CN116539570A - 用于分析生物样品的连接子、标记物和方法 - Google Patents

用于分析生物样品的连接子、标记物和方法 Download PDF

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Abstract

提供了一种用于分析生物样品的连接子(100)，其包含被配置成直接或间接结合目标分子(104)的至少一个第一亲和试剂(102)；连接到所述第一亲和试剂(102)并包含至少一个第一亲和相互作用物(110)的骨架(106)；其中所述第一亲和相互作用物(110)被配置成特异性结合包含标签(114)的第二亲和相互作用物(112)，以将所述标签(114)结合到所述骨架(106)；其中所述骨架(106)包含切割位点(108)以用于不可逆地分离所述第一亲和试剂(102)和具有所述标签(114)的所述第一亲和相互作用物(110)。在进一步的方面，提供了用于分析生物样品的标记物和方法。

Description

用于分析生物样品的连接子、标记物和方法
技术领域
本发明涉及用于分析生物样品，特别是用于生物样品的成像分析的连接子(connector)、标记物(marker)和方法。
背景技术
为了解决生命科学领域的关键问题，准确识别和定位生物样品(例如组织样品或细胞培养物)中的某些结构或目标分子至关重要。这可以通过在样品中引入仅与特定结构(例如特定生物分子)结合的标记物来完成。这些标记物通常包含仅连接至所讨论结构的亲和试剂和直接缀合至亲和试剂或通过其他方式(例如第二亲和试剂)连接至亲和试剂的一种或多种荧光染料或标签(label)。
例如，荧光显微镜允许以高空间分辨率对样品进行成像，但通常只涉及少数的不同荧光染料，通常在1至5种之间。在同一实验中，可用的染料必须分配给用于识别细胞类型的所有标记物，功能标记物(如感兴趣的蛋白质)和一般的形态标记物。这意味着只有有限数量的结构可以被独特的荧光染料标记并因此同时被识别。这进一步意味着在大多数成像实验中只能很差地识别不同的细胞类型。虽然存在允许更可靠和稳健地识别细胞类型的现代方法，例如基于基因调节网络(GRN)的分析，但它们需要从样品中读出更多数量的不同标记物。虽然文献PCT/EP2021/066645和PCT/EP2021/073819公开了同时利用大量荧光分子分析生物样品的方法，但生成具有不同亲和力和具有不同荧光特性的标签的多组标记物仍然耗时且昂贵。
发明内容
一个目的是提供用于分析生物样品的连接子、标记物和方法，其允许以低成本和时间消耗生成标记物并分析样品。
上述目的通过本公开的实施方案得以实现。有利的实施方案在以下描述中限定。
提供了一种用于分析生物样品的连接子，其包含被配置成直接或间接结合目标分子的至少一个第一亲和试剂；连接到第一亲和试剂并包含至少一个第一亲和相互作用物的骨架；其中第一亲和相互作用物被配置成特异性结合包含标签的第二亲和相互作用物，以将标签结合到骨架；其中骨架包含切割位点以用于不可逆地分离第一亲和试剂和具有标签的第一亲和相互作用物。标签特别地可以是光学可检测的。目标分子是生物样品的特定结构，例如生物样品的蛋白质、小分子(例如乳酸)或生物样品的mRNA分子。进一步的实例是肽、小分子、代谢物、激素、神经递质、金属离子。生物样品可以是例如组织、体液、固体活检、液体活检、胚胎(例如斑马鱼、果蝇)、模式生物(例如斑马鱼幼虫、果蝇胚胎、秀丽隐杆线虫)、细胞(例如原核生物、真核生物、古细菌)、多细胞生物(例如团藻)、悬浮细胞培养物、单层细胞培养物、3D细胞培养物(例如源自各种器官(例如肠、脑、心脏、肝脏)的球状体、类肿瘤、类器官)，任何上述物质的裂解物，或病毒。
因此，连接子依次包含：第一亲和试剂、具有切割位点的骨架和第一亲和相互作用物。
第一亲和试剂和目标分子之间的结合特别地可以是特异性的。这意味着，第一亲和试剂仅结合目标分子。然而，当结合是间接的时，第一亲和试剂可以仅结合另一个实体，而另一个实体又仅结合目标分子。因此，在这种情况下，第一亲和试剂仅间接结合目标分子。
