CN118076723A - 用于固定床生物反应器的均匀细胞培养基材 - Google Patents

用于固定床生物反应器的均匀细胞培养基材 Download PDF

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CN118076723A CN202280053331.4A CN202280053331A CN118076723A CN 118076723 A CN118076723 A CN 118076723A CN 202280053331 A CN202280053331 A CN 202280053331A CN 118076723 A CN118076723 A CN 118076723A
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Abstract

提供了用于培养细胞的填装床生物反应器系统。系统包括细胞培养容器，其具有至少一个内部储器，流体连接到储器的入口，和流体连接到储器的出口；以及布置在储器中且排布成固定床的细胞培养基质。细胞培养基质包括基材，其构造成使其与细胞粘附。细胞培养基质维持了整个细胞培养基质的储器中的均匀流动。

Description

用于固定床生物反应器的均匀细胞培养基材
相关申请的交叉参考
本申请根据35U.S.C.§119，要求2021年7月30日提交的美国临时申请系列第63/227,693号的优先权权益，本文以其内容作为基础并将其全文通过引用结合于此。
技术领域
本公开内容大体上涉及用于培养细胞的基材和结合了此类基材的固定床生物反应器，以及用于培养细胞的系统和方法。具体来说，本公开内容涉及具有改进的流体流动特性的细胞培养基材。
背景技术
在生物加工行业，出于生产激素、酶、抗体、疫苗和细胞疗法的目的进行大规模细胞培养。细胞和基因治疗市场正在快速增长，有希望的治疗进入临床试验并迅速走向商业化。然而，一次细胞治疗剂量可能需要数十亿个细胞或数万亿个病毒。由此，能够在短时间内提供大量细胞产品对于临床成功是至关重要的。
生物加工中使用的大部分细胞都依赖于锚点，这意味着细胞需要表面来粘附从而进行生长和发挥功能。传统上，粘附细胞的培养是在二维(2D)细胞粘附表面上进行的，所述细胞粘附表面整合在多种容器形式中的一种，例如：T型瓶、培养皿、细胞工厂、细胞堆叠容器、辊瓶以及容器。这些方案会具有明显缺陷，包括难以实现高到足以使得可用于治疗或细胞的大规模生产的细胞密度。
已经建议有替代方法来增加培养细胞的体积密度。这些包括在搅拌罐中进行的微载体培养。在这种方案中，附着到微载体表面的细胞经受恒定剪切应力，导致对增殖和培养性能的明显影响。高密度细胞培养系统的另一个例子是空心纤维生物反应器，其中，当他们在纤维空间之间的空间中增殖时，细胞可以形成大的三维聚集体。然而，由于缺乏营养物，细胞生长和性能受到明显抑制。为了缓解这个问题，将这些生物反应器制造成小的并且不适合大规模生产。
用于锚定依赖细胞的高密度培养系统的另一个例子是填装床生物反应器系统。在这种类型的生物反应器中，使用细胞基材来提供粘附细胞的附着表面。介质沿表面或通过半多孔基材灌注，以提供细胞生长所需的营养物和氧气。例如，先前的美国专利第4,833,083号、第5,501,971号以及第5,510,262号已经公开了含有支撑或基质系统的填装床来俘获细胞的填装床生物反应器系统。填装床基质通常是由多孔颗粒作为基材或者聚合物的非织造微纤维来制造得到的。此类生物反应器起到了再循环流通式生物反应器的功能。明显问题之一在于，此类生物反应器在填装床内的细胞分布不是均匀的。例如，填装床起到了深度过滤器的功能，细胞主要俘获在入口区域处，导致接种步骤期间的细胞分布的梯度。此外，由于无规纤维填装，填装床的横截面的流动阻力以及细胞俘获效率不是均匀的。例如，介质快速流动通过具有低的细胞填装密度的区域，而缓慢流动通过由于较高数量的俘获细胞导致较高阻力的区域。这产生了通道效应，其中，营养物和氧气被更有效地传递到具有较低体积细胞密度的区域，而具有较高细胞密度的区域则维持在非最优培养条件下。
现有技术公开的填装床系统的另一个明显缺陷在于，无法在培养过程结束时高效地收获完整的活细胞。如果最终产品是细胞或者如果生物反应器被用作“接种序列”的一部分(其中，细胞群体在一个容器中生长，然后转移到另一个容器以使得群体进一步生长)的话，那么细胞的收获是至关重要的。美国专利第9,273,278号公开了改善细胞收获步骤期间从填装床回收细胞的效率得到改善的生物反应器设计。其基于疏松填装床基质以及填装床颗粒的振动或搅拌来实现多孔基质碰撞并由此分离细胞。然而，这种方案是费力的，并且可能导致明显细胞破坏，从而降低了整体细胞存活率。
目前市场上的填装床生物反应器的例子是Pall有限公司生产的iCellis使用由以非织造布置的无规取向纤维构成的细胞基材材料的小条。将这些条填装到容器中以产生填装床。然而，如同市场上类似的解决方案那样，这种类型的填装床基材存在缺陷。具体来说，基材条的非均匀填装产生了填装床内视觉可见的通道，导致优先和非均匀的介质流动以及填装床的营养物分布。对/>的研究已经注意到“细胞的系统性非均质分布，它们的数量从固定床的顶部到底部发生增加”以及“营养物梯度……导致限制了细胞生长和生产”，这全都导致“可能影响转染效率的细胞的不均分布”。(Rationalplasmid design and bioprocess optimization to enhance recombinant adeno-associated virus(AAV)productivity in mammalian cells(合理的质粒设计和生物过程优化，以提高哺乳动物细胞中重组腺相关病毒(AAV)的生产力)，生物技术期刊，2016年11月，290-297页)。研究注意到填装床的搅拌可以改善分布，但是会具有其他缺陷(即，“在接种和转染过程中为了更好地分散而进行的必要搅拌会诱发剪切应力的增加，这进而导致细胞活力降低”，同上)。/>的另一项研究注意到：细胞的不均匀分布使得使用生物量传感器监测细胞群体是困难的(“……如果细胞分布不均匀，则顶部载体上细胞的生物量信号可能无法显示整个生物反应器的全貌”。Process Development of Adenoviral VectorProduction in Fixed Bed Bioreactor:From Bench to Commercial Scale(固定床生物反应器中腺病毒载体生产的工艺开发：从实验室到商业规模)，人类基因治疗，第26卷，第8期，2015年)。
此外，由于纤维在基材条中的无规排布以及的一个填装床与另一个之间的条填装中的变化，用户可能难以预测细胞培养性能，因为培养之间的基材是不同的。此外，/>的填装基材非常难以或不可能高效地收获细胞，因为相信细胞被填装床所俘获。
虽然利用现有平台可以制造用于早期临床试验的病毒载体，但是需要能够以更大数量生产高质量产品的平台，以达到后期商业制造规模。
存在对于能够以高密度形式、均匀细胞分布和便于获得且增加收获产率的方式对细胞进行培养的细胞培养基材和/或基质、生物反应器、系统和方法的需求。具体来说，需要具有改进的流体流动特性的用于固定床生物反应器的细胞培养基材。
发明内容
根据本公开内容的实施方式，提供了用于细胞培养的填装床生物反应器系统。该系统包括：细胞培养容器，其具有至少一个内部储器，流体连接到储器的入口，和流体连接到储器的出口；以及布置在储器中的填装床细胞培养基质。细胞培养基质包括多个结构受限定的基材层，用于使得细胞贴附到其，并且每层基材层具有规则且均匀的物理结构和孔隙度。实施方式的一些方面包括具有均匀孔隙度的填装床细胞培养基质和/或构造成使得均匀流体流动通过其的填装床细胞培养基质。作为另一个方面，所述多个结构受限定的基材包括布置在储器中的基材碟的堆叠。在另一个方面中，结构受限定的基材包括限定了孔隙度的多个开口，所述多个开口以规则或均匀式样排布在每个基材碟中。
根据本公开内容的实施方式，提供了细胞培养基质。细胞培养基质包括基材，其具有第一侧，与第一侧相反的第二侧，将第一侧与第二侧分开的厚度，以及形成在基材中且穿过基材厚度的多个开口。所述多个开口构造成允许细胞培养介质、细胞或者细胞产物中的至少一种流动穿过基材厚度。基材可以是以下至少一种：模制聚合物栅格片(latticesheet)、3D打印栅格片和织造网片。基材具有规则有序结构并且提供了用于细胞贴附、生长和最终的细胞释放的表面。
根据本公开内容的实施方式，提供了用于细胞培养的生物反应器系统，该系统包括：具有至少一个储器的细胞培养容器；以及布置在所述至少一个储器中的细胞培养基质，细胞培养基质包括织造基材，其具有表面构造成使得细胞贴附到其的多根交织纤维。
根据一个或多个实施方式，提供了细胞培养系统，该系统包括：生物反应器容器；以及布置在生物反应器容器中且构造成培养细胞的细胞培养基质。细胞培养基质包括基材，其包含：第一侧，与第一侧相反的第二侧，将第一侧与第二侧分开的厚度，以及形成在基材中且穿过基材厚度的多个开口，并且所述多个开口构造成允许细胞培养介质、细胞或者细胞产物中的至少一种流动穿过基材厚度。
