CN116549468A - 用于治疗肿瘤的联合药物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于治疗肿瘤的联合药物；旨在提供一种靶向运输化疗药物和代谢类药物，且能活化肿瘤微环境，联合化疗、代谢疗法和免疫疗法治疗肿瘤病人的治疗方案；其技术要点是利用免疫激活型仿生纳米囊泡负载化疗药物盐酸阿霉素DOX和糖代谢抑制剂2‑脱氧‑D‑葡萄糖2‑DG；其中：激活型仿生纳米囊泡是囊泡本身高表达PD1分子，可以竞争性地和PD‑L1相互作用，解除对免疫细胞的抑制作用；DOX是一种化疗药物；2‑DG是一种糖酵解抑制剂，可以抑制细胞内的糖酵解过程；属于医药生物技术领域。
Description
技术领域
本发明涉及用于治疗肿瘤的联合药物，属于医药技术领域。
背景技术
在中国，癌症在难治愈性疾病中的排名中一直稳居前三，也是提高民众预期寿命的重要障碍。快节奏的、亚健康的的生活方式以及慢性感染、环境暴露等是导致癌症发生的主要原因。其中，肺癌是最常见的癌症，也是男性癌症死亡的主要原因，其次是前列腺癌、结直肠癌以及肝癌。在女性中，乳腺癌是最常见的癌症，也是癌症死亡的主要原因，其次是结直肠癌和肺癌。目前，排名前几位的恶性肿瘤，比如肺癌、食管癌、胃癌、肝癌都是预后较差、死亡率很高的。主要是由于恶性肿瘤的极强侵袭性和癌症早期筛查手段的低效性，导致大于一半的癌症患者诊断时已处于晚期。目前，癌症的治疗手段除了传统的手术、放、化疗，还有近些年发展起来的靶向药物治疗和免疫疗法。但这些治疗手段仍面临诸多挑战，如靶向药物治疗的不稳定性；免疫治疗适宜人群的不确定性；化疗药物的耐药性和生物毒性等。
化疗作为传统癌症治疗最有效的手段之一，主要是指通过化学治疗药物消除癌细胞进而治疗癌症。但由于化疗药物进入人体内，无法区别癌细胞和正常细胞，通常会引发人体一系列的异常反应，最常见的反应主要是恶心、呕吐、免疫力降低。例如，广谱抗肿瘤药物盐酸阿霉素(Doxorubicin，DOX)是临床上广泛使用的癌症化疗剂、主要用于乳腺癌、肺小细胞肺癌、白血病、恶性淋巴瘤等。DOX作为反相转录酶、RNA聚合酶和DNA拓扑异构酶II的抑制剂，能诱导DNA损伤和细胞凋亡。但由于DOX会导致骨髓抑制、肝功能不全以及严重的的心肌毒性等毒副作用，使其临床应用受到限制。此外，频繁使用DOX引发的耐药性也是另一个严重问题。
近十年，免疫疗法在癌症的治疗方面取得了重大进展，成为晚期癌症治疗不可或缺的一种治疗手段。不同于靶向治疗或者化疗等实验手段，免疫疗法是通过重塑肿瘤的免疫微环境，将免疫抑制型的肿瘤微环境转变为激活型的免疫微环境。比如：针对免疫检查点程序性死亡受体1(PD1)/程序性死亡分子1配体(PD-L1)通路的免疫治疗。PD1/PD-L1通路在肿瘤组织中异常激活，PD-1主要表达于活化的免疫细胞，包括T细胞、B细胞、树突状细胞、单核-巨噬细胞等免疫细胞上；PD-L1是PD1的配体，在肿瘤细胞上高表达。PD1与PD-L1的相互作用，能够抑制效应T细胞的功能，有助于肿瘤形成免疫抑制型的肿瘤微环境，参与肿瘤的免疫逃逸，促进肿瘤形成和转移。因此，阻断PD1/PD-L1通路，是目前治疗癌症的一个具有吸引力的靶点。
与正常细胞一样，癌细胞需要能量才能生长和繁殖。这些能量主要来自于糖和葡萄糖(存在于血液中的糖)。但与正常细胞不同的是，癌细胞生长所需的糖是正常细胞的200多倍。癌细胞能以糖酵解的方式获得大量ATP，并为肿瘤细胞创造了酸性低氧的有利生存环境。代谢葡萄糖类似物2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)是葡萄糖转运和糖酵解ATP产生的抑制剂，通过降低肿瘤细胞内的的能源和养料，进而改变肿瘤细胞的代谢环境，进而抑制肿瘤细胞的抑制Warburg效应。2-DG还参与诱导细胞信号异常传导、细胞周期阻滞、DNA修复异常、钙离子内流和细胞凋亡等。除此之外，由于2-DG结构类似葡萄糖，可作为葡萄糖的类似物，而改变N-连接糖基化，进而引起蛋白质的错误折叠，而被降解，比如：2-DG可诱导PD-L1的错误折叠及降解。鉴于大多数恶性肿瘤细胞优先利用糖酵解，因此有机会利用这种弱点来选择性地消除癌细胞，同时不影响未转化的正常细胞。但临床试验表明，2-DG的药物样特性差，体内有效生物利用度和治疗浓度要求很高，导致将其用于单药治疗杀伤肿瘤面临挑战。
值得关注的是：免疫疗法和代谢疗法在肿瘤的临床治疗中成功应用，成功的延长了一些癌症患者的生存期。临床上大约有百分之二十的病人对PD1抗体的免疫治疗有效。但是一些具有驱动基因突变的癌症病人，对免疫疗法获益较少。比如：具有EGFR驱动基因突变的癌症病人对PD1抗体的治疗基本没有响应。因此，临床上急需要一些药物可以扩大免疫治疗的范围以及增加免疫治疗的效果。
目前，纳米靶向递药系统的开发也为肿瘤免疫治疗提供了全新思路。将纳米靶向递药系统与癌症免疫治疗结合，通过纳米载体包裹的免疫调节剂激活免疫细胞，增强抗肿瘤免疫，改善肿瘤微环境，从而实现对恶性肿瘤的清除。程序性细胞死亡蛋白1(PD1)/PD-L1可以通过之间的相互作用使免疫系统沉默，也是目前纳米靶向递药系统针对的一个主要免疫检查点。因此，能够开发负载2-DG的仿生纳米靶向递药系统作为肿瘤放、化疗的治疗剂或辅助剂，并结合免疫疗法的研究具有重要意义。
发明内容
基于目前化疗药物对病人的毒性大，靶向治疗耐药以及病人对免疫治疗响应不大这一突出问题，本发明的目的在于提供一种针对消耗肿瘤细胞能量和养分、活化肿瘤微环境以及靶向肿瘤细胞递送化疗药物联合药物，从而达到治疗肿瘤病人的目的。
为此，本发明提出的技术方案是这样的：
一种用于治疗癌症的联合药物，主要由仿生纳米囊泡P-NV，2-DG，DOX组成。
其中，仿生纳米囊泡P-NV由基因工程改造后高表达PD1的肺癌细胞TC1细胞制备而成，可以识别肿瘤细胞的PD-L1以及肿瘤细胞本身的归巢效果，靶向运输到肿瘤部位，阻断PD1/PD-L1的信号转导，进而达到解除肿瘤微环境免疫抑制的效果；2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)是葡糖糖类似物，抑制肿瘤细胞的糖酵解过程及能量生产，同时可以降解肿瘤细胞上的PD-L1的表达，可以同时达到抑制肿瘤细胞的代谢以及解除PD1/PD-L1的抑制效果等；盐酸阿霉素(Doxorubicin，DOX)是临床上广泛使用的癌症化疗剂，能诱导DNA损伤和细胞凋亡，进而抑制癌细胞的增殖。