第一亲和相互作用物可以仅结合第二亲和相互作用物。这种结合在生理条件下可能是不可逆的。
特别地，这可以进一步克服当前解决方案的缺点，例如：特别地，本发明能够使用单价(第一)亲和试剂产生连接子，单价(第一)亲和试剂例如为纳米抗体、单链抗体、适体、寡核苷酸、或小分子化合物，其与包含用于染料失活的切割位点和亲和相互作用物的骨架组合，该亲和相互作用物用于介导连接子与标签的高亲和力相互作用或偶联。这种设计有很多优点，例如，可以构建完全基于肽或完全基于核苷酸的连接子，这允许它们一次性合成或从单个表达盒中表达。这使得制造特别容易，具有成本效益且可重复。归功于这种设计方案，只有标签需要使用标准偶联化学偶联到第二亲和相互作用物。然而，这可以由制造商更大规模地完成。对于(最终)用户而言，该设计在多路复用应用中具有关键优势，在多路复用应用中，用户通常需要将标签与他们打算在研究中使用的第一抗体进行偶联，第一抗体可以容易地为>100种抗体。执行>100个偶联反应是一个繁琐的手动过程，这与批次间的显着差异有关。使用本文中描述的连接子，用户可以简单地将合适的连接子用第二亲和试剂(例如第一抗体)预孵育，以将第二亲和试剂连接到连接子。这可以通过在多孔板中简单地混合连接子和抗体来执行，其可以使用标准的实验室自动化和液体处理设备(例如移液机器人或分配器)容易地自动化进行。
优选地，第一亲和试剂是纳米抗体、单域抗体、适体、小分子或寡核苷酸。这使得能够特别容易地组装连接子，并以高亲和力和特异性与目标分子结合。
更优选地，当第一亲和试剂被配置成间接结合目标分子时，连接子包含与第一亲和试剂结合的第二亲和试剂，并且第二亲和试剂被配置成(直接)结合目标分子。这使得能够特别灵活地组装和使用连接子，例如，与相同同种型的几种抗体组合。
优选地，第二亲和试剂是抗体并且第一亲和试剂被配置成结合抗体的片段可结晶区(Fc区)。这使得能够以特别高的亲和力和特异性与目标分子结合。特别地，第一亲和试剂可以是纳米抗体。
优选地，骨架包含寡核苷酸或肽。例如，骨架可以是基于DNA折纸的或纳米尺。这使得能够容易地组装和高效生产骨架。
优选地，切割位点是可光切割的切割位点。这使得能够容易地切割切割位点。
在一个优选的实施方案中，骨架在切割位点处通过位点特异性酶(例如TEV蛋白酶、半胱天冬酶(caspase，全称为半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶)、Xa因子或限制酶)、切割光(例如UV光)或通过温度变化特异性地可切割。具体来说，这导致骨架的共价键被限制酶或蛋白水解酶、UV光切割；或杂交寡核苷酸骨架的解链/变性。这使得能够有效地切割切割位点。
优选地，第一亲和相互作用物和第二亲和相互作用物被配置成形成生物缀合物(bioconjugate，也称为生物共轭体)。这意味着第一亲和相互作用物和第二亲和相互作用物可以彼此共价结合。形成生物缀合物的相互作用物对的实例是spytag/spycatcher、snooptag/snoopcatcher和dogtag/dogcatcher。这使得第一亲和相互作用物和第二亲和相互作用物能够彼此牢固且特异性地结合。
优选地，第一亲和相互作用物是生物素或链霉亲和素中的一种，并且第二亲和相互作用物是生物素或链霉亲和素中的另一种。这使得第一亲和相互作用物和第二亲和相互作用物能够彼此牢固且特异性地结合。
更优选地，连接子包含多个第一亲和相互作用物，每个第一亲和相互作用物结合一个第二亲和相互作用物。
优选地，标签包含至少第一荧光团。这使得能够通过光学读出装置诸如显微镜来检测标签。
在另一方面，提供了一种用于分析生物样品的标记物，其包含前述连接子并且还包含具有标签的第二亲和相互作用物。具有标签的第二亲和相互作用物与第一亲和相互作用物结合，以将标签连接到连接子。标签可以特别地包含至少一种荧光团。荧光团可以例如是荧光蛋白、荧光分子或荧光量子点。
