CN116529353A - 具有受控的分区孔隙度的填装床生物反应器 - Google Patents

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Abstract

提供了用于培养细胞的填装床细胞培养基质和生物反应器系统。系统包括细胞培养容器，其具有入口、出口以及流体连接到且布置在入口与出口之间的内部储器。细胞培养基质布置在储器中，细胞培养基质具有结构受限定的基材，具有限定了多个孔的基材材料，以及基材材料用于使得细胞粘附到其。渗透区位于一部分的细胞培养基质中，所述至少一个渗透区所具有的渗透性高于渗透区外的细胞培养基质的标准渗透性。渗透区具有基材中的开口，其中，开口的直径大于所述多个孔中的任一个。

Description

具有受控的分区孔隙度的填装床生物反应器
相关申请的交叉参考
本申请根据35U.S.C.§119，要求2020年11月30日提交的美国临时申请系列第63/119,006号的优先权权益，本文以其内容作为基础并将其全文通过引用结合于此。
技术领域
本公开内容大体上涉及填装床构造中的细胞培养基材以及细胞培养的系统和方法。具体来说，本公开内容涉及具有受控和可变孔隙度的限定区的填装床细胞培养基材以及结合了此类基材的生物反应器系统和采用此类基材的细胞培养方法。
背景技术
在生物加工行业，出于生产激素、酶、抗体、疫苗和细胞疗法的目的进行大规模细胞培养。细胞和基因治疗市场正在快速增长，有希望的治疗进入临床试验并迅速走向商业化。然而，一次细胞治疗剂量可能需要数十亿个细胞或数万亿个病毒。由此，能够在短时间内提供大量细胞产品对于临床成功是至关重要的。
生物加工中使用的大部分细胞都依赖于锚点，这意味着细胞需要表面来粘附从而进行生长和发挥功能。传统上，粘附细胞的培养是在二维(2D)细胞粘附表面上进行的，所述细胞粘附表面整合在多种容器形式中的一种，例如：T型瓶、培养皿、细胞工厂、细胞堆叠容器、辊瓶以及容器。这些方案会具有明显缺陷，包括难以实现高到足以使得可用于治疗或细胞的大规模生产的细胞密度。
已经建议有替代方法来增加培养细胞的体积密度。这些包括在搅拌罐中进行的微载体培养。在这种方案中，附着到微载体表面的细胞经受恒定剪切应力，导致对增殖和培养性能的明显影响。高密度细胞培养系统的另一个例子是空心纤维生物反应器，其中，当他们在纤维空间之间的空间中增殖时，细胞可以形成大的三维聚集体。然而，由于缺乏营养物，细胞生长和性能受到明显抑制。为了缓解这个问题，将这些生物反应器制造成小的并且不适合大规模生产。
用于锚定依赖细胞的高密度培养系统的另一个例子是填装床生物反应器系统。在这种类型的生物反应器中，使用细胞基材来提供粘附细胞的附着表面。介质沿表面或通过半多孔基材灌注，以提供细胞生长所需的营养物和氧气。例如，先前的美国专利第4,833,083号、第5,501,971号以及第5,510,262号已经公开了含有支撑或基质系统的填装床来俘获细胞的填装床生物反应器系统。填装床基质通常是由多孔颗粒作为基材或者聚合物的非织造微纤维来制造得到的。此类生物反应器起到了再循环流通式生物反应器的功能。明显问题之一在于，此类生物反应器在填装床内的细胞分布不是均匀的。例如，填装床起到了深度过滤器的功能，细胞主要俘获在入口区域处，导致接种步骤期间的细胞分布的梯度。此外，由于无规纤维填装，填装床的横截面的流动阻力以及细胞俘获效率不是均匀的。例如，介质快速流动通过具有低的细胞填装密度的区域，而缓慢流动通过由于较高数量的俘获细胞导致较高阻力的区域。这产生了通道效应，其中，营养物和氧气被更有效地传递到具有较低体积细胞密度的区域，而具有较高细胞密度的区域则维持在非最优培养条件下。
现有技术公开的填装床系统的另一个明显缺陷在于，无法在培养过程结束时高效地收获完整的活细胞。如果最终产品是细胞或者如果生物反应器被用作“接种序列”的一部分(其中，细胞群体在一个容器中生长，然后转移到另一个容器以使得群体进一步生长)的话，那么细胞的收获是至关重要的。美国专利第9,273,278号公开了改善细胞收获步骤期间从填装床回收细胞的效率得到改善的生物反应器设计。其基于疏松填装床基质以及填装床颗粒的振动或搅拌来实现多孔基质碰撞并由此分离细胞。然而，这种方案是费力的，并且可能导致明显细胞破坏，从而降低了整体细胞存活率。
目前市场上的填装床生物反应器的例子是Pall有限公司生产的iCellis使用由以非织造布置的无规取向纤维构成的细胞基材材料的小条。将这些条填装到容器中以产生填装床。然而，如同市场上类似的解决方案那样，这种类型的填装床基材存在缺陷。具体来说，基材条的非均匀填装产生了填装床内视觉可见的通道，导致优先和非均匀的介质流动以及填装床的营养物分布。对/>的研究已经注意到“细胞的系统性非均质分布，它们的数量从固定床的顶部到底部发生增加”以及“营养物梯度……导致限制了细胞生长和生产”，这全都导致“可能影响转染效率的细胞的不均分布”。(Rationalplasmid design and bioprocess optimization to enhance recombinant adeno-associated virus(AAV)productivity in mammalian cells(合理的质粒设计和生物过程优化，以提高哺乳动物细胞中重组腺相关病毒(AAV)的生产力)，生物技术期刊，2016年11月，290-297页)。研究注意到填装床的搅拌可以改善分布，但是会具有其他缺陷(即，“在接种和转染过程中为了更好地分散而进行的必要搅拌会诱发剪切应力的增加，这进而导致细胞活力降低”，同上)。/>的另一项研究注意到：细胞的不均匀分布使得使用生物量传感器监测细胞群体是困难的(“……如果细胞分布不均匀，则顶部载体上细胞的生物量信号可能无法显示整个生物反应器的全貌”。Process Development of Adenoviral VectorProduction in Fixed Bed Bioreactor:From Bench to Commercial Scale(固定床生物反应器中腺病毒载体生产的工艺开发：从实验室到商业规模)，人类基因治疗，第26卷，第8期，2015年)。
此外，由于纤维在基材条中的无规排布以及的一个填装床与另一个之间的条填装中的变化，消费者可能难以预测细胞培养性能，因为培养之间的基材是不同的。此外，/>的填装基材非常难以或不可能高效地收获细胞，因为相信细胞被填装床所俘获。
虽然利用现有平台可以制造用于早期临床试验的病毒载体，但是需要能够以更大数量生产高质量产品的平台，以达到后期商业制造规模。如上文所述，现有的细胞培养平台依赖于随机和不受控的结构或孔隙度的粘附性细胞基材，由于随机填装、通道效应、细胞截留等导致不均匀并且甚至是不可预测的基材结构和性能。无论填装床基材基质是均匀或是随机的，对于按需控制流体流动通过填装床总会是困难的，这导致细胞培养各个方面中的困难，包括均匀细胞接种、细胞生长分布、细胞培养介质流动均匀性以及收获能力。
存在对于能够以高密度形式、均匀细胞分布、便于获得且增加收获产率以及可控填装床孔隙度的方式对细胞进行培养的填装床细胞培养基质、系统和方法的需求从而改善接种、培养和/或收获性能。
发明内容
根据本公开内容的实施方式，提供了用于细胞培养的填装床生物反应器系统。系统包括：细胞培养容器，其包含入口、出口和至少一个内部储器，所述内部储器流体连接到且布置在入口与出口之间的流体路径中；布置在储器中的细胞培养基质，所述细胞培养介质包括结构受限定的基材，具有限定了多个孔的基材材料，其中，基材材料用于使得细胞粘附到其；以及在一部分的细胞培养基质中的至少一个渗透区。所述至少一个渗透区的渗透性高于所述至少一个渗透区外的细胞培养基质的标准渗透性。渗透区包括基材中的开口，其中，开口的直径大于所述多个孔中的任一个。
根据一个或多个实施方式的方面，细胞培养基质包括多层基材。所述多层基材中的每层可以包括有序且基本均匀的孔阵列。渗透区包括所述多层中具有开口的多个层。在至少一部分的所述多个层中的开口的细胞培养基质的水平横截面的面积可以不同于所述多个层中的至少一个中的开口。具有开口的所述多个层中的每一个可以具有相同的开口布置。具有开口的所述多个层中的至少一部分可以相对于具有开口的所述多个层中的至少一个转动，其中，转动是绕着细胞培养基质的纵轴。在另一个方面中，所述多层中的一个或多个具有基材中的多个开口。具有多个开口的所述多层中的一个或多个可以绕着细胞培养基质的纵轴具有旋转对称性。
在一些方面中，开口所具有的形状包括以下至少一种：矩形、正方形、圆形、椭圆形、圆形、圆弧和三角形。开口可以从基材的边缘朝向基材的中心延伸。在一些实施方式中，系统还包括：布置在入口与细胞培养基质之间的流动分配板，其中，入口和流动分配板布置成使得经由入口进入内部储器的流体在内部储器的宽度上以不同速度流动通过流动分配板，以及细胞培养基质的渗透区设计成补偿来自流动分配板的不同速度，从而使得通过细胞培养基质的灌注速度曲线在细胞培养基质的宽度上是均匀的。
根据本公开内容的另一个实施方式，提供了用于生物反应器中的基于培养粘附细胞的细胞培养基质。细胞培养基质包括结构受限定的基材，基材材料限定了多个孔，所述基材材料构造成使得细胞粘附到其；以及在一部分的细胞培养基质中的至少一个渗透区，所述至少一个渗透区的渗透性高于所述至少一个渗透区外的细胞培养基质的标准渗透性。渗透区包括基材中的开口，其中，开口的直径大于所述多个孔中的任一个。
