CN116515663A - 乳酸菌组合物及其用于制备抑制抗药性肠杆菌的口服组合物的用途 - Google Patents

乳酸菌组合物及其用于制备抑制抗药性肠杆菌的口服组合物的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种乳酸菌组合物及其用于制备抑制抗药性肠杆菌的口服组合物的用途。上述乳酸菌组合物包含乳酸菌做为有效成分，其中乳酸菌可例如为由鼠李糖乳杆菌J J 101、副干酪乳杆菌J J 102、胚芽乳酸菌J J 103及上述任意组合所组成的组。此乳酸菌组合物经口投予受试对象后，可抑制抗药性肠杆菌的生长，故有潜力应用于预防、改善及/或治疗抗药性肠杆菌感染。

Description

乳酸菌组合物及其用于制备抑制抗药性肠杆菌的口服组合物 的用途
【技术领域】
本发明是有关于一种乳酸菌组合物，特别是关于一种乳酸菌组合物其用于制备抑制抗药性肠杆菌之口服组合物的用途。
【背景技术】
肠杆菌(Enterobacteriaceae)为革兰氏阴性菌，属于γ-变形菌纲肠杆菌目。肠杆菌普遍存在环境(如：土壤及水)及生物体(如：动物及植物)中，且是人体的肠道菌之一。肠杆菌包含有益的共生菌，亦包含伺机性感染的病原菌。此些病原菌可引发赤痢、肠热症、尿路感染、伤口感染、肝脓疡、败血症、脑膜炎、肺炎等疾病，是院内感染及社区感染的主要病原菌之一。
抗生素是治疗肠杆菌感染的主要药物，其中碳青霉烯(carbapenem)类抗生素的抗菌范围广泛，且抗药菌种较少，是目前对抗多重抗药性的肠杆菌的最后防线。然而，近年来，克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)等肠杆菌演化出降低对碳青霉烯类抗生素的感受性的方法，如：产碳青霉烯酶肠杆菌(carbapenemase-producing Enterobacteriaceae，CPE)表达碳青霉烯酶，能分解碳青霉烯类抗生素，从而增加受感染患者的致病率及死亡率，是目前全球公卫重大威胁之一。
有鉴于抗生素等药物对于细菌感染管制有其极限，亟需提供一种非药物的组合物，以用于抑制抗药性肠杆菌，并解决上述问题。
【发明内容】
因此，本发明之一样方面是提供一种乳酸菌组合物，包含乳酸菌做为有效成分。乳酸菌是选自于由鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)JJ101、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)JJ102、胚芽乳酸菌(Lactiplantibacillus plantarum，亦称植物乳杆菌)JJ103及上述任意组合所组成的组，其中此乳酸菌组合物抑制抗药性肠杆菌的生长。
本发明的另一方面是提供一种其用于制备抑制抗药性肠杆菌的口服组合物的用途，包含上述乳酸菌做为有效成分。
根据本发明的上述的方面，提出一种乳酸菌组合物，包含乳酸菌做为有效成分，其中此乳酸菌可例如为选自于由鼠李糖乳杆菌JJ101、副干酪乳杆菌JJ102、胚芽乳酸菌JJ103及上述任意组合所组成的组。上述鼠李糖乳杆菌JJ101是于2022年01月12日保藏在德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH，DSMZ，地址：德国38124布伦瑞克市茵和芬史塔街7B号)，保藏编号为DSM 34122，副干酪乳杆菌JJ102是于2022年01月12日保藏在DSMZ，保藏编号为DSM 34123，且胚芽乳酸菌JJ103是于2022年01月12日保藏在DSMZ，保藏编号为DSM 34124。鼠李糖乳杆菌JJ101、副干酪乳杆菌JJ102、胚芽乳酸菌JJ103是于2022年01月18日完成存活试验。此乳酸菌组合物抑制抗药性肠杆菌的生长。
在本发明的一实施例中，乳酸菌组合物可选择性包含益生元，其中益生元可包含但不限于乳果糖及/或异麦芽寡糖。在本发明的一实施例中，益生元的含量为1重量％至5重量％。在本发明的一实施例中，乳酸菌组合物为口服组合物。在本发明的一实施例中，抗药性肠杆菌具有克雷伯氏肺炎菌的碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae carbapenemase，KPC)-2。在本发明的一实施例中，受试对象是投予具有有效剂量的乳酸菌至少7天。在本发明的一实施例中，当受试对象是小鼠时，有效剂量可例如为5.0×1010CFU/kg体重/天至1.5×1011CFU/kg体重/天。
根据本发明的另一方面，提出一种其用于制备抑制抗药性肠杆菌的口服组合物的用途，包含乳酸菌做为有效成分。此乳酸菌可例如为选自于由鼠李糖乳杆菌JJ101、副干酪乳杆菌JJ102、胚芽乳酸菌JJ103及上述任意组合所组成的组，其中鼠李糖乳杆菌JJ101的保藏编号为DSM 34122，副干酪乳杆菌JJ102的保藏编号为DSM 34123，且胚芽乳酸菌JJ103的保藏编号为DSM 34124。
在本发明的一实施例中，抗药性肠杆菌具有KPC-2。在本发明的一实施例中，乳酸菌组合物可选择性包含乳果糖及/或异麦芽寡糖。
