CN116539781A - 一种坤泰胶囊中阿胶及其异源性成分的检测方法 - Google Patents

一种坤泰胶囊中阿胶及其异源性成分的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种坤泰胶囊中阿胶及其异源性成分的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：(1)将坤泰胶囊内容物制备成供试品溶液；(2)将所述供试品溶液进行超高效液相色谱‑质谱检测，得到特征谱图，根据所述特征谱图测定阿胶特征多肽的含量，并判断异源性成分；所述阿胶特征多肽包括驴源多肽A1、驴源多肽A2；所述异源性成分包括龟甲胶、鹿角胶、黄明胶、新阿胶、牛皮特征肽A、马源寡肽A。本发明在鉴别坤泰胶囊中的阿胶的同时，可以测定坤泰胶囊中阿胶特征多肽含量和检查牛皮和马皮等5种异源成分掺假，为坤泰胶囊的质量控制提供快速简便、灵敏度高、专属性强的新方法，提升坤泰胶囊的品质，保障该制剂的质量安全。

Description

一种坤泰胶囊中阿胶及其异源性成分的检测方法
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种坤泰胶囊中阿胶及其异源性成分的检测方法。
背景技术
坤泰胶囊处方源于医圣张仲景《伤寒论》中的经典名方“黄连阿胶汤”，由黄连、阿胶、熟地黄等制备而成的纯中药制剂，为贵阳新天药业股份有限公司的全国独家品种和国家中药保护品种，收载于《中华人民共和国药典》2020年版一部，具有滋阴清热、安神除烦的功效，阿胶为该处方中的主药之一，在坤泰胶囊中占比约为20％。
随着人们保健意识的增强，以养血滋补功效著称的阿胶越发受到关注。但是，由于驴并不是主要的家畜，对阿胶需求的增加必然会导致原料的短缺。若不进行杂皮胶(马皮、骡皮、牛皮、猪皮、羊皮、废旧皮革等)的检测控制，则将导致含有阿胶原料的所有产品存在潜在质量风险。胶类样品的主要成分为胶原蛋白，不同物种的胶原蛋白的氨基酸序列存在差异，因此使用蛋白酶对胶类样品进行酶解可得到每种胶类样品特有的氨基酸序列肽段(特征肽)。检测阿胶及其有关制剂中杂皮胶的方法已有不少报道，但这些方法往往只针对其中1-2种胶类掺入。
有报道采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS法)检测阿胶、黄明胶和鹿角胶中猪皮特征肽。方法:采用胰蛋白酶进行酶解处理；使用C18色谱柱，柱温30℃，以0.1％甲酸水溶液(A)-0.1％甲酸乙腈溶液(B)为流动相,梯度洗脱，流速0.4mL·min-1，进样量为2μL，电喷雾离子源(ESI+),采用多重反应监测模式(MRM)，正离子模式,对猪皮特征肽目标离子m/z 406.5(双电荷)→657.3和m/z 406.5(双电荷)→556.3进行检测。检测限为11mg·kg-1,阿胶样品中猪皮杂质残留限值为76.7mg·kg-1。(谢强胜.等.“基于酶解法采用超高效液相色谱-串联质谱法检测阿胶、黄明胶、鹿角胶中猪皮特征肽”药物分析杂志，2022,42(01):166-171)。
还有报道建立超高效液相色谱-三重四级杆质谱法(UPLC-MS/MS法)测定驴胶补血颗粒中牛皮源、猪皮源成分。方法用胰蛋白酶对驴胶补血颗粒中胶类成分进行酶解,采用UPLC-MS/MS法，以牛皮源特征肽m/z 641.3(双电荷)→726.2、m/z 641.3(双电荷)→783.3及猪皮源特征肽m/z 774.5(双电荷)→977.8、m/z774.5(双电荷)→1034.6作为检测离子对,离子化模式为ESI+，进行多反应监测。(郑文燕.等，“UPLC-MS/MS法检测驴胶补血颗粒中牛皮源及猪皮源成分”沈阳药科大学学报，2021,38(11):1152-1158)。
因此，建立一种检测方法，可以同时测定坤泰胶囊中阿胶特征多肽的含量并检测猪皮、牛皮和马皮等5种异源成分是否存在掺假情况是本领域的研究重点。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种坤泰胶囊中阿胶及其异源性成分的检测方法，可以同时鉴别坤泰胶囊中的阿胶、测定坤泰胶囊中阿胶特征多肽的含量和检测猪皮、牛皮和马皮等5种异源成分。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种坤泰胶囊中阿胶及其异源性成分的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
(1)将坤泰胶囊内容物制备成供试品溶液；
(2)将所述供试品溶液进行超高效液相色谱-质谱检测，得到特征谱图，根据所述特征谱图测定阿胶特征多肽的含量，并判断异源性成分；
所述阿胶特征多肽包括驴源多肽A1、驴源多肽A2；
所述异源性成分包括龟甲胶、鹿角胶、黄明胶、新阿胶、牛皮特征肽A、马源寡肽A。
本发明采用蛋白酶切技术，以以特征肽为指标，建立一种超高效液相色谱串联质谱测定方法，同时鉴别坤泰胶囊中的阿胶、测定坤泰胶囊中阿胶特征多肽含量和检查猪皮、牛皮和马皮等5种异源成分掺假，为坤泰胶囊的质量控制提供快速简便、灵敏度高、专属性强的新方法，提升坤泰胶囊的品质，保障该制剂的质量安全。
