CN116555479A - Snp突变位点作为分子标记的用途及其snp分子标记、用途和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明SNP突变位点作为分子标记的用途及其SNP分子标记、用途和方法，属于分子生物学技术领域。所述SNP突变位点选自EVMNO.1、EVMNO.2中一个或两个；EVMNO.1为位于烟草基因组LG1号染色体第153204197位的C＞A；EVMNO.2为位于烟草基因组LG1号染色体第155162419位的A＞T。本发明还提供基于上述SNP突变位点的SNP标记，以及该SNP标记的用途、鉴定或筛选烟草株高突变材料的方法和烟草育种方法。本发明不仅可用于烟草植株高度早期的预测以及筛选，还可用于烟草植株高株和矮株的选育。为分析标记辅助选择育种以及烟草品种改良奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及SNP突变位点作为分子标记的用途及其SNP分子标记、用途和方法。
背景技术
优化植物结构是育种者使作物适应各种不同环境的有效策略，从而有可能提高产量，而植物高度在决定植物结构方面起着关键作用。植物高度与产量性状密切相关，因为它在植物结构、荚果数量和抗倒伏方面起着关键作用。烟草是研究植物病理学、遗传学和生物技术的模式植物，烟草遗传学和基因组学的研究加强了烟草作为模式植物的使用。烟草是一种重要的经济作物，在120多个国家种植。烟草一直是农业、组织培养和重组DNA研究的重要植物。因此，开展烟草植株高度相关的研究，对于改良植物结构提高产量、促进其它植株高度相关研究具有重要的意义。
分子标记技术可以找到与烟草植株高度QTL紧密连锁的标记，通过分子标记对烟草植株高度进行辅助选择，可以加快烟草品质的育种进程。目前研究人员采用SSR、SLAF等分子标记技术对烟草植株高度候选基因初定位，发现候选基因与分子标记的遗传距离普遍较远。单核苷酸多态性(SNPs)是最丰富的DNA变异类型，由于其在基因组中的广泛分布，目前被用作遗传标记。SNP可用于单体型图谱、遗传图谱、关联图谱、指纹图谱的构建，为分子育种、系统进化、种质资源鉴定提供重要保障。下一代测序(NGS)技术的最新发展使得快速发现数以千计的SNP标记和对大型人群进行高通量基因分型成为可能。因为重测序技术快速而简单，全面而可靠，重测序技术已被广泛用于鉴定基因组多样性。
目前有关烟草株高相关的分子标记尚未见报道，因此本领域继续开发烟草株高相关分子标记。
发明内容
出于解决提供与烟草株高相关的分子标记这一技术问题的目的，本发明的目的在于提供3个与烟草植株高度关联的SNP分子标记及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
SNP突变位点作为分子标记的用途，其特征在于，所述SNP突变位点选自EVM NO.1、EVM NO.2中一个或两个；
所述EVM NO.1为位于烟草基因组LG1号染色体第153204197位的C＞A；
所述EVM NO.2为位于烟草基因组LG1号染色体第155162419位的A＞T。
所述烟草基因组版本为烟草品种云晒1号的基因组V1.0；
优选地，所述分子标记为SNP分子标记；
优选地，所述SNP分子标记系与烟草植株高度性状连锁的标记。
SNP分子标记，其特征在于，选自下述分子标记中的一个或两个：
基于烟草基因组LG1号染色体第153204197位的C＞A的SNP标记1；
基于烟草基因组LG1号染色体第155162419位的A＞T的SNP标记2。
SNP分子标记系与烟草植株高度性状连锁的标记；
优选地，SNP标记1与烟草植株高度性状连锁的片段序列如SEQ ID NO.1所示；
优选地，SNP标记2与烟草植株高度性状连锁的片段序列如SEQ ID NO.2所示；
优选地，所述烟草基因组版本为烟草品种云晒1号的基因组V1.0。
烟草植株高度分子标记筛选或鉴定烟草材料的用途，其特征在于，烟草植株高度分子标记选自下述分子标记中的一个或两个：
基于烟草基因组LG1号染色体第153204197位的C＞A的SNP标记1；