应用本发明的乳酸菌组合物及其用于制备抑制抗药性肠杆菌的口服组合物的用途，可在体外及/或在体内抑制具有KPC-2的抗药性肠杆菌的生长，故本发明的乳酸菌组合物有潜力应用于预防、改善及/或治疗抗药性肠杆菌感染。
鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)JJ101是于2022年01月12日保藏在德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund ZellkulturenGmbH，DSMZ，地址：德国38124布伦瑞克市茵和芬史塔街7B号)，保藏编号为DSM 34122。
副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)JJ102是于2022年01月12日保藏在DSMZ，保藏编号为DSM34123。
胚芽乳酸菌(Lactiplantibacillus plantarum)JJ103是于2022年01月12日保藏在DSMZ，保藏编号为DSM 34124。
【附图说明】
为让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附附图的详细说明如下：
[图1]是绘示根据本发明的一实施例的小鼠经口投予不同鼠李糖乳杆菌连续3天并停止管喂后，小鼠粪便的鼠李糖乳杆菌含量的折线图。
[图2]是绘示根据本发明的一实施例的小鼠经口投予不同副干酪乳杆菌连续3天并停止管喂后，小鼠粪便的副干酪乳杆菌含量的折线图。
[图3]是绘示根据本发明的一实施例的小鼠经口投予不同胚芽乳酸菌连续3天并停止管喂后，小鼠粪便的胚芽乳酸菌含量的折线图。
[图4]是绘示根据本发明的一实施例的感染小鼠粪便的CPE含量的折线图。
[图5]是绘示根据本发明的一实施例的不同组别的感染小鼠粪便的CPE含量的折线图。
[图6A]及[图6B]分别绘示根据本发明的一实施例的菌株JJ101及CPE共培养在含有不同益生元的共培养液后，共培养液的CPE含量及pH值的折线图。
[图7A]及[图7B]分别绘示根据本发明的一实施例的菌株JJ102及CPE共培养在含有不同益生元的共培养液后，共培养液的CPE含量及pH值的折线图。
[图8A]及[图8B]分别绘示根据本发明的一实施例的菌株JJ103及CPE共培养于含有不同益生元的共培养液后，共培养液的CPE含量及pH值的折线图。
[图9]是绘示根据本发明的一实施例的不同组别的感染小鼠粪便的CPE含量的折线图。
【具体实施方式】
承上所述，本发明提供一种乳酸菌组合物及其用于制备抑制抗药性肠杆菌的口服组合物的用途，其中此乳酸菌组合物包含乳酸菌做为有效成分。经体外共培养实验及动物实验证实，乳酸菌组合物可抑制抗药性肠杆菌的生长。
本文所述的“乳酸菌”(lacticacid bacteria)是指可分解糖类(如：乳糖、葡萄糖、蔗糖及/或果糖等)后产生乳酸及/或醋酸的细菌，如：乳酸杆菌、片球菌、芽孢杆菌及双歧杆菌。值得注意的是，乳酸菌的不同菌株可能互相干扰而影响功效，但特定菌株组合也可能产生协同作用，从而改善菌株在动物体内(即肠道)的存留能力及/或功效。因此，应用乳酸菌时，需根据菌株、受试对象及/或功效，选用单株乳酸菌或多株乳酸菌(称为复合乳酸菌)。
补充说明的是，乳酸菌在动物体内(即肠道)的存留能力佳是指乳酸菌在动物体内(即肠道)的时间较久及/或存留的活菌数较多，其中乳酸菌在动物体内(即肠道)的活菌数可例如通过计算每单位重量的粪便的活菌数而评估。在一实施例中，乳酸菌具耐酸性及耐胆盐性，因此其肠道存留能力较佳。
在一实施例中，乳酸菌可例如为选自于由鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillusrhamnosus)、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)、胚芽乳酸菌(Lactiplantibacillus plantarum，亦称植物乳杆菌)及上述任意组合所组成的组。在一实施例中，鼠李糖乳杆菌可例如为保藏编号为DSM 34122的鼠李糖乳杆菌JJ101(亦称为菌株JJ101)，副干酪乳杆菌可例如为保藏编号为DSM 34123的副干酪乳杆菌JJ102(亦称为菌株JJ102)，且胚芽乳酸菌可例如为保藏编号为DSM 34124的胚芽乳酸菌JJ103(亦称为菌株JJ103)。
补充说明的是，鼠李糖乳杆菌JJ101、副干酪乳杆菌JJ102及胚芽乳酸菌JJ103皆是于2022年01月12日保藏在德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ，地址：德国38124布伦瑞克市茵和芬史塔街7B号)，2022年01月18日完成存活试验。
在一实施例中，乳酸菌是由鼠李糖乳杆菌JJ101、副干酪乳杆菌JJ102及胚芽乳酸菌JJ103所组成，其中鼠李糖乳杆菌JJ101、副干酪乳杆菌JJ102及胚芽乳酸菌JJ103的菌数比可例如为1～5：1～5：1～10，使鼠李糖乳杆菌JJ101、副干酪乳杆菌JJ102及胚芽乳酸菌JJ103可在动物体内维持协同作用，从而更有效地抑制抗药性肠杆菌的生长。在一具体例中，鼠李糖乳杆菌JJ101、副干酪乳杆菌JJ102及胚芽乳酸菌JJ103的菌数比可例如为1：1：1。