在另一方面，提供了一种用于分析生物样品的方法，其包括以下步骤：提供，特别地是生成至少第一组标记物，其中第一组标记物包含至少多个第一连接子，所述多个第一连接子被配置成直接或间接结合第一目标分子，并且每个第一连接子包含第一标签；将至少第一组标记物引入样品中，以使标记物与样品中的它们各自的目标分子结合；将激发光引导到生物样品上，激发光被配置成使至少第一标签可视化或激发至少第一标签；以及由至少第一标签发出的光产生至少一个光学读出。标记物可仅包含第一亲和试剂或另外包含第二亲和试剂，因此第一目标分子可通过第一亲和试剂直接结合或通过第二亲和试剂间接结合。标签可以通过第一亲和相互作用物和第二亲和相互作用物与连接子结合。
为了将标记物引入样品中，样品可被渗透。此外，标记物可以作为单独的部分或作为先前结合在一起的部分引入到样品中。优选地，当标记物包含具有第一亲和试剂和标签的连接子时，可以将单独的部分单独地引入样品中。然而，当标记物包含具有第一和第二亲和试剂和标签的连接子时，可以在引入样品中之前将单独的部分组装或结合在一起。
光学读出可以通过能够进行荧光多色读取或成像的读出装置产生。读出装置通常包括至少一个激发光源、包括至少一个检测通道的检测系统并且可以包含滤光片和/或色散光学元件以将激发光路由至样品和/或将来自样品的发射光路由至检测器。特别地，读出装置可以是荧光显微镜。
此外，可以包括任选的洗涤步骤，例如在将标记物引入样品中之后，以去除未结合的标记物。
优选地，第一组标记物还包含至少多个第二连接子，该多个第二连接子被配置成直接或间接结合第二目标分子，并且每个第二连接子包含第二标签。第二目标分子被第二连接子的第一亲和试剂结合。这使得能够分析大量目标分子。
特别优选的是，第一标签和第二标签具有不同的荧光特性。特别地，标签是荧光团。荧光特性可以包括激发波长/光谱、发射波长/光谱和发射持续时间或荧光寿命。这使得能够区分第一标签和第二标签。
优选地，在步骤e)中，切割至少第一组标记物的连接子的切割位点。例如，可通过添加酶或通过用UV光照射标记物来实现切割。切割导致标签与标记物分离。这使得能够使标记物消隐，这意味着从标记物中去除荧光信号。
优选地，在步骤f)中，将被切割掉的第二亲和相互作用物与标签一起从生物样品中除去。这可以通过例如用缓冲液洗涤样品来实现。这使得能够去除切割掉的标签的背景荧光。
优选地，用第二组标记物重复步骤a)至d)，其中第二组标记物包含至少多个第三连接子，该多个第三连接子被配置成直接或间接结合第三目标分子，并且每个连接子包含第三标签。
该方法和标记物具有与上述连接子相同的优点。特别地，可以使用针对连接子的上述特征来补充该方法和标记物。
本发明的进一步的特征和优点来自于下面参考附图描述的优选实施方案的描述。
附图说明
下面结合附图对具体实施方案进行描述，其中：
图1显示了用于分析生物样品的连接子的示意图，
图2显示了基于核苷酸的连接子的示意图，
图3显示了基于肽的连接子的示意图，
图4显示了具有连接的标签的连接子的示意图，
图5显示了具有多个连接子的生物样品的示意图，
图6显示了用于分析生物样品的方法的流程图，并且
图7显示了具有相同同种型抗体的标记物的示意图。
具体实施方式
图1显示了用于分析生物样品的连接子100的示意图。连接子100包含第一亲和试剂102，其被配置成特异性地且直接结合目标分子104。第一亲和试剂102是例如纳米抗体。
此外，连接子100包含连接到第一亲和试剂102的骨架106。骨架106包含切割位点108，用于例如通过酶109将骨架106不可逆地分离成两个部分106’、106”。
此外，骨架包含至少一个第一亲和相互作用物110。第一亲和相互作用物110被配置成特异性结合包含标签114的第二亲和相互作用物112，以使得标签114能够结合至连接子100的骨架106。第一亲和相互作用物110和第二亲和相互作用物112因此能够特异性地彼此结合。结合后，具有标签114的第二亲和相互作用物112连接到连接子100。第一亲和相互作用物110与第二亲和相互作用物112的结合可以是基本上不可逆的。一旦第一亲和相互作用物110和第二亲和相互作用物112彼此结合，切割位点108能够使得标签114与连接子100，或者更确切地说与第一亲和试剂102不可逆地分离。标签114可以是染料，特别是一种或多种荧光团。