基于烟草基因组LG1号染色体第155162419位的A＞T的SNP标记2。
所述烟草基因组版本为烟草品种云晒1号的基因组V1.0；
优选地，SNP标记1与烟草植株高度性状连锁的片段序列如SEQ ID NO.1所示；
优选地，SNP标记2与烟草植株高度性状连锁的片段序列如SEQ ID NO.2所示；
优选地，所述烟草材料指烟草株高突变材料；
优选地，所述烟草株高突变材料选自：携带株高突变位点的烟草材料或具有株高突变表型的烟草材料；
优选地，所述株高突变位点选自EVM NO.1、EVM NO.2中一个或两个；
所述EVM NO.2为位于烟草基因组LG1号染色体第153204197位的C＞A；
所述EVM NO.2为位于烟草基因组LG1号染色体第155162419位的A＞T。
一种鉴定或筛选烟草株高突变材料的方法，其特征在于，基于所述的SNP分子标记对候选烟草材料进行鉴定或筛选。
所述鉴定指：基于SNP分子标记、采用分子生物学方法进行检测；
优选地，所述分子生物学方法选自：PCR和/或电泳和/或测序和/或KASP；
优选地，检测SNP标记1的PCR引物或KASP引物为F:5’-GTGCCTCGAACTTGAA-3’，R:5’-GGTTGCGAGGCATTTATCC-3’；PCR或KASP的反应体系为cDNA：1μl，前后引物：各1μl，Buffer：5μl，dNTP：5μl，MgSO4：3μl，KOD酶：1μl，ddH2O：补足至50μl；反应程序为94℃预变性2min后，97℃变性12s，59℃退火30s，68℃延伸30s，30个循环后，70℃保持5min，16℃保存；
优选地，检测SNP标记2的PCR引物或KASP引物为F:5'-CGGGTCAGTCCTGTATTTCT-3'，R:5'-GTCCCTTTGTTATAGTTCTTCT-3'；PCR或KASP的反应体系为cDNA：1μl，前后引物：各1μl，Buffer：5μl，dNTP：5μl，MgSO4：3μl，KOD酶：1μl，ddH2O：补足至50μl；反应程序为93℃预变性2min后，98℃变性10s，58℃退火30s，68℃延伸30s，30个循环后，68℃保持5min，16℃保存；
优选地，所述烟草株高突变材料选自：携带株高突变位点的烟草材料或具有株高突变表型的烟草材料；
优选地，所述株高突变位点选自EVM NO.1、EVM NO.2中一个或两个；
所述EVM NO.1为位于烟草基因组LG1号染色体第153204197位的C＞A；
所述EVM NO.2为位于烟草基因组LG1号染色体第155162419位的A＞T。
一种烟草育种方法，其特征在于，基于所述的SNP分子标记、和/或，所述的一种鉴定或筛选烟草株高突变材料的方法筛选出烟草株高突变材料作为育种材料。
所述烟草株高突变材料选自：携带株高突变位点的烟草材料或具有株高突变表型的烟草材料；
优选地，所述株高突变位点选自EVM NO.1、EVM NO.2中一个或两个；
所述EVM NO.1为位于烟草基因组LG1号染色体第153204197位的C＞A；
所述EVM NO.2为位于烟草基因组LG1号染色体第155162419位的A＞T。
本发明的有益效果如下：
本发明通过全基因组重测序获得高质量的clean data，结合生物信息学的技术手段，与参考基因组进行比对分析，获得与烟草植株高度关联的2个SNP突变位点，它们是与位于烟草LG1号染色体的EVM NO.1、EVM NO.2。本发明基于这2个SNP突变位点开发获得2个SNP分子标记，并经实验证实，2个SNP分子标记与植株高度相关联，2个SNP分子标记各自单独使用或联用均能有效地鉴定、区分、筛选出烟草群体中的高株材料和矮株材料，鉴定准确率高达100％。
本发明提供的与烟草植株高度相关的SNP分子标记以及基因均是DNA的表现形式，在烟草种植的全生育期全部位均可检测，不受外界环境的影响，也不受季节的限制，无需进行基因片段长度的分析，只需分析有无即可，效率高，速度快。本发明提供的SNP突变位点的应用及其SNP分子标记与相关方法，不仅可用于烟草植株高度早期的预测以及筛选，还可用于烟草植株高株和矮株的选育。为分析标记辅助选择育种以及烟草品种改良奠定了基础。