经动物实验证实，相较于同属其他菌株，动物经口投予鼠李糖乳杆菌JJ101、副干酪乳杆菌JJ102及胚芽乳酸菌JJ103任一者连续3天后，肠道存留的活菌数较多，表示鼠李糖乳杆菌JJ101、副干酪乳杆菌JJ102及胚芽乳酸菌JJ103的肠道存留能力较佳。
本文所述的“抗药性肠杆菌”是指对抗生素具有抗药性的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)菌株。本文所述的“乳酸菌抑制抗药性肠杆菌”是指乳酸菌与抗药性肠杆菌在体外共培养后，可有效抑制抗药性肠杆菌的生长(如：抗药性肠杆菌含量降低至少2个数量级，相当于抑制率为99％)，或经口投予后，动物体内抗药性肠杆菌含量显著降低。补充说明的是，抑制率是初始菌量与处理后菌量的差值对初始菌量的百分率，其中初始菌量是未与乳酸菌共培养的抗药性肠杆菌的活菌数，且处理后菌量是与乳酸菌共培养后，抗药性肠杆菌的活菌数，或者初始菌量是未经口投予乳酸菌的受感染动物粪便中的抗药性肠杆菌含量，且处理后菌量是经口投予乳酸菌后，受感染动物粪便中的抗药性肠杆菌含量。
在一实施例中，上述抗生素可例如为β-内酰胺类(β-lactam)抗生素，其可透过干扰细胞壁的合成，以抑制细菌的生长。β-内酰胺类抗生素可包含但不限于青霉素、头孢菌素、碳青霉烯(carbapenem)及单酰胺环。在一实施例中，抗药性肠杆菌可例如为β-内酰胺类抗药性肠杆菌。在一实施例中，抗药性肠杆菌可例如为碳青霉烯抗药性肠杆菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE)。在一些具体例中，抗药性肠杆菌可例如为产碳青霉烯酶肠杆菌(carbapenemase-producing Enterobacteriaceae，CPE)。
补充说明的是，碳青霉烯酶为β-内酰胺酶(β-lactamases)的一种，可水解β-内酰胺类抗生素(如：碳青霉烯)，从而降低CPE对β-内酰胺类抗生素的感受性。克雷伯氏肺炎菌碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniaecarbapenemase，KPC)为碳青霉烯酶的一种，首次于1996年发现在克雷伯氏肺炎菌上，因而得其名。KPC的基因是位在质粒上，故可跨菌种传播，目前其他肠杆菌(如：佛氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌、日沟维肠杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、产酸克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、肠道沙门氏菌、黏质沙雷氏菌)及其他非肠杆菌的革兰氏阴性菌(如：铜绿假单胞菌、恋臭假单孢菌、不动杆菌属)皆发现过产生KPC的菌株。依据基因序列的不同，KPC可分类为KPC-1、KPC-2、KPC-3等。其中，具有KPC-2的抗药性肠杆菌在临床上较为常见，如：序列型(sequence type，ST)11的克雷伯氏肺炎菌。
经动物实验证实，受CPE感染的动物经口投予鼠李糖乳杆菌JJ101、副干酪乳杆菌JJ102及胚芽乳酸菌JJ103任一者连续至少4天后，即可有效降低受感染动物的粪便中的抗药性肠杆菌的含量，且经口投予上述菌株至少7天后，抗药性肠杆菌含量降低至少2个数量级，相当于抑制率为99％，证实鼠李糖乳杆菌JJ101、副干酪乳杆菌JJ102及胚芽乳酸菌JJ103皆具有抑制抗药性肠杆菌的生长的功效。其次，同时投予鼠李糖乳杆菌JJ101、副干酪乳杆菌JJ102及胚芽乳酸菌JJ103连续7天后，受感染动物的肠道存留的抗药性肠杆菌降低至少3个数量级，相当于抑制率为99.9％，说明上述三株菌一起使用，抑制抗药性肠杆菌的生长的功效更佳。
在一实施例中，乳酸菌组合物可选择性包含益生元，其中包含益生元的乳酸菌组合物又可称作为合益素。本文所述的“益生元”是指无法被宿主消化，但有益于宿主消化道中的特定菌株的生长及/或代谢活性，从而改善宿主健康的物质。
常见的益生元包含双糖、低聚糖碳水化合物(oligosaccharide carbohydrates，OSCs)、抗性淀粉及其他非糖类物质，具体可为果寡糖(fructo-oligosaccharide)、半乳寡糖(galacto-oligosaccharide)、低聚葡萄糖(polydextrose)、木寡糖(xylo-oligosaccharide)、乳果糖(lactulose)、异麦芽寡糖(isomalto-oligosaccharides)及菊糖(inulin)等。在一实施例中，益生元可包含但不限于乳果糖及/或异麦芽寡糖。在一实施例中，乳果糖及/或异麦芽寡糖可促进乳酸菌产生酸性物质(如：有机酸)，从而增加乳酸菌的抑制抗药性肠杆菌的生长的功效。
在一实施例中，益生元的含量不限，以不超过安全剂量即可，益生元对成人的每日安全剂量可例如为小于10g，以免引起腹胀及腹泻等不适症状。在一实施例中，益生元的含量可例如为1重量％至5重量％，1.5重量％至2.5重量％，或者2重量％，以充分刺激上述乳酸菌的生长及/或代谢活性，但不超过上述每日安全剂量。
