CN116549456A - 氯丙嗪在制备冠状病毒抑制剂中的应用 - Google Patents

氯丙嗪在制备冠状病毒抑制剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了氯丙嗪在制备冠状病毒抑制剂中的应用。本发明提供了氯丙嗪或其在药学上可接受的盐的应用，为如下(a)或(b)或(c)或(d)：(a)在制备冠状病毒抑制剂中的应用；(b)在抑制冠状病毒中的应用；(c)在制备产品中的应用；所述产品的用途为治疗冠状病毒感染引起的疾病；(d)在治疗冠状病毒感染引起的疾病中的应用。本发明通过实验证明氯丙嗪具有良好的抗SARS‑CoV‑2活性和/或抗HCoV‑OC43，具有重要的治疗SARS‑CoV‑2感染和/或HCoV‑OC43感染的应用前景。

Description

氯丙嗪在制备冠状病毒抑制剂中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及氯丙嗪在制备冠状病毒抑制剂中的应用。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)属于巢式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)，为单正链RNA病毒，颗粒呈圆形、椭圆形或轻度多形性，直径为100～120nm。SARS-CoV-2表面有结构蛋白包膜，分别为刺突糖蛋白(S蛋白)突起、小包膜糖蛋白(E蛋白)，膜蛋白(M蛋白)和核衣壳蛋白(N蛋白)。新冠病毒的基因组排列为：5’-mGcap-ORF1ab-S-ORF3-E-M-ORF7-ORF8-ORF10b-N(ORF13-ORF14)-polyA-3’，编码16种具有调节功能的非结构蛋白(nsp1至nsp16)。这16个非结构蛋白形成由多种酶组成的复制酶-转录酶复合物(RTC)，包括木瓜蛋白酶样蛋白酶(nsp3)，胰凝乳蛋白酶样主蛋白酶(3CL蛋白酶，nsp5)，引物酶复合物(nsp7-nsp8)，RNA依赖性RNA聚合酶RdRp(nsp12)，解旋酶(nsp13)和外核糖核酸酶(nsp14)。
新型冠状病毒侵入宿主细胞后，大量复制，新冠病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)即nsp12作为病毒基因组转录和复制的关键酶便开始快速发挥作用，正链mRNA通过RdRp转录为负链RNA后，RdRp再次发挥酶促作用将其逆转录为更多的正链RNA，后翻译成蛋白质，即可直接影响病毒遗传物质RNA的合成。新冠病毒的RNA聚合酶是由病毒自身编码的RNA依赖的RNA聚合酶，与哺乳动物细胞内的DNA依赖的RNA聚合酶完全不同；另外，新冠病毒编码聚合酶各亚基的基因序列在不同新冠病毒毒株间高度保守，使得新冠病毒RNA聚合酶是极赋潜力的抗新冠病毒药物靶标。
氯丙嗪是吩噻嗪类代表药物，是中枢多巴胺受体的拮抗剂，临床上常作为抗精神病药物。氯丙嗪口服易吸收，口服2-4小时血药浓度达高峰，持续6小时左右。肌内注射后达血药浓度高峰迅速，90％与血浆蛋白结合。脑中浓度比血浓度高10倍。可通过胎盘屏障，进入胎儿体内。在肝脏以氧化或与葡萄糖醛酸结合，代谢产物中7-羟基氯丙嗪仍有药理活性。主要经肾脏排出，排泄较慢。
发明内容
本发明的目的是提供氯丙嗪在制备冠状病毒抑制剂中的应用。
本发明提供了氯丙嗪或其在药学上可接受的盐的应用，为如下(a)或(b)：
(a)在制备冠状病毒抑制剂中的应用；
(b)在抑制冠状病毒中的应用。
本发明还提供了氯丙嗪或其在药学上可接受的盐的应用，为如下(c)或(d)：
(c)在制备产品中的应用；所述产品的用途为治疗冠状病毒感染引起的疾病；
(d)在治疗冠状病毒感染引起的疾病中的应用。
本发明还提供了氯丙嗪或其在药学上可接受的盐的应用，为如下(e)或(f)或(g)或(h)：
(e)在制备冠状病毒RdRp抑制剂中的应用；
(f)在抑制冠状病毒的RdRp活性中的应用；
