CN116531329A - 一种含氨甲环酸正壬醇酯的泡沫硬化剂组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种含氨甲环酸正壬醇酯的泡沫硬化剂组合物及其制备方法和应用 Download PDF

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CN116531329A CN202310591132.5A CN202310591132A CN116531329A CN 116531329 A CN116531329 A CN 116531329A CN 202310591132 A CN202310591132 A CN 202310591132A CN 116531329 A CN116531329 A CN 116531329A
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Abstract

一种含氨甲环酸正壬醇酯的泡沫硬化剂组合物及其制备方法和应用，属于医药技术领域，由氨甲环酸正壬醇酯或其药学上可接受盐、药学可接受辅料和溶剂组成，所述含氨甲环酸正壬醇酯的泡沫硬化剂组合物临用前制备成泡沫剂。本发明为泡沫剂的临床应用提供了更多的选择性，也填补了氨甲环酸正壬醇酯泡沫硬化剂这一领域的空白。本发明的氨甲环酸正壬酯泡沫硬化剂具有较高的稳定性，注入血管后提高了药物在注射血管内的排血作用；因泡沫硬化剂良好的粘附性使其不易被血液冲走或稀释，延长了硬化剂对血管内皮的作用时间，有利于破坏血管内皮促使其脱落和栓塞的快速形成，并刺激细胞基质纤维化使血管纤维化闭琐；增强泡沫硬化治疗的效果。

Description

一种含氨甲环酸正壬醇酯的泡沫硬化剂组合物及其制备方法 和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种含氨甲环酸正壬醇酯的泡沫硬化剂组合物的制备及其在硬化治疗中的应用。
背景技术
根据2018年ISSVA分类(ISSVAclassification for vascular anomalies[EB/OL].(2018-05-18))，将血管异常性疾病分为血管肿瘤和脉管畸形两大类。脉管畸形根据累及的脉管类型，分为单纯性脉管畸形、混合性脉管畸形、知名大血管畸形、脉管畸形合并其他病变、暂未归类的脉管性病变和PIK3CA相关的过度增殖性疾病谱6个亚类。其中单纯性脉管畸形包括毛细血管畸形、淋巴管畸形、静脉畸形、动静脉畸形和动静脉瘘。其中，最常见的是静脉畸形，临床症状为疼痛、肿胀、出血、美容畸形和功能受损等，需要积极干预。目前临床上静脉畸形的治疗方式各异，传统的方式如：手术切除、冷冻、激光、铜针、电化学等，但复发率较高、并发症较多，临床效果十分不理想。近年来，泡沫硬化剂因其疗效安全、可靠而广泛应用于国内外临床。
静脉曲张的分类主要根据部位的不同可以分为下肢静脉曲张、胃底食管静脉曲张、精索静脉曲张，其中以下肢静脉曲张最为常见，多发于大隐静脉，可以由多种不同疾病引起，它可以通过腿部肿胀和疲劳、疼痛、肌肉痉挛、瘙痒等症状显著影响患者的生活质量(常光其,陈翠菊.慢性下肢静脉疾病诊断与治疗中国专家共识[J].中国血管外科杂志),2014,6(03):143-151.)。目前，下肢浅静脉曲张的治疗方法有传统外科手术及激光、射频消融、泡沫硬化疗法等微创技术。
硬化治疗在静脉曲张和静脉崎形的治疗中与外科手术、激光、射频和曲张静脉切除术一样具有举足轻重的地位，己经具有150多年的历史。泡沫硬化剂相较于传统液体硬化剂，优势在于效果更好、更安全、气体能排挤置换血液，使药物与血管内皮细胞更充分、更长时间的接触，从而增强疗效。主要使用的泡沫硬化剂为聚多卡醇(Polidocanol，POL)、十四烷基硫酸钠(STS)等。其中聚多卡醇的不良反应较少，使用最为广泛。但是总体而言，目前可供选择使用的泡沫硬化剂种类较少，且存在治疗效果不够理想、易复发等棘手问题(HageA,Chick J,Srinivasa R,et al.Treatment of Venous Malformations:The Data,WhereWe Are,and How It Is Done[J].Techniques in vascular and interventionalradiology,2018,21(2):45-54.)。