图2和图3显示了连接子100的示例性实施方案的示意图。
图2显示了基于核苷酸的连接子200、202的示意图。连接子200、202各自包含骨架204，骨架204可以是寡核苷酸，特别是DNA或RNA寡核苷酸，和/或包含核酸类似物，诸如PNA、LNA、XNA和吗啉代。在骨架204的一端，骨架204连接到第一亲和试剂206，第一亲和试剂206是基于寡核苷酸的，类似于骨架204，并且其包含使第一亲和试剂206能够直接或间接结合目标分子208、210的特定序列。
在连接子200的情况下，第一亲和试剂206通过第二亲和试剂212(诸如抗体)间接结合到目标分子208，例如蛋白质。第二亲和试剂212例如在其片段可结晶区(Fc区)包含与第一亲和试剂206的特定序列互补的寡核苷酸序列。第二亲和试剂212的抗原结合片段(Fab区)可以特异性结合目标分子208。因此，连接子200通过第二亲和试剂212间接地特异性结合目标分子208。
替代地并且在连接子202的情况下，目标分子210是RNA或DNA分子，例如mRNA分子。第一亲和试剂206结合与第一亲和试剂206的序列互补的目标分子210的特定序列。
在骨架204的另一端，骨架204包含第一亲和相互作用物214，该第一亲和相互作用物214被配置成特异性结合第二亲和相互作用物216。第一亲和相互作用物214例如可以是基于寡核苷酸的适体，类似于骨架204。第二亲和相互作用物216可以是例如另外的适体或生物素。第二亲和相互作用物216又连接到标签218，例如染料分子。
此外，骨架204包含切割位点220。切割位点220优选是针对限制酶(特别是稀切酶，诸如NotI)的限制位点。这使得能够将标签218与连接子200、202分开。
由于包含第一亲和试剂206、具有切割位点220的骨架204和第一亲和相互作用物214的连接子200、202都是基于寡核苷酸的，因此连接子200、202可以各自在单个反应中合成或在单片(single piece)中合成。
图3显示了基于肽的连接子300、302的示意图。连接子300、302各自包含骨架304，骨架304可以是肽。在骨架304的一端，骨架304连接到第一亲和试剂306、308，第一亲和试剂306、308是基于肽的，类似于骨架304，并且直接或间接特异性结合目标分子310。
在连接子300的情况下，第一亲和试剂306通过第二亲和试剂312(诸如抗体)间接结合到目标分子310，例如蛋白质。第一亲和试剂306是例如纳米抗体或单域抗体，其例如在其片段可结晶区(Fc区)特异性结合第二亲和试剂312。第二亲和试剂312的抗原结合片段(Fab区)可特异性结合目标分子310。因此，连接子300通过第二亲和试剂312间接特异性结合目标分子310。
替代地并且在连接子302的情况下，第一亲和试剂308是例如纳米抗体或单域抗体，其直接特异性结合目标分子310。
在骨架304的另一端，骨架304包含第一亲和相互作用物314，第一亲和相互作用物314被配置成特异性结合第二亲和相互作用物316。第一亲和相互作用物314可以是基于肽的，类似于骨架304，例如，其可以是链霉亲和素。在这种情况下，第二亲和相互作用物316可以是例如生物素。第二亲和相互作用物316又连接到标签318，诸如染料分子。彼此特异性结合的第一亲和相互作用物314和第二亲和相互作用物316的替代对可以是形成生物缀合物的肽对，诸如SpyTag和SpyCatcher、SnoopTag和SnoopCatcher、或DogTag和DogCatcher。