(g)在制备冠状病毒RNA复制抑制剂中的应用；
(h)在抑制冠状病毒RNA复制中的应用。
示例性的，所述产品可为药物、疫苗或药物制剂。
所述产品为药物时，除含有氯丙嗪或其在药学上可接受的盐外，还可含有适宜的载体材料。这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中优选的是水溶性载体材料。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等；腔道给药，如经直肠和阴道；呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药。
上述应用中，制备药物时，氯丙嗪或其在药学上可接受的盐可作为有效成分之一，也可作为唯一有效成分。
上述应用中，制备药物时，氯丙嗪或其在药学上可接受的盐可作为活性成分之一，也可作为唯一活性成分。
本发明还提供了药用化合物，其特征在于：所述药用化合物的活性成分为氯丙嗪或其在药学上可接受的盐。
所述药用化合物用于抑制冠状病毒。
所述药用化合物用于治疗冠状病毒感染引起的疾病。
所述药用化合物用于抑制冠状病毒的RNA复制。
所述药用化合物用于抑制冠状病毒的RdRp活性。
本发明还提供了抑制冠状病毒感染动物的方法，包括如下步骤：给受体动物施用氯丙嗪或其在药学上可接受的盐以抑制冠状病毒感染动物。
本发明还提供了治疗冠状病毒感染引起的疾病的方法，包括如下步骤：给受体动物施用氯丙嗪或其在药学上可接受的盐以治疗冠状病毒感染引起的疾病。
RdRp的全称为RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp，也称为nsp12)。
氯丙嗪或其在药学上可接受的盐通过靶向RdRp发挥抗冠状病毒作用。
以上任一所述冠状病毒可为β属冠状病毒。
示例性的，所述冠状病毒为SARS-CoV-2或HCoV-OC43。
本发明中，所述动物可为哺乳动物，如人。
所述动物还可为除哺乳动物以外的所述病毒感染的其他动物。
冠状病毒感染引起的疾病可为呼吸系统感染和/或消化系统感染。所述呼吸系统感染为呼吸道感染和/或肺部感染。所述呼吸道感染可为鼻咽炎、鼻炎、咽喉炎、气管炎和/或支气管炎。所述肺部感染可为肺炎。所述消化系统感染可为腹泻。
冠状病毒感染引起的疾病可为病毒性肺炎、严重急性呼吸综合征等。
SARS-CoV-2，其序列特征包括但不局限于代表病毒(发表于
Lancet.2020Jan30.pii:S0140-6736(20)30251-8.doi:10.1016/S0140-6736(20)30251-8.)。
本发明中，术语“药学上可接受的盐”指在可靠的医学判断范围内，适合用于与人类和低等动物的组织接触而不出现过度的毒性、刺激、过敏反应等，且与合理的效果/风险比相称的盐。药学可接受的盐是本领域公知的。例如，S.M.Berge,et al.,J.Pharmaceutical Sciences,1977,66:1中对药学可接受的盐进行了详细描述。
本发明通过实验证明氯丙嗪能在低细胞毒性的前提下体外有效抑制SARS-CoV-2和/或HCoV-OC43的复制，具有良好的抗SARS-CoV-2活性和/或抗HCoV-OC43，具有重要的治疗SARS-CoV-2感染和/或HCoV-OC43感染的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中氯丙嗪对SARS-CoV-2RdRp的抑制活性的结果。
图2为实施例2中氯丙嗪在mRNA水平抑制SARS-CoV-2RdRp的转录活性的结果。
图3为实施例3中氯丙嗪的细胞毒性的结果。
图4为实施例4中氯丙嗪对新冠病毒核酸外切酶nsp14的抗性的结果。
图5为实施例5中细胞水平上氯丙嗪抗HCoV-OC43的活性的结果。