作为一些实施方式的方面，细胞培养基质可以包括多层基材。所述多层基材中的每层可以具有有序且基本均匀的孔阵列。渗透区可以包括所述多层中具有开口的多个层。在至少一部分的所述多个层中的开口的细胞培养基质的水平横截面的面积可以不同于所述多个层中的至少一个中的开口。包含开口的所述多个层中的每一个包括相同的开口布置。具有开口的所述多个层中的至少一部分可以相对于具有开口的所述多个层中的至少一个转动，其中，转动是绕着细胞培养基质的纵轴。所述多层中的一个或多个可以具有基材中的多个开口。具有多个开口的所述多层中的一个或多个可以绕着细胞培养基质的纵轴具有旋转对称性。开口可以具有以下至少一种形状：矩形、正方形、圆形、椭圆形、圆形、圆弧和三角形。
在以下详细描述、附图和任一权利要求中部分地提出了本公开内容的其他方面，它们部分会源自详细描述或者可以通过实施本公开内容来习得。要理解的是，前面的一般性描述和以下的具体描述这两者都只是示例性和解释性的，不构成对所揭示的本公开内容的限制。
附图说明
图1A显示根据本公开内容一个或多个实施方式的细胞培养基材的三维模型的立体图。
图1B是图1A的基材的二维平面图。
图1C是图1B中的基材沿线A-A的横截面。
图2A显示根据一些实施方式的细胞培养基材的例子。
图2B显示根据一些实施方式的细胞培养基材的例子。
图2C显示根据一些实施方式的细胞培养基材的例子。
图3A显示根据一个或多个实施方式的多层细胞培养基材的立体图。
图3B显示根据一个或多个实施方式的多层细胞培养基材的平面图。
图4显示根据一个或多个实施方式的图3B的多层细胞培养基材沿线B-B的横截面图。
图5显示根据一个或多个实施方式的图4的多层细胞培养基材沿线C-C的横截面图。
图6显示根据一个或多个实施方式的细胞培养系统的示意图。
图7显示根据一个或多个实施方式的细胞培养系统的示意图。
图8显示根据一个或多个实施方式的卷型圆柱形构造的细胞培养基质。
图9显示根据一个或多个实施方式的结合了卷型圆柱形细胞培养基质的细胞培养系统。
图10A是根据一个或多个实施方式的具有两个渗透区的细胞培养基质的立体图。
图10B是根据一个或多个实施方式的具有两个渗透区的细胞培养基质的立体图。
图10C是根据一个或多个实施方式的具有渗透区的细胞培养基质的立体图。
图11A是根据一个或多个实施方式的没有虚拟通道的细胞培养基材的平面图。
图11B是根据一个或多个实施方式的具有多个虚拟通道的细胞培养基材的平面图。
图11C是根据一个或多个实施方式的具有多个虚拟通道的细胞培养基材的平面图。
图11D是根据一个或多个实施方式的具有多个虚拟通道的细胞培养基材的平面图。
图11E是根据一个或多个实施方式的具有多个虚拟通道的细胞培养基材的平面图。
图11F是根据一个或多个实施方式的具有多个虚拟通道的细胞培养基材的平面图。
图12A是根据一个或多个实施方式的具有多个虚拟通道的细胞培养基材的平面图。
图12B是根据一个或多个实施方式的类似于图12A的细胞培养基材的平面图，但是绕其中心轴旋转了近似30°。
图12C是根据一个或多个实施方式的来自图12A和12B的细胞培养基材的堆叠的平面图。
图12D是根据一个或多个实施方式的来自图12C的细胞培养基材的堆叠的分解立体图。
图13A是根据一个或多个实施方式的具有多个虚拟通道的细胞培养基材的平面图。
图13B是根据一个或多个实施方式的类似于图13A的细胞培养基材的平面图，但是绕其中心轴旋转了近似15°。
图13C是根据一个或多个实施方式的类似于图13A的细胞培养基材的平面图，但是绕其中心轴旋转了近似30°。
图13D是根据一个或多个实施方式的类似于图13A的细胞培养基材的平面图，但是绕其中心轴旋转了近似45°。
图13E是根据一个或多个实施方式的来自图13A-13D的细胞培养基材的堆叠的平面图。
图13F是根据一个或多个实施方式的来自图13E的细胞培养基材的堆叠的分解立体图。
图14A是根据一个或多个实施方式的在通过流动分配板之后的介质的流速曲线的非均匀性的示意性代表。
图14B是根据一个或多个实施方式的具有特定设计的渗透区的填装床的流速曲线代表。
图14C是根据一个或多个实施方式的图14B的填装床当与图14A的流动分配板组装时所得到的流动均匀性的代表。
图15A是根据一个或多个实施方式的没有虚拟通道的细胞培养基材的平面图。
图15B是根据一个或多个实施方式的具有多个虚拟通道的细胞培养基材的平面图。
图15C是根据一个或多个实施方式的具有多个虚拟通道的细胞培养基材的平面图。
图15D是根据一个或多个实施方式的类似于图15B的细胞培养基材的平面图，但是绕其中心轴旋转了近似30°。
图15E是根据一个或多个实施方式的具有多个虚拟通道的细胞培养基材的平面图。
图15F是根据一个或多个实施方式的来自图15A-15E的细胞培养基材的堆叠的分解立体图。
图16A是根据一个或多个实施方式的具有多个虚拟通道的基材堆叠的平面示意图。
图16B是根据一个或多个实施方式的来自图16A的堆叠的线A-A处的横截面的照片。
图17是根据一个或多个实施方式的细胞培养系统的示意性代表。
具体实施方式
下面参考附图(如果有的话)对本公开内容的各个实施方式进行详细描述。参考各个实施方式不限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求书的范围限制。此外，在本说明书中列出的任何实例都不是限制性的，并且仅列出了要求保护的本发明的诸多可能的实施方式中的一些实施方式。
本公开内容的实施方式：填装床细胞培养基材，以及结合了此类填装床基材的细胞培养或生物反应器系统，以及采用此类填装床基材和生物反应器系统的细胞培养方法。
在常规大规模细胞培养生物反应器中，使用了不同类型的填装床生物反应器。通常来说，这些填装床含有多孔基材或基质来保留粘附或悬浮的细胞以及来支撑生长和增殖。填装床基质提供了高的表面积-体积比，所以细胞密度会高于其他系统。然而，填装床常常起到深度过滤器的作用，其中，细胞被物理俘获或卷入基质的纤维中。因而，由于细胞接种物的线性流动穿过填装床，细胞在填装床内经受非均质分布，导致穿过填装床的深度或宽度上的细胞密度的变化。例如，细胞密度可能在生物反应器的入口区域较高，而在更靠近生物反应器的出口处明显更低。这种填装床内的细胞的非均匀分布明显阻碍了生物加工制造中的此类生物反应器的规模化和可预测性，并且甚至会导致每单位表面积或体积的填装床的细胞或病毒载体生产的生长效率下降。
现有技术公开的填装床生物反应器遭遇的另一个问题是通道效应。由于填装的非织造纤维的无规特性，填装床的任意给定横截面处的局部纤维密度是不均匀的。介质在具有低纤维密度(高床可渗透性)区域中快速流动，而在高纤维密度(较低床可渗透性)区域中流动要慢得多。作为结果，填装床上的非均匀介质灌注产生通道效应，其自身表现为明显的营养物和代谢产物梯度，这对整体细胞培养和生物反应器性能产生负面影响。位于低介质灌注区域中的细胞会挨饿，并且非常普遍地由于缺乏营养物或代谢产物中毒而死亡。细胞收获是当使用填装了非织造纤维状支架的生物反应器时遭遇的另一个问题。由于填装床起到深度过滤器的功能，在细胞培养过程结束时释放的细胞被俘获在填装床内，并且细胞回收是非常低的。这明显限制了此类生物反应器在活细胞是产物的生物加工中的应用。因而，非均匀性导致具有不同的流体和剪切暴露的区域，有效地降低了可用的细胞培养面积，导致非均匀培养，并且干扰了转染效率和细胞释放。
为了解决现有细胞培养方案的这些和其他问题，本公开内容的实施方式提供了细胞生长基材、此类基材的填装床基质和/或使用此类基材的填装床系统，它们实现了对于锚点依赖性细胞和细胞产品(例如，蛋白质、抗体、病毒颗粒)生产的高效和高产率细胞培养。实施方式包括由多孔基材材料的有序且规则阵列制造的多孔细胞培养基质，其实现了均匀的细胞接种以及介质/营养物灌注，以及高效的细胞收获。实施方式还实现了具有基材和生物反应器的可规模化细胞培养解决方案，能够对细胞进行接种和生长和/或细胞产品的收获，从工艺开发规格到完全生产尺寸规格，而没有牺牲实施方式的均匀性能。例如，在一些实施方式中，生物反应器可以容易地从工艺开发规格规模化至生产规格，在生产规格上具有相当的每单位基材表面积的病毒基因组(VG/cm2)。本文实施方式的可收获性和可规模化使得它们能够用于高效接种序列用于在与相同细胞基材上的多倍规模进行细胞种群生长。此外，本文实施方式提供了具有高表面积的细胞培养基质，其结合本文所述的其他特征实现了高产率的细胞培养解决方案。例如，在一些实施方式中，本文所讨论的细胞培养基材和/或生物反应器可以产生每批次1016至1018个病毒基因组(VG)。实施方式还包括具有受控的分区(zonal)孔隙度以及穿过填装床的限定虚拟通道的填装床细胞培养基质，作为对填装床在通过细胞培养基质的流体流动方面而言的整体性能进行控制的方式。这种在填装床中形成具有不同孔隙度的区的能力会改善例如：细胞接种均匀性、介质灌注均匀性、细胞培养和生长均匀性以及细胞收获。
在一个实施方式中，提供的基质具有结构受限定的表面区域用于粘附细胞来进行附着和增殖，其具有良好的机械强度并且当装配到填装床或其他生物反应器中的时候形成高度均匀多样性的互连流体网络。如本文所用，“结构受限定的”表示具有受限定且有序结构而不是随机和无规律结构的基材或基质。例如，将非织造基材视为是随机和/或无规的。在结构受限定的基质或基材中，可以对孔隙度、纤维尺寸和取向并且甚至基材材料的分开片的取向进行设计和控制。