进一步的，上述的用于治疗肿瘤的联合药物，其特征在于，由仿生纳米囊泡P-NV，2-DG，DOX组成。
进一步的，上述的用于治疗肿瘤的联合药物，其特征在于，所述的仿生纳米囊泡、盐酸阿霉素DOX和糖代谢抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖2-DG按照质量比10：6.9：5.8组成。
进一步的，上述的用于治疗肿瘤的联合药物，其特征在于，所述的仿生纳米囊泡、盐酸阿霉素DOX和糖代谢抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖2-DG按照质量比10∶5∶4组成。
进一步的，上述的用于治疗肿瘤的联合药物，其特征在于，所述的仿生纳米囊泡、盐酸阿霉素DOX和糖代谢抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖2-DG按照质量比10∶4∶3组成。
进一步的，上述的用于治疗肿瘤的联合药物，其特征在于，所述的仿生纳米囊泡、盐酸阿霉素DOX和糖代谢抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖2-DG按照质量比10∶3∶2组成。
进一步的，上述的用于治疗肿瘤的联合药物，其特征在于，所述的仿生纳米囊泡P-NV、2-脱氧-D-葡萄糖2-DG、盐酸阿霉素DOX按照上述质量比给药，但不只局限于上述质量比。
进一步的，上述的用于治疗肿瘤的联合药物，其特征在于，所述的仿生纳米囊泡P-NV、2-脱氧-D-葡萄糖2-DG、盐酸阿霉素DOX给药方式均为小鼠尾静脉注射，每两天给一次药。
进一步的，上述的用于治疗肿瘤的联合药物，其特征在于，所述的肿瘤为肺癌，但不局限于肺癌。
进一步的，上述的用于治疗肿瘤的联合药物，所述的给药方式为尾静脉注射，但不只局限于次此给药方式。
进一步的，上述的用于治疗肿瘤的联合药物，所述的肿瘤包括原位癌和转移癌。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下技术优点：
本申请提供的技术方案用小鼠肺癌细胞TC1构建了高表达mPD1的工程细胞，进一步超声共挤压，使其生成天然的细胞膜纳米囊泡(P-NV)，利用该载体来递送广谱抗癌药物盐酸阿霉素(DOX)和代谢类抗癌药物2-脱氧葡萄糖(2-DG)，并评估了细胞膜纳米囊泡对两类抗癌药物的负载率和释放率。本发明研究发现负载DOX的细胞膜纳米囊泡PD-NV、负载2-DG的细胞膜纳米囊泡PG-NV以及DOX和2-DG双载的细胞膜纳米囊泡PDG-NV可以在体外抑制小鼠肺癌对照细胞TC1(TC-1C)和稳定高表达PD-L1的TC1-mPD-L1(简称TC-1L)的细胞生长，且对TC1-mPD-L1(TC-1L)细胞的抑制水平更高。本研究发现负载2-DG的细胞膜纳米囊泡可以在体外，通过PD-L1的去糖基作用，抑制小鼠肺癌细胞TC-1C和TC-1L细胞mPD-L1的表达，从而逆转肿瘤细胞的免疫抑制。
本申请提供的技术研究发现，在小动物模型中，包括小鼠的肺癌移植瘤模型以及原发瘤模型，仿生纳米囊泡P-NV、仿生纳米囊泡P-NV负载2-DG(PG-NV)、仿生纳米囊泡P-NV负载DOX(PD-NV)和仿生纳米囊泡P-NV负载2-DG和DOX(PDG-NV)治疗后对小鼠的体重没有不良影响；治疗后，小鼠的器官也没有明显病理异常。仿生纳米囊泡P-NV对小鼠的治疗基本没有明显效果；仿生纳米囊泡P-NV负载2-DG(PG-NV)能轻微抑制小鼠癌症的增长；仿生纳米囊泡P-NV负载DOX(PD-NV)能抑制小鼠癌症的增长；当纳米囊泡负载2-DG和DOX(PDG-NV)治疗小鼠的肿瘤模型时，能显著缩小鼠肿瘤的生长，具有明显的协同作用，基本达到对肿瘤治愈的效果。
综上所述，仿生纳米囊泡P-NV负载2-DG，DOX以后，通过抑制PD-1/PD-L1相互作用，进而解除对肿瘤的免疫抑制作用，促进抗肿瘤的炎性免疫细胞的浸润，改善免疫微环境，同时抑制肿瘤细胞的有氧糖酵解，诱导肿瘤细胞的DNA损伤和细胞凋亡，进而产生协同抗癌的作用。
附图说明
图1是细胞膜纳米囊泡P-NV对细胞活性的影响。
其中，A：50μg/mL细胞膜纳米囊泡P-NV对3T3细胞(小鼠成纤维细胞)和BEAS-2B细胞(人肺支气管上皮细胞)的生长没有明显影响。B：100μg/mL细胞膜纳米囊泡P-NV对3T3细胞和BEAS-2B细胞的生长没有明显影响。C：200μg/mL细胞膜纳米囊泡P-NV对3T3细胞和BEAS-2B细胞的生长没有明显影响。D：200μg/mL细胞膜纳米囊泡P-NV不影响对照组TC1细胞(TC-1C)和工程化TC1-mPD-L1细胞(TC-1L)的生长；
图2是细胞膜纳米囊泡P-NV对盐酸阿霉素(DOX)和2-脱氧葡萄糖(2-DG)的负载和释放效率。
其中，A：细胞膜纳米囊泡P-NV对盐酸阿霉素(DOX)和2-脱氧葡萄糖(2-DG)的负载率的统计结果；B：细胞膜纳米囊泡P-NV中盐酸阿霉素(DOX)和2-脱氧葡萄糖(2-DG)的药物释放率的统计结果；
图3是P-NV负载不同药物对对照组TC1-1C细胞和工程化TC-1L细胞的活力的影响。
其中，A：较低浓度的细胞膜纳米囊泡负载DOX(PD-NV)能在短时间(24h)内，剂量依耐性抑制对照组TC1-1C细胞和工程化TC-1L细胞，且对TC-1L细胞的生长抑制更显著；B：细胞膜纳米囊泡负载2-DG(PG-NV)时间依赖性逐渐抑制对照组TC1-1C细胞和工程化TC-1L细胞的细胞活力，随着时间的延长，对细胞的毒性越明显，且对TC-1L细胞的生长抑制更显著；D：较低浓度的细胞膜纳米囊泡同时负载DOX和2-DG的(PDG-NV)能时间依赖性和剂量依赖性的抑制对照组TC1-1C细胞和工程化TC-1L细胞的细胞活力，在与靶细胞共孵育48h后，细胞几乎全部死亡，且对TC-1L细胞的生长抑制更显著。
图4是高浓度的游离2-DG和细胞膜纳米囊泡负载的较低浓度2-DG(PG-NV)可以显著抑制对照组TC1-1C细胞和工程化TC-1L细胞内糖酵解的水平。PG-NV的抑制ATP产生的能力显著优于游离的2-DG.