图6为实施例6中细胞水平上氯丙嗪抗SARS-CoV-2的活性的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。pCMV6-entry载体：ORIGEN公司。pRetroX-Tight-Pur载体：Clontech公司。DMSO：二甲基亚砜。瑞德西韦：美国Selleck生物科技有限公司产品，货号为S8932。Vigofect：Vigorous公司,货号为T001。实施例中所用的细胞裂解液为1×CellLysis(Promega,Madison,WI,USA)。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例中，通过CoV-RdRp-Gluc模型验证氯丙嗪对聚合酶的抑制活性。CoV-RdRp-Gluc模型为新冠病毒SARS-CoV-2RdRp特异启动的荧光素酶报告系统。
CoV-RdRp-Gluc模型包括质粒pCoV-Gluc、质粒pCOVID19-nsp7(简称为nsp7质粒)、质粒pCOVID19-nsp8(简称为nsp8质粒)和质粒pCOVID19-nsp12(简称为nsp12质粒)。质粒pCoV-Gluc：将序列表的序列1所示的双链DNA分子(序列表的序列1中，第272-829位核苷酸为Gluc基因，Gluc基因的上游和下游分别为新冠病毒的5′UTR和3′UTR)插入pRetroX-Tight-Pur载体的BamHI和Notl酶切位点之间，得到质粒pCoV-Gluc。nsp7质粒、nsp8质粒和nsp12质粒，均为真核密码子优化的质粒。nsp7质粒是将nsp7基因(如序列表的序列2所示)通过XhoI酶切位点无缝克隆到pCMV6-entry载体所获得的重组质粒。nsp8质粒是将nsp8基因(如序列表的序列3所示)通过XhoI酶切位点无缝克隆到pCMV6-entry载体所获得的重组质粒。nsp12质粒是将nsp12基因(如序列表的序列4所示)通过XhoI酶切位点无缝克隆到pCMV6-entry载体所获得的重组质粒。
CoV-RdRp-Gluc模型的原理：在CMV启动子的作用下，正链的Gluc(mRNA)发生转录，经翻译产生Gluc蛋白；当在系统中同时表达新冠病毒RNA依赖的RNA聚合酶(nsp12)时，RdRp首先以正链的Gluc为模板合成负链的vRNA，随后vRNA被转录为正链Gluc(mRNA)，最终翻译成Gluc蛋白；因此，加入RdRp后增加的Gluc反映了SARS-CoV-2RdRp的活性。nsp12发挥功能时需要nsp7和nsp8的参与。
如无特殊说明，细胞培养条件均为：置于37℃，5％ CO2细胞培养箱中培养。
氯丙嗪，CAS登记号是50-53-3，化学名为3-(2-氯-10H-吩噻嗪-10-基)-N，N-二甲基丙-1-胺，结构式见式(I)。用于实施例的氯丙嗪，为美国Selleck生物科技有限公司产品，货号为S5749。
实施例1、对SARS-CoV-2RdRp的抑制活性(细胞水平)
一、化合物对SARS-CoV-2RdRp的抑制活性
1、取6孔板，接种293T细胞(5×105个/孔)，采用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养24小时。
2、完成步骤1后，借助Vigofect共转染pCoV-Gluc质粒、nsp12质粒、nsp7质粒和nsp8质粒(0.71μg质粒/孔，上述四种质粒的质量配比依次为1:10:30:30，总量为0.71μg)，培养4小时。
3、完成步骤2后，弃除上清，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基，培养12小时。
4、完成步骤3后，收集细胞，用胰酶消化后重悬于含10％胎牛血清的DMEM培养基，得到细胞浓度为1.0×104个细胞/100μL的细胞悬液。
5、取96孔板，接种步骤4得到的细胞悬液(100μL/孔)。
6、取完成步骤5的96孔板，试验组加入1mM氯丙嗪溶液(1μL/孔)，阳性对照组加入1mM瑞德西韦溶液(1μL/孔)，阴性对照组加入DMSO(1μL/孔)，然后培养24小时。1mM氯丙嗪溶液是将氯丙嗪溶于DMSO得到的。1mM瑞德西韦是将瑞德西韦溶于DMSO得到的。