在具体实施方式中，机械稳定的不可降解的织造网可以用作基材来支撑粘附的细胞生产。本文公开的细胞培养基质支撑了具有高体积密度形式的锚定依赖性细胞的附着和增殖。此类基质能够实现均匀细胞接种，以及细胞或生物反应器的其他产物的高效收获。此外，本公开内容的实施方式支撑细胞培养来提供接种步骤期间的均匀细胞分布并实现所公开的基质上的粘附细胞的汇合单层或多层，并且可以避免形成具有有限营养物扩散和代谢产物浓度增加的大型和/或不可控3D细胞聚集体。因而，基质消除了生物反应器运行期间的扩散限制。此外，基质能够从生物反应器进行简单且高效的细胞收获。一个或多个实施方式的结构受限定的基质实现了从生物反应器的填装床的完全细胞回收和一致细胞收获。
根据一些实施方式，还提供了使用具有基质的生物反应器来进行细胞培养的方法，用于治疗蛋白、抗体、病毒疫苗或病毒载体的生物加工生产。
不同于用于细胞培养生物反应器的现有细胞培养基材(即，随机无序纤维的非织造基材)，本公开内容的实施方式包括具有受限定且有序结构的结构受限定的细胞培养基材。受限定且有序结构实现了一致且可预测的细胞培养结果。此外，基材具有开放多孔结构，其防止了细胞捕获和实现了均匀流动通过填装床。这种构造实现了改进的细胞接种、营养物传递、细胞生长和细胞收获。根据一个或多个具体实施方式，基质由基材材料形成，所述基材材料具有薄片状构造，具有被较小的厚度分隔开的第一与第二侧，从而片厚度相对于基材的第一和第二侧的宽度和/或长度是小的。此外，形成了穿过基材厚度的多个孔或开口。开口之间的基材材料的尺寸和几何形貌允许细胞粘附到基材材料的表面，仿佛是近似二维(2D)表面那样，同时允许绕着基材材料和穿过开口的充分的流体流动。在一些实施方式中，基材是：基于聚合物的材料并且可以形成为模制聚合物片；具有压孔穿过厚度的开口的聚合物片；许多丝线，它们熔合成网状层；3D打印基材；或者织造成网状层的多根丝线。基质的物理结构具有高的表面-体积比，用于培养锚定依赖性细胞。根据各种实施方式，基质可以以本文所讨论的某些方式那样布置成或者填装到生物反应器中，用于均匀细胞接种和生长、均匀介质灌注以及高效细胞收获。
本公开内容的实施方式可以实现实用规模的病毒载体平台，其可以产生如下规格的病毒基因组：每批次大于约1014个病毒基因组；每批次大于约1015个病毒基因组；每批次大于约1016个病毒基因组；每批次大于约1017个病毒基因组；或者最高至或大于每批次大于约1016个病毒基因组。在一些实施方式中，每批次产生约1015至约1018或更多的病毒基因组。例如，在一些实施方式中，病毒基因组产率可以是：每批次约1015至约1016个病毒基因组；或者每批次约1016至约1019个病毒基因组；或者每批次约1016-1018个病毒基因组；或者每批次约1017至约1019个病毒基因组；或者每批次约1018至约1019个病毒基因组；或者每批次约1018或更多个病毒基因组。
此外，本文公开的实施方式不仅能够实现细胞培养基材的细胞附着和生长，并且还能够实现培养细胞的存活收获。无法收获活细胞是目前平台的明显缺陷，并且这导致难以建立和维持足够数量的细胞以实现生产能力。根据本公开内容实施方式的方面，可以从细胞培养基材收获活细胞，包含80％至100％存活率，或者约85％至约99％存活率，或者约90％至约99％存活率。例如，对于收获的细胞，是至少80％存活率，至少85％存活率，至少90％存活率，至少91％存活率，至少92％存活率，至少93％存活率，至少94％存活率，至少95％存活率，至少96％存活率，至少97％存活率，至少98％存活率，或者至少99％存活率。可以采用例如胰蛋白酶、TrypLE或Accutase从细胞培养基材释放细胞。
图1A和1B分别显示根据本公开内容一个或多个实施方式的例子的细胞培养基材100的三维(3D)立体图和二维(2D)平面图。细胞培养基材100是由沿第一方向的第一组多根纤维102和沿第二方向的第二组多根纤维104制造得到的织造网状层。基材100的织造纤维形成多个开口106，其可以由一个或多个宽度或直径(例如，D1、D2)所限定。开口的尺寸和形状可以基于编织类型(例如，数量、丝线的形状和尺寸；以及相交丝线之间的角度等)发生变化。织造网可以表征为宏观二维片或层。然而，对织造网的仔细检查揭示了由于网的相交纤维的上升和下降所导致的三维结构。因此，如图1C所示，织造网100的厚度T可以比单纤维的厚度(例如t1)更厚。如本文所用，厚度T是织造网的第一侧108与第二侧110之间的最大厚度。不希望受限于理论，相信基材100的三维结构是有利的，因为这提供了大的表面积来培养粘附的细胞，并且网的结构刚性可以提供实现了均匀流体流动的一致且可预测的细胞培养基质结构。
在图1B中，开口106具有直径D1(定义为相对的纤维102之间的距离)以及直径D2(定义为相对的纤维104之间的距离)。取决于编织几何形貌，D1和D2可以是相等或者不等的。对于D1和D2是不相等的情况，较大的那个可以被称作主直径，而较小的那个被称作次直径。在一些实施方式中，开口的直径可以被称作开口的最宽部分。除非另有说明，否则如本文所用的开口直径会表示开口的相对侧上的平行纤维之间的距离。
给定的多根纤维102的纤维具有厚度t1，以及给定的多根纤维104的纤维具有厚度t2。在如图1A所示的圆形横截面或者其他三维横截面纤维的情况下，厚度t1和t2是纤维横截面的最大直径或厚度。根据一些实施方式，所述多根纤维102全都具有相同的厚度t1，而所述多根纤维104全都具有相同的厚度t2。此外，t1和t2可以是相等的。然而，在一个或多个实施方式中，t1和t2是不等的，例如当所述多根纤维102不同于所述多根纤维104的时候。此外，所述多根纤维102和所述多根纤维104可以分别含有两种或更多种不同厚度的纤维(例如，t1a、t1b等，以及t2a、t2b等)。根据实施方式，厚度t1和t2相对于其上培养的细胞的尺寸是大的，从而纤维提供了相对于细胞角度而言近似平坦表面，这相比于其中的纤维尺寸是小的其他解决方案(例如，规格为细胞直径)可以实现更好的细胞附着和生长。由于织造网的三维特性，如图1A-1C所示，纤维的可用于细胞附着和增殖的2D表面积超过了等价平坦2D表面上用于附着的表面积。
在一个或多个实施方式中，纤维可以具有如下直径范围：约50μm至约1000μm，约100μm至约750μm，约125μm至约600μm，约150μm至约500μm，约200μm至约400μm，约200μm至约300μm，或者约150μm至约300μm。对于微观水平而言，由于纤维相比于细胞的规格(例如，纤维直径大于细胞)，单丝线纤维的表面以近似2D平面呈现用于粘附细胞的附着和增殖。可以将纤维织造成开口范围约为100μm x 100μm至约为1000μm x 1000μm的网。在一些实施方式中，开口可以具有如下直径：约50μm至约1000μm，约100μm至约750μm，约125μm至约600μm，约150μm至约500μm，约200μm至约400μm，或者约200μm至约300μm。这些丝线直径和开口直径的范围是一些实施方式的例子，但是并不旨在对根据所有实施方式的网的可能的特征尺寸进行限制。对纤维直径和开口直径的组合进行选择以提供穿过基材的高效且均匀流体流动，例如当细胞培养基质包含多个相邻网状层(例如，单体层的堆叠或者卷起来的网状层)的时候。
诸如纤维直径、开口直径和织造类型/图案之类的因素会决定可用于细胞附着和生长的表面积。此外，当细胞培养基质包括堆叠、卷材或者重叠基质的其他布置时，细胞培养基质的填装密度会影响填装床基质的表面积。填装密度会随着基材材料的填装厚度(例如，基材的层所需的空间)发生变化。例如，如果细胞培养基质的堆叠具有一定的高度，则可以将堆叠中的每一层认为具有填装厚度，其通过将堆叠的总高度除以堆叠中的层数来确定。填装密度会基于纤维直径和编织发生变化，但是也会基于堆叠中的相邻层的对齐发生变化。例如，由于织造层的三维特性，存在一定量的相邻层基于它们的相互对齐所能够容纳的互锁或重叠。在第一对齐中，相邻层可以紧密贴合在一起；但是在第二对齐中，相邻层可以具有零重叠，例如当上层的最低点与下层的最高点直接接触时。对于某些应用，可能希望提供具有较低密度的层填装(例如，当高的可渗透性具有优先级时)或者较高密度的层填装(例如，当最大化基材表面积具有优先级时)的细胞培养基质。根据一个或多个实施方式，填装厚度可以是：约50μm至约1000μm，约100μm至约750μm，约125μm至约600μm，约150μm至约500μm，约200μm至约400μm，约200μm至约300μm。
上述结构因素可以确定细胞培养基质的表面积，无论是细胞培养基材的单层的表面积还是具有多层基材的细胞培养基质的表面积。例如，在具体实施方式中，具有圆形形状和6cm直径的织造网基材的单层可以具有约68cm2的有效表面积。如本文所用，“有效表面积”是基材材料的可用于细胞附着和生长的部分中的纤维的总表面积。除非另有说明，否则涉及的“表面积”指的是这个有效表面积。根据一个或多个实施方式，直径为6cm的单层织造网基材可以具有如下有效表面积：约50cm2至约90cm2，约53cm2至约81cm2，约68cm2，约75cm2，或者约81cm2。提供的这些有效表面积范围仅仅是举例，并且一些实施方式可以具有不同的有效表面积。细胞培养基质还可以用孔隙度进行表征，如本文实施例所讨论的那样。
可以从与细胞培养应用相容的聚合物材料的单丝线或多丝线纤维制造基材网，包括例如：聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚丁二烯、聚氯乙烯、环氧乙烷、聚吡咯和聚环氧丙烷。网状基材可以具有不同的图案或织造，包括例如：针织、经编(warp-knitted)或机织(woven)(例如，平纹、斜纹、荷兰纹、五针编织)。