其中，A：高浓度的游离2-DG可以剂量依赖性的抑制对照组TC1-1C细胞和工程化TC-1L细胞糖酵解产生的ATP水平，且对两种靶细胞产生的ATP水平的抑制无差异；B：细胞膜纳米囊泡负载的较低浓度2-DG(PG-NV)也能剂量依赖性的抑制对照组TC1-1C细胞和工程化TC-1L细胞产生的ATP水平，且对TC-1L细胞的ATP水平的抑制效果更显著。
图5是高浓度的游离2-DG和细胞膜纳米囊泡负载的较低浓度2-DG(PG-NV)可以促进工程化工程化TC-1L细胞的mPD-L1的蛋白降解。PG-NV对mPD-L1蛋白的降解能力显著优于游离的2-DG.
其中，A：高浓度的游离2-DG可以剂量依赖性的促进工程化TC-1L细胞的mPD-L1蛋白的降解(上图)，下图为TC-1L细胞mPD-L1蛋白表达变化的统计；B：细胞膜纳米囊泡P-NV对TC-1L细胞mPD-L1蛋白降解无影响。而细胞膜纳米囊泡负载的较低浓度2-DG(PG-NV)可以剂量依赖性促进工程化TC-1L细胞的mPD-L1蛋白的降解(上图)，下图为TC-1L细胞mPD-L1蛋白表达变化的统计；C：细胞膜纳米囊泡负载的较低浓度2-DG(PG-NV)时间依赖性的促进工程化TC-1L细胞的mPD-L1蛋白的降解(上图)，下图为TC-1L细胞mPD-L1蛋白表达变化的统计。
图6是高浓度的游离2-DG和细胞膜纳米囊泡负载的较低浓度2-DG(PG-NV)能导致对照组TC1-1C细胞和工程化TC-1L细胞的细胞膜上锚定的mPD-L1蛋白减少。PG-NV解除mPD-L1蛋白细胞膜锚定的能力显著优于游离的2-DG.
其中，A：高浓度的游离2-DG或细胞膜纳米囊泡负载的较低浓度2-DG(PG-NV)能剂量依赖性的减少工程化TC-1L细胞的细胞膜上mPD-L1蛋白(左图)，右图为TC-1L(细胞的细胞膜上mPD-L1表达变化的平均荧光强度统计；B：对照组TC1-1C细胞的细胞膜的mPD-L1表达水平很低，但高浓度的游离2-DG或细胞膜纳米囊泡负载的较低浓度2-DG(PG-NV)仍可以剂量依赖性的减少对照组TC1-1C细胞的细胞膜上mPD-L1蛋白(左图)，右图为对照组TC1-1C细胞的细胞膜上mPD-L1表达变化的平均荧光强度统计；
图7是细胞膜纳米囊泡单载DOX(PD-NV)、2-DG(PG-NV)可以不同程度的抑制小鼠肺癌移植瘤的增长。细胞膜纳米囊泡同时装载DOX和2-DG(PDG-NV)可以显著的抑制小鼠肺癌移植瘤的增长，具有明显的协同作用，基本达到治愈肺癌移植瘤的效果。
其中，A：小鼠接受不同的治疗(PBS、P-NV、PG-NV、PD-NV或者PDG-NV)后的体重变化；B：P-NV负载不同药物治疗对小鼠皮下移植瘤生长抑制的评价图；C：P-NV负载不同药物治疗两周后，解剖小鼠体外移植瘤的肿瘤照片；D：小鼠体外移植瘤的肿瘤重量统计图；E：P-NV负载不同药物治疗两周后，小鼠肿瘤组织的石蜡切片Ki67染色图；F：小鼠肿瘤组织的石蜡切片Ki67染色阳性细胞统计图。
图8是小鼠接受不同的治疗(PBS、P-NV、PG-NV、PD-NV或者PDG-NV)后，两周后检测小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的HE染色(苏木精-伊红染色)切片，没有明显异常。
图9是EGFR第19位外显子缺失转基因(简称为：CC10-RTTA/EGFR-DEL)小鼠肺癌模型的诱导及后期治疗。
其中：A：四环素诱导CC10-RTTA/EGFR-DEL转基因小鼠产生原位肺癌的原理及流程；B：CC10-RTTA/EGFR-DEL转基因小鼠诱导成原位肺癌后，后期接受不同的治疗(PBS、P-NV、PG-NV、PD-NV或者PDG-NV)的流程图。
图10是细胞膜纳米囊泡P-NV能轻微抑制小鼠原发肺癌的生长以及改善免疫抑制型微环境。
其中，A：CC10-RTTA/EGFR-DEL转基因小鼠模型中评价P-NV对肺癌原发瘤治疗的CT效果图(左图)；小鼠治疗前后的肺组织中肿瘤相对浸润面积统计图(右图)；B：P-NV治疗两周后肺部组织的石蜡切片HE染色(苏木精-伊红染色)以及Ki67染色评价图(左图)；P-NV治疗两周后，肺部组织的石蜡切片HE染色(苏木精-伊红染色)相对肿瘤面积统计图以及Ki67染色阳性细胞个数统计图(右图)；C：P-NV治疗两周后，肺部组织的浸润的CD4阳性(CD4+)和CD8阳性(CD8+)T细胞浸润免疫荧光评价图(左图)；浸润的CD4阳性(CD4+)和CD8阳性(CD8+)T细胞数量统计图(右图)。
图11是细胞膜纳米囊泡负载2-DG(PG-NV)可以一定程度上抑制转基因小鼠的肺癌原位瘤的生长，能有限的增效P-NV对小鼠原位瘤的治疗效果以及改善免疫抑制型微环境。
其中，A：CC10-RTTA/EGFR-DEL转基因小鼠模型中评价PG-NV对肺癌原发瘤治疗的CT效果图(左图)；小鼠治疗前后的肺组织中肿瘤相对浸润面积统计图(右图)；B：PG-NV治疗两周后肺部组织的石蜡切片HE染色(苏木精-伊红染色)以及Ki67染色评价图(左图)；PG-NV治疗两周后，肺部组织的石蜡切片HE染色(苏木精-伊红染色)相对肿瘤面积统计图以及Ki67染色阳性细胞个数统计图(右图)；C：PG-NV治疗两周后，肺部组织的浸润的CD4阳性(CD4+)和CD8阳性(CD8+)T细胞浸润免疫荧光评价图(左图)；浸润的CD4阳性(CD4+)和CD8阳性(CD8+)T细胞数量统计图(右图)。
图12是细胞膜纳米囊泡负载DOX(PD-NV)能一定程度的抑制转基因小鼠的肺癌原位瘤的生长，有限的增效P-NV对小鼠原位瘤的治疗效果以及改善免疫抑制型微环境。
其中，A：CC10-RTTA/EGFR-DEL转基因小鼠模型中评价PD-NV对肺癌原发瘤治疗的CT效果图(左图)；小鼠治疗前后的肺组织中肿瘤相对浸润面积统计图(右图)；B：PD-NV治疗两周后肺部组织的石蜡切片HE染色(苏木精-伊红染色)以及Ki67染色评价图(左图)；PD-NV治疗两周后，肺部组织的石蜡切片HE染色(苏木精-伊红染色)相对肿瘤面积统计图以及Ki67染色阳性细胞个数统计图(右图)；C：PD-NV治疗两周后，肺部组织的浸润的CD4阳性(CD4+)和CD8阳性(CD8+)T细胞浸润免疫荧光评价图(左图)；浸润的CD4阳性(CD4+)和CD8阳性(CD8+)T细胞数量统计图(右图)。