根据一个或多个实施方式，提供了用于细胞培养的生物反应器系统。该系统包括：具有第一端、第二端和位于第一与第二端之间的至少一个储器的细胞培养容器；以及布置在所述至少一个储器中的细胞培养基质。细胞培养基质具有多个织造基材，每个包括表面构造成使得细胞贴附到其的多根交织纤维。生物反应器系统构造成以从第一端到第二端的流动方向使得材料流动通过所述至少一个储器，以及所述多个织造基材中的基材堆叠成使得每个织造基材基本平行于其他每一个织造基材并且基本垂直于流动方向。
根据一个或多个实施方式，提供了用于细胞培养的生物反应器系统。该系统包括：具有第一端、第二端和位于第一与第二端之间至少一个储器的细胞培养容器；以及布置在所述至少一个储器中的细胞培养基质，细胞培养基质包括多个织造基材，每个具有表面构造成使得细胞贴附到其的多根交织纤维。生物反应器系统构造成以从第一端到第二端的流动方向使得材料流动通过所述至少一个储器，以及所述多个织造基材中的基材堆叠成使得每个织造基材基本平行于其他每一个织造基材并且基本平行于流动方向。
根据一个或多个实施方式，提供了用于细胞培养的生物反应器系统。该系统包括：具有第一端、第二端和位于第一与第二端之间的至少一个储器的细胞培养容器；以及布置在所述至少一个储器中的细胞培养基质。细胞培养基质包括织造基材，其包括具有构造成使得细胞粘附到其的表面的多根交织纤维，并且织造基材以卷绕构造布置在所述至少一个储器中从而提供圆柱形细胞培养基质，织造基材的表面平行于圆柱形细胞培养基质的纵轴。
根据另一个实施方式，提供了生物反应器中的细胞培养方法。该方法包括提供生物反应器容器，其具有生物反应器容器内的细胞培养室以及布置在细胞培养室中的细胞培养基质。提供细胞培养基质使得在其上培养细胞。细胞培养基质包括基材，其具有第一侧，与第一侧相反的第二侧，将第一侧与第二侧分开的厚度，以及形成在基材中且穿过基材厚度的多个开口。该方法还包括在细胞培养基质上接种细胞；在细胞培养基质上培养细胞；以及收获细胞培养的产物。基材中的所述多个开口允许细胞培养介质、细胞或者细胞产物中的至少一种流动穿过基材厚度。
附图说明
图1A显示根据本公开内容一个或多个实施方式的细胞培养基材的三维模型的立体图。
图1B是图1A的基材的二维平面图。
图1C是图1B中的基材沿线A-A的横截面。
图2A显示根据一些实施方式的细胞培养基材的例子。
图2B显示根据一些实施方式的细胞培养基材的例子。
图2C显示根据一些实施方式的细胞培养基材的例子。
图3A显示根据一个或多个实施方式的多层细胞培养基材的立体图。
图3B显示根据一个或多个实施方式的多层细胞培养基材的平面图。
图4显示根据一个或多个实施方式的图3B的多层细胞培养基材沿线B-B的横截面图。
图5显示根据一个或多个实施方式的图4的多层细胞培养基材沿线C-C的横截面图。
图6显示根据一个或多个实施方式的细胞培养系统的示意图。
图7显示根据一个或多个实施方式的细胞培养系统的示意图。
图8是根据一个或多个实施方式的细胞培养系统的示意性代表。
图9A显示根据本公开内容实施方式的两个实例的总细胞收获的实验结果(对比HYPER烧瓶)。
图9B显示根据本公开内容实施方式的两个实例的每个容器的总基因组拷贝数的实验结果(对比HYPER烧瓶)。
图9C显示根据本公开内容实施方式的两个实例的单位表面积的基因组拷贝数的实验结果(对比HYPER烧瓶)。
图10A显示根据本公开内容一个或多个实施方式的具有紧密填装布置的建模多层织造网细胞培养基材的平面图。
图10B显示根据本公开内容一个或多个实施方式的图10A的多层织造网细胞培养基材的横截面侧视图。
图11A显示根据本公开内容一个或多个实施方式的处于疏松填装布置的建模多层织造网细胞培养基材的平面图。
图11B显示根据本公开内容一个或多个实施方式的图11A的多层织造网细胞培养基材的横截面侧视图。
图12A显示如图10A和10B所示的虚线体积中的建模的空的空间。
图12B显示如图11A和11B所示的虚线体积中的建模的空的空间。
图13A是根据本公开内容一个或多个实施方式的根据来自表5的网样品A的网样品照片。
图13B是根据本公开内容一个或多个实施方式的根据来自表5的网样品B的网样品照片。
图13C是根据本公开内容一个或多个实施方式的根据来自表5的网样品C的网样品照片。
图13D是根据本公开内容一个或多个实施方式的根据来自表5的网样品D的网样品照片。
图13E是根据本公开内容一个或多个实施方式的根据来自表5的网样品E的网样品照片。
图13F是根据本公开内容一个或多个实施方式的根据来自表5的网样品F的网样品照片。
图14是来自图23的织造网样品A-F的渗透性的柱状图。
图15显示采用来自图23的样品A-C的压降测试的结果。
图16A显示根据本公开内容一个或多个实施方式的具有织造网基材的生物反应器的流动均匀性模型。
图16B是图16A的流动均匀性模型的放大图。
图17A是用于测量非织造基材的渗透性的实验设备的示意性代表图。
图17B是用于测量无规填装非织造基材的渗透性的实验设备的示意性代表图。
图17C是根据本公开内容一个或多个实施方式用于测量开放织造网基材的渗透性的实验设备的示意性代表图。
图18是织造和非织造细胞培养基材的渗透性测量的柱状图。
图19A显示绕着相对于流动方向90°对准的非织造网基材片的模拟流动速度。
图19B显示绕着相对于流动方向45°对准的非织造网基材片的模拟流动速度。
图20A显示绕着所有相邻结构(neighbor)之间具有1mm间隙的非织造网基材片的模拟流动速度。
图20B显示绕着所有相邻结构(neighbor)之间具有1mm间隙的开放织造网的模拟流动速度。
图21是用于对不同细胞培养基材样品的停留时间分布进行测量的实验设定的示意图。
图22显示织造和非织造细胞培养基材的染料浓度变化与停留时间分布测量过程中的时间的关系图。
图23显示对于根据本公开内容实施方式的具有织造基材的生物反应器与其他市售可得非织造细胞培养基材，染料浓度变化与流动通过它们的标准化体积的关系图。
具体实施方式
下面参考附图(如果有的话)对本公开内容的各个实施方式进行详细描述。参考各个实施方式不限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求书的范围限制。此外，在本说明书中列出的任何实例都不是限制性的，并且仅列出了要求保护的本发明的诸多可能的实施方式中的一些实施方式。
本公开内容的实施方式：细胞培养基材，以及结合了此类基材的细胞培养或生物反应器系统，以及采用此类基材和生物反应器系统的细胞培养方法。
在常规大规模细胞培养生物反应器中，使用了不同类型的填装床生物反应器。通常来说，这些填装床含有多孔基质来保留粘附或悬浮的细胞以及来支撑生长和增殖。填装床基质提供了高的表面积-体积比，所以细胞密度会高于其他系统。然而，填装床常常起到深度过滤器的作用，其中，细胞被物理俘获或卷入基质的纤维中。因而，由于细胞接种物的线性流动穿过填装床，细胞在填装床内经受非均质分布，导致穿过填装床的深度或宽度上的细胞密度的变化。例如，细胞密度可能在生物反应器的入口区域较高，而在更靠近生物反应器的出口处明显更低。这种填装床内的细胞的非均匀分布明显阻碍了生物加工制造中的此类生物反应器的规模化和可预测性，并且甚至会导致每单位表面积或体积的填装床的细胞或病毒载体生产的生长效率下降。
现有技术公开的填装床生物反应器遭遇的另一个问题是通道效应。由于填装的非织造纤维的无规特性，填装床的任意给定横截面处的局部纤维密度是不均匀的。介质在具有低纤维密度(高床渗透性)区域中快速流动，而在高纤维密度(较低床渗透性)区域中流动要慢得多。作为结果，填装床上的非均匀介质灌注产生通道效应，其自身表现为明显的营养物和代谢产物梯度，这对整体细胞培养和生物反应器性能产生负面影响。位于低介质灌注区域中的细胞会挨饿，并且非常普遍地由于缺乏营养物或代谢产物中毒而死亡。细胞收获是当使用填装了非织造纤维状支架的生物反应器时遭遇的另一个问题。由于填装床起到深度过滤器的功能，在细胞培养过程结束时释放的细胞被俘获在填装床内，并且细胞回收是非常低的。这明显限制了此类生物反应器在活细胞是产物的生物加工中的应用。因而，非均匀性导致具有不同的流体和剪切暴露的区域，有效地降低了可用的细胞培养面积，导致非均匀培养，并且干扰了转染效率和细胞释放。
为了解决现有细胞培养方案的这些和其他问题，本公开内容的实施方式提供了细胞生长基材、此类基材的基质和/或使用此类基材的填装床系统，它们实现了对于锚点依赖性细胞和细胞产品(例如，蛋白质、抗体、病毒颗粒)生产的高效和高产率细胞培养。实施方式包括由多孔基材材料的有序且规则阵列制造的多孔细胞培养基质，其实现了均匀的细胞接种以及介质/营养物灌注，以及高效的细胞收获。实施方式还实现了具有基材和生物反应器的可规模化细胞培养解决方案，能够对细胞进行接种和生长和/或细胞产品的收获，从工艺开发规格到完全生产尺寸规格，而没有牺牲实施方式的均匀性能。例如，在一些实施方式中，生物反应器可以容易地从工艺开发规格规模化至生产规格，在生产规格上具有相当的每单位基材表面积的病毒基因组(VG/cm2)。本文实施方式的可收获性和可规模化使得它们能够用于高效接种序列用于在与相同细胞基材上的多倍规模进行细胞种群生长。此外，本文实施方式提供了具有高表面积的细胞培养基质，其结合本文所述的其他特征实现了高产率的细胞培养解决方案。例如，在一些实施方式中，本文所讨论的细胞培养基材和/或生物反应器可以产生每批次1016至1018个病毒基因组(VG)。
