的方法，其中相对于伐地那非在水中的渗透，伐地那非在所述有机水性溶剂中穿过鼻黏膜的渗透增加。
22.如权利要求19所述的方法，其中相对于伐地那非在水中的生物利用度，伐地那非在所述有机水性溶剂中的生物利用度增加。
23.如权利要求19-22中任一所述的方法，其中所述有机水性溶剂包括醇。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述醇是乙醇或甘油。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述乙醇的浓度是5％至40％。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述乙醇的浓度是12％、25％或30％。
27.如权利要求19-22中任一所述的方法，其中所述有机水性溶剂包括聚醚。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述聚醚是聚乙二醇。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述聚乙二醇是PEG 6000或PEG 400。
30.如权利要求28-29中任一所述的方法，其中所述聚乙二醇的浓度是1％至20％。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述聚乙二醇的浓度是5％。
32.如权利要求19-31中任一所述的方法，其中所述配方的pH是约3.5至约8.0。
33.如权利要求19-32中任一所述的方法，其中伐地那非与用于治疗勃起功能障碍的另一种活性剂组合。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述另一种活性剂是另一种磷酸二酯酶抑制剂。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述其他磷酸二酯酶抑制剂是西地那非。
36.如权利要求34所述的方法，其中所述其他磷酸二酯酶抑制剂是他达拉非。
37.一种用于增强伐地那非穿过鼻黏膜的渗透的配方，其包括如权利要求1-15中任一所述的配方。
38.如权利要求37所述的配方，其通过鼻腔给药用于治疗勃起功能障碍。
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