CN1165618C - 多核苷酸免疫原性剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多核苷酸免疫原性剂，它能引起针对表皮生长因子受体(EGFR)家族成员的免疫应答。

Description

多核苷酸免疫原性剂
发明领域
本发明涉及一些可作为免疫原性剂的表达载体，它们编码部分或完整长度的erbB蛋白(EGF受体)，尤其是her2/erbB-2/neu受体。
更具体讲，本发明涉及上述载体用于制备引起宿主细胞特异性免疫应答的药物的应用。
发明背景
已知有多种不同的表皮生长因子受体(EGFR)，如EGFR1，HER-2/neu，HER-3，HER-4等。尤其是HER-2/neu已经被提出作为肿瘤治疗的靶点(WO 90/14357)。
原癌基因HER-2/neu编码一种185kDa的膜受体蛋白(p185)(Schechter.A.等，1984，自然(Nature)312/513)。
HER-2/neu的功能目前尚不十分清楚，但似乎与酪氨酸激酶的活性增强有关(Di Fiore.P.等.1990分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)10：2749)。
已经提出用不同配体与这一受体相结合，依据配体种类与/或实验条件的不同，它们能介导兴奋性及抑制性信号(Peles.E.等.1992细胞(Cell.)69：205)。
HER-2/neu在胎盘形成及器官发生时期表达(Kokay.Y等.1987美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)84：8498；Knezevic V.等.1994 J.Anat.1985：181)。在许多具上皮/腺体的成熟组织中可以检测到少量该受体(Press.M.等.1990癌基因(Oncogenes.)5：953)。
p185的突变或过量表达与肿瘤的致病机理有关。点突变会导致原癌基因的激活(Bargmann.C.& Weimberg R.A.1988 EMBO J.7：2043)。在人类中尚未发现这类突变，但是已经在腺体源性的癌症中发现(如乳腺、卵巢、肺及肾脏的腺体癌)，肿瘤转移活性与具有正常结构的p185的扩增或过量表达有关。
p185的扩增与乳腺癌患者的预后不良有关(Yokota.J.等.1986 Lancet.I.765；Slamon.D.J.等.1987科学(Science)，235：1772；Yonemura.Y.等，1991.癌症研究(Cancer Research.)51：1034，Gustarson.B.A.等人.1992.欧洲癌症杂志(Europ.J.Cancer.)28：263)。
近来的研究还提出该受体过量表达与药物抗性现象有关。
事实上过量表达HER-2/neu的癌症对5-氟尿嘧啶治疗不敏感(Paikj S.M.等.1991美国癌症研究会进展(Proc.Am.Assoc.Cancer Resear.)32，291)。转染实验已证明了这一点，乳腺癌细胞系在导入HER-2/neu后对他莫昔芬和顺铂有了抗性(Benz C.C.等.1992乳腺癌的研究治疗(BreastCancer Research Treat.)24，84)。
处于乳腺癌I期的患者，虽有良好的预后，但也有免疫化学方法可检测到的HER-2/neu，这些患者化疗之后又会复发(Alfred D.C.等.1992 J.Clin.Onc.10，599和Gusterson B.A.等.1992 J.Clin.Onc.10，1049)。而且，抗HER-2/neu的抗体可增加顺铂及肿瘤坏死因子(TNF)对乳房及卵巢癌的细胞毒性(Hancock M.C.等，1991，癌症研究，51，4575和HudziacR.M.1989分子细胞生物学9，1165)。另一方面，在抗药性细胞系中，EGFR数量增加(Meyers M.B.等.1986美国国家科学院进展83，5521)，针对上述受体的抗体增强了药物的细胞毒性效果(Aboud-Pirak E.等.1988国家癌症研究所杂志(J.Natl.Canc.Inst.)80，1605；Baselga J.等.1993国家癌症研究所杂志85，1327)。