此外，骨架304包含切割位点320。切割位点320优选是特定的肽序列，在此处，相应的蛋白酶，例如来自烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus)的TEV蛋白酶或Xa因子、或scUlp1(来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，底物为scSUMO)、或bdSENP1(来自二穗短柄草(Brachypodium distachyon)，底物为bdSUMO)、或bdNEDP1(来自二穗短柄草，底物为bdNEDD8)、或sNEDP1(来自大西洋鲑(Salmo salar)，底物为ssNEDD8)、或scAtg4(来自酿酒酵母，底物为Atg4p)、或xlUsp2(来自非洲爪蟾(Xenopus laevis)，底物为xlUsp2)，可以切割基于肽的骨架304。这使得能够将标签318与连接子300、302分离。上述底物和蛋白酶的全长版本、截短版本或片段可用作切割位点/蛋白酶对。
在本发明的特别优选的实施方案中，bdSENP1或bdSENP1衍生物用于进行切割。这提供了许多优势，包括在纳摩尔(nM)范围内的浓度下非常有效的底物切割，即25℃下5nM或0°下20-50nm用于接近定量切割(文献中描述的条件：Steffen Frey,DirkA newset of highly efficient,tag-cleaving proteases for purifying recombinantproteins,Journal of Chromatography A,第1337卷,2014,第95-105页)，并且在0-37℃之间的温度下具有良好的活性。
由于包含第一亲和试剂306、具有切割位点320的骨架304和第一亲和相互作用物314的连接子300、302都是基于寡核苷酸的，因此连接子300、302可以各自通过单个DNA结构体的重组表达来合成和/或合成为连续的单片。
作为结合图2和图3讨论的第一亲和试剂206、306的替代方案，第一亲和试剂102、206、306可以是纳米抗体或单域抗体的多聚体、常规抗体、适体，或药物、小分子或毒素。
替代地，例如在骨架是基于寡核苷酸的，特别是DNA折纸的情况下，以及切割位点是两条寡核苷酸链的杂交部分的情况下，切割位点108、220、320可以通过温度变化来切割，或者在切割位点是可光切割的接头的情况下，切割位点108、220、320可以通过激活光(诸如UV光)进行切割。
图4显示了连接子400、402、404，其各自具有附接的标签。具有相同结构和相同功能的元件具有相同的附图标记。连接子400包含第一亲和试剂102，如前所述，附接到连接子400的骨架406的标签包括四个荧光团408。骨架406可以例如是基于肽的。骨架406包含四个第一亲和相互作用物110，其各自被配置成特异性结合四个第二亲和相互作用物112，以便单独附接连接到第二亲和相互作用物112上的荧光团408。可以通过混合具有第二亲和相互作用物112的荧光团408和连接子400二者将荧光团408附接到连接子400上。如前所述，第一亲和相互作用物110和第二亲和相互作用物112可以分别是例如链霉亲和素和生物素。
连接子402具有附接的标签410，具体地，标签410通过特异性结合第一亲和相互作用物412的第二亲和相互作用物414附接到连接子402的第一亲和相互作用物412。标签410包含DNA折纸骨架416，其连接到第二亲和相互作用物414并且包含四个第一辅助亲和相互作用物418。DNA折纸骨架416例如可以是纳米尺。四个荧光团420分别通过特异性结合第一辅助亲和相互作用物418并连接到荧光团410中的一个上的第二辅助亲和相互作用物422附接到骨架416。
在本发明的特别优选的实施方案中，第一辅助亲和相互作用物和第二辅助亲和相互作用物是生物素-链霉亲和素对中的一个。在这种情况下，在允许生物素化的短链与DNA折纸骨架416相互作用之前，允许短链与链霉亲和素缀合的染料或荧光团结合(预孵育)。由于生物素-链霉亲和素之间的相互作用实际上是不可逆的，因此可以利用这一点将相同染料的多个拷贝(如实例402中所述的)或多个染料(单个或多个拷贝)(如实例404中所述的)附接到DNA折纸骨架416上。在这种情况下，可能期望使用具有4、3、2个或仅具有一个活性生物素结合位点的链霉亲和素版本。