有专利申请书(申请公布号CN114146077A)公开了氨甲环酸正壬醇酯作为硬化剂治疗血管瘤、脉管畸形和静脉曲张等静脉性疾病，但是其给药剂型为自组装凝胶制剂。氨甲环酸正壬醇酯作为一种潜在的硬化剂研究报道的极少，更没有人认为其可以制备泡沫型硬化剂在临床使用。我们在实验研究中偶然发现，通过处方优化设计，氨甲环酸正壬醇酯可以制备成稳定性符合硬化治疗要求的泡沫制剂，其具备一些优越的特性，如黏附性、致密性和通针性。黏附性和致密性使得泡沫在注射后易于控制，以排开血液降低其稀释效应。通针性使得泡沫可经细小穿刺针注射而不改变其性质。可以用少量的液体制作较大剂量的泡沫，有效降低了硬化剂的使用剂量，可以大大降低不良反应发生的风险；泡沫的其他特性包括超声可视性以及对硬化能力的增强作用，从而减少了药物的用量、降低了药物浓度。
发明内容
针对现有技术中泡沫硬化剂种类较少，且存在治疗效果不够理想、易复发等棘手问题，本发明的目的是提供一种新型的泡沫硬化剂，即一种含氨甲环酸正壬醇酯的泡沫硬化剂组合物，同时还提供其在硬化治疗中的应用。
本发明在实验研究中，将氨甲环酸正壬醇酯或其药学上可接受盐制备成泡沫硬化剂，通过添加稳定剂的手段和方法增强了氨甲环酸正壬醇酯泡沫的稳定性，延长氨甲环酸正壬醇酯泡沫的泡沫半衰期。这一制剂技术能够克服氨甲环酸正壬醇酯泡沫稳定性不足的问题，从而实现泡沫通过静脉注射后对血液的阻断作用，使其不易被血液冲走或稀释，并使硬化剂分子与病变区血管内皮的接触更加充分，极大延长了与血管壁的作用时间，进而提高了泡沫硬化治疗的效果。这一发现在现有文献中未见类似报道，有很好的创造性。
本发明提供的一种含氨甲环酸正壬醇酯的泡沫硬化剂组合物，包括氨甲环酸正壬醇酯或其药学上可接受盐(TA9)、药学可接受辅料和溶剂；所述药学可接受辅料包括稳泡剂，所述溶剂为注射用水；所述含氨甲环酸正壬醇酯的泡沫硬化剂组合物，临用前制备成泡沫剂。
所述药学可接受盐为盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、枸橼酸盐、酒石酸盐或乳酸盐。
所述氨甲环酸正壬醇酯或其药学上可接受的盐在所述泡沫硬化剂组合物中的质量体积浓度(w/v)为0.5％-20％，优选的，质量体积浓度为1.0-10.0％。
所述稳泡剂为乙醇、1,2-丙二醇(PG)、甘油(Gly)、聚乙二醇(PEG)之一种，或者是两种或两种以上的任意比例的混合物；其中：所述聚乙二醇平均分子量为200-1000；所述稳泡剂采用乙醇时，其在所述泡沫硬化剂组合物中的质量体积浓度(w/v)为0.1％-10％，优选质量体积浓度为0.5％-5％；稳泡剂采用1,2-丙二醇时，其在所述泡沫硬化剂组合物中的质量体积浓度(w/v)为0.1％-55％，优选质量体积浓度为15％-40％；稳泡剂采用甘油时，其在所述泡沫硬化剂组合物中的质量体积浓度(w/v)为0.1％-55％，优选质量体积浓度为15％-40％；稳泡剂采用PEG时，其在所述泡沫硬化剂组合物中的质量体积浓度(w/v)为0.1％-55％，优选质量体积浓度为15％-40％。
本发明所述含氨甲环酸正壬醇酯的泡沫硬化剂组合物，其还可以含有药学上可接受酸、碱或者缓冲盐，用以调节体系pH至4-9的范围，优选调节pH至5-7之间。
本发明所述含氨甲环酸正壬醇酯的泡沫硬化剂组合物，其还包括氯化钠溶液，其质量体积浓度为0.1％-2.0％。
本发明还提供一种含氨甲环酸正壬醇酯的泡沫硬化剂组合物的制备方法，包括如下步骤：
氨甲环酸正壬醇酯或其药学上可接受盐(TA9)、稳泡剂和溶剂混匀溶解；或者将氨甲环酸正壬醇酯无菌粉末临用前加入专用溶剂溶解，配制成溶液；使用前，利用Tessari方法(Tessari L,Cavezzi A,Frullini A.Preliminary experience with a newsclerosing foam in the treatment of varicose veins[J].Dermatologic surgery:official publication for American Society for Dermatologic Surgery[et al],2001,27(1):58-60.)制得；具体制备步骤如下：