经体外共培养实验证实，乳果糖及/或异麦芽寡糖可促进鼠李糖乳杆菌JJ101、副干酪乳杆菌JJ102及胚芽乳酸菌JJ103的任一者产生酸性物质，使共培养液的pH值是小于5，从而抑制抗药性肠杆菌生长。其次，经动物实验证实，相较于投予乳酸菌(不含益生元)，同时投予乳酸菌及益生元，受感染动物的肠道内的抗药性肠杆菌含量降低得比较快(如：投予7天后，受感染动物的肠道内的抗药性肠杆菌含量降低至少5个数量级，相当于抑制率为至少99.999％)。
在应用上述乳酸菌时，其投予途径并无特别限制，可例如经口投予，端视实际需求调整。上述乳酸菌的投予量及投予次数，亦可视需求弹性调整。在一实施例中，鼠李糖乳杆菌JJ101、副干酪乳杆菌JJ102及胚芽乳酸菌JJ103在体外培养液的有效剂量为105CFU/mL至107CFU/mL。在一实施例中，当受试对象是小鼠时，乳酸菌的有效剂量可例如为5.0×1010CFU/kg体重/天至1.5×1011CFU/kg体重/天。举例而言，在上述动物实验中，乳酸菌对小鼠的有效剂量为1.0×1011CFU/kg体重/天，即2.0×109CFU/小鼠(20g体重)/天。
补充说明的是，动物实验中，小鼠是直接经口投予抗药性肠杆菌，因此小鼠肠道中的抗药性肠杆菌含量是远高于临床病人。其次，小鼠有食粪的习性，会反复摄入粪便中的抗药性肠杆菌。因此，小鼠需经口投予具有较高剂量的乳酸菌，才能有效降低抗药性肠杆菌。换言之，当乳酸菌在临床应用对成人的有效剂量是低于动物实验中对小鼠的有效剂量，就能有效抑制抗药性肠杆菌。在一具体例中，乳酸菌对成人的有效剂量可例如为1.0×108CFU/60kg体重/天至1.0×1010CFU/60kg体重/天。在一实施例中，受试对象是投予上述有效剂量的乳酸菌连续数天。在一实施例中，受试对象是投予乳酸菌连续至少7天，如：7天至1年，抑或14天至6个月。
上述乳酸菌具有抑制抗药性肠杆菌的生长的功效，因此可做为乳酸菌组合物的有效成分。在一实施例中，乳酸菌组合物可例如为口服组合物。在一实施例中，乳酸菌组合物可例如为食品组合物或医药组合物。在一实施例中，乳酸菌组合物可选择性包含食品或医药上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、辅助剂及/或添加剂，可例如为溶剂、乳化剂、悬浮剂、崩解剂、黏合剂、安定剂、螫合剂、稀释剂、胶凝剂、防腐剂、润滑剂及/或吸收延缓剂等。乳酸菌组合物的剂型并无特别限制，可例如为水溶液、悬浮液、分散液、乳液(单相或多相分散体系、单室或多室脂质体)、水胶、凝胶、固体脂质纳米粒、锭剂、颗粒剂、粉剂或胶囊剂等。
以下利用数个实施例以说明本发明的应用，然其并非用以限定本发明，本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。
实施例一、乳酸菌分离、培养及微生物学性质
菌株LYC1504、菌株JJ101、菌株LYC1119、菌株JJ102、菌株LYC1129、菌株LYC1031、菌株LYC1112、菌株LYC1117、菌株LYC1146、菌株LYC1159及菌株JJ103等11株乳酸菌(lacticacidbacteria，LAB)是分离自水果发酵物。将LAB以四区划线法接种在de Man，Rogosa and Sharpe(MRS)琼脂培养基上，并于37℃下培养16小时至18小时，以获得单一菌落。接着，将单一菌落接种至MRS培养液，并于37℃下培养16小时至24小时，从而获得LAB培养液。将LAB培养液离心，以获得菌体沉淀物(pellet)。
对LAB的菌体沉淀物进行RNA纯化及逆转录，再利用核酸序列如序列识别号(SEQID NOs.)：1及2所示的上游引物及下游引物进行聚合酶链反应(polymerase chainreaction，PCR)，以获得16S rDNA核酸片段，并进行核酸测序，从而获得LAB的16S rDNA核酸序列。利用基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)进行比对，鉴定11株LAB中有2株鼠李糖乳杆菌(菌株LYC1504及菌株JJ101)、3株副干酪乳杆菌(菌株LYC1119、菌株JJ102及菌株LYC1129)及6株胚芽乳酸菌(菌株LYC1031、菌株LYC1112、菌株LYC1117、菌株LYC1146、菌株LYC1159及菌株JJ103)。
上述菌株JJ101的16SrDNA核酸序列是如SEQ ID NOs：3所示。菌株JJ102的16SrDNA核酸序列是如SEQ ID NOs：4所示。菌株JJ103的16S rDNA核酸序列是如SEQ ID NOs：5所示。菌株JJ101、菌株JJ102及菌株JJ103是于2022年01月12日保藏在DSMZ，并于2022年01月18日完成存活试验，其中菌株菌株JJ101的保藏编号为DSM 34122，菌株JJ102的保藏编号为DSM 34123，且菌株JJ103的保藏编号为DSM 34124。
补充说明的是，菌株JJ101(鼠李糖乳杆菌)的菌落乳白色、不透明，呈圆形，表面光滑突起，边缘整齐，其菌体呈短杆状，两端钝圆，以单个、成对、短链状或链状形式存在，无鞭毛、无运动性，无孢子形成，且革兰氏染色为阳性。菌株JJ102(副干酪乳杆菌)的菌落乳白色、不透明，呈圆形或类圆型，表面光滑突起，边缘整齐，其菌体呈短杆状，两端钝圆，以单个、成对或短链状形式存在，无鞭毛、无运动性，无孢子形成，且革兰氏染色为阳性。菌株JJ103(胚芽乳酸菌)的菌落乳白色、不透明，呈圆形到略不规则形，表面光滑突起，边缘整齐，其菌体呈杆状直线型，两端呈圆弧形，以单个、成对或短链状形式存在，无鞭毛但能运动，无孢子形成，且革兰氏染色为阳性。