优选地，所述供试品溶液采用如下方法进行制备，所述方法包括：将所述坤泰胶囊内容物采用碳酸氢铵溶液溶解后，离心，取上清液，将所述上清液进行酶解，得到所述供试品溶液。
优选地，所述碳酸氢铵溶液中碳酸氢铵的质量百分含量为0.8-1.2％，例如可以为0.9％、1％、1.1％等。
优选地，所述溶解时的料液比为1:(80-120)，例如可以为1:80、1:85、1:90、1:95、1:100、1:105、1:110、1:115等，以坤泰胶囊内容物为1g计，碳酸氢铵溶液为80-120mL。
上述各项数值范围中的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述酶解采用的酶制剂为胰蛋白酶溶液。
优选地，所述胰蛋白酶溶液中胰蛋白酶的浓度为0.8-1.2μg/μL，例如可以为0.9μg/μL、1μg/μL、1.1μg/μL等。
优选地，所述超高效液相色谱-质谱检测的检测条件如下：采用C18柱，柱温为35-45℃，例如可以为36℃、38℃、40℃、42℃、44℃等，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为甲酸乙腈溶液，进行梯度洗脱，流速为0.2-0.4mL/min，例如可以为0.25mL/min、0.3mL/min、0.35mL/min等，进样体积为0.8-1.2μL，例如可以为0.9μL、1μL、1.1μL等。
优选地，所述梯度洗脱的过程为：0-0.5min，例如可以为0.1min、0.2min、0.3min、0.4min等，流动相A：97％，流动相B：3％；0.5-2.5min，例如可以为0.6min、0.8min、1min、1.2min、1.4min、1.6min、1.8min、2min、2.2min、2.4min等，流动相A：97-10％，例如可以为95％、90％、85％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％等，流动相B：3-90％，例如可以为5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％等；2.5-3.5min，例如可以为2.6min、2.8min、3min、3.2min、3.4min等，流动相A：10-97％，例如可以为20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％等，流动相B：90-3％，例如可以为85％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％等；3.5-4min，例如可以为3.6min、3.7min、3.8min等，流动相A：97％，流动相B：3％。
优选地，所述甲酸水溶液中甲酸的质量百分含量为0.1-0.3％，例如可以为0.15％、0.2％、0.25％等。
优选地，所述甲酸乙腈溶液中甲酸的质量百分含量为0.1-0.3％，例如可以为0.15％、0.2％、0.25％等。
优选地，所述超高效液相色谱-质谱检测的检测条件还包括：采用电喷雾离子化(ESI)正离子模式下多反应监测(MRM)，毛细管电压2.7-2.9kV，例如可以为2.75kV、2.8kV、2.85kV等，离子源温度145-155℃，例如可以为146℃、148℃、150℃、152℃、154℃等，喷雾气与反吹气为N2，去溶剂气流速800-1200L/h，例如可以为900L/h、1000L/h、1100L/h等，去溶剂气温度450-550℃，例如可以为460℃、480℃、500℃、520℃、540℃等。
优选地，所述超高效液相色谱-质谱检测中质谱数据采集及处理软件为MassLynxV4.1工作站。
上述各项数值范围中的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述检测方法还包括制备对照品溶液的步骤，以及采用和供试品溶液相同的检测方法，检测对照品溶液得到特征谱图的步骤。
优选地，所述对照品溶液中的对照品为马源寡肽A、牛皮特征肽A、驴源多肽A1和驴源多肽A2。
优选地，所述对照品溶液采用如下方法进行制备，所述方法包括：分别称取马源寡肽A、牛皮特征肽A溶于碳酸氢铵溶液中，再采用基质溶液稀释，分别得到马源寡肽A、牛皮特征肽A对照品溶液；分别称取驴源多肽A1、驴源多肽A2溶于碳酸氢铵溶液中，分别得到驴源多肽A1、驴源多肽A2对照品溶液。
优选地，所述基质溶液采用如下方法进行制备，所述方法包括：称取阿胶对照药材溶于碳酸氢铵溶液中，得到所述基质溶液。
优选地，所述检测方法还包括制备缺阿胶阴性样品溶液的步骤、制备缺龟甲胶、鹿角胶、黄明胶、新阿胶和马皮胶阴性样品溶液的步骤。
优选地，所述检测方法还包括制备参比溶液是步骤，所述参比溶液中包括龟甲胶、鹿角胶和新阿胶。
优选地，所述检测方法包括如下步骤：
(1)将所述坤泰胶囊内容物采用碳酸氢铵溶液溶解后，离心，取上清液，将所述上清液采用胰蛋白酶溶液进行酶解，得到所述供试品溶液；