(1)将TA9和稳泡剂溶解到溶剂中，配制成混合物溶液；
(2)将步骤(1)所得的混合物溶液和空气按一定的比例(v/v)，分别装入两支注射器中；所述气液比1:1-5:1；
(3)将步骤(2)的两支注射器通过一个医用三通阀连接(图12)；将注射器来回快速推注40-50次进行混合而制取泡沫。
本发明提供一种泡沫疗法用泡沫硬化剂的制备方法，也可以利用下面的步骤制备：
泡沫剂由氨甲环酸正壬醇酯无菌粉末和专用溶剂二部分组成；氨甲环酸正壬醇酯无菌粉末通过冷冻干燥或者无菌分装工艺制备；专用溶剂由注射用水和药学上可接受的辅料组成；临用前，氨甲环酸正壬醇酯无菌粉末用专用溶剂溶解后，利用Tessari法制得泡沫剂。
一种含氨甲环酸正壬醇酯的泡沫硬化剂组合物在制备静脉系统疾病硬化治疗药物中的应用。
本发明的有益效果：
1.本发明的含氨甲环酸正壬酯的泡沫硬化剂组合物，在现有文献中未见报道；为泡沫剂的临床应用提供了更多的选择性，也填补了氨甲环酸正壬醇酯泡沫硬化剂这一领域的空白。
2.本发明的氨甲环酸正壬酯泡沫硬化剂具有较高的稳定性，注入血管后提高了药物在注射血管内的排血作用；因泡沫硬化剂良好的粘附性使其不易被血液冲走或稀释，延长了硬化剂对血管内皮的作用时间，有利于破坏血管内皮促使其脱落和栓塞的快速形成，并刺激细胞基质纤维化使血管纤维化闭琐；增强泡沫硬化治疗的效果。
3.氨甲环酸正壬酯泡沫硬化剂因其含液体量低，极大地降低了硬化剂的剂量，和液体硬化剂注射比较，给药剂量大大降低，提高了药物使用的安全性；是一种理想的硬化剂，可以用于血管瘤、脉管畸形以及静脉曲张的治疗。因此本发明极高的应用价值和前景。
附图说明
图1不同浓度TA9对泡沫半衰期的影响；
图2不同推注次数对泡沫半衰期的影响；
图3不同液气比对泡沫半衰期的影响；
图4添加不同浓度甘油对泡沫半衰期的影响；
图5TA9溶液和泡沫、TA9-Gly溶液和泡沫的粘度分析；
图6TA9溶液和泡沫、TA9-Gly溶液和泡沫的密度分析；
图7不同浓度Gly、TA9和TA9-Gly对HUVEC细胞毒性；
图8不同浓度Gly、TA9和TA9-Gly作用于HUVEC细胞LDH释放率；
图9小鼠尾静脉注射前和注射生理盐水(NS)和TA9-Gly(Foam)后30分钟、3天、10天、28天的变化图；
图10兔耳缘静脉注射前和注射生理盐水(NS)和TA9-Gly(Foam)后30分钟、3天、10天、28天的变化图；
图11兔耳缘静脉注射生理盐水(NS)和TA9-Gly(Foam)后30分钟、3天、10天、28天的H&E染色图；
图12Tessari法示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清晰，使本领域技术人员能够更好地理解本发明，以下结合附图与实施例对本发明的实施方式作进一步详细地阐述。
实验材料
试剂：
氨甲环酸正壬醇酯(自制)
甘油(天津市大茂化学试剂厂)
1mL一次性无菌医用注射器(长春白求恩医疗器械有限公司)
医用三通阀(铭安医疗器械有限公司)
DMEM培养基(美国Corning公司)
胰蛋白酶(美国Sigma-Aldrich公司)
青霉素链霉素(美国Gibco公司)
CCK-8(上海碧云天生物技术有限公司)
乳酸脱氢酶检测试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)
4％多聚甲醛(武汉赛维尔生物科技有限公司)
HE染液套装(武汉赛维尔生物科技有限公司)
细胞及动物：
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(美国ATCC细胞库)
家兔、KM小鼠(辽宁长生生物科技有限公司)
实验仪器：
AR2000ex流变仪(美国TA仪器公司)
电子天平秤(北京赛多利斯仪器系统有限公司)
MCO-18AC二氧化碳培养箱(日本Panasonic公司)
HR40-IIA2超净工作台(青岛海尔股份有限公司)