类似于抗体，EGF也可增加烷化剂如顺铂、电离射线、丝裂霉素C、5-氟尿嘧啶、阿霉素的细胞毒性效果：(Christen R.D.1990临床调查杂志(J.Clin.Inv.)86，1632；Kowk T.T.等.1989国家癌症研究所杂志81，1020；Amagase H.等.1990药物动力学杂志(J.Pharm.Dyn.)13，263；AmagaseH.等.XXX日本癌研究杂志(Jpn.J.Canc.Res.)80.670；Kowk T.T.等.1991 Int.J.Cancer 49，73)。
p185在正常上皮组织中少量表达，而在癌组织中大量表达，因此可推出在被动免疫治疗中，此受体可以作为靶抗原(例如可以用单克隆抗体来治疗)。比如已经知道某些抗p185的单克隆抗体在体外及裸鼠中都能抑制乳腺癌细胞的生长(Marx.J.1993科学259：226)。
最近已经证实，抗erbB-2单克隆抗体可以通过对受体本身进行下调而具有抑制肿瘤细胞的效果(Katsumatu M.等，1985，自然医学(NatureMedicine)1：644-648)。
虽然已经提出用主动免疫(疫苗接种)来中和这种靶抗原，但这种方法的缺点是被引发的免疫反应有可能对正常表达这种抗原的上皮组织有毒性。
另一方面，将体内导入只表达neu原癌基因胞外部分的重组痘病毒，可以完全、特异地抑制表达这种抗原的肿瘤细胞而保护小鼠(Bernards R.等.1987美国国家科学院进展84：6854)。
由于在肿瘤发生和胚胎发育过程中，生长因子及其受体作为自分泌及旁分泌调节循环起重要作用，因此基于这两个发育过程的实验模型对本发明的目的尤为重要。
发明概要
本发明涉及基本纯的cDNA在制备用于肿瘤免疫治疗的致免疫药物中的应用，这些cDNA编码同源性源HER-2/neu，或其它EGF受体，或上述受体的部分序列。
本发明也涉及包含有一种上述cDNA的表达载体如质粒。
本发明也涉及上述cDNA在分离筛选用于产生特异单克隆抗体的B-淋巴细胞中的应用。
附图简述
图1 pCDneuNT构建体
图2 pCDneuNT免疫对妊娠的影响
Swiss(远交系)雌性小鼠(3至6只)用pCDneuNT免疫，最后一次加强给药两周后，与雄性小鼠交配一天。通过阴道涂片上精细胞的存在来分析交配情况(妊娠第一天)，报道的数据涉及怀孕过程中个体生长速率。1、2号小鼠未经免疫(对照)。
发明的详细描述
按照本发明，通过体内注入编码EGFR、尤其是HER-2/neu的非感染性cDNA可引发用于抗肿瘤治疗的免疫应答。
事实上，这种治疗方法能显著减小肿瘤块，并能抑制实验诱发的同系肿瘤的生长。
妊娠模型也证实了这种体内免疫的效果，事实上，胚胎发育与肿瘤发生具有某些相关联的生物学特点，至少在它们的起始阶段是这样。例如这一时期erbB-2/neu基因的表达量增加。
实际上已证实妊娠小鼠体内的免疫应答选择性地抑制了这种抗原，从而阻碍了胚胎发育。但是对已分化的成熟上皮组织则没有或只有极微弱的细胞毒性。依据这一特异性细胞毒性效果，上述选择性与抗p185抗体的产生有关(这些抗体识别受体胞外结构域上的抗原决定簇)，而且还表现出对甲醛异乎寻常的抗性。这种选择性通过下列实验也得到进一步证实：抗体能与pCDneuNT质粒转化的NHI-3T3成纤细胞以及过量表达c-erbB-2的乳腺肿瘤细胞系SK-BR3进行反应，人乳腺浸润性导管癌及neu转基因小鼠结状乳腺癌样品进行的组织学染色也可证明这一点。
由于在肿瘤发生和胚胎发育这两个过程中，免疫反应引起的抑制作用令人惊异地仅局限于正在发育组织中过量表达erbB-2/neu的结构，而对已分化的组织无效，因此可认为用编码EGFR的序列进行DNA疫苗接种能作为一种特异而有效的抗肿瘤疗法。
与已知免疫疗法相比，本发明有几个优点，例如与被动注入单克隆抗体相比，导入多核苷酸不仅可以引发抗体的产生，还能够引起具有细胞毒性的CD8+MHC I型T-淋巴细胞的产生和扩散。
另一种免疫疗法是导入某些含特异序列的肽，这些序列是引起免疫应答的蛋白的抗原决定簇。甚至与这种疗法相比，本发明也具有显著的优点，即它不局限于特定的同种异型，因为针对隐性亚优势抗原决定簇的潜在T细胞可被同源性外源抗原激活，以在各主体中获得根据其自身的同种异型自动选择的Th免疫应答。