可以需要对网状丝线的表面化学性进行改性以提供所需的细胞粘附性质。可以通过网的聚合物材料的化学处理或者通过丝线表面接枝细胞粘附分子来进行此类改性。或者，网可以涂覆证实了细胞粘附性质的生物相容性水凝胶的薄层，包括例如胶原蛋白或或者，网的丝线纤维的表面可以通过各种类型的等离子体、加工气体和/或行业中已知的化学品的处理工艺赋予细胞粘附性质。然而，在一个或多个实施方式中，网能够在没有表面处理的情况下提供高效的细胞生长表面。
图2A-2C显示根据本公开内容一些预期实施方式的织造网的不同例子。下表1总结了这些网的纤维直径和开口尺寸，以及通过相应的网的单层所提供的相对于相当的2D表面的细胞培养表面积的近似增加大小。在表1中，网A指的是图2A的网，网B指的是图2B的网，以及网C指的是图2C的网。表1的这三种网几何形貌仅仅是举例，并且本公开内容的实施方式不限于这些具体例子。因为网C提供了最高的表面积，所以其对于实现细胞粘附和增殖的高密度并进而提供最高效的基材用于细胞培养可以是有利的。然而，在一些实施方式中，细胞培养基材包含具有较低表面积的网(例如，网A或网B)或者不同表面积的网组合对于例如实现培养室内所需的细胞分布或流动特性可能是有利的。
表1：图2A-2C中的网对比，以及所得到的相比于2D表面的细胞培养表面积增加
如上表所示，网的三维质量相比于相当尺寸的平坦2D表面提供了增加的表面积用于细胞附着和增殖。这种表面积增加有助于通过本公开内容的实施方式实现可规模化性能。对于工艺发展和工艺验证研究，通常需要小规格的生物反应器来节约试剂成本和增加实验产出。本公开内容的实施方式可适用于此类小规格研究，但是也可以放大规格至工业或生产规模。例如，如果将2.2cm直径圆圈形式的100层的网C填装成2.2cm内直径的圆柱体填装床，则可用于细胞附着和增殖的总表面积等于约935cm2。为了使得此类生物反应器放大10倍，可以使用类似的设定：具有7cm内直径和100层相同网的圆柱体填装床。在此类情况下，总表面积会等于9,350cm2。在一些实施方式中，可用的表面积约为99,000cm2/L或更大。因为填装床中的塞式灌注流，以ml/分钟/cm2横截面填装床表面积表示的相同流速可用于较小规模和较大规模版本的生物反应器。较大的表面积实现了较高的接种密度和较高的细胞生长密度。根据一个或多个实施方式，本文所述的细胞培养基材证实具有最高至22,000个细胞/cm2或更高的细胞接种密度。作为参考，康宁的二维表面上的接种密度约为20,000个细胞/cm2。
更高表面积和更高细胞接种或生长密度的另一个优点在于，本文公开实施方式的成本可等于或低于竞争解决方案。具体来说，每个细胞产品(例如，每个细胞或每个病毒基因组)的成本可等于或低于其他填装床生物反应器。
在下文讨论的本公开内容的另一个实施方式中，可以以圆柱形卷材形式将织造网基材填装到生物反应器内(参见图8和9)。在此类实施方式中，可以通过增加网带的整体长度及其高度来实现填装床生物反应器的可规模化。用于这种圆柱形卷材构造的网的量可以基于所需的填装床填装密度发生变化。例如，可以将圆柱形卷材致密地填装成紧密卷或者疏松地填装成疏松卷。填装密度通常会取决于所需的给定应用或规格所要求的细胞培养基材表面积。在一个实施方式中，可以通过采用如下方程式从填装床生物反应器直径计算所需的网长度：
式中，L是填装生物反应器所需的网的总长度(即，图8中的H)，R是填装床培养室的内半径，r是绕其进行卷绕的网的内支撑体(图9中的支撑体366)的半径，以及t是一层网的厚度。在此类构造中，可以通过增加填装床圆柱形卷材的直径或宽度(即，图8中的W)和/或增加填装床圆柱形卷材的高度H来实现生物反应器的可规模化，从而提供了更多的基材表面积用于接种和生长粘附细胞。
通过使用结构受限定的充分硬度的细胞培养基质，实现了基质或固定床上的高流动抗性均匀性。根据各种实施方式，可以以单层或多层形式部署基质。这种灵活性消除了扩散限制并且提供了对于附着到基质的细胞的均匀的营养物和氧传递。此外，开放基质缺乏填装床构造中的任何细胞俘获区域，实现了在培养结束时具有高存活率的完全细胞收获。基质还为填装床传递了填装均匀性并且实现了从工艺发展单元到大规模工业生物加工单元的直接可规模化。能够从填装床直接收获细胞的能力消除了对于将基质重新悬浮到搅拌或机械振荡容器中的需求，这会增加复杂度并且会使得细胞遭受有害的剪切应力。此外，细胞培养基质的高填装密度得到了工业规模上体积可管理的高的生物加工生产能力。
图3A显示具有多层基材200的基质的实施方式，以及图3B是同一多层基材200的平面图。多层基材200包括第一网基材层202和第二网基材层204。尽管第一与第二基材层202和204是重叠的，但是网的几何形貌(例如，开口直径与纤维直径之比)使得第一与第二基材层202和204的开口重叠并为流体提供流动通过多层基材200的总厚度的路径，如图3B中的无丝线开口206所示。
图4显示图3B中的线B-B处的多层基材200的横截面图。箭头208显示通过第二基材层204中的开口然后绕着第一基材层202中的丝线的可能的流体流动路径。将网基材层的几何形貌设计成允许高效且均匀的流动通过一个或多个基材层。此外，基质200的结构可以容纳以多取向通过基质的流体流动。例如，如图4所示，本体流体流动的方向(如箭头208所示)垂直于第一与第二基材层202和204的主侧表面。然而，基质也可以相对于流动取向成使得基材层的侧面平行于本体流动方向。图5显示沿图4中的线C-C的多层基材200的横截面图，以及基质200的结构允许流体流动(箭头210)通过多层基材200中的流体路径。除了流体流动垂直于或平行于网层的第一和第二侧之外，基质也可以布置成具有处于中间角度的多片基材，或者甚至相对于流体流动是随机布置的情况。通过织造基材的基本各向同性的流动行为实现了这种取向灵活性。相反地，现有的生物反应器中的用于粘附细胞的基材不展现出这种行为，作为替代，它们的填装床倾向于产生优先流动通道并且具有各向异性渗透性的基材材料。本公开内容的基质的灵活性使得其能够用于各种应用以及生物反应器或容器设计，同时实现整个生物反应器容器的更好且更均匀的渗透性。
如本文所讨论的那样，根据一个或多个实施方式，细胞培养基材可以用于生物反应器容器中。例如，基材可以用于填充床生物反应器构造，或者三维培养室内的其他构造。然而，实施方式不限于三维培养空间，并且其考虑了基材可用于可能被视为二维培养表面构造的情况，其中，基材中的一层或多层是平坦的，例如在平底培养碟中以提供用于细胞的培养基材。出于污染考虑，容器可以是在使用后可丢弃的一次性容器。
根据一个或多个实施方式，提供了细胞培养系统，其中，在生物反应器的培养室中使用细胞培养基质。图6显示细胞培养系统300的例子，其包括在生物反应器容器302的内部具有细胞培养室304的生物反应器容器302。在细胞培养室304内的是由基材层308的堆叠制造的细胞培养基质306。基材层308堆叠，将基材层的第一或第二侧面朝相邻基材层的第一或第二侧。生物反应器容器300在一端具有入口310用于将介质、细胞和/或营养物输入到培养室304中，以及在相对侧具有出口312用于从培养室304去除介质、细胞或细胞产品。由于受限定的结构以及高效的流体流动通过堆叠基材，通过允许以这种方式堆叠基材层，可以简单地对系统进行规模化而没有对细胞附着和增殖产生负面影响。虽然容器300通常可能如本文所述的那样具有入口310和出口312，但是一些实施方式可能使用入口310和出口312中的一个或两个来同时进行介质、细胞或者其他内含物进入和离开培养室304。例如，入口310可以用于在细胞接种、灌注或培养阶段期间使得介质或细胞流入培养室304中，但是也可以用于在收获阶段用于通过入口310去除介质、细胞或者细胞产品中的一种或多种。因此，术语“入口”和“出口”并不旨在限制那些开口的功能。
在一个或多个实施方式中，可以通过插入不同几何形貌的基材层来控制填装床的流动阻力和体积密度。具体来说，网尺寸和几何形貌(例如，纤维直径、开口直径和/或开口几何模型)限定了填装床形式中的流体流动阻力。通过插入不同尺寸和几何形貌的网，可以在生物反应器的一个或多个特定部分中控制或者改变流动阻力。这可以实现填装床中更好的液体灌注均匀性。例如，10层网A(表1)之后10层网B(表1)以及之后10层网C(表1)可以进行堆叠从而实现所需的填装床特性。作为另一个例子，填装床可以从10层网B开始，之后是50层网C，之后是10层网B。可以持续此类重复式样直到整个生物反应器填充了网。这些仅仅是距离并且用于示意性目的，并不旨在对可能的组合进行限制。事实上，可以是不同尺寸的网的各种组合，从而获得细胞生长表面的体积密度的不同轮廓以及流动阻力。例如，可以通过插入不同尺寸的网来组装具有变化的体积细胞密度的区(例如，产生低/高/低/高等密度的图案的一系列的区)的填装床柱。如下文所讨论的那样，还可以通过产生穿过全部或部分填装床的通道来提供变化孔隙度的区。