在一个实施方式中，提供的基质具有结构受限定的表面区域用于粘附细胞来进行附着和增殖，其具有良好的机械强度并且当装配到填装床或其他生物反应器中的时候形成高度均匀多样性的互连流体网络。在具体实施方式中，机械稳定的不可降解的织造网可以用作基材来支撑粘附的细胞生产。本文公开的细胞培养基质支撑了具有高体积密度形式的锚定依赖性细胞的附着和增殖。此类基质能够实现均匀细胞接种，以及细胞或生物反应器的其他产物的高效收获。此外，本公开内容的实施方式支撑细胞培养来提供接种步骤期间的均匀细胞分布并实现所公开的基质上的粘附细胞的汇合单层或多层，并且可以避免形成具有有限营养物扩散和代谢产物浓度增加的大型和/或不可控3D细胞聚集体。因而，基质消除了生物反应器运行期间的扩散限制。此外，基质能够从生物反应器进行简单且高效的细胞收获。一个或多个实施方式的结构受限定的基质实现了从生物反应器的填装床的完全细胞回收和一致细胞收获。
根据一些实施方式，还提供了使用具有基质的生物反应器来进行细胞培养的方法，用于治疗蛋白、抗体、病毒疫苗或病毒载体的生物加工生产。
不同于用于细胞培养生物反应器的现有细胞培养基材(即，无序纤维的非织造基材)，本公开内容的实施方式包括具有受限或有序结构的细胞培养基材。受限定且有序结构实现了一致且可预测的细胞培养结果。此外，基材具有开放多孔结构，其防止了细胞捕获和实现了均匀流动通过填装床。这种构造实现了改进的细胞接种、营养物传递、细胞生长和细胞收获。根据一个或多个具体实施方式，基质由基材材料形成，所述基材材料具有薄片状构造，具有被较小的厚度分隔开的第一与第二侧，从而片厚度相对于基材的第一和第二侧的宽度和/或长度是小的。此外，形成了穿过基材厚度的多个孔或开口。开口之间的基材材料的尺寸和几何形貌允许细胞粘附到基材材料的表面，仿佛是近似二维(2D)表面那样，同时允许绕着基材材料和穿过开口的充分的流体流动。在一些实施方式中，基材是：基于聚合物的材料并且可以形成为模制聚合物片；具有压孔穿过厚度的开口的聚合物片；许多丝线，它们熔合成网状层；3D打印基材；或者织造成网状层的多根丝线。基质的物理结构具有高的表面-体积比，用于培养锚定依赖性细胞。根据各种实施方式，基质可以以本文所讨论的某些方式那样布置成或者填装到生物反应器中，用于均匀细胞接种和生长、均匀介质灌注以及高效细胞收获。
本公开内容的实施方式可以实现实用规模的病毒载体平台，其可以产生如下规格的病毒基因组：每批次大于约1014个病毒基因组；每批次大于约1015个病毒基因组；每批次大于约1016个病毒基因组；每批次大于约1017个病毒基因组；或者最高至或大于每批次约1016个病毒基因组。在一些实施方式中，每批次产生约1015至约1018或更多的病毒基因组。例如，在一些实施方式中，病毒基因组产率可以是：每批次约1015至约1016个病毒基因组；或者每批次约1016至约1019个病毒基因组；或者每批次约1016-1018个病毒基因组；或者每批次约1017至约1019个病毒基因组；或者每批次约1018至约1019个病毒基因组；或者每批次约1018或更多个病毒基因组。
此外，本文公开的实施方式不仅能够实现细胞培养基材的细胞附着和生长，并且还能够实现培养细胞的存活收获。无法收获活细胞是目前平台的明显缺陷，并且这导致难以建立和维持足够数量的细胞以实现生产能力。根据本公开内容实施方式的方面，可以从细胞培养基材收获活细胞，包含80％至100％存活率，或者约85％至约99％存活率，或者约90％至约99％存活率。例如，对于收获的细胞，是至少80％存活率，至少85％存活率，至少90％存活率，至少91％存活率，至少92％存活率，至少93％存活率，至少94％存活率，至少95％存活率，至少96％存活率，至少97％存活率，至少98％存活率，或者至少99％存活率。可以采用例如胰蛋白酶、TrypLE或Accutase从细胞培养基材释放细胞。
图1A和1B分别显示根据本公开内容一个或多个实施方式的例子的细胞培养基材100的三维(3D)立体图和二维(2D)平面图。细胞培养基材100是由沿第一方向的第一组多根纤维102和沿第二方向的第二组多根纤维104制造得到的织造网状层。基材100的织造纤维形成多个开口106，其可以由一个或多个宽度或直径(例如，D1、D2)所限定。开口的尺寸和形状可以基于编织类型(例如，数量、丝线的形状和尺寸；以及相交丝线之间的角度等)发生变化。织造网可以表征为宏观二维片或层。然而，对织造网的仔细检查揭示了由于网的相交纤维的上升和下降所导致的三维结构。因此，如图1C所示，织造网100的厚度T可以比单纤维的厚度(例如，t1)更厚。如本文所用，厚度T是织造网的第一侧108与第二侧110之间的最大厚度。不希望受限于理论，相信基材100的三维结构是有利的，因为这提供了大的表面积来培养粘附的细胞，并且网的结构刚性可以提供实现了均匀流体流动的一致且可预测的细胞培养基质结构。
在图1B中，开口106具有直径D1(定义为相对的纤维102之间的距离)以及直径D2(定义为相对的纤维104之间的距离)。取决于编织几何形貌，D1和D2可以是相等或者不等的。对于D1和D2是不相等的情况，较大的那个可以被称作主直径，而较小的那个被称作次直径。在一些实施方式中，开口的直径可以被称作开口的最宽部分。除非另有说明，否则如本文所用的开口直径会表示开口的相对侧上的平行纤维之间的距离。
给定的多根纤维102的纤维具有厚度t1，以及给定的多根纤维104的纤维具有厚度t2。在如图1A所示的圆形横截面或者其他三维横截面纤维的情况下，厚度t1和t2是纤维横截面的最大直径或厚度。根据一些实施方式，所述多根纤维102全都具有相同的厚度t1，而所述多根纤维104全都具有相同的厚度t2。此外，t1和t2可以是相等的。然而，在一个或多个实施方式中，t1和t2是不等的，例如当所述多根纤维102不同于所述多根纤维104的时候。此外，所述多根纤维102和所述多根纤维104可以分别含有两种或更多种不同厚度的纤维(例如，t1a、t1b等，以及t2a、t2b等)。根据实施方式，厚度t1和t2相对于其上培养的细胞的尺寸是大的，从而纤维提供了相对于细胞角度而言近似平坦表面，这相比于其中的纤维尺寸是小的一些其他解决方案(例如，规格为细胞直径)可以实现更好的细胞附着和生长。由于织造网的三维特性，如图1A-1C所示，纤维的可用于细胞附着和增殖的2D表面积超过了等价平坦2D表面上用于附着的表面积。
在一个或多个实施方式中，纤维可以具有如下直径范围：约50μm至约1000μm，约100μm至约750μm，约125μm至约600μm，约150μm至约500μm，约200μm至约400μm，约200μm至约300μm，或者约150μm至约300μm。对于微观水平而言，由于纤维相比于细胞的规格(例如，纤维直径大于细胞)，单丝线纤维的表面以近似2D表面呈现用于粘附细胞的附着和增殖。可以将纤维织造成开口范围约为100μm x 100μm至约为1000μm x 1000μm的网。在一些实施方式中，开口可以具有如下直径：约50μm至约1000μm，约100μm至约750μm，约125μm至约600μm，约150μm至约500μm，约200μm至约400μm，或者约200μm至约300μm。这些丝线直径和开口直径的范围是一些实施方式的例子，但是并不旨在对根据所有实施方式的网的可能的特征尺寸进行限制。对纤维直径和开口直径的组合进行选择以提供穿过基材的高效且均匀流体流动，例如当细胞培养基质包含多个相邻网状层(例如，单体层的堆叠或者卷起来的网状层)的时候。
诸如纤维直径、开口直径和织造类型/图案之类的因素会决定可用于细胞附着和生长的表面积。此外，当细胞培养基质包括堆叠、卷材或者重叠基质的其他布置时，细胞培养基质的填装密度会影响填装床基质的表面积。填装密度会随着基材材料的填装厚度(例如，基材的层所需的空间)发生变化。例如，如果细胞培养基质的堆叠具有一定的高度，则可以将堆叠中的每一层认为具有填装厚度，其通过将堆叠的总高度除以堆叠中的层数来确定。填装厚度会基于纤维直径和编织发生变化，但是也会基于堆叠中的相邻层的对齐发生变化。例如，由于织造层的三维特性，存在一定量的相邻层基于它们的相互对齐所能够容纳的互锁或重叠。在第一对齐中，相邻层可以紧密贴合在一起；但是在第二对齐中，相邻层可以具有零重叠，例如当上层的最低点与下层的最高点直接接触时。对于某些应用，可能希望提供具有较低密度的层填装(例如，当高的渗透性具有优先级时)或者较高密度的层填装(例如，当最大化基材表面积具有优先级时)的细胞培养基质。根据一个或多个实施方式，填装厚度可以是：约50μm至约1000μm，约100μm至约750μm，约125μm至约600μm，约150μm至约500μm，约200μm至约400μm，约200μm至约300μm。