7、完成步骤6后，收集上清作为供试样本，检测荧光素酶活性。
荧光素酶活性的检测方法包括如下步骤：
①将腔肠素-H底物溶于600微升无水乙醇，得到1.022mM底物母液，-20℃备用。
腔肠素-H底物：Promega公司，货号为S2011。
②取底物母液，用PBS缓冲液(pH7.4)稀释，使底物浓度为16.7μmol/L，室温避光孵育30分钟，即为底物工作液。
③取白色不透明、平底的96孔板，加入供试样本(10μL/孔)和底物工作液(60μL/孔)，持续收集信号0.5秒，原始输出结果为相对光单位Relative Light Units(RLU)。
将阴性对照组上清检测荧光素酶活性的原始输出结果作为100％，计算试验组上清和阳性对照组上清的相对值。结果见图1的A(***P<0.001，以阴性对照组为参照)。
结果显示，相比于阴性对照组，氯丙嗪对SARS-CoV-2RdRp的抑制活性约70％。
二、化合物对SARS-CoV-2RdRp的EC50测定
步骤1至5同步骤一的1至5。
6、取完成步骤5的96孔板，试验组加入氯丙嗪溶液(1μL/孔)，阳性对照组加入瑞德西韦溶液(1μL/孔)，阴性对照组加入DMSO(1μL/孔)，然后培养24小时。
体系中的氯丙嗪浓度分别设置为1.25、2.5、5、10、20、40或80μM；体系中的瑞德西韦浓度分别设置为0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10或20μM。
7、完成步骤6后，收集上清作为供试样本，检测荧光素酶活性。
荧光素酶活性的检测方法同步骤一的7。
相对SARS-CoV-2RdRp抑制率＝(1-试验组上清液或阳性对照组上清液进行检测的原始输出结果/阴性对照组上清液进行检测的原始输出结果)×100％。
结果见图1的B和C(横坐标的log指的是以log10浓度，浓度为体系中的氯丙嗪浓度或体系中的瑞德西韦浓度)。氯丙嗪抑制SARS-CoV-2RdRp的EC50值为4.41μM。
结果表明，氯丙嗪是极具潜力的SARS-CoV-2RdRp抑制剂。
实施例2、在mRNA水平上抑制SARS-CoV-2RdRp的转录活性
1、取6孔板，接种293T细胞(5×105个/孔)，采用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养24小时。
2、完成步骤1后，借助Vigofect共转染pCoV-Gluc质粒、nsp12质粒、nsp7质粒和nsp8质粒(0.71μg质粒/孔，上述四种质粒的质量配比依次为1:10:30:30，总量为0.71μg)，培养4小时。
3、完成步骤2后，弃除上清，加入含供试化合物和10％胎牛血清的DMEM培养基，培养24小时。供试化合物为氯丙嗪时，设置两个浓度，即5.00μM与10.00μM。供试化合物为瑞德西韦时，设置两个浓度，即2μM与10μM。设置不加入供试化合物的对照处理(即0浓度处理)。
4、完成步骤3后，收集细胞，提取总RNA，分别使用引物minus-Gluc-RT或引物plus-Gluc-RT将总RNA反转录为cDNA。
minus-Gluc-RT：5'-ACTGTCGTTGACAGGACACG-3'；
plus-Gluc-RT：5'-TGGATCTTGCTGGCGAATGT-3'。
5、以步骤4得到的cDNA为模板，以GAPDH基因为内参基因，通过RT-PCR检测Gluc正负链mRNA的表达量。
用于检测Gluc的引物如下：
Gluc-F：5'-CGGGTGTGACCGAAAGGTAA-3'；
Gluc-R：5'-TGGATCTTGCTGGCGAATGT-3'。
用于检测GAPDH基因的引物如下：
GAPDH-F：5'-GTCCACTGGCGTCTTCACCA-3'；
GAPDH-R：5'-GTGGCAGTGATGGCATGGAC-3'。