在图6中，本体流动方向是从入口310到出口312的方向，并且在这个例子中，基材层308的第一和第二主侧垂直于本体流动方向。相反地，图7所示的例子是这样的实施方式，其中，系统320包括生物反应器容器322以及培养空间324内的基材328的堆叠，具有平行于本体流动方向的第一和第二侧，所述本体流动方向对应于进入入口330和离开出口332的流动线所示的方向。因此，本公开内容实施方式的基质可以用于任一种构造。在系统300和320的每一个中，基材308、328经过尺寸调节和形状调节以填充由培养室304、324限定的内部空间，从而每个容器中的培养空间经过填充用于细胞生长表面以使得以每单位体积的细胞数而言的效率最大化。虽然图7显示多个入口330和多个出口332，但是考虑系统320可以由单个入口进行进料并且可以具有单个出口。然而，根据本文各种实施方式，可以使用分配板来帮助对介质、细胞或者营养物在填装床的横截面上进行分布，并且由此改善了流动通过填装床的流体的均匀性。由此，多个入口330代表了分配板是如何可以在填装床横截面上提供多个孔用于产生更均匀的流动。
图8显示基质的实施方式，其中，基材形成为圆柱体卷材350。例如，将包含网状基材352的基质材料片绕着中心纵轴y辊制成圆柱体。圆柱体卷材350具有沿着垂直于中心纵轴y的维度的宽度W以及沿着垂直于中心纵轴y的方向的高度H。在一个或多个优选实施方式中，圆柱体卷材350设计成在生物反应器容器中使得中心纵轴y平行于流体通过装纳圆柱体卷材的生物反应器或培养室的本体流动F的方向。图9显示细胞培养系统360，其具有以此类圆柱形卷材构造容纳细胞培养基质364的生物反应器容器362。类似于图8中的圆柱形卷材350，细胞培养基质364具有中心纵轴，其在图9中延伸进入到页面中。系统360还包括中心支撑元件366，绕其放置了细胞培养基质364。中心支撑元件366可以提供完全是用于细胞培养基质364的物理支撑和/或对齐，但是根据一些实施方式也可以提供其他功能。例如，中心支撑元件366可以提供一个或多个开口用于沿着基质的长度H将介质供给到细胞培养基质364。在其他实施方式中，中心支撑元件366可以包含一个或多个附连点位用于在圆柱体卷材的内部部件处固定细胞培养基质364的一个或多个部分。这些附连点位可以是钩子、夹扣、柱子、夹具或者将网片附连到中心支撑元件366的其他装置。
如上文所讨论的那样，诸如图3A-9中所示那些的填装床细胞培养基质由于基质的均匀、一致和/或可预测的结构受限定的基材可以提供许多性能优势。在本文公开的一些实施方式中，此类细胞培养基质在填装床的宽度和/或高度上具有一致的孔隙度和结构。例如，对于图6，每个基材层308可以具有均匀且基本同样的结构(例如，具有基材层308上不间断编织的织造碟)。这帮助实现了整个填装床的一致且均匀的流体流动。然而，在一些情况下，可能希望改变整个或者部分填装床的孔隙度和结构，从而以所需的方式控制通过其的流体流动。因此，本公开内容的实施方式包括这样的填装床基质，其所具有的一个或多个受限定的渗透区的孔隙度和/或渗透性不同于填装床基质的其他区域的孔隙度或渗透性。作为这些实施方式中的一些方面，产生虚拟通道来增加细胞培养基质的特定区域中的流动，从而产生了这些渗透区。
如本文所用，“渗透区”定义为细胞培养基质的这样一个部分，其中，细胞培养基材经过调节增加了基质在限定区域中的渗透性或孔隙度(相对于仅含有未经调节的细胞培养基材的细胞培养基质的部分而言)。当细胞培养基材的任意其他规则限定且有序结构被打断以增加相对于未经调节位置而言的经调节的位置中的渗透性或孔隙度时，将细胞培养基质认为是“经过调节的”。可以通过去除部分基材材料来实现此类调节(例如，切割掉基材材料；在基材材料中模制得到间隙；可溶性基材的部分进行受控溶解；或者由任何其他方法(包括3D打印)制成的基材材料中留下空位)。虽然术语“经过调节的”可能暗示了暂时性(其中，基材材料从其原始形式发生变化)，但是应理解的是，在本公开内容的上下文中，“经过调节的”可以表示细胞培养基材的受限定的且规则结构的任何变化，无论该变化是当基材材料自身产生时所产生的或者该变化是在已经产生了基材材料之后通过改变基材材料所实现的。换言之，调节导致基材材料或基质中的开口大于结构受限定的基质的细胞培养基材的平均孔径。细胞培养基材的“未经调节的”区域应该理解表示细胞培养基材具有结构受限定的基材的受限定且有序结构的任意部分(没有对该结构进行任何调节或干扰)。由于渗透区是细胞培养基材的经调节的部分的结果，渗透区不同于由于上文所讨论的现有填装床系统中的非均匀性或随机填装基材所导致的渗透性的局部变化。
如本文所用，“虚拟通道”定义为这样的穿过基质的流体流动路径，其相比于基质仅含有未经调节的细胞培养基材的部分而言具有更高的局部渗透性。将此类通道描述为“虚拟”的原因是这些通道没有(通过例如壁或管)受到物理限制，而是存在于具有开放多孔结构的细胞培养基质中。因此，不一定存在将虚拟通道与细胞培养基质的余下部分分开的任何阻隔。可以将虚拟通道视为以基质的水平(即，垂直于通过细胞培养基质或生物反应器的介质的本体流动方向)横截面延伸，或者可以将其视为以纵向(即，平行于本体流动方向)延伸通过部分或者整个填装床基质。
如本文所用，“渗透区”和“虚拟通道”可以同时含有经过调节和未经调节的基材材料的区域。例如，本公开内容的实施方式包括具有细胞培养基材的堆叠层的多层填装床细胞培养基质。可以通过如下方式在堆叠层中产生渗透区或虚拟通道：从填装床的纵向区段去除基材材料，以及该纵向区段中的层的全部或者仅部分可以具有材料去除以增加渗透性。例如，即使纵向区段中仅一部分的层去除了材料，通过该纵向区段的渗透性仍然会高于穿过基质仅含有未经调节的基材层的其他纵向区段。
图10A-10C显示根据本公开内容一个或多个实施方式的具有渗透区的细胞培养基质的立体图。在图10A中，显示具有两个渗透区382和384的细胞培养基质380，其具有宽度w、高度h和纵轴381。当介质或者其他流体以箭头F的方向(即，平行于纵轴381)流动通过细胞培养基质时，渗透区382、384会展现出相比于细胞培养基质380的其他部分而言更高的渗透性。如上文所讨论的那样，渗透区382、384在细胞培养基质380中含有一个或多个开口，这导致在那些区中高于标准渗透性的情况。在图10A中，显示渗透区382、384以沿着细胞培养基质380的高度h的程度延伸，但是这不一定表示整个区382、834都是开放和不受阻碍的。相反地，渗透区382、384可以包括仅一个或选定区域中的部分细胞培养基质380具有开口用于增加渗透性。然而，渗透区382、384仍然可以被视为沿着高度h的程度延伸，因为在那些区中的任何流动阻力的下降都会导致区382、384内沿着流动方向F的渗透性增加。尽管图10A仅显示两个渗透区，但是实施方式不限于这种构造，并且可以存在更少或更多的渗透性增加的区。类似地，尽管将渗透区显示为圆柱形区，实施方式不限于这种形状的区，而是可以具有可以经由在细胞培养基质中结合开口来实现的任意所需形状。
类似于图10A，图10B显示具有两个渗透区388和390的细胞培养基质386，其具有宽度w、高度h和纵轴387。以细胞培养基质386中的不同高度显示矩形渗透区388和390，从而显示在一些实施方式中，渗透区可以被视为是细胞培养基质中的局部区。例如，在由细胞培养基材中形成的虚拟通道或开口形成渗透区的实施方式中，可以将渗透区定义为那些虚拟通道它们本身和/或它们的紧邻附近的地方。
图10C显示具有渗透区394的细胞培养基质392的另一个例子，这时的形状是空心圆柱体。如本文所述，实施方式包括的具有渗透区的细胞培养基质是绕着细胞培养基质的纵轴(393)对称的。再次要注意的是，渗透区394不一定要求细胞培养基质392中空心圆柱体开口形式的虚拟通道或开口。相反地，渗透区394可以是形成在细胞培养基质392中的不同开口或虚拟通道的复合效应的结果，导致类似于图10C中的空心圆柱体形状的区中的渗透性增加。
根据本公开内容一些实施方式，提供的细胞培养基质是由细胞培养基材的堆叠层(例如，织造网碟的堆叠)制造得到的。在填装床细胞培养基质由基材层的堆叠制造的情况下，可以通过在一个或多个个体基材层中产生开口来实现产生渗透区的虚拟通道。例如，在一个或多个实施方式中，图11A显示基材材料的层400a的例子，其可以堆叠以形成填装床细胞培养基质。层400a由具有有序且均匀建构的结构受限定的基材材料制造。在这个例子中，层400的材料是多孔基材(例如，织造网)，但是层400a不具有会产生用于增加渗透性的渗透区的虚拟通道的任何其他开口。然而，图11B-11F分别显示相同多孔基材材料的层400b-400f的例子，但是添加了形成在层400b-400f中的虚拟通道402b-402f。如图11B-11F所示，虚拟通道402b-402f是形成在多孔基材中的开口或切口并且可以具有各种形状和布置。例如，虚拟通道可以是矩形切口(图11B-11D中的虚拟通道402b-402d)；圆形、半圆形或圆弧形(图11E中的虚拟通道402e)；或者三角形切口(图11F中的虚拟通道402f)。此外，每层可以含有多个虚拟通道或开口，并且这些虚拟通道可以以得到层旋转对称性的方式布置。然而，这些仅仅是举例，并且考虑本公开内容的实施方式的范围内对于其他形状和/或布置也是可行的。本领域技术人员会理解的是，尽管基材材料是多孔的，但是虚拟通道402b-402f仍然会提供相比于基材的余下部分而言更小的流动阻力，因为通过虚拟通道形成的开口明显大于多孔基材材料的孔。
类似于图11B，图12A是具有多个虚拟通道的细胞培养基材层410a的平面图。在图12B中，提供了具有类似的虚拟通道布置的另一种基材层410b，但是显示层410b的位置相对于层410a旋转了约30°。当层410a与旋转过的层410b堆叠时(如图12C所示)，所得到的堆叠412的虚拟通道没有重叠而是提供了两倍数量的虚拟通道(当以平面图观察堆叠412时)。此外，由于虚拟通道朝向堆叠412的中心径向向内移动，虚拟通道的密度增加，这会导致最高密度虚拟通道的区域中的渗透性增加。然而，在堆叠412的中心(在那里没有虚拟通道)，渗透性会基本是未经调节的多孔基材层(即，没有虚拟通道)的情况。图12D显示来自堆叠412的复合虚拟通道的改性流动曲线F412，其中，流动方向平行于堆叠412的纵轴411。如所示，在堆叠412的中心处(在那里没有虚拟通道)，渗透性最低。在堆叠的外边缘处(在那里存在虚拟通道但是它们是最低面密度)，渗透性高于堆叠412的中心但是低于堆叠412中虚拟通道的密度为峰值的渗透性。