所述碳酸氢铵溶液中碳酸氢铵的质量百分含量为0.8-1.2％；所述溶解时的料液比为1:(80-120)；所述胰蛋白酶溶液中胰蛋白酶的浓度为0.8-1.2μg/μL；
(2)将所述供试品溶液进行超高效液相色谱-质谱检测，得到特征谱图，根据所述特征谱图测定阿胶特征多肽的含量，并判断异源性成分；
所述阿胶特征多肽包括驴源多肽A1、驴源多肽A2；
所述异源性成分包括龟甲胶、鹿角胶、黄明胶、新阿胶、牛皮特征肽A、马源寡肽A；
所述超高效液相色谱-质谱检测的检测条件如下：柱温为35-45℃，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为甲酸乙腈溶液，进行梯度洗脱，流速为0.2-0.4mL/min，进样体积为0.8-1.2μL；采用电喷雾离子化正离子模式下多反应监测，毛细管电压2.7-2.9kV，离子源温度145-155℃，喷雾气与反吹气为N2，去溶剂气流速800-1200L/h，去溶剂气温度450-550℃；
所述甲酸水溶液中甲酸的质量百分含量为0.1-0.3％；
所述甲酸乙腈溶液中甲酸的质量百分含量为0.1-0.3％。
上述各项数值范围中的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明采用蛋白酶切技术，以特征肽为指标，建立一种超高效液相色谱串联质谱测定方法，同时鉴别坤泰胶囊中的阿胶、测定坤泰胶囊中阿胶特征多肽含量和检查猪皮、牛皮和马皮等5种异源成分掺假，为坤泰胶囊的质量控制提供快速简便、灵敏度高、专属性强的新方法，提升坤泰胶囊的品质，保障该制剂的质量安全。
附图说明
图1为测试例1中阿胶对照药材溶液的检测谱图；
图2为测试例1中阴性样品溶液的检测谱图；
图3为测试例1中制备例2的供试品溶液的检测谱图；
图4为测试例2中龟甲胶参比溶液的检测谱图；
图5为测试例2中鹿角胶参比溶液的检测谱图；
图6为测试例2中新阿胶参比溶液的检测谱图；
图7为测试例2中黄明胶参比溶液的检测谱图；
图8为测试例2中牛皮特征肽A对照品溶液的检测谱图；
图9为测试例2中马皮胶参比溶液的检测谱图；
图10为测试例2中马源寡肽A对照品溶液的检测谱图；
图11为测试例2中缺龟甲胶、鹿角胶、黄明胶、新阿胶和马皮胶阴性样品溶液的检测谱图；
图12为测试例3中混合对照品溶液的检测谱图；
图13为测试例3中阴性样品溶液的检测谱图；
图14为测试例3中制备例3的供试品溶液的检测谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
本文所用术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，还可包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。
本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显只指单数形式。
本发明所描述的术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例性地”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本文中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例。
以下实施例中试剂或仪器来源如下：
ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪；
Xevo TQS三重四极杆质谱仪(美国Waters公司，包括自动进样器，二元梯度泵，柱温箱，真空脱气机，Masslynx 4.1质谱工作站)；
VX-Ⅲ多管涡旋振荡器(北京藤锦医药科技有限公司)；
EL204电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；
WP-UP-Ⅳ-20型超纯水机(四川沃特尔科技发展有限公司)；
Allegra 30R Centrifuge低温高速离心机(美国Beckman Coulter公司)；
KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；
阿胶对照药材、龟甲胶对照药材、鹿角胶对照药材、黄明胶对照药材、新阿胶对照药材、驴源多肽A1、驴源多肽A2、牛皮特征肽A、马源寡肽A(中国食品药品检定研究院，批号分别为121274-201904、121693-201702、121694-201702、121695-201802、121745-201701、112040-202102、112041-202102、111941-201804、112035-202002)；
碳酸氢铵：分析纯；
胰蛋白酶：序列分析纯，(上海罗恩试剂，批号分别为1066-33-7、9002-07-7)；