附图说明
图1为本发明实验例1的SNP标记1的显著性t检验结果。
图2为本发明实验例1的SNP标记2的显著性t检验结果。
图1-图2的横坐标为对应SNP标记的等位基因的碱基情况，图1的横坐标右侧为野生型等位基因的碱基，横坐标左侧为突变型等位基因的碱基；图2的横坐标左侧为野生型等位基因的碱基，横坐标右侧为突变型等位基因的碱基。
图1-图2的纵坐标为烟草植株高度数值，图中每一个点代表一个烟草；中间部分的***代表显著性程度，三颗星表示显著性p<0.001，极为显著，即表示突变前与突变后的植株高度存在显著性差异，且显著性程度很高。
具体实施方式
以下结合实施例、实验例对本发明的具体内容作进一步详细说明，但并不以此限制本发明的保护范围。
生物材料的来源
一、实验例2使用的370份烟草种质由申请人单位保存。370份烟草种质包含：275份烤烟品种；72份晒烟品种；1份黄花烟品种；6份晾烟品种；11份白肋烟品种；5份香料烟品种。370份烟草品种均是公知公用的烟草品种，可商购获得。因篇幅有限，罗列部分品种的信息如下表1所示：
表1
第1组实施例、本发明的突变位点的用途
本组实施例提供SNP突变位点作为分子标记的用途。本组所有实施例都具备如下共同特征：所述SNP突变位点选自EVM NO.1、EVM NO.2中一个或两个；
所述EVM NO.1为位于烟草基因组LG1号染色体第153204197位的C＞A；
所述EVM NO.2为位于烟草基因组LG1号染色体第155162419位的A＞T。
在具体的实施例中，所述烟草基因组版本为烟草品种云晒1号的基因组V1.0；
优选地，所述分子标记为SNP分子标记；
优选地，所述SNP分子标记系与烟草植株高度性状连锁的标记。
出于本发明的教导，根据本发明披露的SNP突变位点所在的基因组位点前后的连锁片段序列，结合分子生物学领域常规技术手段，本领域技术人员可以分别获得上述各个SNP突变位点所在的基因组位点前后的连锁片段序列的特异性扩增引物和/或检测上述各个SNP突变位点所在的基因组位点前后的连锁片段序列或SNP(单核苷酸多态性)的其他手段(例如，测序、ARMS-PCR等)。任何基于本发明披露的上述SNP突变位点所在的基因组位点前后的连锁片段序列设计得到的引物序列，任何克隆、扩增、扩繁、富集、合成、连接、转化、制备、生产、销售、许诺销售、进口、出口该引物序列的行为，任何检测上述各个SNP突变位点所在的基因组位点前后的连锁片段序列或SNP(单核苷酸多态性)的其他手段(例如，测序、ARMS-PCR等)均落入本发明的保护范围。
出于本发明的教导，根据本发明披露的各个SNP突变位点所在基因组位置的前后片段序列和/或基于各个SNP突变位点开发得到的SNP分子标记的连锁片段序列，结合分子生物学领域常规技术手段，本领域技术人员可以分别获得各个SNP突变位点所在基因组位置的前后片段序列和/或基于各个SNP突变位点开发得到的SNP分子标记的连锁片段序列的特异性扩增引物。任何基于本发明披露的各个SNP突变位点所在基因组位置的前后片段序列和/或基于各个SNP突变位点开发得到的SNP分子标记的连锁片段序列设计得到的引物序列以及任何克隆、扩增、扩繁、富集、合成、连接、转化、制备、生产、销售、许诺销售、进口、出口该引物序列的行为均落入本发明的保护范围。
第2组实施例、本发明的分子标记
本组实施例提供SNP分子标记。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述SNP分子标记选自下述分子标记中的一个或两个：
基于烟草基因组LG1号染色体第153204197位的C＞A的SNP标记1；
基于烟草基因组LG1号染色体第155162419位的A＞T的SNP标记2。
在一些实施例中，SNP分子标记系与烟草植株高度性状连锁的标记；
优选地，SNP标记1与烟草植株高度性状连锁的片段序列如SEQ ID NO.1所示；
优选地，SNP标记2与烟草植株高度性状连锁的片段序列如SEQ ID NO.2所示；
优选地，所述烟草基因组版本为烟草品种云晒1号的基因组V1.0。