上述结构因素可以确定细胞培养基质的表面积，无论是细胞培养基材的单层的表面积还是具有多层基材的细胞培养基质的表面积。例如，在具体实施方式中，具有圆形形状和6cm直径的织造网基材的单层可以具有约68cm2的有效表面积。如本文所用，“有效表面积”是基材材料的可用于细胞附着和生长的部分中的纤维的总表面积。除非另有说明，否则涉及的“表面积”指的是这个有效表面积。根据一个或多个实施方式，直径为6cm的单层织造网基材可以具有如下有效表面积：约50cm2至约90cm2，约53cm2至约81cm2，约68cm2，约75cm2，或者约81cm2。提供的这些有效表面积范围仅仅是举例，并且一些实施方式可以具有不同的有效表面积。细胞培养基质还可以用孔隙度进行表征，如本文实施例所讨论的那样。
可以从与细胞培养应用相容的聚合物材料的单丝线或多丝线纤维制造基材网，包括例如：聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚丁二烯、聚氯乙烯、聚环氧乙烷、聚吡咯和聚环氧丙烷。网状基材可以具有不同的图案或编织，包括例如：针织、经编(warp-knitted)或织造(woven)(例如，平纹、斜纹、荷兰纹、五针编织)。
可以需要对网状丝线的表面化学性进行改性以提供所需的细胞粘附性质。可以通过网的聚合物材料的化学处理或者通过丝线表面接枝细胞粘附分子来进行此类改性。或者，网可以涂覆证实了细胞粘附性质的生物相容性水凝胶的薄层，包括例如胶原蛋白或或者，网的丝线纤维的表面可以通过各种类型的等离子体、加工气体和/或行业中已知的化学品的处理工艺赋予细胞粘附性质。然而，在一个或多个实施方式中，网能够在没有表面处理的情况下提供高效的细胞生长表面。
图2A-2C显示根据本公开内容一些预期实施方式的织造网的不同例子。下表1总结了这些网的纤维直径和开口尺寸，以及通过相应的网的单层所提供的相对于相当的2D表面的细胞培养表面积的近似增加大小。在表1中，网A指的是图2A的网，网B指的是图2B的网，以及网C指的是图2C的网。表1的这三种网几何形貌仅仅是举例，并且本公开内容的实施方式不限于这些具体例子。因为网C提供了最高的表面积，所以其对于实现细胞粘附和增殖的高密度并进而提供最高效的基材用于细胞培养可以是有利的。然而，在一些实施方式中，细胞培养基材包含具有较低表面积的网(例如，网A或网B)或者不同表面积的网组合对于例如实现培养室内所需的细胞分布或流动特性可能是有利的。
表1：图2A-2C中的网对比和所得到的相比于2D表面的细胞培养表面积增加
如上表所示，网的三维质量相比于相当尺寸的平坦2D表面提供了增加的表面积用于细胞附着和增殖。这种表面积增加有助于通过本公开内容的实施方式实现可规模化性能。对于工艺发展和工艺验证研究，通常需要小规格的生物反应器来节约试剂成本和增加实验产出。本公开内容的实施方式可适用于此类小规格研究，但是也可以放大规格至工业或生产规模。例如，如果将2.2cm直径圆圈形式的100层的网C填装成2.2cm内直径的圆柱体填装床，则可用于细胞附着和增殖的总表面积等于约935cm2。为了使得此类生物反应器放大10倍，可以使用类似的设定：具有7cm内直径和100层相同网的圆柱体填装床。在此类情况下，总表面积会等于9,350cm2。在一些实施方式中，可用的表面积约为99,000cm2/L或更大。因为填装床中的塞式灌注流，以ml/分钟/cm2横截面填装床表面积表示的相同流速可用于较小规模和较大规模版本的生物反应器。较大的表面积实现了较高的接种密度和较高的细胞生长密度。根据一个或多个实施方式，本文所述的细胞培养基材证实具有最高至22,000个细胞/cm2或更高的细胞接种密度。作为参考，康宁的二维表面上的接种密度约为20,000个细胞/cm2。如本文所用，“塞式灌注流动”或者“塞流”指的是通过具有根据本文实施方式的固定床的生物反应器的层状流动，其中，流过垂直于流动方向的固定床的任何横截面的流动以相同的速率穿过横截面。
较高表面积和高的细胞接种或生长密度的另一个优点在于，本文公开实施方式的成本可等于或低于竞争解决方案。具体来说，每个细胞产品(例如，每个细胞或每个病毒基因组)的成本可等于或低于其他填装床生物反应器。
通过使用结构受限定的充分硬度的培养基质，可以实现基质或填装床上的高流动抗性均匀性。根据各种实施方式，可以以单层或多层形式部署基质。这种灵活性消除了扩散限制并且提供了对于附着到基质的细胞的均匀的营养物和氧传递。此外，开放基质缺乏填装床构造中的任何细胞俘获区域，实现了在培养结束时具有高存活率的完全细胞收获。基质还为填装床传递了填装均匀性并且实现了从工艺发展单元到大规模工业生物加工单元的直接可规模化。能够从填装床直接收获细胞的能力消除了对于将基质重新悬浮到搅拌或机械振荡容器中的需求，这会增加复杂度并且会使得细胞遭受有害的剪切应力。此外，细胞培养基质的高填装密度得到了工业规模上体积可管理的高的生物加工生产能力。
图3A显示具有多层基材200的基质的实施方式，以及图3B是同一多层基材200的平面图。多层基材200包括第一网基材层202和第二网基材层204。尽管第一与第二基材层202和204是重叠的，但是网的几何形貌(例如，开口直径与纤维直径之比)使得第一与第二基材层202和204的开口重叠并为流体提供流动通过多层基材200的总厚度的路径，如图3B中的无丝线开口206所示。
图4显示图3B中的线B-B处的多层基材200的横截面图。箭头208显示通过第二基材层204中的开口然后绕着第一基材层202中的丝线的可能的流体流动路径。将网基材层的几何形貌设计成允许高效且均匀的流动通过一个或多个基材层。此外，基质200的结构可以容纳以多取向通过基质的流体流动。例如，如图4所示，本体流体流动的方向(如箭头208所示)垂直于第一与第二基材层202和204的主侧表面。然而，基质也可以相对于流动取向成使得基材层的侧面平行于本体流动方向。图5显示沿图4中的线C-C的多层基材200的横截面图，以及基质200的结构允许流体流动(箭头210)通过多层基材200中的流体路径。除了流体流动垂直于或平行于网层的第一和第二侧之外，基质也可以布置成具有处于中间角度的多片基材，或者甚至相对于流体流动是随机布置的情况。通过织造基材的基本各向同性的流动行为实现了这种取向灵活性。相反地，现有的生物反应器中的用于粘附细胞的基材不展现出这种行为，作为替代，它们的填装床倾向于产生优先流动通道并且具有各向异性渗透性的基材材料。本公开内容的基质的灵活性使得其能够用于各种应用以及生物反应器或容器设计，同时实现整个生物反应器容器的更好且更均匀的渗透性。
如本文所讨论的那样，根据一个或多个实施方式，细胞培养基材可以用于生物反应器容器中。例如，基材可以用于填充床生物反应器构造，或者三维细胞培养室内的其他构造。然而，实施方式不限于三维培养空间，并且其考虑了基材可用于可能被视为二维培养表面构造的情况，其中，基材中的一层或多层是平坦的，例如在平底培养碟中以提供用于细胞的培养基材。出于污染考虑，容器可以是在使用后可丢弃的一次性容器。
根据一个或多个实施方式，提供了细胞培养系统，其中，在生物反应器的培养室中使用细胞培养基质。图6显示细胞培养系统300的例子，其包括在生物反应器容器302的内部具有细胞培养室304的生物反应器容器302。在细胞培养室304内的是由基材层308的堆叠制造的细胞培养基质306。基材层308堆叠，将基材层的第一或第二侧面朝相邻基材层的第一或第二侧。生物反应器容器300在一端具有入口310用于将介质、细胞和/或营养物输入到培养室304中，以及在相对端具有出口312用于从培养室304去除介质、细胞或细胞产品。由于受限定的结构以及高效的流体流动通过堆叠基材，通过允许以这种方式堆叠基材层，可以简单地对系统进行规模化而没有对细胞附着和增殖产生负面影响。虽然容器300通常可能如描述的那样具有入口310和出口312，但是一些实施方式可能使用入口310和出口312中的一个或两个来同时进行介质、细胞或者其他内含物进入和离开培养室304。例如，入口310可以用于在细胞接种、灌注或培养阶段期间使得介质或细胞流入培养室304中，但是也可以用于在收获阶段用于通过入口310去除介质、细胞或者细胞产品中的一种或多种。因此，术语“入口”和“出口”并不旨在限制那些开口的功能。
在一个或多个实施方式中，可以通过插入不同几何形貌的基材层来控制填装床的流动阻力和体积密度。具体来说，网尺寸和几何形貌(例如，纤维直径、开口直径和/或开口几何模型)限定了填装床形式中的流体流动阻力。通过插入不同尺寸和几何形貌的网，可以在生物反应器的一个或多个特定部分中控制或者改变流动阻力。这会实现填装床中更好的液体灌注均匀性。例如，10层网A(表1)之后10层网B(表1)以及之后10层网C(表1)可以进行堆叠从而实现所需的填装床特性。作为另一个例子，填装床可以从10层网B开始，之后是50层网C，之后是10层网B。可以持续此类重复式样直到整个生物反应器填充了网。这些仅仅是示例并且用于示意性目的，并不旨在对可能的组合进行限制。事实上，可以是不同尺寸的网的各种组合，从而获得细胞生长表面的体积密度的不同轮廓以及流动阻力。例如，可以通过插入不同尺寸的网来组装具有变化的体积细胞密度的区(例如，产生低/高/低/高等密度的图案的一系列的区)的填装床柱。