图13是细胞膜纳米囊泡同时装载DOX和2-DG(PDG-NV)可以有效治疗转基因小鼠的肺癌原位瘤，基本达到治愈的效果，能显著地增效P-NV对小鼠原位瘤的治疗效果，同时可以明显改善小鼠肺部抑制型的肿瘤免疫微环境。
其中A：CC10-RTTA/EGFR-DEL转基因小鼠模型中评价PDG-NV对肺癌原发瘤治疗的CT效果图(左图)；小鼠治疗前后的肺组织中肿瘤相对浸润面积统计图(右图)；B：PDG-NV治疗两周后肺部组织的石蜡切片HE染色(苏木精-伊红染色)以及Ki67染色评价图(左图)；PGD-NV治疗两周后，肺部组织的石蜡切片HE染色(苏木精-伊红染色)相对肿瘤面积统计图以及Ki67染色阳性细胞个数统计图(右图)；C：PDG-NV治疗两周后，肺部组织的浸润的CD4阳性(CD4+)和CD8阳性(CD8+)T细胞浸润免疫荧光评价图(左图)；浸润的CD4阳性(CD4+)和CD8阳性(CD8+)T细胞数量统计图(右图)。
具体实施方式
下面结合实验例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本发明提供的一种用于治疗肿瘤的联合药物，由仿生纳米囊泡P-NV、2-DG和DOX按照质量比10∶6.9∶5.8组成。
实施例2
本发明提供的一种用于治疗肿瘤的联合药物，由仿生纳米囊泡P-NV、2-DG和DOX按照质量比10∶5∶4组成。
实施例3
本发明提供的一种用于治疗肿瘤的联合药物，由仿生纳米囊泡P-NV、2-DG和DOX按照质量比10∶4∶3组成。
实施例4
本发明提供的一种用于治疗肿瘤的联合药物，由仿生纳米囊泡P-NV、2-DG和DOX抗体按照质量比10∶3∶2组成。
下面将根据本发明中所用到的仿生纳米囊泡P-NV、2-DG和DOX的最优质量比例10∶6.9∶5.8对该发明的具体实验例进行说明。
实验例1
评价细胞膜纳米囊泡P-NV对正常细胞及肺癌细胞活性的影响
一、实验方法
(A)检测50μg/mL的P-NV处理，对3T3细胞(小鼠成纤维细胞)和BEAS-2B细胞(人肺支气管上皮细胞)生长的影响。将3T3或者BEAS-2B按照每孔2×104个的密度接种于96孔板中，培养大概6h后，细胞就可以贴壁生长。每个孔加入包含终浓度为50μg/mL P-NV的完全DMEM培养基(包含10％FBS，1％双抗)，进行孵育。在孵育时间为12h，24h以及48h的时间点，加入10μL CCK8(Cell Counting Kit)溶液，反应1h，利用多功能酶标仪(TECAN，SparkTM10M)检测细胞的活性。(B)检测100μg/mL的P-NV处理，对3T3细胞和BEAS-2B细胞生长的影响。方法参照实验例1方法A，不同的是在于用100μg/mL的P-NV对细胞进行处理。(C)检测200μg/mL的P-NV处理，对3T3细胞和BEAS-2B细胞生长的影响。方法参照实验例1方法A，不同的是在于用200μg/mL的P-NV对细胞进行处理。(D)检测200μg/mL细胞膜纳米囊泡P-NV对肺癌细胞TC1细胞(TC-1C)和工程化的肺癌细胞TC-1L细胞(TC-1L)的影响。方法参照实验例1方法A，不同的是在于用200μg/mL的P-NV对TC-1C细胞以及TC-1L细胞进行处理。
二、实验结果及分析
CCK8实验显示：50、100、200μg/mL细胞膜纳米囊泡P-NV对3T3细胞和BEAS-2B细胞的生长没有明显影响(图1A&B&C)。同时200μg/mL细胞膜纳米囊泡P-NV对TC-1C和TC-1L的生长没有影响(图1D)。以上结果说明本次用于后续装载药物的细胞膜纳米囊泡对细胞本身没有毒性，不影响细胞的活力。
实验例2
评价细胞膜纳米囊泡P-NV对盐酸阿霉素(DOX)和2-脱氧葡萄糖(2-DG)的负载和释放效率
一、实验方法
(A)将2-脱氧葡萄糖(2-DG)负载到细胞膜纳米囊泡P-NV上：将2mL预先准备好的蛋白浓度1mg/mL的粒径小于0.4μM的P-NV水溶液转移至Ultra离心式过滤器(Millipore，UFC201024)，4℃/6000g离心10min左右，将其超滤至体积400μL，随后将超滤管套上收集管并倒转，4℃/4000g，离心3min收集400μL超滤上清。将200μL浓度为2.5M的2-DG水溶液加入超滤收集的400μl的P-NV，轻轻混匀，放入4℃摇床孵育过夜。随后将孵育液转移至/>Ultra离心式过滤器，4℃/6000g离心15min，收集530μL超滤下清，为未负载到P-NV的游离2-DG。之后将超滤管套上收集管并倒转，4℃/4000g，离心3min收集60μL超滤上清，为负载2-DG的细胞膜纳米囊泡P-NV(简称PG-NV)。将盐酸阿霉素(DOX)负载到细胞膜纳米囊泡P-NV上：实验方法参照实验例2方法A，不同的是在于将200μl的20mM的DOX水溶液直接稀释到1.8mL的预先准备好的蛋白浓度1mg/mL的粒径小于0.4μM的P-NV水溶液中，轻轻混匀，放入4℃摇床孵育过夜。随后将孵育液在4℃/4000g，离心60min，收集上清，为未负载到P-NV的游离DOX。随后将负载DOX的细胞膜纳米囊泡P-NV沉淀(简称PD-NV)重悬到200μL水溶液中。
(B)PG-NV在PBS中释放2-DG的测定：将PG-NV取50μL(利用实验例2，方法A中的制备方式制备)重悬到8mL PBS(PH＝7.3)中，充分混匀，随后取出7mL并均分成7份，置于37℃摇床孵育(180rpm/min)，用于检测0h、2h、4h、8h、16h、24h时PG-NV在PBS中2-DG的释放率。在对应时间点将含有PG-NV的PBS溶液转移至Ultra离心式过滤器中，4℃/6000g，离心20min，收集离心后的清澈溶液用于光谱分析。光谱分析采用离子色谱仪(Thermo science，ICS5000+)，DIONEX Carbo Pac PA10色谱柱(4mm x 250mm)，流动相为氢氧化钠溶液(c＝18mmol/L，流速＝0.8mL/min)，并使用脉冲安培检测器检测在不同的时间点(0h、2h、4h、8h、16h、24h)检测2-DG在溶液中的含量。峰面积由脉冲安培检测器检测，并计算10分钟-13分钟的峰面积。PD-NV在水中释放DOX的检测：实验方法参照实验例2方法A，不同的是在于将方法A中制备的取100μL的PD-NV重悬到8mL去离子水中，充分混匀，随后取出7mL并均分成7份，置于37℃摇床孵育，用于检测0h、2h、4h、8h、16h、24h时PD-NV在去离子水中DOX的释放率。随后至指定时间点将孵育液在4℃/14000g，离心60min，收集上清用于后期的酶标仪(TECAN)检测。根据DOX在595nM处的吸光值，对DOX进行定量分析。