坤泰胶囊：每粒装0.5g，(贵阳新天药业股分有限公司，批号分别为210305、210307、210308、210309、210312、210316、210323、210331、210333、210403、210420、210433、210504、210509、210511、210512、210515、210518、210524、211246)。
制备例1
本制备例提供一种马皮胶，所述马皮胶的制备方法如下：
马皮去毛，割成小块，加超纯水超声清洗，晾干，取干皮34.5g，加1％碳酸钠(干皮重量)，加入2倍水，加热至60℃，焯皮30min，清洗，重复2次。熬胶三次，第一次加入2.6倍水熬取胶汁8h，过滤；第二次加入1.4倍水熬取胶汁3h，过滤；第三次加入1.2倍水熬取胶汁3h，过滤。合并胶汁，0.0204倍冰糖(以干皮质量计)加纯化水溶解过滤加入胶汁中，再将0.0224倍豆油、0.0080倍黄酒(以干皮质量计)过滤加入胶汁中，加热浓缩至“挂旗”状态，100℃真空干燥箱干燥获得胶，即为马皮胶。
参照“马皮特征肽的发现及其在阿胶中马皮源成分检测中的应用”，巩丽萍.等，药物分析杂志，2018年，38卷，02期，364-369页，提供的马皮特征肽特征分子离子峰对本制备例的马皮胶进行鉴定，鉴定结果为马皮胶。
制备例2
本制备例提供一种供试品溶液，所述供试品溶液用于阿胶鉴别及异源成分检查，制备方法如下：
精密称取坤泰胶囊内容物0.5g，置50mL量瓶中，加1％碳酸氢铵溶液40mL，超声处理30min(功率250W，频率40kHz)使样品完全溶解，再加1％碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，取溶液1mL，14000r/min离心10min，精密量取上清液800μL，置离心管中，加胰蛋白酶溶液80μL，涡混3min，37℃恒温酶解12h，14000r/min离心10min，取上清液，即得。
胰蛋白酶溶液(临用时配制)：取胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液制成每1μL中含1μg的溶液。
制备例3
本制备例提供一种供试品溶液，所述供试品溶液用于阿胶特征多肽含量测定，制备方法如下：
精密称取坤泰胶囊内容物0.5g，置50mL量瓶中，加1％碳酸氢铵溶液40mL，超声处理30min(功率250W，频率40kHz)使样品完全溶解，再加1％碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，取溶液2mL，14000r/min离心10min，精密量取上清液1mL至5mL量瓶中，加胰蛋白酶溶液1mL，加1％碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，37℃恒温酶解12h，14000r/min离心10min，取上清液，即得。
胰蛋白酶溶液(临用时配制)：取胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液制成每1μL中含1μg的溶液。
制备例4
本制备例提供一种阿胶基质溶液，所述阿胶基质溶液制备方法如下：
分别精密称取阿胶照药材0.1g，置50mL量瓶中，加1％碳酸氢铵溶液40mL，超声处理30min(功率250W，频率40kHz)使样品完全溶解，再加1％碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
制备例5
本制备例提供一种对照品溶液，所述对照品溶液制备方法如下：
精密称取马源寡肽A、牛皮特征肽A、驴源多肽A1和驴源多肽A2对照品，溶于1％碳酸氢铵溶液中，获得浓度分别为0.9880mg/mL、1.1440mg/mL、0.9880mg/mL、1.2800mg/mL的储备液，放置-20℃冰箱保存备用。
分别精密量取适量的马源寡肽A和牛皮特征肽A对照品储备液，用前述阿胶基质溶液稀释至浓度分别为150ug/mL和75ug/mL的对照品溶液；
精密量取驴源多肽A1和驴源多肽A2对照品储备液，用1％碳酸氢铵溶液梯度稀释至0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、1.25μg/mL，即得混合系列对照品溶液。
制备例6
本制备例提供一种缺阿胶阴性样品溶液，制备方法如下：
按照坤泰胶囊处方，以缺阿胶的其余药味照处方量制成缺阿胶阴性样品，精密称取缺阿胶阴性样品0.5g，置50mL量瓶中，加1％碳酸氢铵溶液40mL，超声处理30min(功率250W，频率40kHz)使样品完全溶解，再加1％碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，取溶液1mL，14000r/min离心10min，精密量取上清液800μL，置离心管中，加胰蛋白酶溶液80μL，涡混3min，37℃恒温酶解12h，14000r/min离心10min，取上清液，即得。
胰蛋白酶溶液(临用时配制)：取胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液制成每1μL中含1μg的溶液。
制备例7