实施例二、评估乳酸菌及抗药性肠杆菌在动物体内的存留能力
1.乳酸菌在动物体内的存留能力
利用BALB/c小鼠(以下简称为小鼠)做为实验动物。将5周龄雌性小鼠饲养在动物房的独立通气饲养笼中，使小鼠适应环境。在适应环境的期间，小鼠可自由摄取标准粒状饲料和灭菌蒸馏水。动物房的温度是23±3℃，相对湿度是60±10％，且每日有12小时的光照期及12小时的黑暗期。待小鼠成长至达6周龄后，再进行后续评估。
首先，每日投予小鼠抗生素，并检测小鼠粪便的细菌含量，以确认粪便是否呈无菌。检测方法说明如下：将小鼠的新鲜粪便秤重后，加入1mL的生理盐水(normal saline，NS)研磨成检测液，再将检测液分别涂布在肠杆菌培养基、米勒亨顿(Mueller Hintonbroth，MHB)琼脂及LAB培养基上，并于37℃下培养24小时后计算菌落数。上述肠杆菌培养基是含有16μg/mL的万古霉素(vancomycin)、64μg/mL的氨苄青霉素(ampicillin)及16μg/mL的头孢唑肟(cefotaxime)的伊红甲基蓝(eosin methylene blue，EMB)琼脂，可用以检测肠杆菌。LAB培养基是含有32μg/mL的万古霉素的MRS琼脂，且pH值是5.0，可用以检测LAB。
在小鼠粪便经检测确认呈无菌后，分别管喂小鼠不同LAB液，其中LAB液是将上述11株LAB的沉淀物分别回溶在磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline，PBS)后获得，并调整LAB含量，使小鼠经口投予2.0×109CFU/天的LAB连续3天。然后，停止管喂，并在停止管喂1天、3天及7天后，使用上述LAB培养基检测小鼠粪便的LAB含量，其中LAB含量是LAB活菌数对小鼠粪便重量的比值(单位：CFU/g)。
请参阅图1，其中图1是绘示根据本发明的一实施例的小鼠经口投予不同鼠李糖乳杆菌连续3天并停止管喂后，小鼠粪便的鼠李糖乳杆菌含量的折线图，其中横轴表示时间(单位：天)，纵轴表示鼠李糖乳杆菌含量(单位：CFU/g)，折线101及折线103分别为菌株LYC1504及菌株JJ101。如图1所示，停止管喂1天及3天后，小鼠粪便的菌株JJ101(折线103)含量是高于菌株LYC1504(折线101)，其中停止管喂3天后，菌株JJ101含量是高于107CFU/g，证实菌株JJ101的肠道存留能力较佳。
请参阅图2，其中图2是绘示根据本发明的一实施例的小鼠经口投予不同副干酪乳杆菌连续3天并停止管喂后，小鼠粪便的副干酪乳杆菌含量的折线图，其中横轴表示时间(单位：天)，纵轴表示副干酪乳杆菌含量(单位：CFU/g)，折线201、折线203及折线205分别为菌株LYC1119、菌株JJ102及菌株LYC1229。如图2所示，停止管喂1天后，小鼠粪便的菌株JJ102含量(折线203)是高于菌株LYC1119及菌株LYC1229(折线201及折线205)，其中菌株JJ102含量是高于107CFU/g，证实菌株JJ102的肠道存留能力较佳。
请参阅图3，其中图3是绘示根据本发明的一实施例的小鼠经口投予不同胚芽乳酸菌连续3天并停止管喂后，小鼠粪便的胚芽乳酸菌含量的折线图，其中横轴表示时间(单位：天)，纵轴表示胚芽乳酸菌含量(单位：CFU/g)，折线301、折线303、折线305、折线307、折线309及折线311分别为菌株LYC1031、菌株LYC1112、菌株LYC1117、菌株LYC1146、菌株LYC1159及菌株JJ103。
如图3所示，停止管喂1天、3天及7天后，小鼠粪便的菌株JJ103含量(折线311)皆高于其他菌株(折线301至折线309)，其中停止管喂3天后，菌株JJ103含量为106CFU/g至107CFU/g，且停止管喂7天后，菌株JJ103含量仍多于105CFU/g，证实相较于其他胚芽乳酸菌，菌株JJ103的肠道存留能力较佳。
2.抗药性肠杆菌在动物体内的存留能力
菌株KPC001、菌株KPC011、菌株KPC021及菌株KPC035是自中国台湾奇美医院医学研究中心临床所分离的表达KPC-2的抗药性肠杆菌(以下称为CPE)。将CPE以四区划线法接种在肠杆菌培养基上，并于37℃下培养16小时至18小时，以获得单一菌落。接着，将单一菌落接种至MHB中，并于37℃下培养16小时至24小时，从而获得CPE培养液。将CPE培养液离心，以获得CPE的菌体沉淀物(pellet)。
每日投予小鼠抗生素，直到小鼠粪便呈无菌。然后，管喂小鼠CPE液，其中CPE液是将CPE的菌体沉淀物回溶在含有20重量％脱脂奶粉水溶液中，并调整CPE液的CPE含量，使小鼠经口投予3.0×108CFU/天的CPE连续3天，从而获得感染小鼠。然后，停止管喂，并于停止管喂1天、2天、7天、10天、14天、17天、21天、24天、28天、31天及35天后，再次搜集感染小鼠的粪便，并用MHB琼脂检测粪便的CPE含量，其中CPE含量是CPE活菌数对粪便重量的比值(单位：CFU/g)。