酶标仪(美国Thermo Fisher公司)
实施例1
本实施例提供一种硬化治疗用含氨甲环酸正壬醇酯的泡沫硬化剂组合物，处方和制备方法如下；对比测定TA9不同浓度对泡沫稳定性的影响。
(一)处方
(二)制备方法
(1)将TA9添加到注射用水中溶解，配制成溶液，TA9的浓度(w/v)分别为2％、3％、4％、5％、6％；再分别加入氯化钠，浓度(w/v)为0.9％；即得浓度(w/v)分别为2％、3％、4％、5％、6％的硬化剂溶液。
(2)采用Tessari法制备泡沫剂，具体操作为：将两支一次性注射器(1mL)通过一个医用三通阀连接，将(1)所得的混合溶液和空气以1:3的比例在两支注射器间来回快速推注40次进行混合，从而获取泡沫剂。
(3)将步骤2所得的泡沫剂与医用三通阀脱离，垂直放置后开始计时，观察底部形成的液体体积，当底部形成的液体体积为原液体积的一半(0.1mL)时停止计时，该时间即为该泡沫的半衰期。
实验结果如图1所示，随着TA9浓度的添加，TA9泡沫剂的半衰期开始延长，后达到平台期。在TA9的百分含量为4％时达到最大值230s，证明了TA9浓度的增加在一定程度上能够增强TA9泡沫的稳定性。
实施例2
本实施例提供一种硬化治疗用含氨甲环酸正壬醇酯的泡沫硬化剂组合物，处方和制备方法如下；对比不同测定推注混合次数对泡沫稳定性的影响。
(一)处方
组分 浓度(w/v)％
TA9 4
氯化钠 0.9
注射用水加至 100
(二)制备方法
(1)将TA9添加到注射用水中溶解，配制成溶液，TA9的浓度(w/v)4％；再加入氯化钠，浓度(w/v)为0.9％；即得浓度(w/v)为4％的硬化剂溶液。
(2)采用Tessari法制备泡沫剂，具体操作为：将两支一次性注射器(1mL)通过一个医用三通阀连接，将(1)所得的混合溶液和空气以1:3的比例在两支注射器间分别来回快速推注20、30、40、55、70次进行混合，从而获取泡沫剂。
(3)将步骤2所得的泡沫剂与医用三通阀脱离，垂直放置后开始计时，观察底部形成的液体体积，当底部形成的液体体积为原液体积的一半时停止计时，该时间即为该泡沫的半衰期。
实验结果如图2所示，推注次数影响泡沫稳定性半衰期，推注次数20、30、40、55、70次时对应的半衰期分别为206s，246s，275s，282s，291s，泡沫稳定性随推注次数的增加而增加，优选40-50次作为制备泡沫的推注次数。
实施例3
本实施例提供一种硬化治疗用含氨甲环酸正壬醇酯的泡沫硬化剂组合物，处方和制备方法如下；对比测定不同的气液比例对泡沫稳定性的影响。
(一)处方
组分 浓度(w/v)％
TA9 4
氯化钠 0.9
注射用水加至 100
(二)制备方法
(1)将TA9添加到注射用水中溶解，配制成溶液，TA9的浓度(w/v)4％；再加入氯化钠，浓度(w/v)为0.9％；即得浓度(w/v)为4％的硬化剂溶液(1)将TA9添加到生理盐水中配置成混合溶液，TA9的浓度为4％。
(2)采用Tessari法制备泡沫剂，具体操作为：将两支一次性注射器(1mL)通过一个医用三通阀连接，将空气和(1)所得的混合溶液和分别以1:1、2:1、3:1、4:1、5:1的比例在两支注射器间来回快速推注40次进行混合，从而获取泡沫剂。
(3)将步骤2所得的泡沫剂与医用三通阀脱离，垂直放置后开始计时，观察底部形成的液体体积，当底部形成的液体体积为原液体积的一半时停止计时，该时间即为该泡沫的半衰期。
实验结果如图3所示，泡沫稳定性随气液比例的增加而达到稳定，气液比例选择在3:1到5:1之间泡沫稳定性最好，泡沫半衰期在280s-306s
实施例4
本实施例提供一种硬化治疗用含氨甲环酸正壬醇酯的泡沫硬化剂组合物，处方和制备方法如下；对比测定不同浓度的甘油作为稳泡剂对泡沫稳定性的影响。
(一)处方
(二)制备方法
(1)将TA9添加到注射用水中溶解，配制成溶液，TA9的浓度(w/v)4.5％；再加入氯化钠，浓度(w/v)为0.9％；最后加入甘油，搅拌均匀，甘油的浓度分别为0％、10％、15％、20％、25％、30％。即得含有不同浓度甘油的硬化剂溶液。
(2)采用Tessari法制备泡沫剂，具体操作为：将两支一次性注射器(1mL)通过一个医用三通阀连接，将(1)所得的混合溶液和空气以1:3的比例在两支注射器间来回快速推注40次进行混合，从而获取泡沫剂。