RT-PCR的反应程序：95℃30s，1个循环；95℃5s、60℃30s，40个循环。
结果见图2。氯丙嗪在5.00μM与10.00μM的浓度下可以剂量依赖性抑制正链RNA和负链RNA的转录，其中使正链mRNA的水平分别下降到50.10％和38.64％，使负链mRNA的水平分别下降到31.93％和11.45％。以上结果说明，氯丙嗪能够显著抑制新冠病毒RNA的合成。
实施例3、细胞毒性
为了排除氯丙嗪的细胞毒性对SARS-CoV-2RdRp抑制效果造成的非特异性干扰。使用CCK-8(Cell Counting Kit-8)试剂盒检测氯丙嗪对293T细胞的细胞毒性。CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。WST-8(水溶性四唑盐)，化学名为2-(2-甲基氧-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)，是一种类似于MTT的化合物。在电子耦合试剂存在的情况下，WST-8可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan；细胞增殖越多越快，颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。通过酶联免疫检测仪在450nm波长处测定光吸收值，可间接反映活细胞数量。
1、用含10％胎牛血清的DMEM培养基悬浮293T细胞，得到细胞浓度为2.5×104个细胞/100μL的细胞悬液。
2、取96孔板，试验孔、阳性对照孔和阴性对照孔均加入步骤1得到的细胞悬液(100μL/孔)，空白对照孔预留，培养24小时。
3、完成步骤2后，取所述96孔板，试验孔加入氯丙嗪溶液(1μL/孔)，阳性对照孔加入瑞德西韦溶液(1μL/孔)，阴性对照孔加入DMSO(1μL/孔)，空白对照孔加入100μL含10％胎牛血清的DMEM培养基，培养48小时。
氯丙嗪溶液：将氯丙嗪溶于DMSO，且使其为不同浓度。
瑞德西韦溶液：将瑞德西韦溶于DMSO，且使其为不同浓度。
4、完成步骤3后，取所述96孔板，每孔加入10μL CCK-8溶液，孵育1-2小时后，使用Enspire2300Multiable酶标仪(PekinElmer)检测各孔在450nm波长处的光吸收值。
相对细胞存活率＝样品孔的OD450nm/空白对照孔的OD450nm。
结果见图3(横坐标的log指的是以log10浓度，浓度为体系中的氯丙嗪浓度或体系中的瑞德西韦浓度)。结果显示，氯丙嗪对293T细胞的CC50值大于100μM。
实施例4、对新冠病毒核酸外切酶nsp14的抗性
在RdRp复制复合物中，外切核糖核酸酶nsp14及其辅助因子nsp10在冠状病毒复制过程中发挥校对功能，可以将复制过程中掺入的错误诱变核苷酸从病毒RNA中切除，从而产生对核苷酸类似物抑制剂的抗性。许多核苷酸类似物抑制剂如利巴韦林被nsp14和nsp10从病毒RNA链中切除，从而极大地影响其抗病毒活性。因此，需要研究在nsp14和nsp10存在的情况下，氯丙嗪对RdRp的抑制活性是否受到影响。
质粒pCOVID19-nsp10(简称nsp10质粒)和质粒pCOVID19-nsp14(简称nsp14质粒)，均为真核密码子优化的质粒。nsp10质粒是将nsp10基因(如序列表的序列5所示)通过XhoI酶切位点无缝克隆到pCMV6-entry载体所获得的重组质粒。nsp14质粒是将nsp14基因(如序列表的序列6所示)通过XhoI酶切位点无缝克隆到pCMV6-entry载体所获得的重组质粒。
1、取6孔板，接种293T细胞(5×105个/孔)，采用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养24小时。
2、完成步骤1后，借助Vigofect共转染pCoV-Gluc质粒、nsp12质粒、nsp7质粒、nsp8质粒、nsp10质粒和nsp14质粒(1.21μg质粒/孔，上述六种质粒的质量配比依次为1:10:30:30:25:25，总量为1.21μg)，培养4小时。