请参阅图4，其中图4是绘示根据本发明的一实施例的感染小鼠粪便的CPE含量的折线图，其中横轴表示时间(单位：天)，纵轴表示CPE含量(单位：CFU/g)，折线401、折线403、折线405及折线407分别表示菌株KPC001、菌株KPC011、菌株KPC021及菌株KPC035。如图4所示，停止管喂1天后，小鼠粪便不同菌株的CPE含量皆为约1010CFU/g，且在停止管喂4天至35天后，小鼠粪便不同菌株的CPE含量仍维持在104CFU/g至106CFU/g。上述结果显示，不同菌株的CPE的肠道存留能力没有差异。后续评估以菌株KPC001进行。
实施例三、评估乳酸菌抑制抗药性肠杆菌的功效
每日投予小鼠抗生素，直到小鼠粪便呈无菌。然后，使小鼠经口投予3.0×108CFU/天的CPE连续3天，以获得感染小鼠。接者，检测感染小鼠粪便的CPE含量，做为感染小鼠未经口投予LAB的CPE含量。然后，将感染小鼠分为5组(空白组、实验组1、实验组2、实验组3及实验组4)。空白组的感染小鼠是经口投予PBS连续21天，实验组1的感染小鼠是经口投予2.0×109CFU/天的菌株JJ101连续21天，实验组2的感染小鼠是经口投予2.0×109CFU/天的菌株JJ102连续21天，实验组3的感染小鼠是经口投予2.0×109CFU/天的菌株JJ103连续21天，且实验组4的感染小鼠是经口投予2.0×109CFU/天的复合LAB连续21天，其中复合LAB是由菌株JJ101、菌株JJ102及菌株JJ103以1：1：1的菌数比组成。在小鼠经口投予LAB连续4天、7天、11天、14天、18天及21天后，检测感染小鼠粪便的CPE含量。
请参阅图5，其中图5是绘示根据本发明的一实施例的不同组别的感染小鼠粪便的CPE含量的折线图，其中横轴表示感染小鼠经口投予LAB的连续天数(单位：天)，纵轴表示感染小鼠粪便的CPE含量(单位：CFU/g)，折线501、折线503、折线505、折线507及折线509分别表示空白组、实验组1、实验组2、实验组3及实验组4，且不同字母A、B、C及D表示具有统计上的显著差异(p<0.05)。
如图5所示，实验组1至实验组4(折线503至折线509)的感染小鼠粪便的CPE含量是低于空白组(折线501)，证实菌株JJ101、菌株JJ102及菌株JJ103的个别或组合皆具有抑制CPE生长的功效。其中，相较于感染小鼠未经口投予LAB的CPE含量，感染小鼠经口投予不同LAB菌株连续21天后，实验组1至实验组3(折线503至折线507)的感染小鼠粪便的CPE含量降低2个至3个数量级，且感染小鼠同时经口投予三株LAB菌株连续21天后，实验组4的感染小鼠粪便的CPE含量降低至少5个数量级，相当于抑制率为至少99.999％，证实相较于菌株JJ101、菌株JJ102及菌株JJ103分别经口投予，菌株JJ101、菌株JJ102及菌株JJ103同时经口投予的抑制CPE生长的功效佳。
实施例四、评估合益素抑制抗药性肠杆菌的功效
1.不同益生元的促进乳酸菌产生酸性物质的功效
LAB可分解糖类而产生酸性物质(如：乳酸及/或醋酸)，从而降低环境(如：肠道)pH值，进而抑制CPE。因此，如果LAB可越有效地利用益生元，则此益生元及LAB组成的合益素抑制CPE生长的功效越佳。
将上述11株LAB分别接种不同配方的不含葡萄糖的MRS培养液中，并于37℃下培养24小时，以获得培养物。然后，测量培养物的pH值，并将结果(3重复的平均±标准差)记录在表1中，其中NON组表示MRS培养液不添加糖类、SUC组表示MRS培养液添加2重量％的蔗糖、FOS组表示MRS培养液添加2重量％的果寡糖，IN组表示MRS培养液添加2重量％的菊糖、IMO组表示MRS培养液添加2重量％的异麦芽寡糖、LU组表示MRS培养液添加2重量％的乳果糖，且XOS组表示MRS培养液添加2重量％的木寡糖。
表1
如表1所示，SUC组、FOS组、IN组、XOS组、IMO组及LU组的培养物的pH值是低于NON组，表示糖类可促进LAB产生酸性物质。其次，菌株JJ101在LU组及IMO组的培养物的pH值是低于5.0，说明乳果糖及异麦芽寡糖具有促进菌株JJ101产生酸性物质的功效。菌株JJ102只有在XOS组的培养物的pH值是高于5.0，说明上述糖类中，只有木寡糖无法促进菌株JJ102产生酸性物质。菌株JJ103在SUC组、LU组及IMO组的培养物的pH值是低于5.0，说明蔗糖、乳果糖及异麦芽寡糖具有促进菌株JJ103产生酸性物质的功效。补充说明的是，蔗糖可被动物消化，不能做为益生元。因此，当复合LAB是由菌株JJ101、菌株JJ102及菌株JJ103所组成，应选用乳果糖及/或异麦芽寡糖做为益生元。
2.菌株JJ101及不同益生元形成的合益素的pH值及抑制CPE生长的功效