而且由于抗原浓度低时传统免疫能产生高度亲和性的抗体，因此正如在多核苷酸免疫实验中所观察到的，低浓度抗原的表达能使免疫起始阶段就产生高亲和性抗体。
与使用病毒载体进行免疫相比，用裸DNA进行操作更为安全。因为：1)DNA无传染性，2)抗原性DNA不会整合到宿主染色体中(表达载体以游离体形式存在约一周)。
病毒免疫产生的细胞毒性会减少表达病毒抗原的宿主细胞数量。
更不利的是很多病毒对宿主的转录因子有负调控作用，这一方面会减少细胞表面MHC I型分子的表达量，另一方面妨碍胞内蛋白的正常加工，同样也会减少MHC分子上抗原决定簇的数目。因而本发明的另一优点是抗原DNA序列更易于获得和控制。
按照本发明，可用已知方法制备这种免疫原性剂。由于EGFR或HER-2/neu的DNA序列已知，因此可用传统的PCR、重组DNA等方法制备。也可选择使用嵌合结构或基因的部分序列，只要其表达产物具有合适的免疫原性就行。例如可以把EGFR DNA与一段或几段调控序列(启动子及复制起始区)相连接，使之能在动物组织或用于该制备方法的微生物中得到表达。上述调控序列可以从质粒或病毒获得，如SV40或巨细胞病毒(CMV)或Rons肉瘤病毒(1994年9月29日的WO 94/21707)。
该制剂可按已知方法给药(Donnelly J.J.等.1994，The immunologist2∶1)
DNA肌肉注射被认为是治疗传染性疾病的一种新的免疫接种方法，除此方法，其它DNA导入途径也是可行的，如非肠道的及粘膜途径(美国国家科学院进展1986 83，9551；1990年10月4日的WO 90/11092)。DNA也可以吸附于微金颗粒上，通过发射装置透皮给药(Johnston，1992自然356，152)。
而且如同前面所讨论的，这一免疫方法在制备具有体内生物活性的单克隆抗体方面有显著优点。事实上，用含有上述癌基因或相关原癌基因(neuNT，neu)的DNA对动物进行免疫后，可以直接从其脾中分离到淋巴细胞系以用于制备单克隆抗体。与之相似，所述疫苗可用于从人外周血分离淋巴细胞系以制备单克隆抗体，在被动免疫中作为佐剂，可与有细胞毒性的分子进行结合。
实施例：
1.1 pCDneuNT表达载体的克隆
所有的DNA酶切操作、重组体的克隆及鉴定均严格按照Maniatis的方法(《基因克隆》)。质粒pSV2neuNT含有编码全部neuNT产物蛋白的cDNA(ref，Weinberg)，用HindIII，Sal I及EcoR I酶切这一质粒。EcoR I酶切后可产生原质粒(PSV2neo)的两个片段，Hind III/SalI双酶切则产生完整长度的cDNA(约4600bp)，再将这一Hind III/Sal I双酶切片段克隆进预先经Hind III/Sa lI双酶切的中间载体pSP64。如前所述再对重组质粒pSP64neuNT(Amersham)进行克隆及鉴定。pSP64neuNT经Hind III/EcoR I双酶切产生两个片段：1)3000bp片段(pSP64)，2)约4600bp片段(neuNT)，将片段2再克隆到预先制备并经Hind III/Sal I双酶切的pCDNAneo中，最后得到了可应用于免疫过程的重组载体。
1.2小鼠及大鼠的免疫
将几种小鼠(雌性远交系Swiss，CD1，Balb-c，近交系FVBN，Balb-cH2 D)按0.3ml/100g体重的剂量用戊巴比妥-Equithesinain麻醉后，用胰岛素注射器(1ml)注射100μl溶有DNA的盐溶液(1mg/ml)，免疫注射共分三次进行，每次间隔两周。Wister大鼠也用同样的方法免疫。
1.3抗原的体内表达
为证明pCDneuNT质粒在体内表达了neuNT抗原，注射完毕后48小时杀死动物，完整取出其四头股肌，加入蛋白抑制剂和非离子去垢剂匀浆。提出总蛋白，按标准步骤进行斑点杂交，用单特异性兔多克隆抗neuIgG抗体(K15)SC-07(Santa Kruz Biotecnology，USA)来检测p185抗原(斑点杂交及所有下述其它免疫化学技术的操作都引自《抗体：实验操作手册》1988，冷泉港实验室Ed.Harlow/Darid Lane)。