3、完成步骤2后，弃除上清，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基，培养12小时。
4、完成步骤3后，收集细胞，用胰酶消化后重悬于含10％胎牛血清的DMEM培养基，得到细胞浓度为1.0×104个细胞/100μL的细胞悬液。
5、取96孔板，接种步骤4得到的细胞悬液(100μL/孔)。
6、取完成步骤5的96孔板，试验组加入氯丙嗪溶液(1μL/孔)，阳性对照组加入瑞德西韦溶液(1μL/孔)，阴性对照组加入DMSO(1μL/孔)，然后培养24小时。
氯丙嗪溶液：将氯丙嗪溶于DMSO，且使其为不同浓度。
瑞德西韦溶液：将瑞德西韦溶于DMSO，且使其为不同浓度。
7、完成步骤6后，收集上清作为供试样本，检测荧光素酶活性。
荧光素酶活性的检测方法同实施例1的步骤一的7。
相对SARS-CoV-2RdRp抑制率＝(1-试验组上清液或阳性对照组上清液进行检测的原始输出结果/阴性对照组上清液进行检测的原始输出结果)×100％。
结果见图4(横坐标的log指的是以log10浓度，浓度为体系中的氯丙嗪浓度或体系中的瑞德西韦浓度)。结果显示，氯丙嗪具有对nsp14较好的抗性，其EC50值为4.40μM。结果表明，氯丙嗪对外切核糖核酸酶nsp14具有良好的抗性，与核苷类似物相比具有很大优势。
实施例5、细胞水平上氯丙嗪抗HCoV-OC43的活性
为了验证氯丙嗪对冠状病毒的抑制活性，对普通冠状病毒HCoV-OC43(GenebankAY391777.1)进行检测。冠状病毒HCoV-OC43记载于如下文献(即文献中的“rOC43-ns2Del-Rluc”)：Shen L,Niu J,Wang C,Huang B,Wang W,Zhu N,Deng Y,Wang H,Ye F,Cen S,TanW.2019.High-throughput screening and identifification of potent broad-spectrum inhibitors of coronaviruses.J Virol93:e00023-19.https://doi.org/10.1128/JVI.00023-19.。
1、用含10％ FBS的DMEM培养基悬浮BHK-21细胞，得到1.0×104个细胞/ml的细胞悬液。
2、取96孔板，接种步骤1获得的细胞悬液(100μL/孔)，培养24小时。
3、完成步骤2后，弃上清，加入含2％ FBS的DMEM培养基(100μL/孔)。
4、完成步骤3后，试验组加入氯丙嗪溶液(1μL/孔)，阳性对照组加入瑞德西韦溶液(1μL/孔)，阴性对照组加入DMSO(1μL/孔)，然后培养1小时。
氯丙嗪溶液：将氯丙嗪溶于DMSO，且使其为不同浓度。
瑞德西韦溶液：将瑞德西韦溶于DMSO，且使其为不同浓度。
5、完成步骤4后，以MOI＝0.01的剂量感染冠状病毒HCoV-OC43，然后培养72小时。
6、完成步骤5后，弃上清，每孔加入50μL细胞裂解液，37℃裂解30min，混匀，每孔取样10μL。
7、完成步骤6后，检测取样样本的荧光素酶活性。
荧光素酶活性的检测方法同步骤一的7。
相对HCoV-OC43抑制率＝(1-试验组上清液或阳性对照组上清液进行检测的原始输出结果/阴性对照组上清液进行检测的原始输出结果)×100％。
结果见图5(横坐标的log指的是以log10浓度，浓度为体系中的氯丙嗪浓度或体系中的瑞德西韦浓度)。试验结果显示，氯丙嗪对HCoV-OC43的EC50值为3.37μM。结果说明，氯丙嗪能够有效抑制冠状病毒HCoV-OC43的复制，可以作为有效的HCoV-OC43抑制剂。
实施例6、细胞水平上氯丙嗪抗SARS-CoV-2的活性