(3)将步骤2所得的泡沫剂与医用三通阀脱离，垂直放置后开始计时，观察底部形成的液体体积，当底部形成的液体体积为原液体积的一半时停止计时，该时间即为该泡沫的半衰期。
实验结果如图4所示，实验范围内随着添加甘油浓度的增大，TA9泡沫的半衰期逐渐延长，在甘油的百分含量为30％时半衰期延长趋势变缓，可以将半衰期从230s延长至574s，数据证明了甘油能够明显增强TA9泡沫的稳定性。
实施例5
本实施例提供一种硬化治疗用含氨甲环酸正壬醇酯的泡沫硬化剂组合物，处方和制备方法如下：
(一)处方
(二)制备方法
(1)将TA9添加到注射用水中溶解，配制成溶液，TA9的浓度(w/v)4.0％；再加入甘油，搅拌均匀，甘油的浓度为25.0％；加入氯化钠，搅拌溶解，氯化钠的浓度为0.5％；加入磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲盐(8.8:1)，调节pH5.5-8；即得TA9泡沫硬化剂(TA9-Gly)溶液。
(2)采用Tessari法制备泡沫剂，具体操作为：将两支一次性注射器(1mL)通过一个医用三通阀连接，将(1)所得的混合溶液和空气以1:3的比例在两支注射器间来回快速推注40次进行混合，从而获取TA9-Gly泡沫剂。
(3)将步骤2所得的泡沫剂与医用三通阀脱离，垂直放置后开始计时，观察底部形成的液体体积，当底部形成的液体体积为原液体积的一半时停止计时，该时间即为该泡沫的半衰期。测定的泡沫半衰期为：520s
实施例6
本实施例提供一种硬化治疗用含氨甲环酸正壬醇酯的泡沫硬化剂组合物，处方和制备方法如下：
(一)处方
(二)制备方法
(1)将TA9添加到注射用水中溶解，配制成溶液，TA9的浓度(w/v)4.5％；再加入1,2-丙二醇，搅拌均匀，1,2-丙二醇的浓度为30％；加入磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲盐(8.8:1)，调节pH6-8；即得硬化剂溶液。
(2)采用Tessari法制备泡沫剂，具体操作为：将两支一次性注射器(1mL)通过一个医用三通阀连接，将(1)所得的混合溶液和空气以1:3的比例在两支注射器间来回快速推注40次进行混合，从而获取泡沫剂。
(3)将步骤2所得的泡沫剂与医用三通阀脱离，垂直放置后开始计时，观察底部形成的液体体积，当底部形成的液体体积为原液体积的一半时停止计时，该时间即为该泡沫的半衰期，结果为441s。证明了1,2-丙二醇能够显著增强TA9泡沫的稳定性。
实施例7
本实施例提供一种硬化治疗用含氨甲环酸正壬醇酯的泡沫硬化剂组合物，处方和制备方法如下：
(一)处方
(二)制备方法
(1)将TA9添加到注射用水中溶解，配制成溶液，TA9的浓度(w/v)6.0％；再加入PEG400，搅拌均匀，PEG400的浓度为25％；用适量磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲盐(8.8:1)，调节pH在6-8，缓冲盐总浓度为0.2％；即得硬化剂溶液。
(2)采用Tessari法制备泡沫剂，具体操作为：将两支一次性注射器(1mL)通过一个医用三通阀连接，将(1)所得的混合溶液和空气以1:3的比例在两支注射器间来回快速推注40次进行混合，从而获取泡沫剂。
(3)将步骤2所得的泡沫剂与医用三通阀脱离，垂直放置后开始计时，观察底部形成的液体体积，当底部形成的液体体积为原液体积的一半时停止计时，该时间即为该泡沫的半衰期，结果为463s。结果证明PEG400能够显著增强TA9泡沫的稳定性。
实施例8
本实施例提供一种硬化治疗用含氨甲环酸正壬醇酯的泡沫硬化剂组合物，处方和制备方法如下：
(一)处方
(二)制备方法
(1)将TA9添加到注射用水中溶解，配制成溶液，TA9的浓度(w/v)5.0％；再加入PEG200，搅拌均匀，PEG200的浓度为25％；加入磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲盐(8.8:1)，调节pH在5.5-8.5；即得硬化剂溶液。