在图12D的例子中，堆叠412可以被视为在堆叠形成了虚拟通道的区域中具有渗透区(即，堆叠的靠外部分)。然而，如图12D所示，通过渗透区的渗透性不是恒定的。由此，考虑一些实施方式可以将堆叠412描述为这样的渗透区，其具有变化的渗透区或者多个渗透区(例如，峰值渗透区，其中虚拟通道的密度最高；低渗透区，其中，虚拟通道的密度最低但是非零；以及峰值与低渗透区之间的任意数量的中等渗透区。
类似于图12A-12D，图13A-13F显示一系列的层420a-420d，它们可以堆叠成填装床堆叠422，得到流动曲线F422，其中，面积的大小对应于紧邻高于箭头上方的堆叠422的部分中的相对渗透性。同样地，四层420a-420d是类似建构，但是分别相对于之前层旋转了15°。因此，层420b相对于层420a旋转了15°，层420c相对于层420b旋转了15°(相对于420a则是30°)，以及层420d相对于层420c旋转了15°(相对于420a则是45°)。相比于图12C的堆叠412，所得到的堆叠422在堆叠422的区域上甚至具有更多的虚拟通道和甚至更高的虚拟通道峰值密度。因此，流动曲线F422显示渗透区与堆叠422的中心(不含有虚拟通道)之间更大的渗透性差异。
使用受限定的渗透区来控制填装床细胞培养基质中的渗透性可以具有许多用途。例如，取决于细胞培养的类型或阶段，可能希望实现特定的渗透性曲线。渗透区的一种用途是补偿生物反应器系统的非均匀流动性质。也就是说，对于生物反应器系统固有地具有介质或流体的非均匀流动的情况，填装床中的渗透区可以被用于补偿该非均匀性并且会导致更均匀的复合流动曲线。
图14A-14C显示使用渗透区来补偿细胞培养系统的固有非均匀性的例子。图14A显示具有介质入口432和流动分配板434的生物反应器430。在介质经由入口432进入生物反应器430之后，其以箭头F1的方向流动并通过流动分配板434。然而，相比于远离入口432的区域，在入口432附近的流动通过流动分配板434的介质会倾向于以更高的速度从流动分配板434出来。因此，所得到的流速曲线FD不是均匀的，这会影响流动通过下游填装床的介质的(非)均匀性。然而，根据本公开内容的实施方式，细胞培养基质430(图14B)可以设计成具有一个或多个渗透区来控制细胞培养基质430的渗透性并且实现抵消了流动分配板的非均匀流速曲线FD的流速曲线FB。当流动分配板434与细胞培养基质430组合时，细胞培养基质430的受控渗透性可以有效地平衡掉从流动分配板434出来的非均匀流动，导致得到均匀的流速曲线FR。
图12A-13F显示的实施方式中，细胞培养基质的全部层或者连续层具有用于限定渗透区的虚拟通道。然而，本公开内容的实施方式包括具有这样的渗透区的填装床基质，所述渗透区是由具有和不具有虚拟通道的层的组合形成的。图15A-15F显示一个此类实施方式的例子。具体来说，图15A、15C和15E分别显示没有任何虚拟通道的细胞培养基材的层440a、440c和440e。然而，层440b和440d分别含有虚拟通道442b和442d。如图15F所示，在组装好的堆叠中，层440b和440d插入在没有虚拟通道的相邻层之间。对于具有甚至更多层的填装床，具有虚拟通道的层的数量数和排列以及那些虚拟通道它们本身的设计方面而言的可能的排列组合几乎是无限的，并且通过填充床基质提供了大量的渗透性的定制和控制。
图16A是基材的堆叠450的平面示意图，其中，两层具有多个虚拟通道，类似于图15F中的层400a-440e的堆叠。线A-A表示图16B中所示的横截面图，其中，可以在被没有虚拟通道的层分开的两个分开的层中看到虚拟通道452和454。
在图16B的例子中，形成虚拟通道452的开口的宽度约为1319μm以及形成虚拟通道454的开口的宽度约为1330μm。然而，实施方式不限于这些尺度。在一些实施方式中，虚拟通道的开口可以具有如下宽度：约200μm至约3000μm，约300μm至约2500μm，约400μm至约2000μm，约500μm至约1500μm，约600μm至约1800μm，约1000μm至约2000μm，约1000μm至约1800μm，或者约1300μm至约1400μm。同样地，如上文所讨论的那样，虚拟通道的形状可以在很大程度上发生变化，并且开口的尺度也可以是如此。
虽然上文所讨论的一些实施方式涉及有限数量的基材层的堆叠，但是显示的层数量并不旨在限制本公开内容的实施方式而是为了便于说明。本公开内容的实施方式没有被限制到填装床基质中的特定层数量，并且可以包括例如含有数十层、数百层或者数千层的填装床细胞培养基质。
图17显示根据一个或多个实施方式的细胞培养系统500。系统500包括装纳了根据本文公开的一个或多个实施方式的细胞培养基质的生物反应器502。生物反应器502可以流体连接到介质调理容器504，以及系统能够将调理容器504中的细胞培养介质506供给到生物反应器502。介质调理容器504可以包括传感器以及用于生物加工行业中典型生物反应器中存在的用于悬浮批料、进料批料或者灌注培养物的控制组件。这些包括但不限于DO氧传感器、pH传感器、氧产生器/气体喷射单元、温度探针以及营养物添加和基底添加端口。可以通过用于N2、O2和CO2气体的气流控制器来控制供给到喷射单元的气体混合物。介质调理容器504还含有用于介质混合的叶轮。通过上文列出的传感器进行测量的所有介质参数都可以通过介质调理控制单元518进行控制，所述介质调理控制单元518与介质调理容器504联通且能够测量和/或调节细胞培养介质506的状态至所需水平。如图17所示，介质调理容器504提供成与生物反应器容器502分开的容器。这对于能够在与细胞进行培养的地方分开处调理介质然后将经过调理的介质供给到细胞培养空间而言是有利的。然而，在一些实施方式中，可以在生物反应器容器502中进行介质调理。
将来自介质506调理容器504的介质经由入口508传递到生物反应器502，所述入口508也可以包括用于细胞接种液对细胞进行接种和开始培养的注入端口。生物反应器容器502还可以包括一个或多个出口510，细胞培养介质506通过所述出口410离开容器502。此外，细胞或者细胞产品可以通过出口510输出。为了对来自生物反应器502的流出流的内含物进行分析，可以在生产线中提供一个或多个传感器512。在一些实施方式中，系统500包括用于控制进入到生物反应器502中的流的流动控制单元514。例如，流动控制单元514可以接收来自一个或多个传感器512(例如，O2传感器)的信号，并且基于信号通过向位于生物反应器502的入口508的上游的泵516(例如，蠕动泵)传递信号来调节进入到生物反应器502中的流。因此，基于通过传感器512测得的一个参数或者参数组合，泵516可以控制进入到生物反应器502中的流动从而获得所需的细胞培养条件。
通过信号加工单元514控制介质灌注速率，所述信号加工单元514收集并对比来自介质调理容器504的传感器信号与位于填装床生物反应器出口510处的传感器。因为穿过填装床生物反应器502的介质灌注的填装流动特性，沿着填装床建立起了营养物、pH和氧梯度。可以通过根据图11中的流程图以操作方式连接到蠕动泵516的流动控制单元514来自动控制生物反应器的灌注流速。
本公开内容的一个或多个实施方式提供了不同于常规方法的细胞接种步骤。在常规方法中，具有常规基质的填装床填充了培养介质以及将浓缩接种物注入到介质循环回路中。细胞悬液以增加的流速泵送通过生物反应器以降低经由捕获在常规填装床基质上进行细胞接种的非均匀性。在此类常规方法中，以提升的流速在循环回路中泵送细胞可能持续数小时直到大部分的细胞被捕获到填装床生物反应器中。然而，由于常规填装床生物反应器的非均匀深床过滤特性，细胞在填装床内的分布是不均匀的，在生物反应器的入口区域具有较高的细胞密度而在生物反应器的出口区域具有较低的细胞密度。
相反地，根据本公开内容实施方式，与生物反应器中的培养室的空体积等体积的细胞接种物通过生物反应器502的入口508处的细胞接种物注入端口直接注入填充床中(图17)。然后，由于本文所述的细胞培养基质中存在的均匀且连续的流动路径，细胞悬液均匀地分布在填装床内。为了防止初始接种阶段时由于重力导致细胞沉降，可以在接种物注入之后立即开始介质灌注。灌注流速维持在低于预先设定的阈值从而平衡重力并避免从填装床生物反应器洗刷掉细胞。因而在初始细胞附着阶段，细胞在填充床内轻轻翻滚，并且实现了可用基材表面上的细胞的均匀分布和附着。
取决于所需系统，细胞培养基质可以以多种配置布置在培养室内。例如，在一个或多个实施方式中，系统包括基材的一层或多层，宽度在培养室内的受限定的细胞培养空间的宽度上延伸。多层基材可以以这种方式堆叠至预定高度。如上文所讨论的那样，基材层可以布置成使得一层或多层的第一和第二侧垂直于培养介质穿过培养腔体内的受限定的培养空间本体流动方向，或者一层或多层的第一和第二侧可以平行于本体流动方向。在一个或多个实施方式中，细胞培养基质包括相对于本体流动处于第一取向的一个或多个基材层，以及处于不同于第一取向的第二取向的一个或多个其他层。例如，各种层可以具有平行于或垂直于本体流动方向(或者之间的一些角度情况下)的第一和第二侧。