将上述各LAB菌种(鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌及胚芽乳酸菌)中，肠道存留能力较佳的单株LAB(即菌株JJ101、菌株JJ102及菌株JJ103)分别与CPE(菌株KPC001)加入pH6.5的共培养液中，以进行共培养试验，其中共培养液的初始LAB含量为107CFU/mL，且初始CPE含量为106CFU/mL。然后，对共培养液进行LAB含量检测、CPE含量检测及pH值检测，以获得初始LAB含量、CPE含量及pH值(相当于培养0小时)。LAB含量检测是将共培养液涂布在pH5.5的MRS琼脂培养基上，并在37℃下培养，以获得LAB的单一菌落。通过LAB的单一菌落数，可推算共培养液的LAB含量(单位：CFU/mL)。CPE菌数检测是共培养液涂布在含有16μg/mL的氨苄青霉素的EMB琼脂培养基上，并在37℃下培养，以获得CPE的单一菌落。通过CPE的单一菌落数，可推算共培养液的CPE含量(单位：CFU/mL)。
共培养液是由不含葡萄糖的MRS培养液及MHB以1：1的体积比例配制而成，并依据组别添加或不添加糖类，其中NON组的共培养液不含糖类，SUC组的共培养液含有2重量％的蔗糖，FOS组的共培养液含有2重量％的果寡糖，IN组的共培养液含有2重量％的菊糖，XOS组的共培养液含有2重量％的木寡糖，LU组的共培养液含有2重量％的乳果糖，且IMO组的共培养液含有2重量％的异麦芽寡糖。
将共培养液在37℃下进行培养，并在培养3小时、6小时、24小时及48小时后，进行LAB含量检测、CPE含量检测及pH值检测。
上述菌株JJ101与CPE在不同共培养液的共培养实验中，LAB含量检测的结果说明如下：培养48小时后，SUC组、FOS组、IN组、XOS组、LU组及IMO组的共培养液的菌株JJ101含量高于NON组，是大于1.0×108CFU/mL且小于1.0×109CFU/mL(未绘示于图中)，证实益生元在体外有利于菌株JJ101的生长。
请参阅图6A及图6B，其分别绘示根据本发明的一实施例的菌株JJ101及CPE共培养在含有不同益生元的共培养液后，共培养液的CPE含量(图6A)及pH值(图6B)的折线图。图6A的横轴表示时间(单位：小时)，纵轴表示CPE含量(单位：CFU/mL)。图6B的横轴表示时间(单位：小时)，纵轴表示pH值。图6A及图6B的折线601、折线603、折线605、折线607、折线609、折线611及折线613分别表示NON组、SUC组、FOS组、IN组、XOS组、LU组及IMO组。
如图6A所示，在培养24小时后，SUC组(折线603)、FOS组(折线605)、IN组(折线607)及LU组(折线611)的共培养液的CPE含量是低于检测极限。在培养48小时后，IMO组(折线613)的共培养液的CPE含量较初始CPE含量(0小时)少2个数量级(即抑制率为99％)。然而，NON组(折线601)及XOS组(折线609)的共培养液的CPE含量在培养48后是高于初始CPE含量(0小时)。如图6B所示，培养24小时至48小时后，SUC组(折线603)、FOS组(折线605)、IN组(折线607)、LU组(折线611)及IMO组(折线613)的共培养液的pH值是小于5，但XOS组(折线609)及NON组(折线601)的共培养液的pH值是大于5。上述结果证实，蔗糖、果寡糖、菊糖、乳果糖及异麦芽寡糖可促进菌株JJ101产生酸性物质，使共培养液的pH值是小于5，从而抑制CPE生长。
3.菌株JJ102及不同益生元形成的合益素的pH值及抑制CPE生长的功效
上述菌株JJ102与CPE在不同共培养液的共培养实验中，由LAB含量检测的结果可知，培养48小时后，SUC组至XOS组及LU组至IMO组的共培养液的菌株JJ102含量是高于1.0×108CFU/mL而小于1.0×109CFU/mL(图未绘示)，且高于NON组，证实益生元在体外有利于菌株JJ102的生长。
请参阅图7A及图7B，其分别绘示根据本发明的一实施例的菌株JJ102及CPE共培养在含有不同益生元的共培养液后，共培养液的CPE含量(图7A)及pH值(图7B)的折线图。图7A的横轴表示时间(单位：小时)，纵轴表示CPE含量(单位：CFU/mL)。图7B的横轴表示时间(单位：小时)，纵轴表示pH值。图7A及图7B的折线701、折线703、折线705、折线707、折线709、折线711及折线713分别表示NON组、SUC组、FOS组、IN组、XOS组、LU组及IMO组。
如图7A所示，在培养24小时后，FOS组(折线705)的共培养液的CPE含量是低于检测极限。培养48小时后，SUC组(折线703)、IN组(折线707)及LU组(折线711)的共培养液的CPE含量是低于检测极限。IMO组(折线713)的共培养液的CPE含量较初始CPE含量(0小时)少3个数量级(即抑制率为99.9％)。NON组(折线701)及XOS组(折线709)的共培养液在培养48小时后的CPE含量较初始CPE含量高。如图7B所示，在培养48小时后，XOS组(折线709)及NON组(折线701)的共培养液的pH值是大于5，但SUC组、FOS组、IN组、LU组及IMO组的pH值皆小于5。上述结果证实蔗糖、果寡糖、菊糖、乳果糖及异麦芽寡糖可促进菌株JJ102产生酸性物质，使共培养液的pH是小于5，从而抑制CPE生长。
4.菌株JJ103及不同益生元形成的合益素的pH值及抑制CPE生长的功效
由LAB含量检测的结果可知，培养48小时后，NON组的共培养液的菌株JJ103含量最少(9.0×108CFU/mL)，SUC组至XOS组及LU组至IMO组的共培养液的菌株JJ103含量则高于9.0×108CFU/mL(图未绘示)，证实益生元在体外有利于菌株JJ103的生长。