二、实验结果及分析
从离子色谱2-DG峰面积检测结果计算2-DG浓度，通过酶标仪荧光强度计算DOX浓度。通过分析，我们发现通过孵育的方法P-NV对2-DG的负载率≈58％(药物/蛋白质重量比)，P-NV对DOX的负载率≈69％(药物/蛋白质重量比)(图2A)。同样的方式分析PG-NV和PD-NV分别在各时间点的药物释放率，发现在0h到8h之间，随着时间增长PG-NV会大量释放2-DG，随后逐渐达到释放的平台期，释放率85％左右。而PD-NV在2h内快速释放21％左右DOX，随后到达释放的平台期(图2B)。
实验例3
评价细胞膜纳米囊泡负载不同药物对TC-1C和TC-1L细胞的细胞毒性
一、实验方法
(A)检测不同浓度的PD-NV对TC-1C细胞和TC-1L细胞的细胞活力影响：方法参照实验例1方法A，不同的是在于用PD-NV(蛋白浓度0、1.5625μg/mL、3.125μg/mL、6.25μg/mL、12.5、25μg/mL)代替P-NV(蛋白浓度50μg/mL)，细胞活力测定时间设置为24h。
(B)检测不同时间点PG-NV处理对TC-1C细胞和TC-1L细胞的细胞活力影响：方法参照实验例1方法A，不同的是在于用PG-NV(蛋白浓度100μg/mL)代替P-NV(蛋白浓度50μg/mL)。细胞活力测定时间设置为1天、3天、5天。
(C)检测PDG-NV处理对TC-1C细胞和TC-1L细胞的细胞活力影响：参照实验例2方法A和B将DOX和2-DG负载到P-NV，称为PDG-NV。随后细胞活力测定的方法参照实验例1方法A，不同的是在于用PDG-NV(蛋白浓度6.25μg/mL、12.5μg/mL)代替P-NV(蛋白浓度50μg/mL)。细胞活力测定时间设置为12h、24h、48h。
二、实验结果及分析
分析细胞活力测定结果，PD-NV在24h就能在较低浓度且具有剂量依赖性地抑制TC-1C细胞和TC-1L细胞的细胞活力，且对TC-1L细胞的影响更显著(图3A)。100μg/mL的PG-NV能时间依赖性的抑制TC-1C细胞和TC-1L细胞的细胞活力，且对TC-1L细胞的影响更显著(图2B)。低剂量(12.5μg/mL、6.25μg/mL)的PDG-NV在较短时间内就能有效抑制TC-1C细胞和TC-1L细胞的细胞活力，且PDG-NV具有显著的剂量依赖性和时间依赖性，且对TC-1L细胞的细胞活力影响更显著(图3C)。结合实验例1，图1D，200μg/mL的P-NV对TC-1C细胞和TC-1L细胞的细胞活力没有影响。这些结果说明：细胞膜纳米囊泡负载2-DG和DOX后，在较低浓度和较短时间上就可以有效的抑制肿瘤细胞TC-1C和TC-1L细胞的活性，具有非常显著的协同增效作用。
实验例4
相对于高浓度的游离2DG，教低浓度的PG-NV处理就能抑制靶细胞内糖酵解产生的ATP水平，且相比于TC-1C细胞，PG-NV对TC-1L细胞的ATP水平抑制效果更强
一、实验方法
(A)检测高浓度的游离2-DG处理对TC-1C细胞和TC-1L细胞的ATP水平影响：方法参照实验例1方法A，不同的是在于用较高浓度的游离2-DG(0、1.25mM、2.5mM、5mM、10mM)替代P-NV(蛋白浓度50μg/mL)，处理24h后，通过ATP检测试剂盒(promega，G7573)评估细胞产生的ATP水平。
(B)检测PG-NV处理对TC-1C细胞和TC-1L细胞的ATP水平影响：方法参照实验例1方法A，不同的是在于用PG-NV(蛋白浓度200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、0)替代P-NV(蛋白浓度50μg/mL)。根据2-DG的装载效率换算后(图2A)，不同浓度的蛋白分别对应0.7mM、0.35mM、0.16mM、0.09mM、0.04mM、0的2-DG。
二、实验结果及分析
通过检测细胞产生的ATP水平，我们发现：高浓度的游离2-DG可以随着药物处理浓度增大而显著抑制TC-1C细胞和TC-1L细胞细胞产生的ATP水平，且对两种靶细胞产生的ATP水平无显著(图4A)。而低浓度的PG-NV也能随着囊泡浓度增大而显著抑制TC-1C细胞和TC-1L细胞产生的ATP水平，且对TC-1L细胞ATP水平的影响更显著(图4B)。以上结果表明：P-NV装载2-DG后(PG-NV)可以在更低的浓度，对肺癌细胞具有更强的细胞毒性且可以更显著的抑制抑制靶细胞内的糖酵解作用。PG-NV相对于P-NV和游离的2-DG，具有显著的增效作用。
实验例5
相对于高浓度的游离2-DG，低浓度的PG-NV也能促进TC-1L细胞内的mPD-L1蛋白降解
一、实验方法
(A)蛋白免疫印迹检测高浓度的游离2-DG处理对TC-1L细胞的mPD-L1降解的影响：TC-1L细胞按每孔5x105个的密度接种到的12孔板中，并在培养箱中过夜培养。将2-DG(2.5mM、5mM、10mM)加入孔中，处理16h，胰酶消化收集细胞，PBS洗一遍(1300rpm离心3min后弃上清)，用RIPA裂解液(Beyotime)在冰上用裂解30min，加入含有5％β-巯基乙醇的5xSDS混匀，随后95℃煮5-10min。按每条泳道40μg蛋白的量将上述已变性蛋白溶液加到10％SDS-PAGE凝胶上，进行变性凝胶电泳。随后使用指定抗体进行免疫印迹分析，包括Anti-β-Actin、Anti-mPD-L1(上图)。下图为：相对于β-Actin，对mPD-L1蛋白表达的定量分析。
(B)蛋白免疫印迹检测低浓度的PG-NV处理对TC-1L细胞的mPD-L1降解的影响：方法参照实验例5方法A，不同的是在于用P-NV(蛋白浓度100μg/mL)或者PG-NV(蛋白浓度50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)替代游离的2-DG(上图)。下图为：相对于β-Actin，对mPD-L1蛋白表达的定量分析。