(2)采用Tessari法制备泡沫剂，具体操作为：将两支一次性注射器(1mL)通过一个医用三通阀连接，将(1)所得的混合溶液和空气以1:3的比例在两支注射器间来回快速推注40次进行混合，从而获取泡沫剂。
(3)将步骤2所得的泡沫剂与医用三通阀脱离，垂直放置后开始计时，观察底部形成的液体体积，当底部形成的液体体积为原液体积的一半时停止计时，该时间即为该泡沫的半衰期，结果为434s。说明PEG200能够显著增强TA9泡沫的稳定性。
实施例9
本实施例提供一种硬化治疗用含氨甲环酸正壬醇酯的泡沫硬化剂组合物，处方和制备方法如下：
(一)处方
组分 浓度(w/v)％
TA9 4.5
PEG600 20
氯化钠 0.9
注射用水加至 100
(二)制备方法
(1)将TA9添加到注射用水中溶解，配制成溶液，TA9的浓度(w/v)4.5％；再加入PEG600，搅拌均匀，PEG600的浓度为20％。即得硬化剂溶液。
(2)采用Tessari法制备泡沫剂，具体操作为：将两支一次性注射器(1mL)通过一个医用三通阀连接，将(1)所得的混合溶液和空气以1:3的比例在两支注射器间来回快速推注40次进行混合，从而获取泡沫剂。
(3)将步骤2所得的泡沫剂与医用三通阀脱离，垂直放置后开始计时，观察底部形成的液体体积，当底部形成的液体体积为原液体积的一半时停止计时，该时间即为该泡沫的半衰期，结果为489s。证明了PEG600能够显著增强TA9的稳定性。
实施例10
4％TA9溶液和4％TA9泡沫性质的对比研究
(1)流变特性
测定方法：分别取实施例1中4％TA9溶液和4％TA9泡沫，实施例5中TA9-Gly溶液和TA9-Gly泡沫，采用AR 2000流变仪对样品进行测定，使用20mm平板，间距为0.1mm。在稳态流动模式下，设定剪切速率为0-200 1/s，测定样品粘度随剪切速率变化，所有实验均在25℃测定。
测定结果和结论：如图5所示，对样品进行粘度比较，可以看出液体粘度相似，但添加了Gly的TA9-Gly溶液粘度略微大于TA9溶液。泡沫粘度远大于液体粘度，且TA9-Gly泡沫的粘度大于TA9泡沫的粘度，表明Gly增加了TA9硬化剂的粘度。高粘度溶液形成的泡沫具有更大的粘度，在血管中不容易流动，可以阻碍液体的排出，减缓了液膜变薄的过程，提高了泡沫的稳定性。另外，两种制剂都具有剪切变稀的性质，这一特性有利于提高注射给药时的通针性，使注射给药便于医护人员操作。
(2)密度
测定方法：分别取实施例1中4％TA9溶液和4％TA9泡沫，实施例5中TA9-Gly溶液和TA9-Gly泡沫。液体密度测量，取固定体积为0.2mL的液体用电子天平称量记录质量，用质量除以固定体积得到密度，平行三组。泡沫密度测量，取一个空的2mL注射器放在电子天平上去皮，然后如上所述用Tessari法制备泡沫，并收集在同一注射器中，称量注射器质量，并用质量除以体积得到密度，平行三组。
测定结果和结论：如图6所示，对样品进行密度比较。单位体积中液体硬化剂的密度远大于泡沫硬化剂的密度。TA9-Gly泡沫的密度大于TA9泡沫的密度。TA9-Gly溶液的密度大于TA9溶液的密度，且密度与血液密度相似。在静脉中注射泡沫制剂后会形成三个相对不同的水平层包括泡沫层、液体硬化剂层和血液层。鉴于泡沫具有较轻的密度，打入血管后，它会上升到血管顶部破坏上侧血管。随着时间的推移，泡沫破裂消失，液体硬化剂由于重力而流下，与血液混合，以此破坏下侧血管。
实施例11
体外细胞试验
(1)细胞毒性试验
测定方法：采用CCK-8法测定TA9-Gly对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的细胞毒性，HUVEC培养于完全培养基DMEM中，其中含10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素混合液，置于含5％ CO2，37℃细胞培养箱中培养。待细胞增殖至80％后取出，PBS洗涤1次，0.25％的胰蛋白酶进行消化，再加入2mL培养基使细胞脱落重悬。以每孔104个细胞接种到96孔细胞培养板中，使细胞贴壁生长24h。然后用实施例5中的TA9-Gly溶液和不同对照组处理细胞，继续培养24h。实验根据TA9-Gly的浓度设置了2.5、5、10、25、30、50μg/mL五个计量组。TA9-Gly设置为实验组，TA9和Gly设置为对照组组。对照组的添加量与实验组所含相应成分等质量。24h后向每孔加入10μL CCK-8溶液，继续在培养箱中孵育3h，使用多功能酶标仪在于450nm处测定吸光度值，计算细胞活性(％)。以不含细胞的孔及不含药空白组和空白对照组。