在图6中，本体流动方向是从入口310到出口312的方向，并且在这个例子中，基材层308的第一和第二主侧垂直于本体流动方向。相反地，图7所示的例子是这样的实施方式，其中，系统320包括生物反应器容器322以及培养空间324内的基材328的堆叠，具有平行于本体流动方向的第一和第二侧，所述本体流动方向对应于进入入口330和离开出口332的流动线所示的方向。因此，本公开内容实施方式的基质可以用于任一种构造。在系统300和320的每一个中，基材308、328经过尺寸调节和形状调节以填充由培养室304、324限定的内部空间，从而每个容器中的培养空间经过填充用于细胞生长表面以使得以每单位体积的细胞数而言的效率最大化。虽然图7显示多个入口330和多个出口332，但是考虑系统320可以由单个入口进行进料并且可以具有单个出口。然而，根据本文各种实施方式，可以使用分配板来帮助对介质、细胞或者营养物在填装床的横截面上进行分布，并且由此改善了流动通过填装床的流体的均匀性。由此，多个入口330代表了分配板是如何可以在填装床横截面上提供多个孔用于产生更均匀的流动。
图8显示根据一个或多个实施方式的细胞培养系统400。系统400包括装纳了根据本文公开的一个或多个实施方式的细胞培养基质的生物反应器402。生物反应器402可以流体连接到介质调理容器404，以及系统能够将调理容器404中的细胞培养介质406供给到生物反应器402。介质调理容器404可以包括传感器以及用于生物加工行业中典型生物反应器中存在的用于悬浮批料、进料批料或者灌注培养物的控制组件。这些包括但不限于DO氧传感器、pH传感器、氧产生器/气体喷射单元、温度探针以及营养物添加和基底添加端口。可以通过用于N2、O2和CO2气体的气流控制器来控制供给到喷射单元的气体混合物。介质调理容器404还含有用于介质混合的叶轮。通过上文列出的传感器进行测量的所有介质参数都可以通过介质调理控制单元418进行控制，所述介质调理控制单元418与介质调理容器404联通且能够测量和/或调节细胞培养介质406的状态至所需水平。如图8所示，介质调理容器404提供成与生物反应器容器402分开的容器。这对于能够在与细胞进行培养的地方分开要调理介质然后将经过调理的介质供给到细胞培养空间而言是有利的。然而，在一些实施方式中，可以在生物反应器容器402中进行介质调理。
将来自介质406调理容器404的介质经由入口408传递到生物反应器402，所述入口508也可以包括用于细胞接种液对细胞进行接种和开始培养的注入端口。生物反应器容器402还可以包括一个或多个出口410，细胞培养介质406通过所述出口410离开容器402。此外，细胞或者细胞产品可以通过出口410输出。为了对来自生物反应器402的流出流的内含物进行分析，可以在生产线中提供一个或多个传感器412。在一些实施方式中，系统400包括用于控制进入到生物反应器402中的流的流动控制单元414。例如，流动控制单元414可以接收来自一个或多个传感器412(例如，O2传感器)的信号，并且基于信号通过向位于生物反应器402的入口408的上游的泵416(例如，蠕动泵)传递信号来调节进入到生物反应器402中的流。因此，基于通过传感器412测得的一个参数或者参数组合，泵416可以控制进入到生物反应器402中的流动从而获得所需的细胞培养条件。
通过信号加工单元414控制介质灌注速率，所述信号加工单元410收集并对比来自介质调理容器404的传感器信号与位于填装床生物反应器出口510处的传感器。因为穿过填装床生物反应器402的介质灌注的填装流动特性，沿着填装床建立起了营养物、pH和氧梯度。可以通过根据图11中的流程图以操作方式连接到蠕动泵416的流动控制单元414来自动控制生物反应器的灌注流速。
本公开内容的一个或多个实施方式提供了不同于常规方法的细胞接种步骤。在常规方法中，具有常规基质的填装床填充了培养介质以及将浓缩接种物注入到介质循环回路中。细胞悬液以增加的流速泵送通过生物反应器以降低经由捕获在常规填装床基质上进行细胞接种的非均匀性。在此类常规方法中，以提升的流速在循环回路中泵送细胞可能持续数小时直到大部分的细胞被捕获到填装床生物反应器中。然而，由于常规填装床生物反应器的非均匀深床过滤特性，细胞在填装床内的分布是不均匀的，在生物反应器的入口区域具有较高的细胞密度而在生物反应器的出口区域具有较低的细胞密度。
相反地，根据本公开内容实施方式，与生物反应器中的培养室的空体积等体积的细胞接种物通过生物反应器402的入口408处的细胞接种物注入端口直接注入填充床中(图8)。然后，由于本文所述的细胞培养基质中存在的均匀且连续的流动路径，细胞悬液均匀地分布在填装床内。为了防止初始接种阶段时由于重力导致细胞沉降，可以在接种物注入之后立即开始介质灌注。灌注流速维持在低于预先设定的阈值从而平衡重力并避免从填装床生物反应器洗刷掉细胞。因而在初始细胞附着阶段，细胞在填充床内轻轻翻滚，并且实现了可用基材表面上的细胞的均匀分布和附着。
取决于所需系统，细胞培养基质可以以多种配置布置在培养室内。例如，在一个或多个实施方式中，系统包括基材的一层或多层，宽度在培养室内的受限定的细胞培养空间的宽度上延伸。多层基材可以以这种方式堆叠至预定高度。如上文所讨论的那样，基材层可以布置成使得一层或多层的第一和第二侧垂直于培养介质穿过培养室内的受限定的培养空间本体流动方向，或者一层或多层的第一和第二侧可以平行于本体流动方向。在一个或多个实施方式中，细胞培养基质包括相对于本体流动处于第一取向的一个或多个基材层，以及处于不同于第一取向的第二取向的一个或多个其他层。例如，各种层可以具有平行于或垂直于本体流动方向(或者之间的一些角度情况下)的第一和第二侧。
在一个或多个实施方式中，细胞培养系统包括填装床构造的细胞培养基材的多个离散片材，其中，基材的片材长度和或宽度相对于培养室而言是小的。如本文所用，当基材的片材长度和/或宽度约为培养空间的长度和/或宽度的50％或更小时，认为基材的片材长度和/或宽度相对于培养室而言是小的。因而，细胞培养系统可以包括以所需布置填装到培养空间中的多片基材。基材片材的布置可以是随机或者半随机的，或者可以具有预定的规则或对齐，例如片材取向是基本相似的取向(例如，相对于本体流动方向为水平、垂直或者0°与90°之间的角度)。
如本文所用，“受限定的培养空间”指的是培养室内被细胞培养基质占据并且其中要进行细胞接种和/或培养的空间。受限定的培养空间可以填充近似整个培养室，或者可以占据培养室内的一部分空间。如本文所用，“本体(bulk)流动方向”定义为在细胞培养过程中和/或在培养介质流入或流出培养室的过程中，流体或培养介质的本体质量(bulk mass)流动穿过细胞培养基质或在细胞培养基质上方流动的方向。
在一个或多个实施方式中，通过固定机制将细胞培养基质固定在培养室内。固定机制可以将一部分的细胞培养基质固定到围绕机制的培养室的壁或者在培养室的一端固定到室壁。在一些实施方式中，固定机制将一部分的细胞培养基质粘附到穿过培养室的元件，例如平行于培养室的纵轴的元件，或者粘附到垂直于纵轴的元件。然而，在一个或多个其他实施方式中，细胞培养基质可以容纳在培养室内而没有以固定的方式附着到室或生物反应器容器的壁。例如，可以通过培养室或者室内的其他结构元件的边界来容纳基质，从而在没有将基质以固定的方式固定到那些边界或结构元件的情况下将基质保持在生物反应器容器的预定区域中。
一些实施方式的一个方面提供了卷型瓶构造的生物反应器容器。培养室能够含有根据本公开内容所述一个或多个实施方式的细胞培养基质和基材。在卷型瓶构造中，生物反应器容器可以以可运行的方式附连到使得生物反应器容器绕着容器的中心纵轴移动的装置。例如，生物反应器容器可以绕着中心纵轴转动。转动可以是连续的(例如，以一个方向连续)或者不连续的(例如，单方向或交替方向的间歇旋转，或者前后旋转方向的摆动)。在运行时，生物反应器容器的转动导致室内的细胞和/或流体移动。这种移动可以被视为是相对于室的壁进行的。例如，随着生物反应器容器绕其中心纵轴转动，重力可以导致流体、培养介质和/或未粘附的细胞留在朝向室的靠下部分。然而，在一个或多个实施方式中，细胞培养基质基本上相对于容器是固定的，并且因而随着容器进行转动。在一个或多个实施方式中，细胞培养基质可以是未附连的并且随着容器转动自由地移动到相对于容器的所需程度。细胞可以粘附到细胞培养基质，而容器的移动允许细胞同时接收到暴露于培养室内的细胞培养介质或液体以及氧气或其他气体。
通过使用根据本公开内容实施方式的细胞培养基质(例如，包含织造或网基材的基质)，为卷型瓶容器提供了可用于粘附细胞来附着、增殖和功能化的表面积增加。具体来说，在卷型瓶中使用单丝线聚合物材料的织造网的基材，相比于标准卷型瓶，表面积可以增加约2.4至约4.8倍，或者约10倍。如本文所讨论的那样，网基材的每个单股丝线能够呈现其自身作为用于粘附细胞附着的2D表面。此外，多层网可以布置在卷型瓶中，导致总可用表面积增加到标准卷型瓶的约2至20倍。因而可以通过添加本文公开的改进的细胞培养基质，在对现有操作基础设施和加工步骤的影响最小化的情况下，对现有的卷型瓶设备和加工(包括细胞接种、介质交换和细胞收获)进行改动。