(C)蛋白免疫印迹检测低浓度的PG-NV处理不同时间点对TC-1L细胞的mPD-L1降解的影响：方法参照实验例5方法A，不同的是在于用PG-NV(蛋白浓度100μg/mL)处理TC-1L细胞1天、2天、3天、5天(上图)。下图为：相对于β-Actin，对mPD-L1蛋白表达的定量分析。
二、实验结果及分析
蛋白质免疫印迹结果显示，高浓度的游离2-DG处理能促进TC-1L细胞的mPD-L1蛋白降解，且2-DG处理浓度越高，TC-1L细胞的mPD-L1蛋白变化越明显(图5A)。而低浓度PG-NV处理也有效促进TC-1L细胞的mPD-L1蛋白降解，且具有明显的剂量和时间依赖性(图5B&C)。以上结果说明：相对于游离的2-DG，PG-NV可以在更低的浓度降解TC-1L细胞的mPD-L1蛋白，具有显著的增效作用。
实验例6
相对于高浓度的游离2-DG，低浓度的PG-NV处理也能促进TC-1C细胞和TC-1L细胞的细胞膜上mPD-L1蛋白降解
一、实验方法
(A)流式细胞术检测高浓度的游离2-DG和低浓度的PG-NV对TC-1L细胞的细胞膜上mPD-L1的影响：方法参照实验例5方法A，不同的是在于用2-DG(1.25mM、2.5mM、5mM、10mM)和PG-NV(蛋白浓度50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)处理TC-1L细胞16h后。将收集的细胞PBS洗一遍(1300rpm离心3min后弃上清)，随后每个样品加入100μL的预先稀释好的(1∶100)耦联PE荧光的PD-L1流式抗体(BioLegend)，轻轻混匀，在冰上避光孵育20min，用预冷PBS洗两遍，加入适量PBS重悬细胞后，FACS统计TC-1L细胞中PD-L1阳性的细胞比例(左图)；右图：PD-L1-PE平均荧光强度统计。
(B)流式细胞术检测分别高浓度的游离2-DG和低浓度的PG-NV对TC-1C细胞的细胞膜上Mpd-L1的影响：方法参照实验例6方法A，不同的是在于用TC-1C细胞替换了TC-1L细胞(左图)；右图：PD-L1-PE平均荧光强度统计
二、实验结果及分析
通过流式检测发现，TC-1L细胞的细胞膜上mPD-L1蛋白表达很高，高浓度的游离2-DG和低浓度的PG-NV均能以一种剂量依赖性的方式促进TC-1L细胞的细胞膜上mPD-L1蛋白降解(图6A)。TC-1C细胞的细胞膜上mPD-L1蛋白表达极低，用高浓度的游离2-DG和低浓度的PG-NV处理同样能促进TC-1C细胞的细胞膜上mPD-L1蛋白降解(图6B)。以上结果说明：相对于游离的2-DG，PG-NV可以在更低的浓度降解TC-1C和TC-1L细胞膜上的mPD-L1蛋白，具有显著的增效作用。
实验例7
评价细胞膜纳米囊泡P-NV以及P-NV负载不同的药物(PG-NV、PD-NV、PDG-NV)对小鼠肺癌移植瘤增长的影响及相关病理分析。
一、实验方法
(A)小鼠移植瘤模型建立：准备好的小鼠肺癌细胞TC-1L，用PBS和Matrigel基质胶(CORNING)比例为1∶1的混合液重悬(每100μL混合液中含有8x105个细胞)，置于冰上备用。将包含肿瘤细胞的混合液接种到6周龄C57BL/6小鼠背部的侧面，每个接种点注入100μL体积的肿瘤细胞混合液。当肿瘤体积达到80-90mm3左右时，将小鼠进行随机分组，分别是PBS组(control)、P-NV治疗组、PG-NV治疗组、PD-NV治疗组和PDG-NV治疗组，对五组小鼠同步进行给药(每次按1mg/kg剂量行尾静脉注射给药，每两天给药一次)并称量小鼠体重。
(B)待小鼠肿瘤体积达到80-90mm3左右后，分别在第0天，4天，8天，12天，16天测量肿瘤的大小。具体方法是：利用游标卡尺，量取小鼠肿瘤的最大直径(记为D)以及小鼠肿瘤的最小直径(记为d)，利用公式计算小鼠的肿瘤体积体积(记为V)，公式为：V(cm3)＝D×d2/2。将计算好的肿瘤体积，利用软件GraphPad Prism作图，进而绘制出小鼠肿瘤的生长曲线。
(C)待小鼠的治疗结束后，达到治疗终点时，对小鼠进行安乐死，解剖出肿瘤拍照，并对肿瘤称量重量进行统计。
(D)小鼠肺组织的石蜡切片进行Ki67染色：对于实验例7A中的小鼠，在实验终点处，对小鼠进行安乐死，然后解剖小鼠，取出小鼠的肺组织。(1)将肺组织放入10％的福尔马林固定液中浸没，放入摇床室温转动24h。之后，将肺叶取出并放入免疫组化夹中，依次浸泡在70％乙醇、80％乙醇和90％乙醇中各30分钟，然后依次浸泡于1∶1的无水乙醇和二甲苯混合液、二甲苯I、二甲苯II各15分钟，随后用石蜡包埋机对处理过的肺组织进行包埋。使用组织切片机对将包埋好的蜡块进行切片(3-5微米厚度)，将组织切片舒展于温水表面，轻柔将切片贴至载玻片，最后烘干备用。(2)参照Ki-67抗体(免疫组化法)使用说明书。(a)将预先配置抗原修复液(1∶50)置于全自动免疫组化预处理系统(PT Link)中温热至65℃，将石蜡切片浸泡于抗原修复液中。(c)将调整仪器温度至95℃，维持20分钟，随后缓慢将温度降至65℃。(d)取出切片浸泡于洗脱缓冲液中5分钟，随后固定到组织染色机上。(e)用过氧化物酶阻断剂处理5分钟，随后洗脱液冲洗1分钟，一抗处理20分钟，洗脱液冲洗1分钟，HRP偶联的二抗处理20分钟，洗脱液冲洗1分钟。(f)DAB显色10分钟，超纯水冲洗1分钟。(g)苏木素复染5分钟，超纯水冲洗1分钟，随后依次放入70％乙醇2分钟，80％乙醇2分钟，90％乙醇2分钟，无水乙醇2分钟，随后二甲苯浸泡5分钟，二甲苯浸泡5分钟。(h)最后用中性树胶封固石蜡切片，静置风干，在显微镜进行观察和拍照。
二、实验结果及分析
以上结果说明：细胞膜纳米囊泡单载DOX(PD-GV)、2-DG(PG-NV)或者双载DOX和2-DG(PDG-NV)对荷瘤小鼠体重无影响，毒性低(图7A)。小鼠接受不同的治疗(PBS、P-NV、PG-NV、PD-NV或者PDG-NV)后，细胞膜纳米囊泡单载DOX(PD-GV)、2-DG(PG-NV)可以不同程度的抑制小鼠肺癌移植瘤的生长。细胞膜纳米囊泡同时装载DOX和2-DG(PDG-NV)可以显著的抑制小鼠肺癌移植瘤的增长(图7B&C&D)。小鼠接受不同的治疗(PBS、P-NV、PG-NV、PD-NV或者PDG-NV)两周后，小鼠肿瘤切片的Ki67染色(图7E&F)显示，相对于P-NV、PG-NV以及PD-NV，PDG-NV的治疗可以显著的抑制小鼠移植瘤中肿瘤细胞的增殖。以上结果共同说明：细胞膜纳米囊泡同时装载DOX和2-DG(PDG-NV)可以显著的抑制小鼠肺癌移植瘤的增长，具有明显的协同增效作用，基本达到治愈肺癌移植瘤的效果。