在一个或多个实施方式中，细胞培养系统包括填装床构造的细胞培养基材的多个离散片材，其中，基材的片材长度和或宽度相对于培养室而言是小的。如本文所用，当基材的片材长度和/或宽度约为培养空间的长度和/或宽度的50％或更小时，认为基材的片材长度和/或宽度相对于培养室而言是小的。因而，细胞培养系统可以包括以所需布置填装到培养空间中的多片基材。基材片材的布置可以是随机或者半随机的，或者可以具有预定的规则或对齐，例如片材取向是基本相似的取向(例如，相对于本体流动方向为水平、垂直或者0°与90°之间的角度)。
如本文所用，“受限定的培养空间”指的是培养室内被细胞培养基质占据并且其中要进行细胞接种和/或培养的空间。受限定的培养空间可以填充近似整个培养室，或者可以占据培养室内的一部分空间。如本文所用，“本体(bulk)流动方向”定义为在细胞培养过程中和/或在培养介质流入或流出培养室的过程中，流体或培养介质的本体质量(bulk mass)流动穿过细胞培养基质或在细胞培养基质上方流动的方向。
在一个或多个实施方式中，通过固定机制将细胞培养基质固定在培养室内。固定机制可以将一部分的细胞培养基质固定到围绕机制的培养室的壁或者在培养室的一端固定到室壁。在一些实施方式中，固定机制将一部分的细胞培养基质粘附到穿过培养室的元件，例如平行于培养室的纵轴的元件，或者粘附到垂直于纵轴的元件。然而，在一个或多个其他实施方式中，细胞培养基质可以容纳在培养室内而没有以固定的方式附着到室或生物反应器容器的壁。例如，可以通过培养室或者室内的其他结构元件的边界来容纳基质，从而在没有将基质以固定的方式固定到那些边界或结构元件的情况下将基质保持在生物反应器容器的预定区域中。
一些实施方式的一个方面提供了卷型瓶构造的生物反应器容器。培养室能够含有根据本公开内容所述一个或多个实施方式的细胞培养基质和基材。在卷型瓶构造中，生物反应器容器可以以可运行的方式附连到使得生物反应器容器绕着容器的中心纵轴移动的装置。例如，生物反应器容器可以绕着中心纵轴转动。转动可以是连续的(例如，以一个方向连续)或者不连续的(例如，单方向或交替方向的间歇旋转，或者前后旋转方向的摆动)。在运行时，生物反应器容器的转动导致室内的细胞和/或流体移动。这种移动可以被视为是相对于室的壁进行的。例如，随着生物反应器容器绕其中心纵轴转动，重力可以导致流体、培养介质和/或未粘附的细胞留在朝向室的靠下部分。然而，在一个或多个实施方式中，细胞培养基质基本上相对于容器是固定的，并且因而随着容器进行转动。在一个或多个实施方式中，细胞培养基质可以是未附连的并且随着容器转动自由地移动到相对于容器的所需程度。细胞可以粘附到细胞培养基质，而容器的移动允许细胞同时接收到暴露于培养室内的细胞培养介质或液体以及氧气或其他气体。
通过使用根据本公开内容实施方式的细胞培养基质(例如，包含织造或网基材的基质)，为卷型瓶容器提供了可用于粘附细胞来附着、增殖和功能化的表面积增加。具体来说，在卷型瓶中使用单丝线聚合物材料的织造网的基材，相比于标准卷型瓶，表面积可以增加约2.4至约4.8倍，或者约10倍。如本文所讨论的那样，网基材的每个单股丝线能够呈现其自身作为用于粘附细胞附着的2D表面。此外，多层网可以布置在卷型瓶中，导致总可用表面积增加到标准卷型瓶的约2至10倍。因而可以通过添加本文公开的改进的细胞培养基质，在对现有操作基础设施和加工步骤的影响最小化的情况下，对现有的卷型瓶设备和加工(包括细胞接种、介质交换和细胞收获)进行改动。
生物反应器容器任选地包括能够附连到入口和/或出口装置的一个或多个出口。通过所述一个或多个出口，液体、介质或细胞可以被供给到室或者从室去除。容器中的单个端口可以起到入口或出口这两者的作用，或者可以提供多个端口作为专门的入口和出口。
一个或多个实施方式的填装床细胞培养基质可以由织造细胞培养网状基材构成，没有布置在细胞培养基质中或者与细胞培养基质穿插的任何其他形式的细胞培养基材。也就是说，本公开内容实施方式的织造细胞培养网状基材是有效的细胞培养基材，不需要用于现有方案中的无规非织造基材类型。这实现了简化设计和建构的细胞培养系统，同时提供了具有本文讨论的涉及流动均匀性、可收获性等的其他优点的高密度细胞培养基材。
如本文所讨论的那样，提供的细胞培养基材和生物反应器系统提供了许多优点。例如，本公开内容的实施方式可以支撑任意多种病毒载体的产生(例如AAV(所有血清型)和慢病毒)，并且可以用于体内和体外基因治疗应用。均匀的细胞接种和分布使得每个容器的病毒载体产率最大化，并且设计实现了存活细胞的收获，这对于采用同一平台的多膨胀阶段构成的接种序列会是有用的。此外，本文的实施方式可以从工艺发展规格到生产规格是可规模化的，这最终节约了开发时间和成本。本文公开的方法和系统还实现了细胞培养工艺的自动化和控制，以使得载体产率最大化并改善可重复性。最后，达到病毒载体生产水平规格(例如，每批次1016至1018AAV VG)所需的容器数量可以相比于其他细胞培养方案得到极大减少。
实施方式不限于绕着中心纵轴转动的容器。例如，容器可以绕着不是相对于容器居中放置的轴转动。此外，转轴可以是水平轴或垂直轴。
示意性执行方式
以下是本文公开主题的执行方式的各种方面的描述。每个方面可以包括本文公开主题的各种特征、特性或优点中的一个或多个。执行方式旨在阐述本文公开主题的一些方面，并且不应该视为所有可行执行方式的综合性或排他性描述。
方面1属于用于细胞培养的填装床生物反应器系统，该系统包括：包含入口、出口以及至少一个内部储器的细胞培养容器，所述内部储器流体连接到且布置在入口与出口之间的流体路径中；布置在储器内的细胞培养基质，所述细胞培养基质包括结构受限定的基材，其包含限定了多个孔的基材材料，所述基材材料构造成使得细胞粘附到其；以及一部分的细胞培养基质中的至少一个渗透区，所述至少一个渗透区所包含的渗透性高于所述至少一个渗透区外的细胞培养基质的标准渗透性，其中，渗透区包括基材中的开口，所述开口的直径大于所述多个孔中的任一个的直径。
方面2属于方面1的填装床生物反应器系统，其中，细胞培养基质包含多层基材。
方面3属于方面2的填装床生物反应器系统，其中，所述多层基材中的每层包含有序且基本均匀的孔阵列。
方面4属于方面2或方面3的填装床生物反应器系统，其中，渗透区包括所述多层中包含开口的多个层。
方面5属于方面4的填装床生物反应器系统，其中，在至少一部分的所述多个层中的开口的细胞培养基质的水平横截面的面积不同于所述多个层中的至少一个中的开口。
方面6属于方面4或方面5的填装床生物反应器系统，其中，包含开口的所述多个层中的每一个包括相同的开口布置。
方面7属于方面6的填装床生物反应器系统，其中，至少一部分的包含开口的所述多个层相对于包含开口的所述多个层中的至少一个转动，其中，转动是绕着细胞培养基质的纵轴。
方面8属于方面2-7中任一项的填装床生物反应器系统，其中，所述多层中的一个或多个包括基材中的多个开口。
方面9属于方面8的填装床生物反应器系统，其中，具有多个开口的所述多层中的一个或多个绕着细胞培养基质的纵轴具有旋转对称性。
方面10属于方面1-9中任一项的填装床生物反应器系统，其中，开口所具有的形状包括以下至少一种：矩形、正方形、圆形、椭圆形、圆形、圆弧和三角形。
方面11属于方面1-10中任一项的填装床生物反应器系统，其中，开口从基材的边缘朝向基材的中心延伸。
方面12属于方面1-11中任一项的填装床生物反应器系统，还包括：布置在入口与细胞培养基质之间的流动分配板，其中，入口和流动分配板布置成使得经由入口进入内部储器的流体在内部储器的宽度上以不同速度流动通过流动分配板，以及其中，细胞培养基质的渗透区设计成补偿来自流动分配板的不同速度，从而使得通过细胞培养基质的灌注速度曲线在细胞培养基质的宽度上是均匀的。
方面13属于方面1-12中任一项的填装床生物反应器系统，其中，标准渗透性是细胞培养基质的平均渗透性。
方面14属于方面1-13中任一项的填装床生物反应器系统，其中，标准渗透性是细胞培养基质中由不具有开口的基材构成的区段的渗透性。
方面15属于方面1-14中任一项的填装床生物反应器系统，其中，开口包括如下宽度：约200μm至约3000μm，约300μm至约2500μm，约400μm至约2000μm，约500μm至约1500μm，约600μm至约1800μm，约1000μm至约2000μm，约1000μm至约1800μm，或者约1300μm至约1400μm。
方面16属于在生物反应器中培养基于粘附细胞的细胞培养基质，该细胞培养基质包括：结构受限定的基材，其包含限定了多个孔的基材材料，所述基材材料构造成使得细胞粘附到其；以及在一部分的细胞培养基质中的至少一个渗透区，所述至少一个渗透区所包含的渗透性高于所述至少一个渗透区外的细胞培养基质的标准渗透性，其中，渗透区包括基材中的开口，开口的直径大于所述多个孔中的任一个的直径。
方面17属于方面16的细胞培养基质，其包括多层基材。
方面18属于方面17的细胞培养基质，其中，所述多层基材中的每层包含有序且基本均匀的孔阵列。
方面19属于方面17或方面18的细胞培养基质，其中，渗透区包括所述多层中包含开口的多个层。
方面20属于方面19的细胞培养基质，其中，在至少一部分的所述多个层中的开口的细胞培养基质的水平横截面的面积不同于所述多个层中的至少一个中的开口。
方面21属于方面19或方面20的细胞培养基质，其中，包含开口的所述多个层中的每一个包括相同的开口布置。