出于本发明的教导，根据本发明披露的SNP分子标记的连锁片段序列和/或SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示序列，结合分子生物学领域常规技术手段，本领域技术人员可以分别获得上述各个SNP分子标记的连锁片段序列和/或SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列的特异性扩增引物和/或检测上述SNP分子标记的连锁片段序列和/或SEQ ID NO.1或SEQID NO.2所示序列或SNP(单核苷酸多态性)的其他手段(例如，测序、ARMS-PCR等)。任何基于本发明披露的SNP分子标记的连锁片段序列和/或SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列设计得到的引物序列，任何克隆、扩增、扩繁、富集、合成、连接、转化、制备、生产、销售、许诺销售、进口、出口该引物序列的行为，任何检测上述SNP分子标记的连锁片段序列和/或SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示序列或SNP(单核苷酸多态性)的其他手段(例如，测序、ARMS-PCR等)均落入本发明的保护范围。
出于本发明的教导，根据本发明披露的各个SNP突变位点所在基因组位置的前后片段序列和/或基于各个SNP突变位点开发得到的SNP分子标记的连锁片段序列，结合分子生物学领域常规技术手段，本领域技术人员可以分别获得各个SNP突变位点所在基因组位置的前后片段序列和/或基于各个SNP突变位点开发得到的SNP分子标记的连锁片段序列的特异性扩增引物。任何基于本发明披露的各个SNP突变位点所在基因组位置的前后片段序列和/或基于各个SNP突变位点开发得到的SNP分子标记的连锁片段序列设计得到的引物序列以及任何克隆、扩增、扩繁、富集、合成、连接、转化、制备、生产、销售、许诺销售、进口、出口该引物序列的行为均落入本发明的保护范围。
第3组实施例、本发明分子标记的用途
本组实施例提供烟草植株高度分子标记筛选或鉴定烟草材料的用途。本组实施例都具备如下共同特征：烟草植株高度分子标记选自下述分子标记中的一个或两个：
基于烟草基因组LG1号染色体第153204197位的C＞A的SNP标记1；
基于烟草基因组LG1号染色体第155162419位的A＞T的SNP标记2。
在一些实施例中，所述烟草基因组版本为烟草品种云晒1号的基因组V1.0；
优选地，SNP标记1与烟草植株高度性状连锁的片段序列如SEQ ID NO.1所示；
优选地，SNP标记2与烟草植株高度性状连锁的片段序列如SEQ ID NO.2所示；
优选地，所述烟草材料指烟草株高突变材料；
优选地，所述烟草株高突变材料选自：携带株高突变位点的烟草材料或具有株高突变表型的烟草材料；
优选地，所述株高突变位点选自EVM NO.1、EVM NO.2中一个或两个；
所述EVM NO.2为位于烟草基因组LG1号染色体第153204197位的C＞A；
所述EVM NO.2为位于烟草基因组LG1号染色体第155162419位的A＞T。
第4组实施例、本发明鉴定或筛选烟草株高突变材料的方法
本组实施例提供一种鉴定或筛选烟草株高突变材料的方法。本组所有实施例都具备如下共同特征：基于第3组实施例任一项所述的SNP分子标记对候选烟草材料进行鉴定或筛选。
在一些实施例中，所述鉴定指：基于SNP分子标记、采用分子生物学方法进行检测；
优选地，所述分子生物学方法选自：PCR和/或电泳和/或测序和/或KASP；
优选地，检测SNP标记1的PCR引物或KASP引物为F:5’-GTGCCTCGAACTTGAA-3’(SEQID NO.3)，R:5’-GGTTGCGAGGCATTTATCC-3’(SEQ ID NO.4)；PCR或KASP的反应体系为cDNA：1μl，前后引物：各1μl，Buffer：5μl，dNTP：5μl，MgSO4：3μl，KOD酶：1μl，ddH2O：补足至50μl；反应程序为94℃预变性2min后，97℃变性12s，59℃退火30s，68℃延伸30s，30个循环后，70℃保持5min，16℃保存；