实验例8
评价细胞膜纳米囊泡P-NV以及P-NV负载不同的药物(PG-NV、PD-NV、PDG-NV)对小鼠生理状态的影响。
一、实验方法
对于实验例7A中的小鼠，在实验终点处，对小鼠进行安乐死，然后解剖小鼠，取出小鼠的心、肝、脾、肺、肾组织。按照实验例7，方法E，不同的是在于用H&E染色代替Ki67染色。H&E的具体方法如下：预先将各组织组织的石蜡切片于60℃静置半小时，随后参照苏木精-伊红(H&E)染色试剂盒(Mesgen，ME9200)使用说明书进行。(a)石蜡切片脱蜡水化：二甲苯中脱蜡5分钟，二甲苯在脱蜡5分钟，无水乙醇浸泡5分钟，95％乙醇浸泡2分钟，80％乙醇浸泡2分钟，70％乙醇浸泡2分钟，蒸馏水浸泡2分钟。(b)对石蜡片进行染色：苏木素染色8分钟，超纯水冲洗1分钟，超纯水浸泡15分钟，随后伊红染色2分钟，超纯水冲洗1分钟。(d)对石蜡切片进行脱水、透明和封片：将组织切片依次放入95％乙醇1分钟，95％乙醇1分钟，无水乙醇一分钟，二甲苯石碳酸混合液(3∶1)一分钟，二甲苯1分钟，二甲苯1分钟。最后用中性树胶封固石蜡切片，静置风干，在显微镜进行观察和拍照。
二、实验结果及分析
小鼠接受不同的治疗(PBS、P-NV、PG-NV、PD-NV或者PDG-NV)后，两周后检测小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏切片的H&E染色(图8)。以上结果说明，细胞膜纳米囊泡P-NV以及P-NV负载不同的药物(PG-NV、PD-NV、PDG-NV)对小鼠各组织没有明显的损伤，基本不影响小鼠的生活和生理状态。
实验例9
EGFR第19位外显子缺失转基因(简称为：CC10-RTTA/EGFR-DEL)小鼠肺癌模型的诱导及后期治疗流程图。
一、实验方法
(A)本方法利用CC10-RTTA-EGFR癌症驱动基因突变的转基因小鼠的肺癌原位瘤模型评价P-NV负载不同药物对小鼠原位肺癌的治疗效果。CC10蛋白是肺中特异表达的蛋白，Tet-on系统是比较成熟的真核生物外源基因诱导表达系统，RTTA蛋白在强力霉素(Dox)的协助下可以结合特定的TRE序列，从而实现了对TRE元件所连接的目的基因EGFR的转录表达调控。简单来说：CC10-RTTA/EGFR-DEL小鼠在喂养Dox粮食12周左右，即可诱导小鼠在肺部形成原位肺癌肿瘤，进而为后期的治疗提供小鼠模型。
(B)利用实验例9方法A中诱导的小鼠模型，对小鼠进行治疗。在治疗前进行计算机断层扫描(pingseng HEALTHCARE)记录肿瘤的荷瘤情况，当小鼠的肺部形成肿瘤，便可进行治疗。将肺癌小鼠随机分成PBS组(Control)以及P-NV治疗组、PG-NV治疗组、PD-NV治疗组、PDG-NV治疗组，同步进行为期两周的给药治疗(纳米囊泡每次按1mg/kg剂量进行尾静脉注射给药，每两天给药一次)。在治疗期间，通过计算机断层扫描(Computer Tomography，CT)记录7天、14天时肿瘤的荷瘤情况。
实验例10
评价P-NV对CC10-RTTA/EGFR-DEL转基因小鼠的肺癌原位瘤的治疗效果。
一、实验方法
(A)P-NV对CC10-RTTA/EGFR-DEL转基因小鼠的肺癌原位瘤的治疗效果评估。利用实验例9方法A中的小鼠模型，按照实验例9方法B中的治疗方式，对CC10-RTTA/EGFR-DEL转基因肺癌小鼠进行治疗，分别在治疗的第7天、14天时进行CT扫描，评估小鼠的荷瘤情况(左图)。右图是小鼠肺部CT图片肺癌阴影部分的统计。
(B)P-NV对CC10-RTTA/EGFR-DEL转基因小鼠治疗后，肺部H&E染色分析及Ki67阳性细胞分析。按照实验例7方法E和实验例8中方法对小鼠的肺组织进行染色(左图)。不同的是在于用CC10-RTTA/EGFR-DE转基因小鼠的原发肺癌模型替换了TC-1L的肺癌移植瘤模型。右图是组织切片的显微拍照结果的统计及分析。
(C)P-NV对CC10-RTTA/EGFR-DEL转基因小鼠治疗后，肺部组织浸润的CD4阳性(CD4+)和CD8阳性(CD8+)T细胞免疫荧光评价。利用实验例9方法A中的小鼠模型，按照实验例9方法B中的治疗方式，在治疗14天后，按照实验例7方法E对小鼠进行免疫荧光染色(左图)。不同的是在于用驴抗羊-FITC二抗(识别CD8阳性T细胞)，用驴抗羊-CY3二抗(识别CD4阳性T细胞)代替HRP二抗染色，用DAPI代替Ki67染色，以及用荧光显微镜拍照代替普通明视野拍照。右图是肺部组织浸润的CD4阳性(CD4+)和CD8阳性(CD8+)T细胞的个数统计。
二、实验结果及分析
经过两周的治疗，用CT扫描不同治疗组小鼠肺部肿瘤的情况发现，与Control组小鼠(肿瘤面积比治疗前增加了约25％)相比，P-NV治疗组小鼠肺部肿瘤没有明显的增长，面积略有缩小，肺癌小鼠肿瘤面积比治疗前减少约不到10％(图10A)。病理切片的HE染色照片、Ki67染色显示相对于治疗前，病理和Ki67染色也有轻微的减弱(图10B)；肺部浸润的CD4T和CD8 T细胞有轻微的提升(图10C)。所以原位瘤模型的治疗效果说明了P-NV对小鼠的肿瘤微环境的调节也不明显，虽然可以抑制小鼠肺癌的增长，但是肿瘤的消退不明显。
实验例11
评价PG-NV对CC10-RTTA/EGFR-DEL转基因小鼠的肺癌原位瘤的治疗效果。
一、实验方法
(A)PG-NV对CC10-RTTA/EGFR-DEL转基因小鼠的肺癌原位瘤的治疗效果评估。实验方法参照实验例10方法A，不同的是用PG-NV代替P-NV进行治疗。
(B)PG-NV对CC10-RTTA/EGFR-DEL转基因小鼠治疗后，肺部H&E染色分析及Ki67阳性细胞分析。实验方法参照实验例10方法B，不同的是用PG-NV代替P-NV进行治疗。