生物反应器容器任选地包括能够附连到入口和/或出口装置的一个或多个出口。通过所述一个或多个出口，液体、介质或细胞可以被供给到室或者从室去除。容器中的单个端口可以起到入口和出口这两者的作用，或者可以提供多个端口作为专门的入口和出口。
一个或多个实施方式的填装床细胞培养基质可以由织造细胞培养网状基材构成，没有布置在细胞培养基质中或者与细胞培养基质穿插的任何其他形式的细胞培养基材。也就是说，本公开内容实施方式的织造细胞培养网状基材是有效的细胞培养基材，不需要用于现有方案中的无规非织造基材类型。这实现了简化设计和建构的细胞培养系统，同时提供了具有本文讨论的涉及流动均匀性、可收获性等的其他优点的高密度细胞培养基材。
如本文所讨论的那样，提供的细胞培养基材和生物反应器系统提供了许多优点。例如，本公开内容的实施方式可以支撑任意多种病毒载体的产生(例如AAV(所有血清型)和慢病毒)，并且可以用于体内和体外基因治疗应用。均匀的细胞接种和分布使得每个容器的病毒载体产率最大化，并且设计实现了存活细胞的收获，这对于采用同一平台的多膨胀阶段构成的接种序列会是有用的。此外，本文的实施方式可以从工艺发展规格到生产规格是可规模化的，这最终节约了开发时间和成本。本文公开的方法和系统还实现了细胞培养工艺的自动化和控制，以使得载体产率最大化并改善可重复性。最后，达到病毒载体生产水平规格(例如，每批次1016至1018AAV VG)所需的容器数量可以相比于其他细胞培养方案得到极大减少。
实施方式不限于绕着中心纵轴转动的容器。例如，容器可以绕着不是相对于容器居中放置的轴转动。此外，转轴可以是水平轴或垂直轴。
实施例
为了对本公开内容的细胞培养基质、细胞培养系统和相关方法的功效进行验证，根据以下实施例对细胞的接种和培养进行研究。
实施例3
在实施例3中，在填装床生物反应器系统中培养细胞，以及对生物反应器中生产的腺相关病毒(AAV)进行HEK293T细胞的转染。在实施例3中使用与实施例2相同的生物反应器设定(参见图6)。填装床含有100个PET网碟(表1的网C)。每个碟的直径约为20mm，以及床高度约为25mm，总计具有约760cm2的二维表面积可用于细胞附着和增殖。为了对生物反应器进行接种，将8mL的HEK293T细胞悬液(200万个细胞/mL)直接注射到填装床中。将含有约50mL介质的介质储存容器流体连接到生物反应器容器。持续72小时，细胞在Dulbecco的改良Eagle介质(DMEM)培养基(具有+10％ FBS和+6mM L-谷氨酰胺)中进行培养。当储存容器中的介质的pH下降到低于7时，用新鲜介质供给替换介质。相应地调整灌注流速来维持pO2≥50％饱和，以及生物反应器出口处pH≥7。在72小时后，用50mL的/>DMEM(15-018)(具有+10％ FBS和+6mM L-谷氨酰胺)替换培养基，添加转染反应剂达到1:2比例的2ug/mL的AAV2和PEIpro的最终浓度。在接下来的72小时期间，如果储存瓶中的pH下降到低于7，则将培养基更换为新鲜供给。相应地调整灌注流速来维持pO2≥50％饱和以及生物反应器出口处pH≥7。采用5X TrypLE收获细胞。通过荧光流式细胞仪分析转染效率，以及通过ELISA和PCR检测分析病毒颗粒和病毒基因组滴度。表2呈现了细胞培养结果，其中，“VP”指的是病毒蛋白，而“GG”指的是基因组拷贝。
表2：填装床生物反应器中生产的HEK 293T细胞和AAV的转染结果。
下表4以包含不同直径(29mm和60mm)的生物反应器容器的多次实验情形显示上述结果。数据显示较小的(例如，29mm直径，1600cm2表面积)与较大的(例如，60mm直径，6780cm2表面积)容器和/或填装床基质之间良好的可规模性。
表4：生物反应器尺寸上的一致结果。
如上文所讨论的那样，本公开内容的实施方式可以提供能够在较小的实践占地面积中培养高密度的细胞的填装床细胞培养基质和/或生物反应器。例如，上表3和4的实例中的60mm细胞培养基质具有约6870cm2的表面积。作为参照，康宁(Corning)具有约1720cm2的表面积。表3和4的60-mm直径细胞培养基质可以装纳在比HYPER烧瓶小的生物反应器中，但是仍然能够导致收获时较高的细胞数，每个容器更高的总基因组拷贝数(GC或者病毒基因组(VG)。图9A-C显示来自表3和4的具有60-mm直径基材的两种生物反应器容器的这些数字与HYPER烧瓶的对比，还显示了GC每cm2，这尽管低于HYPER烧瓶，但是通过更高的表面积进行了弥补。
实施例6
为了进一步检查本公开内容的基材的流动均匀性和渗透性，采用建模来对三维细胞培养基质的孔隙度进行理解。在紧密填装构造和疏松填装构造中来对织造PET网基材的片材进行建模，这代表了进行建模的特定网片材的基材堆叠的填装密度的上限和下限。具体来说，图10A显示紧密填装构造的平面图，而图10B显示相同堆叠的横截面侧视图。图11A和11B分别显示疏松填装构造的平面图和横截面图。对于每种建模构造，样品细胞600、602限定为围绕了相同体积的网材料，从而对每单位体积的样品细胞600、602的孔隙度进行分析。在图12A(紧密填装堆叠)和12B(疏松填装堆叠)中显示了每种细胞中的开放空间的建模体积。以开放空间的百分比计，孔隙度约为40.8％(疏松填装细胞)和61.4％(紧密填装细胞)。因为图10A-11B中的建模堆叠代表了给定网材料的最紧密和最疏松填装的构造，40.8％和61.4％的孔隙度是这种特定网材料的孔隙度的上限和下限。取决于对齐情况以及当采用这种网材料时的真实填装密度，孔隙度可落在这些极值之间。然而，本公开内容的实施方式不限于这个孔隙度范围，因为细胞培养容器中的基材的网尺寸和布置的变化会导致不同的孔隙度范围。
除了建模孔隙度范围，还采用PET织造网基材的真实填装床对孔隙度进行测量。用100个碟进行测量，每个的直径为22.4mm，以无规对齐方式进行堆叠。100个碟的堆叠总重量是5.65±0.2g。采用如下方程式来计算堆叠的PET材料的体积(假定PET密度为1.38g/cm3)：
VPET ＝ (堆叠总重量)/(PET密度) 等式2
由此计算得到5.65g的PET(100个22.4mm直径的碟)的PET体积VPET是4.1mL。然后，采用如下方程式计算包含了PET体积VPET和堆叠中的开放空间体积的堆叠的总体积(V总)：
V总 ＝ π × (0.5 × 碟直径) × (堆叠床高度) 等式3
100个碟堆叠的堆叠高度为25±1mm。因此，对于22.4mm的碟直径，得到V总为9.85mL。因此，可以采用如下方式计算堆叠床的孔隙度：
孔隙度＝(V总–VPET)/V总等式4
采用等式4和上述数值，计算得到孔隙度为58.4％，这在模型预测的范围内。
实施例7
在实施例7中，对各种PET织造网基材材料的渗透性进行对比。表5显示这个对比中使用的PET网样品。
表5：用于渗透性对比的网基材。
图23显示网样品A至F的照片。图14显示每个网样品A-F的渗透性的结果。图15显示样品A-C的压降测试的结果，其中，以具有不同布置和填装密度的堆叠中的样品A进行压降测试。虚线代表网样品A的最紧密和最疏松填装密度，样品A1是比样品A2更疏松填装的堆叠。相对于Q/A对压降以每厘米的压力(Pa)变化来绘制压降。
实施例8
如本文所讨论的那样，本公开内容的实施方式提供了细胞培养基材、生物反应器系统以及细胞或细胞副产物的培养方法，它们是可规模化的并且可以用于提供细胞接种序列来逐渐增加细胞种群。现有细胞培养方案中的一个问题在于无法将给定的生物反应器系统技术作为接种序列的一部分。相反地，细胞种群通常在各种细胞培养基材上规模化。这会对细胞种群产生负面影响，因为相信细胞变得适应某些表面并且转移到不同类型的表面会导致效率低下。因而会希望使得细胞培养基材或技术之间的此类转染最小化。通过在接种序列上使用相同的细胞培养基材(通过本公开内容的实施方式那样实现)，增加了细胞种群的规模化的效率。例如，接种序列可以从接种到第一容器(例如来自康宁公司的T175烧瓶)中的起始细胞的小瓶开始，然后接种到第二容器(例如来自康宁公司的)中，然后进入根据本发明实施方式的工艺开发规模的生物反应器系统(基材的有效表面积约为20,000cm2)，以及然后进入根据本发明实施方式的更大的生物反应器中试系统(基材的有效表面积约为300,000cm2)。在这个接种序列的最后，细胞可以接种到根据本公开内容实施方式的生产规模生物反应器容器，表面积是例如约5,000,000cm2。然后，当完成细胞培养时，可以进行收获和纯化步骤。可以通过用洗涤剂(例如Triton X-100)进行原位细胞裂解或通过机械裂解来完成收获；并且可以根据需要执行进一步的下游加工。
在接种序列中(例如，从工艺开发水平到中试水平，或者甚至到生产水平)使用相同的细胞培养基材的益处包括：在接种序列和生产阶段中细胞习惯于相同表面所获得的效率；在接种序列阶段过程中减少手动打开操作的数量；由于如本文所述的均匀细胞分布和流体流动，更高效地使用填装床；以及在病毒载体收获过程中使用机械或化学裂解的灵活性。
实施例9
为了对本公开内容的基材的潜在增加的病毒生产产量进行理解，将PET织造网基材的性能与和中所用基材相似的基材材料进行对比。表6总结了简化的生物反应器中采用这些基材生产得到的总病毒颗粒。