连接子404具有通过第二亲和相互作用物414附接到第一亲和相互作用物412的标签424，如针对连接子402所述的。类似地，标签424包含具有四个第一辅助亲和相互作用物418的DNA折纸骨架416。与具有标签410的连接子402相比，标签424包括四个荧光团420、426、428、430，其荧光特性彼此不同。这些特性可以包括激发波长、荧光波长和荧光持续时间。每个荧光团420、426、428、430包含一个第二辅助亲和相互作用物422，其使荧光团420、426、428、430能够附接到标签424的第一辅助亲和相互作用物418中的一个上。通过在标签424中使用不同的荧光团420、426、428、430，可以生成荧光特性具有更大多样性的连接子。荧光特性的多样性使得能够区分各种各样的连接子。
图5显示了具有多个连接子的生物样品500的示意图。生物样品500可以例如是细胞，特别是包含细胞核501的哺乳动物细胞。具有标签的多个连接子502、504、506、508、510、512、514用于特异性结合样品500中的特定目标分子，说明经标记的连接子的使用。标签的荧光特性可能不同。
例如，连接子502通过第二亲和试剂518(这里是抗体)和纳米抗体第一亲和试剂519间接结合到细胞质蛋白质目标分子516。连接子504通过第一亲和试剂522(这里是连接子504的纳米抗体)直接结合到细胞质蛋白质目标分子520。连接子506通过基于寡核苷酸的第一亲和试剂526直接结合至mRNA目标分子524。连接子508通过基于小分子的第一亲和试剂530直接结合至细胞质蛋白质目标分子528。与连接子502类似，连接子510间接结合到细胞质蛋白质目标分子532，然而，连接子510附接到包含多个荧光团的标签534。与连接子502类似，连接子512间接结合到核蛋白目标分子534。与连接子506类似，连接子514直接结合到核mRNA目标分子536。
借助于连接子502、504、506、508、510、512、514，生物样品500的各个组分516、520、524、528、532、534、536可以通过例如生物样品500(其中连接子502、504、506、508、510、512、514与其目标分子结合)的荧光成像来可视化。此外，当使用对于特定的连接子具有独特的荧光特性的不同标签时，根据检测到相应荧光信号的位置，可以在生物样品500的图像内定位组分516、520、524、528、532、534、536。
如上文解释的，连接子之一与通过第一亲和相互作用物和第二亲和相互作用物特异性结合到连接子的标签之一的组合也可称为标记物。当具有标签的连接子任选地特异性结合到第二亲和试剂之一时，情况也是如此。为了产生标记物，可以将连接子、标签和任选的第二亲和试剂混合在一起。这允许标签与连接子结合，更准确地说，允许标签的第二亲和相互作用物与连接子的第一亲和相互作用物结合，从而使标签与连接子附接。
在将第二亲和试剂附接到连接子的情况下，可以在添加标签的同时、之前或之后添加第二亲和试剂。由于第一亲和相互作用物和第二亲和相互作用物彼此特异性地结合，第一亲和试剂和第二亲和试剂也是如此，所以第一亲和相互作用物将仅结合第二亲和相互作用物，并且第一亲和试剂将仅结合第二亲和试剂，即使将所有组分混合在一起。
为了稳定各个部分之间的结合，连接子和标签和/或连接子和第二亲和试剂可以任选地交联，例如通过戊二醛交联。
图6显示了用于分析生物样品500的方法的流程图，例如，其可用于多重成像的情况下。该过程开始于步骤S600。在步骤S602中，提供了一组标记物。第一组标记物可以包含具有第一标签和被配置成特异性结合第一目标分子的第一亲和试剂的多个第一连接子。替代地，多个第一连接子还可以包含被配置成特异性结合第一目标分子的第二亲和试剂，且第一亲和试剂被配置成结合第二亲和试剂。优选地，第一组标记物包括至少多个第二连接子，第二连接子具有第二标签和被配置成特异性结合第二目标分子的第一(或第二)亲和试剂。第一标签和第二标签具有不同的荧光特性，例如激发波长、发射波长或发射持续时间。