(C)PG-NV对CC10-RTTA/EGFR-DEL转基因小鼠治疗后，肺部组织浸润的CD4阳性(CD4+)和CD8阳性(CD8+)T细胞免疫荧光评价。实验方法参照实验例10方法C，不同的是用PG-NV代替P-NV进行治疗。
二、实验结果及分析
经过两周的治疗，用CT扫描不同治疗组小鼠肺部肿瘤的情况发现，与Control组小鼠(肿瘤面积比治疗前增加了约25％)相比，PG-NV治疗组小鼠肺部肿瘤得到了一定程度的抑制，面积略有缩小(肺癌小鼠肿瘤面积比治疗前减少约30％)(图11A)。并且从病理切片的HE染色照片和Ki67照片中也得出与CT扫描相一致的结果(图11B)。肺部浸润的CD4 T和CD8T细胞有轻微的提升(图11C)。所以原位瘤模型的治疗效果说明了PG-NV在一定程度上轻微改善小鼠的肿瘤微环境，对CC10-RTTA/EGFR-DEL转基因小鼠肺癌有轻微治疗效果。
实验例12
评价PD-NV对CC10-RTTA/EGFR-DEL转基因小鼠的肺癌原位瘤的治疗效果。
一、实验方法
(A)PD-NV对CC10-RTTA/EGFR-DEL转基因小鼠的肺癌原位瘤的治疗效果评估。实验方法参照实验例10方法A，不同的是用PD-NV代替P-NV进行治疗。
(B)PD-NV对CC10-RTTA/EGFR-DEL转基因小鼠治疗后，肺部H&E染色分析及Ki67阳性细胞分析。实验方法参照实验例10方法B，不同的是用PD-NV代替P-NV进行治疗。
(C)PD-NV对CC10-RTTA/EGFR-DEL转基因小鼠治疗后，肺部组织浸润的CD4阳性(CD4+)和CD8阳性(CD8+)T细胞免疫荧光评价。实验方法参照实验例10方法C，不同的是用PD-NV代替P-NV进行治疗。
二、实验结果及分析
经过两周的治疗，用CT扫描不同治疗组小鼠肺部肿瘤的情况发现，与Control组小鼠(肿瘤面积比治疗前增加了约25％)相比，PD-NV治疗组小鼠肺部肿瘤得到了一定程度的抑制，面积略有缩小(肺癌小鼠肿瘤面积比治疗前减少约45％)(图12A)。并且从病理切片的HE染色照片和Ki67照片中也得出与CT扫描相一致的结果(图12B)。肺部浸润的CD4 T和CD8T细胞有轻微的提升(图12C)。肺部浸润的CD4 T和CD8 T细胞有明显的提升(图11C)。所以原位瘤模型的治疗效果说明了PD-NV在一定程度上改善了小鼠的肿瘤微环境，对CC10-RTTA/EGFR-DEL转基因小鼠肺癌有一定的治疗效果。
实验例13
评价PDG-NV对CC10-RTTA/EGFR-DEL转基因小鼠的肺癌原位瘤的治疗效果。
一、实验方法
(A)PDG-NV对CC10-RTTA/EGFR-DEL转基因小鼠的肺癌原位瘤的治疗效果评估。实验方法参照实验例10方法A，不同的是用PDG-NV代替P-NV进行治疗。
(B)PDG-NV对CC10-RTTA/EGFR-DEL转基因小鼠治疗后，肺部H&E染色分析及Ki67阳性细胞分析。实验方法参照实验例10方法B，不同的是用PDG-NV代替P-NV进行治疗。
(C)PDG-NV对CC10-RTTA/EGFR-DEL转基因小鼠治疗后，肺部组织浸润的CD4阳性(CD4+)和CD8阳性(CD8+)T细胞免疫荧光评价。实验方法参照实验例10方法C，不同的是用PDG-NV代替P-NV进行治疗。
二、实验结果及分析
经过两周的治疗，用CT扫描不同治疗组小鼠肺部肿瘤的情况发现，与Contro1组小鼠(肿瘤面积比治疗前增加了约25％)相比，PDG-NVG治疗组小鼠肺部肿瘤面积略有缩小(肺癌小鼠肿瘤面积比治疗前减少约70％)(图13A)。病理切片HE染色显示：相对于对照组，小鼠肿瘤的面积减少了约90％左右；和Ki67染色显示：肿瘤的增长活性也降低了月85％左右(图13B)。肺部浸润的CD4 T和CD8 T细胞比例，也得到了非常显著的提升(图13C)。所以原位瘤模型的治疗效果说明了同时负载DOX和2-DG的P-NV(PDG-NV)可以大大的改善小鼠肺组织的肿瘤免疫微环境，对EGFR-DEL转基因小鼠肺癌有更加显著的治疗效果，基本达到治愈的目的。由PDG-NV实现的更显著的抗肿瘤效应表明P-NV、2-DG和DOX的对肿瘤组织协同治疗作用。
Claims (9)
1.用于治疗肿瘤的联合药物，其特征在于，由仿生纳米囊泡负载化疗药物盐酸阿霉素DOX和糖代谢抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖2-DG组成。
2.根据权利要求1所述的用于治疗肿瘤的联合药物，其特征在于，所述的仿生纳米囊泡为激活型仿生纳米囊泡。
3.根据权利要求1所述的用于治疗肿瘤的联合药物，其特征在于，所述的仿生纳米囊泡为本身高表达PD1分子。
4.根据权利要求1所述的用于治疗肿瘤的联合药物，其特征在于，所述的仿生纳米囊泡、盐酸阿霉素DOX和糖代谢抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖2-DG按照质量比10∶6.9∶5.8组成。
5.根据权利要求1所述的用于治疗肿瘤的联合药物，其特征在于，所述的仿生纳米囊泡、盐酸阿霉素DOX和糖代谢抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖2-DG按照质量比10∶5∶4组成。
6.根据权利要求1所述的用于治疗肿瘤的联合药物，其特征在于，所述的仿生纳米囊泡、盐酸阿霉素DOX和糖代谢抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖2-DG按照质量比10∶4∶3组成。
7.根据权利要求1所述的用于治疗肿瘤的联合药物，其特征在于，所述的仿生纳米囊泡、盐酸阿霉素DOX和糖代谢抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖2-DG按照质量比10∶3∶2组成。
8.根据权利要求4所述的用于治疗肿瘤的联合药物，其特征在于，所述的仿生纳米囊泡P-NV、2-脱氧-D-葡萄糖2-DG、盐酸阿霉素DOX给药方式均为尾静脉注射。
9.根据权利要求1所述的用于治疗肿瘤的联合药物，其特征在于，所述的肺癌包括原位癌和转移癌。
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