方面22属于方面21的细胞培养基质，其中，至少一部分的包含开口的所述多个层相对于包含开口的所述多个层中的至少一个转动，其中，转动是绕着细胞培养基质的纵轴。
方面23属于方面17-22中任一项的细胞培养基质，其中，所述多层中的一个或多个包括基材中的多个开口。
方面24属于方面23的细胞培养基质，其中，具有多个开口的所述多层中的一个或多个绕着细胞培养基质的纵轴具有旋转对称性。
方面25属于方面16-24中任一项的细胞培养基质，其中，开口所具有的形状包括以下至少一种：矩形、正方形、圆形、椭圆形、圆形、圆弧和三角形。
方面26属于方面16-25中任一项的细胞培养基质，其中，开口从基材的边缘朝向基材的中心延伸。
方面27属于方面16-26中任一项的细胞培养基质，其中，标准渗透性是细胞培养基质的平均渗透性。
方面28属于方面16-27中任一项的细胞培养基质，其中，标准渗透性是细胞培养基质中由不具有开口的基材构成的区段的渗透性。
方面29属于方面16-28中任一项的细胞培养基质，其中，开口包括如下宽度：约200μm至约3000μm，约300μm至约2500μm，约400μm至约2000μm，约500μm至约1500μm，约600μm至约1800μm，约1000μm至约2000μm，约1000μm至约1800μm，或者约1300μm至约1400μm。
定义
“全合成”或“完全合成”是指完全由合成源材料组成且不含任何源自动物或动物源材料的细胞培养制品，例如微载体或培养容器表面。所公开的全合成细胞培养制品消除了异种污染的风险。
“包括”、“包含”或类似术语意为包括但不限于，即内含而非排他。
“用户”是指使用本文公开的系统、方法、制品或试剂盒的那些人，包括培养细胞以收获细胞或细胞产品的那些人，或者使用根据本文实施方式培养和/或收获的细胞或细胞产物的那些人。
本文所述的实施方式中用来对例如组合物中成分的量、浓度、体积、加工温度、加工时间、产率、流速、压力、粘度和类似数值及其范围或者组件的尺寸以及类似数值及其范围进行修饰的“约”是指可能发生的数值量的改变，例如，源自制备材料、组合物、复合体、浓缩物、组件部件、制品或使用制剂所用的常规测量和操作过程；源自这些过程中的偶然性误差；源自用来实施所述方法的起始材料或成分的制造、来源或纯度的差异；以及类似因素。术语“约”还包括由于具有特定初始浓度或混合物的组合物或制剂的老化而不同的量，以及由于混合或加工具有特定初始浓度或混合物的组合物或制剂而不同的量。
“任选的”或“任选地”表示随后描述的事件或情形会或不会发生，而且该描述包括事件或情形发生的实例和事件或情形不发生的实例。
除非另外说明，否则本文所用的不定冠词“一个”或“一种”及其相应的定冠词“该”表示至少一(个/种)，或者一(个/种)或多(个/种)。
可采用本领域技术人员熟知的缩写(例如，表示小时的“h”或“hr”，表示克的“g”或“gm”，表示毫升的“mL”以及表示室温的“rt”，表示纳米的“nm”以及类似缩写)。
在组分、成分、添加剂、尺度、条件和类似方面公开的具体和优选的数值及其范围仅用于说明，它们不排除其他限定数值或限定范围内的其他数值。本公开内容的系统、试剂盒以及方法可以包括本文所述的任何数值或数值、具体数值、更具体的数值和优选数值的任何组合，包括明示或暗示的中间值和范围。
除非另有表述，否则都不旨在将本文所述的任意方法理解为需要使其步骤以具体顺序进行。因此，当方法权利要求实际上没有陈述为其步骤遵循一定的顺序或者其没有在权利要求书或说明书中以任意其他方式具体表示步骤限于具体的顺序，都不旨在暗示该任意特定顺序。
对本领域的技术人员而言，显而易见的是可以在不背离所示实施方式的精神或范围的情况下作出各种修改和变动。因为本领域的技术人员可以想到所揭示的实施方式的融合了实施方式的精神和实质的各种改良、组合、子项组合和变化，应认为所揭示的实施方式包括所附权利要求书范围内的全部内容及其等同内容。

Claims (29)

1.一种用于培养细胞的填装床生物反应器系统，该系统包括：
细胞培养容器，其包含入口、出口以及流体连接到且布置在入口与出口之间的流体路径中的内部储器；
布置在储器中的细胞培养基质，所述细胞培养基质包括结构受限定的基材，包含限定了多个孔的基材材料，所述基材材料构造成用于使得细胞粘附到其；以及
一部分的细胞培养基质中的至少一个渗透区，所述至少一个渗透区所包含的渗透性高于所述至少一个渗透区外的细胞培养基质的标准渗透性，
其中，渗透区包括基材中的开口，所述开口的直径大于所述多个孔中的任一个的直径。
2.如权利要求1所述的填装床生物反应器系统，其中，细胞培养基质包含多层基材。
3.如权利要求2所述的填装床生物反应器系统，其中，所述多层基材中的每层包含有序且基本均匀的孔阵列。
4.如权利要求2或3所述的填装床生物反应器系统，其中，渗透区包括所述多层中包含开口的多个层。
5.如权利要求4所述的填装床生物反应器系统，其中，在至少一部分的所述多个层中的开口的细胞培养基质的水平横截面的面积不同于所述多个层中的至少一个中的开口。
6.如权利要求4或5所述的填装床生物反应器系统，其中，包含开口的所述多个层中的每一个包括相同的开口布置。
7.如权利要求6所述的填装床生物反应器系统，其中，至少一部分的包含开口的所述多个层相对于包含开口的所述多个层中的至少一个转动，其中，转动是绕着细胞培养基质的纵轴。
8.如权利要求2-7中任一项所述的填装床生物反应器系统，其中，所述多层中的一个或多个包括基材中的多个开口。
9.如权利要求8所述的填装床生物反应器系统，其中，具有多个开口的所述多层中的一个或多个绕着细胞培养基质的纵轴具有旋转对称性。
10.如权利要求1-9中任一项所述的填装床生物反应器系统，其中，开口所具有的形状包括以下至少一种：矩形、正方形、圆形、椭圆形、圆形、圆弧和三角形。
11.如权利要求1-10中任一项所述的填装床生物反应器系统，其中，开口从基材的边缘朝向基材的中心延伸。
12.如权利要求1-11中任一项所述的填装床生物反应器系统，其还包括：布置在入口与细胞培养基质之间的流动分配板，
其中，入口和流动分配板布置成使得经由入口进入内部储器的流体在内部储器的宽度上以不同速度流动通过流动分配板，以及
其中，细胞培养基质的渗透区设计成补偿来自流动分配板的不同速度，从而使得通过细胞培养基质的灌注速度曲线在细胞培养基质的宽度上是均匀的。
13.如权利要求1-12中任一项所述的填装床生物反应器系统，其中，标准渗透性是细胞培养基质的平均渗透性。
14.如权利要求1-13中任一项所述的填装床生物反应器系统，其中，标准渗透性是细胞培养基质中由不具有开口的基材构成的区段的渗透性。
15.如权利要求1-14中任一项所述的填装床生物反应器系统，其中，开口包括如下宽度：约200μm至约3000μm，约300μm至约2500μm，约400μm至约2000μm，约500μm至约1500μm，约600μm至约1800μm，约1000μm至约2000μm，约1000μm至约1800μm，或者约1300μm至约1400μm。
16.一种在生物反应器中培养基于粘附细胞的细胞培养基质，该细胞培养基质包括：
结构受限定的基材，其包含限定了多个孔的基材材料，所述基材材料构造成使得细胞粘附到其；以及
一部分的细胞培养基质中的至少一个渗透区，所述至少一个渗透区所包含的渗透性高于所述至少一个渗透区外的细胞培养基质的标准渗透性，
其中，渗透区包括基材中的开口，所述开口的直径大于所述多个孔中的任一个的直径。
17.如权利要求16所述的细胞培养基质，其包括多层基材。
18.如权利要求17所述的细胞培养基质，其中，所述多层基材中的每层包含有序且基本均匀的孔阵列。
19.如权利要求17或18所述的细胞培养基质，其中，渗透区包括所述多层中包含开口的多个层。
20.如权利要求19所述的细胞培养基质，其中，在至少一部分的所述多个层中的开口的细胞培养基质的水平横截面的面积不同于所述多个层中的至少一个中的开口。
21.如权利要求19或20所述的细胞培养基质，其中，包含开口的所述多个层中的每一个包括相同的开口布置。
22.如权利要求21所述的细胞培养基质，其中，至少一部分的包含开口的所述多个层相对于包含开口的所述多个层中的至少一个转动，其中，转动是绕着细胞培养基质的纵轴。
23.如权利要求17-22中任一项所述的细胞培养基质，其中，所述多层中的一个或多个包括基材中的多个开口。
24.如权利要求23所述的细胞培养基质，其中，具有多个开口的所述多层中的一个或多个绕着细胞培养基质的纵轴具有旋转对称性。
25.如权利要求16-24中任一项所述的细胞培养基质，其中，开口所具有的形状包括以下至少一种：矩形、正方形、圆形、椭圆形、圆形、圆弧和三角形。
26.如权利要求16-25中任一项所述的细胞培养基质，其中，开口从基材的边缘朝向基材的中心延伸。
27.如权利要求16-26中任一项所述的细胞培养基质，其中，标准渗透性是细胞培养基质的平均渗透性。
28.如权利要求16-27中任一项所述的细胞培养基质，其中，标准渗透性是细胞培养基质中由不具有开口的基材构成的区段的渗透性。
29.如权利要求16-28中任一项所述的细胞培养基质，其中，开口包括如下宽度：约200μm至约3000μm，约300μm至约2500μm，约400μm至约2000μm，约500μm至约1500μm，约600μm至约1800μm，约1000μm至约2000μm，约1000μm至约1800μm，或者约1300μm至约1400μm。
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