提供第一组标记物的步骤可以包括由相应的连接子、标签和任选的第二亲和试剂产生标记物。这可以包括在步骤S602中混合相应的连接子、标签和任选的第二亲和试剂，如上所述。
在步骤S604中，用标记物对样品染色。这意味着将标记物添加到样品中，这会导致亲和试剂与其各自的目标分子结合。作为在步骤S602中混合相应的连接子、标签和任选的第二亲和试剂的替代方案，可以在步骤S604中将相应的连接子、标签和任选的第二亲和试剂单独添加到样品中。当标记物仅包含第一亲和试剂而不包含第二亲和试剂时尤其如此。当将连接子和标签分别引入样品中时，标记物就原位生成。然后，标记物通过利用第一亲和试剂或第二亲和试剂结合到各自的目标分子而对样品染色。
在步骤S606中，洗掉未与其目标分子结合的标记物，例如，通过用缓冲溶液洗涤样品。这是为了减少未结合的标记物的标签的背景染色。
在步骤S608中，进行图像读出，例如，通过用荧光灯照射样品并捕获发射光来获取样品的图像。这可以通过荧光显微镜来完成。该图像揭示了目标分子在样品内的位置，这些目标分子被具有被配置成与特定目标分子结合的亲和试剂的标记物染色。
在步骤S610中，通过切割连接子的切割位点将标签与连接子分离。这从标记物结合的目标分子中去除了荧光信号。这也可以称为消隐。
在步骤S612中，例如通过用缓冲溶液洗涤样品，将切割下来的标签从样品中洗掉。该方法在步骤S614结束。
作为在步骤S614结束该方法的替代方案，该方法可以通过使用不同组的标记物重复步骤S602至S612来继续。这使得能够使用对另外的目标分子具有亲和力的新的一组连接子，同时至少部分使用具有与第一组标记物相同的荧光特性的标签。通过反复迭代步骤S602至S612，可以对数量大于具有独特荧光特性的标记物的数量的目标分子进行染色、成像和定位。
如本文所述的连接子或标记物可以进一步与申请PCT/EP2021/066645和PCT/EP2021/073819中公开的用于分析生物样品的方法和工作流程结合使用，其内容并入本文。
图7显示了几个标记物700、702、704的示意图。标记物700、702、704包含相同同种型的抗体706、708、710作为第二亲和试剂。这意味着，它们的Fc区712是相同的。第一亲和试剂714与抗体706、708、710的Fc区712结合。这意味着基于仅包含相同的第一亲和试剂714的一种类型的连接子，可以生成仍然特异性结合不同目标分子716、718、720的标记物。此外，这允许在单组标记物中使用相同同种型的抗体。必须分别制备标记物700、702、704以避免混合不同的抗体706、708、710和标签。
如本文所用的，术语“和/或”包括相关联的列出项目中的一个或多个的任何和所有组合，并且可以缩写为“/”。
尽管已经在设备的上下文中描述了一些方面，但是清楚的是，这些方面也代表相应方法的描述，其中块或装置对应于方法步骤或方法步骤的特征。类似地，在方法步骤的上下文中描述的方面也代表对相应设备的相应块或项目或特征的描述。
附图标记：
100、200、202、300、302、400、402、
404、502、504、506、508、510、512、514 连接子
102、206、306、308、522、526、530、714 第一亲和试剂
104、208、210、310、516、520、524、
528、532、534、536、716、718、720 目标分子
106、204、304、406 骨架
108、220、320 切割位点
109 酶
110、214、314、412 第一亲和相互作用物
112、216、316、414 第二亲和相互作用物
114、218、318、410、424、534 标签
212、312、518 第二亲和试剂
408、420、426、428、430 荧光团
416 DNA折纸骨架
418 第一辅助亲和相互作用物
422 第二辅助亲和相互作用物
500 生物样品
501 核
700、702、704 标记物
706、708、710 抗体
712 抗体的Fc区

Claims (18)

1.一种用于分析生物样品(500)的连接子(100)，其包含：