本制备例提供一种缺龟甲胶、鹿角胶、黄明胶、新阿胶和马皮胶阴性样品溶液，制备方法如下：
按照坤泰胶囊处方，将阿胶替换为等量的阿胶对照药材，制得缺龟甲胶、鹿角胶、黄明胶、新阿胶和马皮胶阴性样品，精密称取缺龟甲胶、鹿角胶、黄明胶、新阿胶和马皮胶阴性样品0.5g，置50mL量瓶中，加1％碳酸氢铵溶液40mL，超声处理30min(功率250W，频率40kHz)使样品完全溶解，再加1％碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，取溶液1mL，14000r/min离心10min，精密量取上清液800μL，置离心管中，加胰蛋白酶溶液80μL，涡混3min，37℃恒温酶解12h，14000r/min离心10min，取上清液，即得。
胰蛋白酶溶液(临用时配制)：取胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液制成每1μL中含1μg的溶液。
制备例8
本制备例提供一种参比溶液，制备方法如下：
分别精密称取龟甲胶、鹿角胶和新阿胶对照药材0.1g，置50mL量瓶中，加1％碳酸氢铵溶液40mL，超声处理30min(功率250W，频率40kHz)使样品完全溶解，再加1％碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，取上述溶液5mL置100mL量瓶中加入阿胶对照药材粉末0.2g，加入1％碳酸氢铵溶液80mL，超声处理30min，使样品完全溶解，再加1％碳酸氢铵溶液稀释至刻度，取溶液1mL，14000r/min离心10min，精密量取上清液800μL，置离心管中，加胰蛋白酶溶液80μL，涡混3min，37℃恒温酶解12h，14000r/min离心10min，取上清液，即为龟甲胶、鹿角胶和新阿胶混合参比溶液。
同法，分别精密称取马皮胶样品和黄明胶对照药材0.1g，分别置50mL量瓶中，加1％碳酸氢铵溶液40mL，超声处理30min(功率250W，频率40kHz)使样品完全溶解，再加1％碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，取上述溶液5mL置100mL量瓶中加入阿胶对照药材粉末0.2g，加入1％碳酸氢铵溶液80mL，超声处理30min，使样品完全溶解，再加1％碳酸氢铵溶液稀释至刻度，取溶液1mL，14000r/min离心10min，精密量取上清液800μL，置离心管中，加胰蛋白酶溶液80μL，涡混3min，37℃恒温酶解12h，14000r/min离心10min，取上清液，分别得到马皮胶和黄明胶参比溶液。
实施例1
本实施例提供一种超高效液相色谱-质谱检测方法，所述方法如下：
采用Waters BEH C18(2.1mm×50mm，1.7μm)柱；保护柱为Waters Van Guard BEHC18(2.1mm×5mm，1.7μm)柱；柱温40℃；流动相：0.2％甲酸水(A)-0.2％甲酸乙腈(B)，梯度洗脱(0-0.5min，3％B；0.5-2.5min，3％-90％B；2.5-3.5min，90％-3％B；3.5-4.0min，3％B)；流速0.3mL/min，进样体积为1μL。
采用电喷雾离子化(ESI)正离子模式下多反应监测(MRM)，毛细管电压2.8kV，离子源温度150℃，喷雾气与反吹气：N2，去溶剂气流速1000L/h，去溶剂气温度500℃，质谱数据采集及处理软件为MassLynx V4.1工作站。
测试例1
阿胶鉴别的方法学考察
1、专属性试验
吸取制备例4的阿胶基质溶液1mL，14000r/min离心10min，精密量取上清液800μL，置离心管中，加胰蛋白酶溶液80μL，涡混3min，37℃恒温酶解12h，14000r/min离心10min，取上清液，得到阿胶对照药材溶液，精密吸取该对照药材溶液、阴性样品溶液、制备例2的供试品溶液各1μL，选择(m/z)539.8(双电荷)→612.4和539.8(双电荷)→923.8作为检测离子对进行测定。
阿胶对照药材溶液的检测谱图如图1所示，阴性样品溶液的检测谱图如图2所示，制备例2的供试品溶液的检测谱图如图3所示，图中，上图为539.8→923.8，下图为539.80→612.40，如图所示，供试品色谱图中，均同时出现与阿胶对照药材色谱保留时间一致的色谱峰；阴性样品未同时出现与阿胶对照药材色谱保留时间一致的色谱峰，表明处方中其他药味对测定结果无干扰，专属性强。
2、线性关系考察和检测限的测定