测定结果和结论：如图7所示，本发明TA9-Gly导致的细胞毒性呈浓度依赖性，浓度为10μg/mL时细胞可基本存活，但是在25μg/mL的浓度下，细胞活性急剧降低，说明在达到一定浓度时TA9-Gly对细胞有显著的毒性。与TA9-Gly组相比，Gly组未显示出细胞毒性，TA9组毒性与TA9-Gly组相似，表明Gly不具有细胞毒性，细胞毒性来源仅为TA9。
(2)乳酸脱氢酶(LDH)释放实验
测定方法：采用LDH释放法测定细胞膜完整性，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养于完全培养基DMEM中，其中含10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素混合液，置于含5％CO2，37℃细胞培养箱中培养。待细胞增殖至80％后取出，PBS洗涤1次，0.25％的胰蛋白酶进行消化，再加入2mL培养基使细胞脱落重悬。以每孔104个HUVEC细胞接种到96孔细胞培养板中培养，使细胞贴壁生长24h。吸去旧培养基，用PBS洗涤1次。然后用实施例5中的TA9-Gly溶液和不同对照组处理细胞，继续培养24h。实验根据TA9-Gly的浓度设置了2.5、5、10、25、30、50μg/mL五个计量组。TA9-Gly设置为实验组，TA9和Gly设置为对照组。对照组的添加量与实验组所含相应成分等质量。继续培养24h，并根据乳酸脱氢酶测定试剂盒说明进行测定。用酶标仪在490nm处测定吸光度，计算LDH释放量(％)。以不含细胞的孔及不含药物的孔为空白组和最大酶释放组。
测定结果和结论：如图8所示，本发明中TA9-Gly作用于HUVEC细胞后，LDH的释放随着浓度的增加而增加，在TA9浓度为25μg/mL条件下，LDH释放量急剧增加至92.04％。与TA9-Gly组相比，Gly组未显示出膜损伤能力，TA9组与TA9-Gly组相似，该结果与细胞毒性结果一致，说明TA9会引发严重的细胞膜损伤，且膜损伤能力仅来自于TA9。
实施例12
体内药效
(1)小鼠尾静脉药效学评价
测定方法：将10只KM小鼠随机分为2组，A组为生理盐水组(NS)，B组为实施例5中制备的4％(w/v)TA9-Gly组(Foam)。随机选择小鼠尾静脉，分别注射25μL生理盐水及25μL 4％(w/v)TA9-Gly(Foam)，并于给药前和给药后30min、3d、10d、28d记录小鼠尾静脉情况。
测定结果和结论：由图9可观察到生理盐水注射后小鼠尾静脉无明显变化。4％(w/v)TA9-Gly注射后约30min，在注射部位观察到明显的血栓形成，但在注射部位以外并没有观察到其他血栓和组织坏死的异常症状。十天后，从透光小图中可以看出血栓范围明显变小，血管变细甚至消失的状态。28天后，TA9-Gly射部位的尾静脉成功闭锁，从透光小图中可以看出血管消失，表明TA9泡沫硬化剂对治疗血管瘤、脉管畸形和静脉曲张的有效性。
(2)兔耳缘静脉药效学评价
测定方法：将8只家兔随机分为2组，A组为生理盐水组(NS)，B组为实施例5中制备的4％(w/v)TA9-Gly组(Foam)。随机选择家兔左耳或右耳的耳缘静脉，分别注射25μL生理盐水及25μL TA9-Gly(Foam)，并于给药前和给药后30min、3d、10d、28d记录家兔耳缘情况。并分别于给药后30min、3d、10d和28d处死一只家兔，取兔耳以4％多聚甲醛固定，石蜡切片，进行H&E染色观察组织学变化。