测试编号 PET织造网 非织造基材
1 6.99E13 7.18E12
2 3.65E13 e
3 7.72E13 1.01E13
4 4.63E13 n/a
平均值 6.01E13 1.01E13
表6：采用PET织造网基材材料和非织造基材生产得到的病毒颗粒。
从表6的结果可以计算得到生产特定数量的病毒颗粒所需的基材材料的体积。例如，如果规模病毒载体生产的目标是3.00E+18个病毒颗粒，如图7所示，则所需的PET织造网的体积约为所需的非织造基材量的1/7。
表7：PET织造网基材材料和非织造基材的对比
实施例10
为了验证通过本公开内容的开放网基材的均匀流动，对通过填装床生物反应器的流体流速进行建模。图16A显示容器620的建模结果，其具有直径为6cm的PET织造网碟的填装床区域622，以及10cm的床高度且有357个PET织造网基材的碟构成。根据所示规格显示流速大小。尽管流速在靠近入口624和出口626处较高，但是在整个填装床区域622(包括沿着填装床的高度和穿过宽度)的速度是一致的。在图16B中以放大图显示由虚线628所示的区域，其显示一旦流体进入细胞培养基质的均匀开放结构，则速度相对恒定。这个实例中的填装床等价于约24,214cm2的总表面。考虑到模型中显示的均匀流动，这个表面积暴露于非均匀流动(定义为相对于平均速度偏差>2.5％)的百分比为0％。
为了对当容器尺寸规格放大时的这种均匀流动的延续程度情况进行验证，进行与图16A相似的额外建模，但是采用具有较宽填装床的逐步更宽的容器。表8显示这些更大容器的非均匀流动的百分比。如所示，甚至当反应器规格放大到60cm直径时，非均匀流动的量保持约为基材表面积的百分之一的二分之一或更小。这显示不同于现有的细胞培养基材，本文所述的均匀开放织造网结构能够在全部整个填装床上具有均匀流动。
填装床直径(cm) 总SA(cm2) 非均匀流动的SA的％*
6(100个碟) 6,780 0.00
6(357个碟) 24,214 0.00
20 269,047 0.00
30 605,357 0.17
40 1,076,190 0.52
60 2,421,428 0.45
表8：具有各种直径的填装床的生物反应器的建模流动均匀性。
实施例11
为了更好地理解本公开内容的织造网基材与现有市场上的非织造无规基材之间的渗透性差异，进行实验来测量这些材料的渗透性。具体来说，将PET织造网与非织造基材材料以及市售可得的相似的非织造无序基材进行对比。对于如下进行渗透性测量：垂直于堆叠碟的填装床的织造网基材层的流动，以及穿过非织造基材的无规填装床，以及穿过非织造基材材料的固定片。非织造网具有约20μm的纤维直径，约0.18mm的厚度，以及91％的孔隙度。织造网基材具有约160μm的直径和250μm的开口直径。
为了测量渗透性，测试用水来模拟细胞培养介质。采用蠕动泵将流速控制在15-50mL/cm2/分钟之间，以模拟基材在生物反应器中通常经历的流动条件。由于测试条件下样品经受的低压降，使用压力计测量样品上的压力差。由于不同的基材类型和填装方法，以略微不同的方式保持基材。
如图17A所示，为了测量非织造网上的流动情况，将非织造基材700切割为12mm直径碟，以及将10层基材保持在用O型环密封的两个开放圆柱室之间。压力计702、704直接连接到开放室来测量非织造基材上的流体的压降。
为了测量通过无规填装非织造网的流动，如图17B所示，将基材切割为5mm x 25mm条，并填装到29mm直径圆柱室中产生填装床710。总计3g的网条填装到30mL体积，得到约45mm的床高度。在填装条的每侧，使用两个开放织造网的碟来限定填装床。在床的每侧具有约3mm厚的开放空间，其中，使用两片厚度为10mm的多孔材料716的片材来对容器的入口和出口处的流动进行再分布。压力计712和714测量填装床710上的压降。
为了测量通过开放织造网的流动，如图17C所示，将网基材切割成29mm直径碟以装配到圆柱室中作为填装床720。层-层填装总计170个碟，直到实现45mm的床高度。每层网中的纤维取向没有彼此对齐。流动是穿过网碟(即，垂直于碟表面)。在床的每侧具有约3mm厚的开放空间，然后使用两片厚度为10mm的多孔材料726的片材来对入口和出口处的流动进行再分布。压力计722和724测量填装床720上的压降。
采用等式(5)计算渗透性：
式中，Q＝流速；K＝渗透性；A＝样品或填装床上的面积；dP＝测试样品或填装床上的压降；μ＝水粘度；以及dL＝总样品厚度或者填装床高度
最终计算得到的渗透性总结于图18。结果显示，非织造网具有低得多的渗透性，约为7.5x10-12 m2，这约为开放织造网上的渗透性的1/50。当将非织造网切割成小条并无规填装时，他们的渗透性会极大地增加并变得类似于开放织造网。相信这种渗透性的增加是由于上文所讨论的通道效应所导致的流动主要绕着网条旁路通过的结果。
基于测量得到的渗透性，对通过和绕着非织造网和开放织造网的流动进行模拟。采用ANSYS Fluent v19.2软件包完成模拟。出于示意性目的，对两种场景进行研究：基材材料的表面是表面相对于流动方向以(i)90°和(ii)45°对齐，如图19A和19B所示。在这两种情况下，当同一水平上的相邻网之间的间隔为5mm时，流动都是主要绕着网且仅约0.02-0.005％的流动穿过网。这会产生网后面的明显的死区，并且导致穿过填装床的非均匀流动。当非织造网片材没有完美对齐垂直于流动方向时，非均匀性变得更严重。
在开放织造网的情况下，开放结构允许容易地流动通过网并且没有在开放网层后面产生死区。相信织造网的规则结构还对穿过每层的均匀流动分布具有贡献作用。这进而实现了流入通过整个填装床的均匀流动。图20A(非织造网片材)和20B(开放织造网基材)清楚地显示了对比，它们显示了靠近基材材料边缘的流动的放大图。在图20A和20B的情况下，在所有六个方向上的相邻网片材之间的间隙缩短至1mm，并且仅对一个此类网片材的周期域进行模拟。图20A显示由于非织造网具有非常低的渗透性，因为流动主要是绕过基材旁路通过，并且非常少的流动穿过基材自身。仅0.17％的总质量流动穿过非织造网。相反地，开放织造网具有高得多的渗透性，从而更多的流动通过其，如图20B所示。比较两种情况下的颜色条时，通过间隙的捷径流变得更弱。对于开放织造网，存在通过基材的高达10.7％的总质量流速，这证实了即使其以具有间隙的方式填装时，开放织造网仍然具有优异的渗透性。
如本文所述，可以将多个织造网碟无规填装，碟之间的对齐情况具有不计其数的变化形式。然而，基于填装密度(即，最紧密和最疏松填装)，可能的对齐范围可以被降低到两种理论极限。这些两种理想或边界条件实现了将大的填装床简化成为小的周期域。采用这种模型，发现从最紧密到最疏松填装极限，穿过基材的渗透性相差约10倍。上面实验测量得到的渗透性数据正好落在这个范围内，这是一个良好的验证点。模型还显示，在两种填装条件下，流动方向上的渗透性类似于横向方向上的情况。这暗示了本公开内容的织造网较不可能如同我们在非织造基材中发现的那样改变流动方向，并且使得流动更均匀，而无论基材取向如何。通过以下实施例种的停留时间分布(RTD)测量进一步证实了本公开内容基材的流动均匀性改进。
实施例12
停留时间分布(RTD)是对容器中的流动进行研究的有用工具。它的理论、测量和分析可参见教科书：Levenspiel,O.，化学反应工程(Chemical Reaction Engineering)，第三版，1999，纽约州威利市。图21显示测量RTD的设定的示意图。室是圆柱形状，直径为29mm且总计36mL填装床体积，将3.6g的非织造网或者200层的开放织造网填充到容器室中。使用1:2000稀释的McCormick绿色食物颜料作为测量的追踪剂。使用具有Flowcell的UV-vis来监测追踪剂浓度的变化。所有实验使用22.5mL/mL的流速。室首先填充水。在切换到绿色染料之后，记录OD的变化。结果如表22所示。
使用如下方程式来计算平均停留时间t(等式(6))和方差σ(等式(7))：
式中，F是步阶式追踪剂响应的标准化浓度。表9总结了从测量计算得到的平均停留时间和方差。开放织造网显示更短的平均停留时间，这可能是由于较低的孔隙度和较少的死区所导致的。在开放织造网的填装床中，孔隙度约为60％，而非织造网的孔隙度则是约为93％的更高孔隙度。在非织造网的填装床中检测到的高得多的标准差暗示了非织造网中的流动较不均匀或者较不理想。
织造网 非织造网
平均停留时间(分钟) 1.37 1.97
方差(分钟2) 0.21 0.84
标准差 0.11 0.22
表9：测量的非织造和开放织造网的平均停留时间和方差。
采用上文所述相同设定，测量了其他市售可得填装床基材材料的RTD。基于供应商的建议和避免疏松填装来计算填装密度。如图23所示是染料浓度随着流动通过容器的水体积的变化。使用测量得到的染料变化来计算它们的标准差，如前面段落所述的那样。计算得到的方差列于表10。
填装密度 标准差
织造网 1.8mL/g 0.11
市售可得基材1 7.5mL/g 0.94
市售可得基材2 6mL/g 0.24
市售可得基材3 10mL/g 0.34