实验结果表明，只有从注射pCDneuNT的动物肌肉中提取的蛋白才能与抗p185抗体结合，而注射对照质粒则不行。因此，pCDneuNT质粒能够指导肌肉纤维中p185分子的合成。
1.4宿主体内的免疫反应性
i)小鼠
已知与外源抗原反应的能力很大程度上依赖于实验动物的种系。关于大鼠neu在小鼠体内的免疫原性，据文献报道(Bernards R.等1987.美国国家科学院进展89：6854-6858)，用病毒疫苗免疫后，能针对原癌基因胞外结构域(ECD)产生抗体的仅限于属于杂合种群的宿主。因此有必要在以这一基因进行免疫后，检测不同种系动物的抗p185的免疫反应性。
八周龄的实验动物(远交系Balb-c，CD1，Swiss，近交系Balb-c H2 D或FVBN小鼠)按前面所述步骤注入100ug对照质粒或等量的pCDneuNT质粒。对照质粒来源于从相同实验动物取出的免疫前血清。
用Western杂交检测抗p185抗体的产生及其特异性，以pCDneuNT转化的3T3细胞裂解产物作为抗原来源(Bernards R.等1987.美国国家科学院进展84：6854-6858)。结果表明，纯种及杂种小鼠均能识别pCDneuNT免疫产生的大鼠蛋白。
通过对过量产生受体的转基因MMTV、neuN小鼠的乳腺瘤进行免疫化学分析，进一步证实了抗原抗体复合物的形成(C.T.Guy等.1992 PNAS 89：10578-582)。
用前面所述方法制备MMTV、neuN转基因小鼠的乳腺瘤组织切片(3-5u)，并加入用pCDneuNT或对照质粒免疫后的抗血清孵育(稀释度1/30)，而后加入与过氧化物酶(1/100稀释)结合的羊抗小鼠抗体，结果只有pCDneuNT抗血清才能在肿瘤细胞膜上形成清楚的着色区。
ii)大鼠
pCDneuNT免疫小鼠是一种典型的异源免疫反应，因为它是一种动物(大鼠)的免疫原性蛋白在另一种动物(小鼠)宿主中引起反应。为证实基因在完全同源的系统中是否可以引起抗p185免疫反应，按照与小鼠免疫相同的方法，把pCDneuNT质粒注入大鼠(远交系)。结果表明，既使将导入质粒的量增至0.8mg也没出现抗p185血清阳性。这一结果与报道相一致(Bernards R.等.美国国家科学院进展84：6854-6858 1987)，并进一步证实鼠模型对自身抗原具有更强的耐受性(相对于人)(Floughton A.N.实验医学杂志(J.Exp.Med.)180：1-4(1994))。如果用同样或其它方法同时注射载体与药物，仍有可能减少或消除针对自身p185的耐受现象。
1.5抗体特异性
i)抗大鼠p185 IgG作为自身抗体
如果注入大鼠pCDneuNT能引起抗大鼠受体的抗体产生(抗neuNT反应)，那么单从系统原因考虑，同样可认为小鼠抗体应该能识别小鼠自身的受体(自身抗原)，也能识别同源的人的erbB-2，组织化学方法已经证实了小鼠抗p185循环抗体与自身抗原发生免疫反应。
如同成年大鼠一样，小鼠中neu原癌基因在上皮/内分泌组织如肺、肝、肾、肠及表皮细胞底层中是生理上正常表达的(Knerewik V.等.1994 J.Anat.181：1985)。在实验中，用过量醚蒸气处死动物。按照Carnoix的方法，用其组成型表达erbB-2/neu的组织(如肾)来制备组织切片(3-5μ)，并进行标准的组织学分析。样品加入抗p185抗血清或对照血清(1∶60稀释度)孵育，然后加入与碱性磷酸酶(1/100稀释)结合的羊抗小鼠抗体，结果清楚表明：a)p185循环抗体能针对同种动物肾细胞反应，b)对照质粒pCDNA-3免疫产生的抗体不能识别同种细胞。将小鼠肾匀浆抽提物与上述免疫小鼠血清或兔抗neuK15 SC-07抗体混合孵育，进行Western杂交，证实了鼠p185可作为靶抗原的特性。
ii)抗大鼠p185 IgG与人受体的交叉反应
对过量表达p185crbB-2的人乳腺瘤细胞系衍生的SKBR3细胞(106受体分子/细胞，Kraus M.H.等.1987 EMBO J.6：606-610)进行免疫荧光显微检测，证明经pCDneuNT免疫的小鼠产生的抗p185抗体可以识别人的与p185同源的erbB-2蛋白。