优选地，检测SNP标记2的PCR引物或KASP引物为F:5'-CGGGTCAGTCCTGTATTTCT-3'(SEQ ID NO.5)，R:5'-GTCCCTTTGTTATAGTTCTTCT-3'(SEQ ID NO.6)；PCR或KASP的反应体系为cDNA：1μl，前后引物：各1μl，Buffer：5μl，dNTP：5μl，MgSO4：3μl，KOD酶：1μl，ddH2O：补足至50μl；反应程序为93℃预变性2min后，98℃变性10s，58℃退火30s，68℃延伸30s，30个循环后，68℃保持5min，16℃保存；
优选地，所述烟草株高突变材料选自：携带株高突变位点的烟草材料或具有株高突变表型的烟草材料；
优选地，所述株高突变位点选自EVM NO.1、EVM NO.2中一个或两个；
所述EVM NO.1为位于烟草基因组LG1号染色体第153204197位的C＞A；
所述EVM NO.2为位于烟草基因组LG1号染色体第155162419位的A＞T。
第5组实施例、本发明烟草育种方法
本组实施例提供一种烟草育种方法。本组实施例都具备如下共同特征：基于第3组实施例任一项所述的SNP分子标记、和/或，第4组实施例任一项所述的一种鉴定或筛选烟草株高突变材料的方法筛选出烟草株高突变材料作为育种材料。
在一些实施例中，所述烟草株高突变材料选自：携带株高突变位点的烟草材料或具有株高突变表型的烟草材料；
优选地，所述株高突变位点选自EVM NO.1、EVM NO.2中一个或两个；
所述EVM NO.1为位于烟草基因组LG1号染色体第153204197位的C＞A；
所述EVM NO.2为位于烟草基因组LG1号染色体第155162419位的A＞T。
实验例1、本发明的SNP标记的获得与验证
一、SNP分子标记的获得
烟草植株高度性状全基因组关联分析(GWAS)定位，对步骤(1)所得的烟草植株高度性状结果和步骤(2)所得的基因型数据，使用GEMMA(v 0.94.1)软件的混合线性模型进行统计分析，筛选得到如下表2所示的2个SNP突变位点。
表2.本发明的SNP突变位点
并基于上述2个SNP突变位点进一步开发获得2个SNP分子标记，所述2个SNP分子标记的连锁片段序列如下表3所示。
二、群体显著性验证
使用表3所示的2个SNP分子标记对370份烟草种质的野生型和突变型的植株高度进行显著性t检验，结果如图1、图2所示，显示两个SNP均表现出对烟草植株高度性状变异具有显著的影响。
表3.本发明SNP分子标记的连锁片段序列
实验例2、本发明分子标记的准确性验证
以370份烟草种质作为验证材料，本发明的SNP标记1、SNP标记2用于筛选烟草株高突变材料的准确性验证数据如下表4所示：
表4.SNP标记验证结果
SNP标记1检出的195份基因型突变材料中，一共195份烟草材料的表型株高均在143.56cm以上，属于突变型的高株。
SNP标记2检出的193份基因型突变材料中，一共193份烟草材料的表型株高均在141.94cm以上，属于突变型的高株。
而野生型烟草植株高度一般都在120cm以下。
Claims (10)
1.SNP突变位点作为分子标记的用途，其特征在于，所述SNP突变位点选自EVM NO.1、EVM NO.2中一个或两个；
所述EVM NO.1为位于烟草基因组LG1号染色体第153204197位的C＞A；
所述EVM NO.2为位于烟草基因组LG1号染色体第155162419位的A＞T。
2.根据权利要求1所述的SNP突变位点作为分子标记的用途，其特征在于，所述烟草基因组版本为烟草品种云晒1号的基因组V1.0；
和/或，所述分子标记为SNP分子标记；
和/或，所述SNP分子标记系与烟草植株高度性状连锁的标记。
3.SNP分子标记，其特征在于，选自下述分子标记中的一个或两个：
基于烟草基因组LG1号染色体第153204197位的C＞A的SNP标记1；
基于烟草基因组LG1号染色体第155162419位的A＞T的SNP标记2。
4.根据权利要求3所述的SNP分子标记，其特征在于，SNP分子标记系与烟草植株高度性状连锁的标记；