SARS-CoV-2记载于如下文献：Lei X,Dong X,Ma R,et al.Activation andevasion of type I interferon responses by SARS-CoV-2.Nat Commun.2020；11(1):3810.Published 2020Jul 30.doi:10.1038/s41467-020-17665-9。
Vero细胞：ATCC，CCL-81。
细胞培养基：含10％ FBS的DMEM培养基。
1、用细胞培养基悬浮Vero细胞，获得细胞悬液。
2、取48孔板，接种步骤1制备的细胞悬液(400μL/孔；每孔细胞数量为5.0×104个)，培养48小时。
3、完成步骤2后，取所述48孔板，试验组加入1mM氯丙嗪溶液(4μL/孔)，对照组加入DMSO(4μL/孔)，培养1小时。1mM氯丙嗪溶液是将氯丙嗪溶于DMSO得到的。
4、完成步骤3后，取所述48孔板，接种SARS-CoV-2(MOI＝0.05)，培养2小时。
5、完成步骤4后，弃除上清，试验组加入含10μM氯丙嗪的细胞培养基，对照组加入细胞培养基，培养24小时。
6、完成步骤5后，收集上清液。
7、取步骤6得到的上清液，采用Direct-zol RNA miniPrep kit(Zymo research,CA,USA)提取总RNA，然后逆转录得到cDNA，然后采用TaqMan Fast Virus1-step MasterMix(Applied Biosystems,Foster City,CA)处理cDNA，然后进行实时定量PCR，获得ct值。通过标准曲线法，得到拷贝数。
实时定量PCR的仪器：CFX96TM Real-Time PCR System(Bio-Rad,Hercules,CA)。
实时定量PCR中，用于扩增SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的特异性引物如下：
引物F：5’-GACCCCAAAATCAGCGAAAT-3’；
引物R：5’-TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG-3’。
病毒复制率(％)＝(试验孔的拷贝数/对照孔的拷贝数)×100％。
结果见图6。结果显示，相比于对照组，约10μM浓度氯丙嗪对SARS-CoV-2的抑制活性约为60％。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.氯丙嗪或其在药学上可接受的盐的应用，为如下(a)或(b)：
(a)在制备冠状病毒抑制剂中的应用；
(b)在抑制冠状病毒中的应用。
2.氯丙嗪或其在药学上可接受的盐的应用，为如下(c)或(d)：
(c)在制备产品中的应用；所述产品的用途为治疗冠状病毒感染引起的疾病；
(d)在治疗冠状病毒感染引起的疾病中的应用。
3.氯丙嗪或其在药学上可接受的盐的应用，为如下(e)或(f)或(g)或(h)：
(e)在制备冠状病毒RdRp抑制剂中的应用；
(f)在抑制冠状病毒的RdRp活性中的应用；
(g)在制备冠状病毒RNA复制抑制剂中的应用；
(h)在抑制冠状病毒RNA复制中的应用。
4.药用化合物，其特征在于：所述药用化合物的活性成分为氯丙嗪或其在药学上可接受的盐。
5.如权利要求4所述的药用化合物，其特征在于：所述药用化合物用于抑制冠状病毒。
6.如权利要求4所述的药用化合物，其特征在于：所述药用化合物用于治疗冠状病毒感染引起的疾病。
7.如权利要求4所述的药用化合物，其特征在于：所述药用化合物用于抑制冠状病毒的RNA复制。
8.如权利要求4所述的药用化合物，其特征在于：所述药用化合物用于抑制冠状病毒的RdRp活性。
9.抑制冠状病毒感染动物的方法，包括如下步骤：给受体动物施用氯丙嗪或其在药学上可接受的盐以抑制冠状病毒感染动物。
10.治疗冠状病毒感染引起的疾病的方法，包括如下步骤：给受体动物施用氯丙嗪或其在药学上可接受的盐以治疗冠状病毒感染引起的疾病。
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