SKBR3细胞经盖片培养后，用冷甲醇/丙酮混合物(1∶1 V/V)固定(渗透细胞)，或用2％多聚甲醛固定(非渗透细胞)，制成载片，然后把细胞样品与抗p185抗血清(1/30终稀释度)混合孵育，用与荧光素FITG(Boehringer)(1∶60)结合的绵羊抗小鼠IgG抗体可证实抗原抗体反应的发生。载片置于激光同焦显微镜上检查(BioRad MRC800K)(三重氩气激光，60×油浸物镜)。
经检查，非渗透细胞的反应中，荧光较强并以分散方式分布于质膜的细胞外侧部分；渗透细胞的反应中，荧光只分布于核周区域。这说明抗p185抗体是由能分别识别抗原胞内及胞外结构域的免疫球蛋白组成的混合物。
把SKBR3，T23.1(反转录病毒erbB-2DNA转染的3T3NIH成纤维细胞)及对照3T3细胞的溶胞产物进行Western杂交，证实鼠抗p185抗体能识别人的同源抗原。用与辣根过氧化物酶-链霉亲和素(1∶200)结合物相反应的生物素化羊抗小鼠IgG抗体(Santa Cruz Biotechnology Inc)来检测，结果证明，在pCDneuNT免疫的小鼠血清中有抗p185抗体。
抗p185抗体能与人erbB-2反应，还可识别这一蛋白的胞外结构域(即使经历强烈的固定过程)。由这一结果可推出下列可能性：即利用这些抗体来检测一些人乳腺癌中erbB-2/neu的过量表达。
21例导管浸润性肿瘤经外科切除后得到其病变组织样品(来源于Macerata的Ospedale Civile的病理解剖部)，将样品按与鼠组织同样步骤进行固定，用石蜡块包埋，制成切片后进行组织化学检测。
这21份样品以绝对成熟的方法加入商品抗体进行反应时，都呈erbB-2阳性结果，当用pCDneuNT免疫的雌性小鼠的血清进行免疫反应时，有8例呈现抗p185的免疫反应阳性。
为证实小鼠抗erbB-2/neu抗体能否与EGFR家族的其它成员反应(如EGFR-1)，将小鼠抗体与细胞表面高表达EGFR-1受体分子(2-3×106个/细胞)的人A431表皮癌细胞系混合孵育。通过荧光激光细胞分类扫描(FACSscann)对抗p185neu抗体与p170ECFR-1的免疫反应进行荧光免疫分析。分别制备抗原及抗体的对照，以淋巴细胞CEM(从一个急性淋巴细胞白血病人中分离衍生而来，不表达EGFR-1)作为阴性对照，以对erbB-2/neu的胞外结构域专一且不与EGFR-1抗原交叉反应的单克隆抗体W600作为阳性对照(Dr.P.G.Natali，Istituto di ricerca sperimentale Regina Elena，Roma)。细胞样品与二次免疫的与荧光素异硫氰酸(FIT)结合的抗小鼠抗体混合孵育后，用Bekton Dickinson FACS进行检测(氩激发激光488nm，发射光在525nm)，结果清楚地表明，免疫小鼠抗血清中的抗p185抗体与W600单克隆抗体呈同样的反应性质，亦即它们都不与p170ECFR-1发生反应。
1.6 p185抗血清的体外活性
抗p185血清对SKBR3细胞生长的抑制作用
以103细胞/平皿的浓度将SKBR3细胞加入35mm培养皿，加入30μl(约300μg总IgG)抗p185抗血清及对照血清(第零天)，一周后取出平皿中细胞用血球计数器计数。结果表明pCDneuNT免疫小鼠中提出的IgG同型免疫球蛋白能抑制SKBR3细胞生长。
1.7免疫接种的生物学效果
i)免疫疗法的毒性
用以高浓度牛胸腺双螺旋DNA作抗原的商品ELISA试剂盒(INOVDiasgnostics Inc；San Diego.CA)，证明进行DNA疫苗免疫后，不产生抗DNA循环抗体。没有观察到IgM与IgG含量的特别变化。
对血色素、VES白细胞系列，蛋白血等血液学及血清学参数进行检测，结果均在正常范围内。
ii)组织病理学检测
由于免疫过的动物具有能与自身组织neu受体反应的循环抗体，因此有可能发生自身免疫病。介导这一过程的可以是补体系统(补体依赖性细胞毒性CDC)与/或天然杀伤细胞(抗体依赖的细胞毒性ADCC)(Stribling等.美国国家科学院杂志89：11277-11281(1992))。
为证实这一假说，用过量醚蒸气处死实验动物，取出组成型表达erbB-2/neu的组织(肾、肠、卵巢、胎盘、乳腺)，用传统方法固定，包埋入石蜡块，按上述标准步骤制成切片(3-5μ)，脱蜡，然后用苏木精及伊红染色。