表10：不同市售可得填装床基材与本公开内容的织造网基材的标准差。
上文的渗透性和停留时间实验显示用于现有生物反应器中的非织造无规细胞培养基材类型具有比根据本公开内容基材低得多的渗透性。取决于相对于非织造基材的流动方向，这些非织造基材还具有不同的渗透性或流速，而本公开内容的基材展现出基本上各向同性的流动行为。相比于本公开内容的均匀织造网基材，由于非织造基材的非均匀流动和较低的停留时间，营养物和转染反应物会需要更久才能到达基材表面上的细胞或者达到基材层的另一侧。除此之外，无规填装的非织造基材的渗透性更高，这表明存在强烈的通道效应并由此导致细胞或营养物的不均匀传递。
示意性执行方式
以下是本文公开主题的执行方式的各种方面的描述。每个方面可以包括本文公开主题的各种特征、特性或优点中的一个或多个。执行方式旨在阐述本文公开主题的一些方面，并且不应该视为所有可行执行方式的综合性或排他性描述。
方面1属于用于细胞培养的填装床生物反应器系统，该系统包括：细胞培养容器，其包含至少一个内部储器；与储器流体连接的入口，和与储器流体连接的出口；以及布置在储器中且排布成固定床的细胞培养基质，所述细胞培养基质包括构造成使得细胞与其粘附的基材，其中，细胞培养基质构造成保持整个细胞培养基质上的储器中的均匀流动。
方面2属于方面1的填装床生物反应器系统，其中，细胞培养基质包括多层基材，其中，多层基材中的每层包括基本规则且均匀的物理结构和孔隙度。
方面3属于方面1的填装床生物反应器系统，其中，细胞培养基质包括基本均匀的孔隙度。
方面4属于方面1的填装床生物反应器系统，其中，均匀流动包括层状流。
方面5属于方面1的填装床生物反应器系统，其中，储器由长度和宽度限定，所述长度从储器与入口相邻的第一端延伸到储器与出口相邻的第二端，细胞培养基质具有基本在储器的宽度上延伸的宽度。
方面6属于方面2的填装床生物反应器系统，其中，多层基材包括堆叠在储器中的多个基材碟。
方面7属于方面6的填装床生物反应器系统，其中，多个基材碟的堆叠构造成展现出在所述多个基材碟中的每一个的宽度上的基本均匀流体流动。
方面8属于方面6的填装床生物反应器系统，其中，多层基材包括限定了孔隙度的多个开口，所述多个开口在所述多个基材碟的每个碟中以规则或均匀式样排布。
方面9属于方面1的填装床生物反应器系统，其中，多层基材包括以下至少一种：模制聚合物栅格、3D打印聚合物栅格以及织造基材。
方面10属于方面9的填装床生物反应器系统，其中，多层基材包括具有多根交织纤维的织造基材，表面构造成与细胞粘附，所述多根交织纤维限定了多个开口。
方面11属于方面10的填装床生物反应器系统，其中，细胞培养基质包括多个织造基材，每个织造基材具有第一侧和第二侧，所述第二侧与第一侧相反且与第一侧相距为织造基材厚度。
方面12属于方面11的填装床生物反应器系统，其中，所述多个织造基材排布成堆叠，从而使得基材的第一和第二侧中的一个面朝相邻基材的第一或第二侧。
方面13属于方面11的填装床生物反应器系统，其中，所述多个基材中的至少一部分没有被间隔物材料或阻隔物分开，或者是彼此物理接触。
方面14属于方面11的填装床生物反应器系统，其中，细胞培养基质布置在生物反应器容器中，从而使得通过生物反应器容器的介质的本体流动方向垂直于第一和第二侧。
方面15属于方面1的填装床生物反应器系统，其中，细胞培养基质在至少90％的细胞培养基质的表面上展现出均匀流体流动。
方面16属于方面1的填装床生物反应器系统，其中，细胞培养基质展现出细胞培养基质在流体流动方向的长度上的塞式流动。
方面17属于方面1的填装床生物反应器系统，其中，细胞培养基质展现出大于3.4x10-10m2的渗透性。
定义
“全合成”或“完全合成”是指完全由合成源材料组成且不含任何源自动物或动物源材料的细胞培养制品，例如微载体或培养容器表面。所公开的全合成细胞培养制品消除了异种污染的风险。
“包括”、“包含”或类似术语意为包括但不限于，即内含而非排他。
“用户”是指使用本文公开的系统、方法、制品或试剂盒的那些人，包括培养细胞以收获细胞或细胞产品的那些人，或者使用根据本文实施方式培养和/或收获的细胞或细胞产物的那些人。
本文所述的实施方式中用来对例如组合物中成分的量、浓度、体积、加工温度、加工时间、产率、流速、压力、粘度和类似数值及其范围或者组件的尺寸以及类似数值及其范围进行修饰的“约”是指可能发生的数值量的改变，例如，源自制备材料、组合物、复合体、浓缩物、组件部件、制品或使用制剂所用的常规测量和操作过程；源自这些过程中的偶然性误差；源自用来实施所述方法的起始材料或成分的制造、来源或纯度的差异；以及类似因素。术语“约”还包括由于具有特定初始浓度或混合物的组合物或制剂的老化而不同的量，以及由于混合或加工具有特定初始浓度或混合物的组合物或制剂而不同的量。
“任选的”或“任选地”表示随后描述的事件或情形会或不会发生，而且该描述包括事件或情形发生的实例和事件或情形不发生的实例。
除非另外说明，否则本文所用的不定冠词“一个”或“一种”及其相应的定冠词“该”表示至少一(个/种)，或者一(个/种)或多(个/种)。
可采用本领域技术人员熟知的缩写(例如，表示小时的“h”或“hr”，表示克的“g”或“gm”，表示毫升的“mL”以及表示室温的“rt”，表示纳米的“nm”以及类似缩写)。
在组分、成分、添加剂、尺度、条件和类似方面公开的具体和优选的数值及其范围仅用于说明，它们不排除其他限定数值或限定范围内的其他数值。本公开内容的系统、试剂盒以及方法可以包括本文所述的任何数值或数值、具体数值、更具体的数值和优选数值的任何组合，包括明示或暗示的中间值和范围。
除非另有表述，否则都不旨在将本文所述的任意方法理解为需要使其步骤以具体顺序进行。因此，当方法权利要求实际上没有陈述为其步骤遵循一定的顺序或者其没有在权利要求书或说明书中以任意其他方式具体表示步骤限于具体的顺序，都不旨在暗示该任意特定顺序。
对本领域的技术人员而言，显而易见的是可以在不背离所示实施方式的精神或范围的情况下作出各种修改和变动。因为本领域的技术人员可以想到所揭示的实施方式的融合了实施方式的精神和实质的各种改良、组合、子项组合和变化，应认为所揭示的实施方式包括所附权利要求书范围内的全部内容及其等同内容。

Claims (17)

1.一种用于培养细胞的填装床生物反应器系统，该系统包括：
细胞培养容器，其包含至少一个内部储器、流体连接到储器的入口和流体连接到储器的出口；以及
设置在储器中且排布成固定床的细胞培养基质，所述细胞培养基质包括基材，所述基材构造成与细胞粘附，
其中，细胞培养基质构造成维持整个细胞培养基质的储器中的均匀流动。
2.如权利要求1所述的填装床生物反应器系统，其中，细胞培养基质包括多层基材，其中，多层基材中的每层包括基本规则且均匀的物理结构和孔隙度。
3.如权利要求1所述的填装床生物反应器系统，其中，细胞培养基质包括基本均匀孔隙度。
4.如权利要求1所述的填装床生物反应器系统，其中，均匀流动包括层状流。
5.如权利要求1所述的填装床生物反应器系统，其中，储器由长度和宽度限定，所述长度从储器与入口相邻的第一端延伸到储器与出口相邻的第二端，细胞培养基质具有基本在储器的宽度上延伸的宽度。
6.如权利要求2所述的填装床生物反应器系统，其中，多层基材包括堆叠在储器中的多个基材碟。
7.如权利要求6所述的填装床生物反应器系统，其中，多个基材碟的堆叠构造成展现出在所述多个基材碟中的每一个的宽度上的基本均匀流体流动。
8.如权利要求6所述的填装床生物反应器系统，其中，多层基材包括限定了孔隙度的多个开口，所述多个开口在所述多个基材碟的每个碟中以规则或均匀式样排布。
9.如权利要求1所述的填装床生物反应器系统，其中，多层基材包括以下至少一种：模制聚合物栅格、3D打印聚合物栅格以及织造基材。
10.如权利要求9所述的填装床生物反应器系统，其中，多层基材包括具有多根交织纤维的织造基材，表面构造成与细胞粘附，所述多根交织纤维限定了多个开口。
11.如权利要求10所述的填装床生物反应器系统，其中，细胞培养基质包括多个织造基材，每个织造基材具有第一侧和第二侧，所述第二侧与第一侧相反且与第一侧相距为织造基材厚度。
12.如权利要求11所述的填装床生物反应器系统，其中，所述多个织造基材排布成堆叠，从而使得基材的第一和第二侧中的一个面朝相邻基材的第一或第二侧。
13.如权利要求11所述的填装床生物反应器系统，其中，所述多个基材中的至少一部分没有被间隔物材料或阻隔物分开，或者是彼此物理接触。
14.如权利要求11所述的填装床生物反应器系统，其中，细胞培养基质布置在生物反应器容器中，从而使得通过生物反应器容器的介质的本体流动方向垂直于第一和第二侧。
15.如权利要求1所述的填装床生物反应器系统，其中，细胞培养基质在至少90％的细胞培养基质的表面上展现出均匀流体流动。
16.如权利要求1所述的填装床生物反应器系统，其中，细胞培养基质展现出细胞培养基质在流体流动方向的长度上的塞式流动。
17.如权利要求1所述的填装床生物反应器系统，其中，细胞培养基质展现出大于3.4x10-10m2的渗透性。
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