被配置成直接或间接结合目标分子(104)的至少一个第一亲和试剂(102)，和
连接到所述第一亲和试剂(102)并包含至少一个第一亲和相互作用物(110)的骨架(106)，
其中所述第一亲和相互作用物(110)被配置成特异性结合包含标签(114)的第二亲和相互作用物(112)，以将所述标签(114)结合到所述骨架(106)，并且
其中所述骨架(106)包含切割位点(108)以用于不可逆地分离所述第一亲和试剂(102)和所述第一亲和相互作用物(110)。
2.根据权利要求1所述的连接子，其中所述第一亲和试剂(102)是纳米抗体、适体或寡核苷酸。
3.根据前述权利要求中的一项所述的连接子，其中，当所述第一亲和试剂(102)被配置成间接结合所述目标分子(104)时，所述连接子包含与所述第一亲和试剂(102)结合的第二亲和试剂(212、312)，并且所述第二亲和试剂(212、312)被配置成结合所述目标分子(104)。
4.根据权利要求3所述的连接子，其中所述第二亲和试剂(212、312)是抗体并且所述第一亲和试剂(102)被配置成结合所述抗体的片段可结晶区。
5.根据前述权利要求中的一项所述的连接子，其中所述骨架(106)包含寡核苷酸或肽。
6.根据前述权利要求中的一项所述的连接子，其中所述切割位点(108)是可光切割的切割位点。
7.根据前述权利要求中的一项所述的连接子，其中所述骨架(106)在所述切割位点(108)处通过酶、切割光或温度变化特异性地可切割。
8.根据前述权利要求中的一项所述的连接子，其中所述第一亲和相互作用物(110)和所述第二亲和相互作用物(112)被配置成形成生物缀合物。
9.根据前述权利要求中的一项所述的连接子，其中所述第一亲和相互作用物(110)是生物素或链霉亲和素中的一种，并且所述第二亲和相互作用物(112)是生物素或链霉亲和素中的另一种。
10.根据前述权利要求中的一项所述的连接子，其包含用于结合多个第二亲和相互作用物(112)的多个第一亲和相互作用物(110)。
11.根据前述权利要求中的一项所述的连接子，其中所述标签(114)包含至少第一荧光团。
12.一种用于分析生物样品的标记物，其包含根据前述权利要求中的一项所述的连接子(100)并且还包含具有标签(114)的第二亲和相互作用物(112)。
13.一种用于分析生物样品(500)的方法，其包括以下步骤：
a)提供具有根据权利要求12所述的标记物的至少第一组标记物，其中所述第一组标记物包含至少多个第一连接子(100)，所述多个第一连接子被配置成直接或间接结合第一目标分子(104)，并且每个第一连接子(100)包含第一标签(114)，
b)将至少所述第一组标记物引入所述样品中，以使所述标记物与所述样品中的它们各自的目标分子(104)结合，
c)将激发光引导到所述生物样品(500)上，所述激发光被配置成使至少所述第一标签(114)可视化，以及
d)由至少所述第一标签(114)发出的光产生至少一个光学读出。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述第一组标记物还包含至少多个第二连接子，所述多个第二连接子被配置成直接或间接结合第二目标分子，并且每个第二连接子包含第二标签。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述第一标签和所述第二标签具有不同的荧光特性。
16.根据权利要求13至15中的一项所述的方法，其中在步骤e)中，切割至少所述第一组标记物的连接子的切割位点。
17.根据权利要求16所述的方法，其中在步骤f)中，去除被切割掉的第二亲和相互作用物。
18.根据前述权利要求16至17中的一项所述的方法，其中用第二组标记物重复步骤a)至d)，其中所述第二组标记物包含至少多个第三连接子，所述多个第三连接子被配置成直接或间接结合第三目标分子，并且每个连接子包含第三标签。
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