对pcDNAneuNT免疫的动物重复进行了组织学检测，结果在免疫小鼠中均未发现即使是最微小的病变(如坏死区，淋巴细胞浸润或其它)，因而可以说DNA免疫不会产生明显的系统或组织水平的毒性。虽然动物的确有自身受体的抗体，但未观察到系统或器官特异的自身免疫病现象。
现概括如下：i)免疫治疗后一年动物仍可正常进食，ii)动物毛皮质量优良，个体及社会行为无改变，iii)几种血液学参数均正常，iv)组织学检测未发现表达neu的组织有病变，v)免疫疗法未产生可以检测到的抗DNA的循环抗体IgM及/或IgG的增加。
iii)pCDneuNT免疫接种对小鼠妊娠的影响
83％的免疫雌性Swiss小鼠(n＝16)产生抗p185循环抗体。将10只血清阳性雌鼠与雄鼠同笼进行交配，此后(妊娠第一天后)通过阴道涂片上的精细胞来确定交配。孕鼠体重每两天记录一次，其中七只表现出每胎子代数量的减少(5±2只，对照组为13±3只)，而其余三只切除子宫检查后发现胚胎全部被重吸收。
更为重要的是上述免疫疗法对近交系小鼠如Balb/c H2 D的影响，免疫后的动物都表现出抗p185抗体的明显增加。19只免疫雌鼠中有14只根本未产下幼鼠，而其余5只仅产下数目很少的子代(1-2只)，而对照组15只鼠均产下18±3只后代。
与上述结果相反的是，未免疫小鼠与经对照质粒免疫的小鼠或pCDneuNT免疫的大鼠(同源基因免疫)在受胎能力方面没有明显差异。
iv)乳房组织及胎盘的组织病理学检测
7只p185血清阳性孕鼠在妊娠第18天杀死，用于进行胎盘及乳腺的组织学检测。如前所述对富尔马林固定组织的切片(3-5μ)进行染色。所有标本中均未发现组织(病理学)病变。
v)对小鼠肿瘤的效果
为证实针对erbB-2/neu的免疫接种对过量表达这种原癌基因的肿瘤的治疗效果，按下述步骤诱发远交系小鼠的肿瘤：Swiss CD1小鼠免疫周期结束两周后，将CMVneuNT转染的、细胞表面大量表达受体的NIH3T3成纤维细胞注入小鼠体内。注射部位瘤块的生长按标准方法随时间进行测定。在未免疫小鼠或对照质粒免疫的小鼠中，肿瘤细胞保持持续生长约三周(如表)，而用pCDneuNT免疫的小鼠注入转化的成纤维细胞后，结果相反，注射部位没有发现肿瘤块的生长。
以上结果均表明，将CMVneuNT质粒以裸DNA的形式溶于注射用生理溶液中，用其进行的免疫接种能够有效、特异地抑制过量表达neu癌基因的肿瘤细胞的粘附与扩散。
                         表
                     肿瘤面积(mm2)
                   1W            2W             3W
A               150±60        380±50        580±70
B               150±60        410±65        550±40
C                 nd             nd             nd
对肿瘤生长的抑制：10周龄的Swiss CD1(Charles River)雌性小鼠(每组12只)用质粒DNA进行免疫，C组用编码neuNT的质粒，B组用编码无关基因(p24-FIV)的质粒，A组注射生理盐水。两周后将neuNT转染的107个3T3 NIH细胞注入小鼠体内。
W：注射后的周数，表内数据为肿瘤的面积(±SD)。
nd：未发现肿瘤。

Claims (6)

1.编码全长的EGF受体家族的原癌基因或癌基因的cDNA在制备抗肿瘤剂中的用途。
2.权利要求1的用途，其中的肿瘤选自乳腺和/或卵巢、肺和肾的腺癌以及其它表达所述癌基因的肿瘤。
3.权利要求1的用途，其中cDNA与当肌肉注射或其它方法给药时能指导cDNA表达的调控序列功能连接。
4.权利要求1的用途，其中cDNA编码HER-2/erbB-2/neu癌基因。
5.权利要求3的用途，其中调控序列来自于质粒或病毒。
6.权利要求1-5之任一项的用途，其中cDNA为质粒性cDNA。
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