取缺阿胶阴性样品0.4g，加入阿胶对照药材0.1g，混匀，置50mL量瓶中，加1％碳酸氢铵溶液40mL，超声处理30min(功率250W，频率40kHz)使样品完全溶解，再加1％碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，制成含有阿胶2mg/mL的模拟样品溶液，精密吸取该溶液1mL、2mL、5mL、10mL、20mL和25mL，置50mL量瓶中，加1％碳酸氢铵溶液稀释至刻度，各取溶液1mL，于14000r/min离心10min，精密量取上清液800μL，置离心管中，加胰蛋白酶溶液80μL，涡混3min，37℃恒温酶解12h，14000r/min离心10min，取上清液，分别制得含阿胶0.04、0.08、0.20、0.40、0.80、1.00mg/mL阿胶的标准曲线溶液，按实施例1检测条件进样分析，以阿胶特征分子离子峰(m/z)539.8(双电荷)→612.4提取的离子流色谱图峰面积(y)与阿胶的浓度(x)绘制标准曲线，计算回归方程：y＝80257x+859.09，r＝0.9998，根据信噪比计算最低检出限(LOD，S/N≥3)为0.013mg/mL。结果表明，阿胶浓度在0.04-1.00mg/mL内，阿胶浓度与该离子对峰面积线性关系良好。
3、精密度试验
精密吸取制备例2的供试品溶液，按实施例1检测条件连续进样6次，结果以阿胶特征分子离子峰(m/z)539.8(双电荷)→612.4提取的离子流色谱图中，峰面积的RSD为1.3％(n＝6)，表明精密度良好。
4、稳定性试验
取同一份制备例2的供试品溶液，分别于配制后的0、2、4、6、8、12h按实施例1检测条件测定。结果以阿胶特征分子离子峰(m/z)539.8(双电荷)→612.4提取的离子流色谱图中，峰面积的RSD为3.9％(n＝6)，结果表明，供试品溶液在配制后12h内较稳定。
5、重复性试验
取制备例2的供试品同一批次6份，按实施例1检测条件进行检测。结果以阿胶特征分子离子峰(m/z)539.8(双电荷)→612.4提取的离子流色谱图中，峰面积的RSD为1.2％(n＝6)，结果表明，本方法重复性较好。
测试例2
异源成分检查的方法学考察
1、专属性实验
参照制备例8制备马皮胶参比溶液的方法，分别制备龟甲胶、鹿角胶和新阿胶参比溶液，以龟甲胶、鹿角胶、新阿胶、黄明胶和马皮胶参比溶液以及马源寡肽A和牛皮特征肽A对照品溶液为阳性样品，缺龟甲胶、鹿角胶、黄明胶、新阿胶和马皮胶阴性样品溶液作为阴性样品，选择龟甲胶、鹿角胶和新阿胶特征肽以及马源寡肽A和牛皮特征肽A离子对作为检测离子对，按实施例1检测条件进样分析。
龟甲胶参比溶液的检测谱图如图4所示，鹿角胶参比溶液的检测谱图如图5所示，新阿胶参比溶液的检测谱图如图6所示，黄明胶参比溶液的检测谱图如图7所示，牛皮特征肽A对照品溶液的检测谱图如图8所示，马皮胶参比溶液的检测谱图如图9所示，马源寡肽A对照品溶液的检测谱图如图10所示，缺龟甲胶、鹿角胶、黄明胶、新阿胶和马皮胶阴性样品溶液的检测谱图如图11所示。
上述图中，1-新阿胶特征肽，2-鹿角胶特征肽，3-牛皮特征肽A，4-龟甲胶特征肽，5-马源寡肽A，如图所示，在龟甲胶、鹿角胶、新阿胶、黄明胶和马皮胶参比溶液以及马源寡肽A和牛皮特征肽A对照品溶液的提取流图色谱图中，均无其他物种的特征肽检出，且阴性样品色谱图中，未出现龟甲胶、鹿角胶和新阿胶特征肽以及马原寡肽A和牛皮特征肽A的特征分子离子峰，说明各异源性成分的特征肽段具有物种特异性，专属性强，对测定结果无干扰。
2、线性关系考察和检测限的测定
分别精密称取龟甲胶、鹿角胶和新阿胶对照药0.1g，置于50mL量瓶中，再分别加入制备例5中马源寡肽A和牛皮特征肽A对照品溶液1mL，加制备例4的阿胶基质溶液稀释至刻度，摇匀，精密吸取该混合溶液1mL、2mL、5mL、10mL、20mL和25mL，分别置50mL量瓶中，加阿胶基质溶液稀释至刻度，摇匀，取溶液1mL，14000r/min离心10min，精密量取上清液800μL，置离心管中，加胰蛋白酶溶液80μL，涡混3min，37℃恒温酶解12h，14000r/min离心10min，取上清液，即制得相当于阿胶中掺入含2％、4％、10％、20％、40％、50％龟甲胶、鹿角胶和新阿胶、质量浓度分别为0.06、0.12、0.3、0.6、1.2、1.5μg/mL马源寡肽A和质量浓度分别为0.03、0.06、0.15、0.30、0.60、0.75μg/mL牛皮特征肽A的混合梯度溶液，按实施例1的检测条件进样分析，分别以各异源性成分特征肽定量离子对的峰面积(y)与其相应的掺入量或质量浓度(x)绘制标准曲线，根据信噪比计算最低检出限(LOD，S/N≥3)，结果见表1。
表1
成分 线性方程 线性范围 r LOD
龟甲胶特征肽 y＝35567.0x-8220.20 2-50％ 0.9996 0.29％
鹿角胶特征肽 y＝1115.9x-144.58 2-50％ 0.9998 0.22％
牛皮特征肽A y＝28303.0x-617.95 0.03-0.75μg/mL 0.9992 0.01μg/mL
新阿胶特征肽 y＝808.7x+73.77 2-50％ 0.9996 0.20％
马源寡肽A y＝175264.0x+1947.40 0.06-1.5μg/mL 0.9998 0.02μg/mL
结果表明，龟甲胶、鹿角胶和新阿胶掺入量在2％-50％范围内，掺入量与峰面积线性关系良好，马源寡肽A对照品浓度0.06μg/mL-1.5μg/mL范围内线性关系良好，牛皮特征肽A对照品浓度0.03μg/mL-0.75μg/mL范围内线性关系良好。
3、精密度试验