图10是兔耳缘静脉注射生理盐水(NS)和4％(w/v)TA9-Gly(Foam)前、30min、3d、10d、28d的透光变化图，可看出注射生理盐水后的耳缘静脉在观察时间内无明显变化。注射TA9-Gly(Foam)30分钟后，耳缘静脉的官腔内充满TA9-Gly泡沫，管周未见明显异样。3天后注射部位明显变黑引发血栓，且栓塞效果明显，血管周围组织有炎症发生。从第10天可以看出炎症缓慢消失，血栓栓塞面积逐渐减少，被栓塞血管无血流通过，局部血管轮廓变得模糊不清。28天后炎症和血栓消失，且局部组织未观察到明显异常。
通过图11H&E染色可观察到生理盐水组无异常，未见血栓和其他异常病变。TA9-Gly(Foam)在给药后30min可观察到血栓的形成。三天后血栓形成完全，给药部位有明显的淤血水肿等炎症反应，血管腔内可见大量炎性细胞浸润，血栓周围及内部出现内皮细胞和纤维母细胞，表明血管纤维组织的增生。10天后血栓现象明显减少，血管内长满大量新生纤维组织。28天后，管腔闭锁，静脉消失，邻近组织正常。以上药效学实验证明了本发明对血管瘤、脉管畸形和静脉曲张硬化治疗的有效性。

Claims (10)

1.一种含氨甲环酸正壬醇酯的泡沫硬化剂组合物，其特征在于其由氨甲环酸正壬醇酯或其药学上可接受盐、药学可接受辅料和溶剂组成；所述药学可接受辅料包括稳泡剂，所述溶剂为注射用水；所述药学可接受盐为盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、枸橼酸盐、酒石酸盐或乳酸盐。
2.根据权利要求1所述的一种含氨甲环酸正壬醇酯的泡沫硬化剂组合物，其特征在于所述氨甲环酸正壬醇酯或其药学上可接受的盐在所述泡沫硬化剂组合物中的质量体积浓度为0.5％-20％。
3.一种含氨甲环酸正壬醇酯的泡沫硬化剂组合物，其特征在于其由氨甲环酸正壬醇酯或其药学上可接受盐、注射用水和药学可接受辅料组成；药学可接受辅料包括稳泡剂；临用前制成泡沫，氨甲环酸正壬醇酯或其药学上可接受的盐在泡沫剂中的质量体积浓度为0.5％-20％。
4.一种含氨甲环酸正壬醇酯的泡沫硬化剂组合物，其特征在于其由氨甲环酸正壬醇酯或其药学上可接受盐的无菌粉末和专用溶剂二部分组合而成；所述氨甲环酸正壬醇酯无菌粉末通过冷冻干燥或者无菌分装工艺制备；专用溶剂由注射用水和药学可接受辅料组成；所述药学可接受辅料包括稳泡剂；临用前氨甲环酸正壬醇酯无菌粉末用专用溶剂溶解，再制成泡沫；氨甲环酸正壬醇酯或其药学上可接受的盐在泡沫剂中的质量体积浓度为0.5％-20％。
5.根据权利要求1-4任一项所述的一种含氨甲环酸正壬醇酯的泡沫硬化剂组合物，其特征在于所述稳泡剂为乙醇、1,2-丙二醇、甘油、聚乙二醇之一种，或者是两种或两种以上的任意比例的混合物；所述聚乙二醇平均分子量为200-1000。
6.根据权利要求5所述的一种含氨甲环酸正壬醇酯的泡沫硬化剂组合物，其特征在于所述稳泡剂采用乙醇时，其在所述泡沫硬化剂组合物中的质量体积浓度为0.1％-10％；稳泡剂采用1,2-丙二醇时，其在所述泡沫硬化剂组合物中的质量体积浓度为0.1％-55％；稳泡剂采用甘油时，其在所述泡沫硬化剂组合物中的质量体积浓度为0.1％-55％；稳泡剂采用聚乙二醇时，其在所述泡沫硬化剂组合物中的质量体积浓度为0.1％-55％。
7.根据权利要求1-4任一项所述的一种含氨甲环酸正壬醇酯的泡沫硬化剂组合物，其特征在于还包括药学上可接受酸、碱或者缓冲盐，用以调节体系pH至4-9的范围。
8.根据权利要求1-4任一项所述的一种含氨甲环酸正壬醇酯的泡沫硬化剂组合物，其特征在于还包括氯化钠溶液，其质量体积浓度为0.1％-2.0％。
9.一种权利要求1-4任一项所述的含氨甲环酸正壬醇酯的泡沫硬化剂组合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将氨甲环酸正壬醇酯或其药学上可接受盐和稳泡剂溶解到溶剂中，配制成混合物溶液；或者将氨甲环酸正壬醇酯无菌粉末加入专用溶剂溶解，配制成溶液；
(2)将步骤(1)所得的混合物溶液和空气按气液比1:1-5:1，分别装入两支注射器中；
(3)将步骤(2)的两支注射器通过一个医用三通阀连接；将注射器来回快速推注40-50次进行混合而制取泡沫。
10.一种权利要求1-4任一项所述的含氨甲环酸正壬醇酯的泡沫硬化剂组合物在制备静脉系统疾病硬化治疗药物中的应用。
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