和/或，SNP标记1与烟草植株高度性状连锁的片段序列如SEQ ID NO.1所示；
和/或，SNP标记2与烟草植株高度性状连锁的片段序列如SEQ ID NO.2所示；
和/或，所述烟草基因组版本为烟草品种云晒1号的基因组V1.0。
5.烟草植株高度分子标记筛选或鉴定烟草材料的用途，其特征在于，烟草植株高度分子标记选自下述分子标记中的一个或两个：
基于烟草基因组LG1号染色体第153204197位的C＞A的SNP标记1；
基于烟草基因组LG1号染色体第155162419位的A＞T的SNP标记2。
6.根据权利要求5所述的烟草植株高度分子标记筛选或鉴定烟草材料的用途，其特征在于，所述烟草基因组版本为烟草品种云晒1号的基因组V1.0；
和/或，SNP标记1与烟草植株高度性状连锁的片段序列如SEQ ID NO.1所示；
和/或，SNP标记2与烟草植株高度性状连锁的片段序列如SEQ ID NO.2所示；
和/或，所述烟草材料指烟草株高突变材料；
和/或，所述烟草株高突变材料选自：携带株高突变位点的烟草材料或具有株高突变表型的烟草材料；
和/或，所述株高突变位点选自EVM NO.1、EVM NO.2中一个或两个；
所述EVM NO.2为位于烟草基因组LG1号染色体第153204197位的C＞A；
所述EVM NO.2为位于烟草基因组LG1号染色体第155162419位的A＞T。
7.一种鉴定或筛选烟草株高突变材料的方法，其特征在于，基于权利要求3或4所述的SNP分子标记对候选烟草材料进行鉴定或筛选。
8.根据权利要求7所述的一种鉴定或筛选烟草株高突变材料的方法，其特征在于，所述鉴定指：基于SNP分子标记、采用分子生物学方法进行检测；
和/或，所述分子生物学方法选自：PCR和/或电泳和/或测序和/或KASP；
和/或，检测SNP标记1的PCR引物或KASP引物为F:5’-GTGCCTCGAACTTGAA-3’，R:5’-GGTTGCGAGGCATTTATCC-3’；PCR或KASP的反应体系为cDNA：1μl，前后引物：各1μl，Buffer：5μl，dNTP：5μl，MgSO4：3μl，KOD酶：1μl，ddH2O：补足至50μl；反应程序为94℃预变性2min后，97℃变性12s，59℃退火30s，68℃延伸30s，30个循环后，70℃保持5min，16℃保存；
和/或，检测SNP标记2的PCR引物或KASP引物为F:5'-CGGGTCAGTCCTGTATTTCT-3'，R:5'-GTCCCTTTGTTATAGTTCTTCT-3'；PCR或KASP的反应体系为cDNA：1μl，前后引物：各1μl，Buffer：5μl，dNTP：5μl，MgSO4：3μl，KOD酶：1μl，ddH2O：补足至50μl；反应程序为93℃预变性2min后，98℃变性10s，58℃退火30s，68℃延伸30s，30个循环后，68℃保持5min，16℃保存；
和/或，所述烟草株高突变材料选自：携带株高突变位点的烟草材料或具有株高突变表型的烟草材料；
和/或，所述株高突变位点选自EVM NO.1、EVM NO.2中一个或两个；
所述EVM NO.1为位于烟草基因组LG1号染色体第153204197位的C＞A；
所述EVM NO.2为位于烟草基因组LG1号染色体第155162419位的A＞T。
9.一种烟草育种方法，其特征在于，基于权利要求3或4所述的SNP分子标记、和/或，权利要求7或8所述的一种鉴定或筛选烟草株高突变材料的方法筛选出烟草株高突变材料作为育种材料。
10.根据权利要求9所述的一种烟草育种方法，其特征在于，所述烟草株高突变材料选自：携带株高突变位点的烟草材料或具有株高突变表型的烟草材料；
和/或，所述株高突变位点选自EVM NO.1、EVM NO.2中一个或两个；
所述EVM NO.1为位于烟草基因组LG1号染色体第153204197位的C＞A；
所述EVM NO.2为位于烟草基因组LG1号染色体第155162419位的A＞T。
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