取前述线性关系考察和检测限的测定下的混合溶液，按实施例1的检测条件分别连续进样6针，结果显示，各异源性成分的特征肽定量离子对提取的离子流色谱中，峰面积值RSD分别为2.0％、4.4％、3.3％、4.3％、1.2％，表明仪器精密度良好。
4、稳定性试验
取前述线性关系考察和检测限的测定下的混合溶液，按实施例1的检测条件分别在0、2、4、6、8、12h进样，测定各异源性成分的特征肽定量离子对的峰面积变化情况，结果显示，各异源性成分的特征肽定量离子对峰面积的RSD(n＝6)值分别为3.2％、1.9％、4.0％、4.3％、2.6％，说明各异源性成分的特征肽在12h内稳定性良好。
5、重复性试验
按制备例8方法平行制备6份龟甲胶、鹿角胶和新阿胶混合参比溶液以及马皮胶和黄明胶参比溶液，按实施例1的检测条件进样分析，测定各异源性成分特征肽定量离子对的峰面积变化情况，结果显示，各异源性成分特征肽定量离子对峰面积的RSD(n＝6)值分别为3.1％、4.0％、3.6％、4.7％、3.3％，表明方法具有良好的重复性。
6、马源寡肽A和牛皮特征肽A判定限度考察
分别精密称取制备例1的6批马皮胶样品和从中国食品药品检定研究院购买的6瓶黄明胶对照药材0.1g，按制备例8方法制备马皮胶和黄明胶参比溶液。以马源寡肽A和牛皮特征肽A的定量离子对进行检测，测得峰面积代入马源寡肽A和牛皮特征肽A的线性方程中计算，结果显示，6份样品对应的马源寡肽A的含量在10.5-11.9μg/g之间，牛皮特征肽A的含量在9.1-9.7μg/g之间。因此，规定马源寡肽A检出的限度为11.9μg/g，牛皮特征肽A检出的限度为9.7μg/g。
测试例3
阿胶特征多肽含量测定的方法学考察
1、专属性试验
精密吸取驴源多肽A1和驴源多肽A2混合对照品溶液、阴性样品溶液、制备例3的供试品溶液各1μL，按实施例1的检测条件进样分析。
混合对照品溶液的检测谱图如图12所示，阴性样品溶液的检测谱图如图13所示，制备例3的供试品溶液的检测谱图如图14所示。图中，驴源多肽A2：上618.35→850.40、下618.35→779.40；驴源多肽A1：上469.35→783.40、下469.25→712.30。
如图所示，供试品色谱图中，在与驴源多肽A1和驴源多肽A2对照品溶液中相应的保留时间位置上，均呈现保留时间一致的色谱峰；阴性样品色谱图中，在与对照品溶液相应的位置上均无相应的色谱峰，表明坤泰胶囊中各药味对测定无干扰，专属性强。
2、线性关系考察和检测限及定量限的测定
取制备例5的混合系列对照品溶液，按实施例1的检测条件进样分析，以驴源多肽A1和驴源多肽A2对照品的定量离子对峰面积(y)与其相应的质量浓度(x)绘制标准曲线，根据信噪比计算最低检出限(LOD，S/N≥3)和最低定量限(LOQ，S/N≥10)，结果见表2。
表2
表格数据结果表明，各成分在各自范围内线性关系良好。
3、精密度试验
取驴源多肽A1和驴源多肽A2混合对照品溶液，按实施例1的检测方法检测分析，连续进样6次，记录驴源多肽A1和驴源多肽A2的定量离子对的峰面积，计算其精密度。结果显示驴源多肽A1、驴源多肽A2定量离子对峰面积RSD(n＝6)分别为4.6％、2.8％，表明仪器的精密度良好。
4、稳定性试验
精密吸取同一份供试品溶液，按实施例1的检测条件分别在0、2、4、6、8、12h进样，计算得驴源多肽A1、驴源多肽A2定量离子对峰面积的RSD(n＝6)均小于5％，表明供试品溶液在12h内稳定性较好。
5、重复性试验
精密称取同一批样品(批号：210433)6份，按制备例3方法制备供试品溶液，按照实施例1检测条件进样分析，测定各特征肽的峰面积，计算得驴源多肽A1、驴源多肽A2定量离子对峰面积的RSD(n＝6)分别为1.5％、2.4％，均小于3％，表明该方法的重复性良好。
6、加样回收率
精密称取已知含量的坤泰胶囊9份(批号：210433)，每份0.5g，每3份为一组，分别精密加入低、中、高3个浓度水平的混合对照品溶液(约目标成分含量50％、100％、150％)，按制备例3方法制备供试品溶液，按实施例1检测条件进行测定，记录各色谱峰峰面积，计算各成分的加样回收率和RSD，见表3。
表3
根据表格数据可知，驴源多肽A1和驴源多肽A2的平均回收率为93.03％-101.40％，RSD为1.50％-4.29％，表明该方法准确度好，可用于驴源多肽A1和驴源多肽A2的含量测定。
6、限度拟定
以阿胶为原粉投料，其在坤泰胶囊中占比约为20％，《中国药典》2020版一部阿胶“检查”规定水份不得过15.0％，“含量测定”特征多肽的限量：按干燥品计算，含特征多肽以驴源多肽A1和驴源多肽A2总量计应不得少于0.15％，以该含量限度核算坤泰胶囊中特征多肽的量：0.20×0.0015×(1-0.15)×1000×1000＝255μg/g。
拟定坤泰胶囊中阿胶的特征多肽含量限度为：本品每1g含阿胶以驴源多肽A1和驴源多肽A2的总量计，不得少于255μg。
测试例4
样品的测定结果
取20批次的坤泰胶囊样品，分别按制备例2和制备例3的方法制备供试品溶液，按实施例1的色谱质谱条件进行测定。
结果显示：20批样品中均检出阿胶，均未检出异源性成分，驴源多肽A1和驴源多肽A2的含量均高于拟定限度。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种坤泰胶囊中阿胶及其异源性成分的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
(1)将坤泰胶囊内容物制备成供试品溶液；
(2)将所述供试品溶液进行超高效液相色谱-质谱检测，得到特征谱图，根据所述特征谱图测定阿胶特征多肽的含量，并判断异源性成分；
所述阿胶特征多肽包括驴源多肽A1、驴源多肽A2；
所述异源性成分包括龟甲胶、鹿角胶、黄明胶、新阿胶、牛皮特征肽A、马源寡肽A。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液采用如下方法进行制备，所述方法包括：将所述坤泰胶囊内容物采用碳酸氢铵溶液溶解后，离心，取上清液，将所述上清液进行酶解，得到所述供试品溶液。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述碳酸氢铵溶液中碳酸氢铵的质量百分含量为0.8-1.2％；
优选地，所述溶解时的料液比为1:(80-120)。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述酶解采用的酶制剂为胰蛋白酶溶液；
优选地，所述胰蛋白酶溶液中胰蛋白酶的浓度为0.8-1.2μg/μL。
5.根据权利要求1-4任一项所述的检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱-质谱检测的检测条件如下：柱温为35-45℃，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为甲酸乙腈溶液，进行梯度洗脱，流速为0.2-0.4mL/min，进样体积为0.8-1.2μL；
优选地，所述甲酸水溶液中甲酸的质量百分含量为0.1-0.3％；
优选地，所述甲酸乙腈溶液中甲酸的质量百分含量为0.1-0.3％。
6.根据权利要求1-5任一项所述的检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱-质谱检测的检测条件还包括：采用电喷雾离子化正离子模式下多反应监测，毛细管电压2.7-2.9kV，离子源温度145-155℃，喷雾气与反吹气为N2，去溶剂气流速800-1200L/h，去溶剂气温度450-550℃。
7.根据权利要求1-6任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括制备对照品溶液的步骤，以及采用和供试品溶液相同的检测方法，检测对照品溶液得到特征谱图的步骤。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述对照品溶液中的对照品为马源寡肽A、牛皮特征肽A、驴源多肽A1和驴源多肽A2；
优选地，所述对照品溶液采用如下方法进行制备，所述方法包括：分别称取马源寡肽A、牛皮特征肽A溶于碳酸氢铵溶液中，再采用基质溶液稀释，分别得到马源寡肽A、牛皮特征肽A对照品溶液；分别称取驴源多肽A1、驴源多肽A2溶于碳酸氢铵溶液中，分别得到驴源多肽A1、驴源多肽A2对照品溶液。
9.根据权利要求1-8任一项所述的检测方法，其特征在于，所述基质溶液采用如下方法进行制备，所述方法包括：称取阿胶对照药材溶于碳酸氢铵溶液中，得到所述基质溶液。
10.根据权利要求1-9任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
(1)将所述坤泰胶囊内容物采用碳酸氢铵溶液溶解后，离心，取上清液，将所述上清液采用胰蛋白酶溶液进行酶解，得到所述供试品溶液；
所述碳酸氢铵溶液中碳酸氢铵的质量百分含量为0.8-1.2％；所述溶解时的料液比为1:(80-120)；所述胰蛋白酶溶液中胰蛋白酶的浓度为0.8-1.2μg/μL；
(2)将所述供试品溶液进行超高效液相色谱-质谱检测，得到特征谱图，根据所述特征谱图测定阿胶特征多肽的含量，并判断异源性成分；
所述阿胶特征多肽包括驴源多肽A1、驴源多肽A2；
所述异源性成分包括龟甲胶、鹿角胶、黄明胶、新阿胶、牛皮特征肽A、马源寡肽A；
所述超高效液相色谱-质谱检测的检测条件如下：柱温为35-45℃，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为甲酸乙腈溶液，进行梯度洗脱，流速为0.2-0.4mL/min，进样体积为0.8-1.2μL；采用电喷雾离子化正离子模式下多反应监测，毛细管电压2.7-2.9kV，离子源温度145-155℃，喷雾气与反吹气为N2，去溶剂气流速800-1200L/h，去溶剂气温度450-550℃；
所述甲酸水溶液中甲酸的质量百分含量为0.1-0.3％；
所述甲酸乙腈溶液中甲酸的质量百分含量为0.1-0.3％。
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