请参阅图8A及图8B，其分别绘示根据本发明的一实施例的菌株JJ103及CPE共培养在含有不同益生元的共培养液后，共培养液的CPE含量(图8A)及pH值(图8B)的折线图。图8A的横轴表示时间(单位：小时)，纵轴表示CPE含量(单位：CFU/mL)。图8B的横轴表示时间(单位：小时)，纵轴表示pH值。图8A及图8B的折线801、折线803、折线805、折线807、折线809、折线811及折线813分别表示NON组、SUC组、FOS组、IN组、XOS组、LU组及IMO组。
如图8A所示，培养24小时后，SUC组(折线803)、LU组(折线811)、IMO组(折线813)的共培养液的CPE含量是低于检测极限，但NON组、FOS组、IN组及XOS组的CPE含量较初始CPE含量高。如图8B所示，SUC组(折线803)、LU组(折线811)及IMO组(折线813)的共培养液的pH值是小于5，但NON组、FOS组、IN组及XOS组的共培养液的pH值是大于5。上述结果证实共培养液的pH值小于5可抑制CPE生长。其次，蔗糖、乳果糖及异麦芽寡糖可促进菌株JJ103产生酸性物质，使共培养液的pH是小于5，从而抑制CPE生长。
由图6A、图6B、图7A、图7B、图8A及图8B的结果可知，蔗糖、果寡糖、菊糖、乳果糖及异麦芽寡糖可有效促进菌株JJ101及菌株JJ102产生酸性物质，但仅蔗糖、乳果糖及异麦芽寡糖可有效促进菌株JJ103产生酸性物质，其中蔗糖可被动物消化，不能做为益生元，因此后续实验以乳果糖及异麦芽寡糖做为益生元。
5.复合乳酸菌及不同益生元形成的合益素的抑制CPE生长的功效
利用PBS回溶菌株JJ101、菌株JJ102及菌株JJ103的菌体沉淀物，以获得复合LAB液，其中菌株JJ101、菌株JJ102及菌株JJ103的菌数比是1：1：1。接着，调制2重量％的乳果糖在复合LAB液中，以获得乳果糖合益素，并调制2重量％的异麦芽寡糖在复合LAB液中，以获得异麦芽寡糖合益素。
将小鼠分为4组(空白组、对照组、实验组1及实验组2)，并每日投予小鼠抗生素，直到小鼠粪便呈无菌。然后，使小鼠经口投予3.0×108CFU/天的CPE连续3天，以获得感染小鼠。接者，检测感染小鼠粪便的CPE含量，做为感染小鼠未经口投予LAB的CPE含量。然后，空白组的感染小鼠是经口投予PBS连续21天，对照组的感染小鼠是经口投予复合LAB液连续21天，实验组1的感染小鼠是经口投予乳果糖合益素连续21天，且实验组2的感染小鼠是经口投予异麦芽寡糖合益素连续21天。在小鼠经口投予LAB连续4天、7天、11天、14天、18天及21天后，检测小鼠粪便的CPE含量。补充说明的是，对照组、实验组1及实验组2的感染小鼠经口投予的复合LAB的菌数为2.0×109CFU/天。
请参阅图9，其中图9是绘示根据本发明的一实施例的不同组别的感染小鼠粪便的CPE含量的折线图，其中横轴表示小鼠经口投予LAB的连续天数(单位：天)，纵轴表示感染小鼠粪便的CPE含量(单位：CFU/g)，折线901、折线903、折线905及折线907分别代表空白组、对照组、实验组1及实验组2，且不同字母a及b表示组间具有统计上的显著差异(p<0.05)。
如图9所示，在经口投予PBS、复合乳酸菌或合益素连续21天后，对照组、实验组1及实验组2的感染小鼠粪便的CPE含量是显著低于空白组，证实复合乳酸菌、乳果糖合益素、异麦芽寡糖合益素可抑制CPE的生长活性。然而，在经口投予PBS、复合乳酸菌或合益素连续7天后，实验组1及实验组2的感染小鼠粪便的CPE含量显著是小于对照组，证实相较于复合乳酸菌(不含益生元)，乳果糖合益素及/或异麦芽寡糖合益素可较快降低CPE含量。
综上所述，鼠李糖乳杆菌JJ101、副干酪乳杆菌JJ102及胚芽乳酸菌JJ103等乳酸菌可抑制抗药性肠杆菌生长的活性，说明此些乳酸菌有潜力应用于预防、改善及/或治疗抗药性肠杆菌感染。
综言之，本发明虽以特定的乳酸菌株、特定的制程、特定的有效剂量、特定投予方式、特定的实验模型及特定的评估方法做为例示，说明本发明之乳酸菌组合物及其用于制备抑制抗药性肠杆菌的口服组合物的用途，惟本领域技术人员应可理解，本发明不限于此，在不脱离本发明的精神及范围内，本发明亦可使其他的乳酸菌株、其他的制程、其他的有效剂量、其他的投予方式、其他的实验模型及其他的评估方法进行。
虽然本发明已以数个特定实施例揭露如上，但可对前述揭露内容进行各种润饰、各种更动及替换，而且应可理解的是，在不脱离本发明的精神和范围内，某些情况将采用本发明实施例的某些特征但不对应使用其他特征。因此，本发明的精神和权利要求范围不应限于以上例示实施例所述。

Claims (10)

1.一种乳酸菌组合物，其特征在于，包含乳酸菌作为有效成分，该乳酸菌是选自于由鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)JJ101、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)JJ102、胚芽乳酸菌(Lactiplantibacillus plantarum)JJ103及其上述任意组合所组成的组，该鼠李糖乳杆菌JJ101是于2022年01月12日保藏在德国微生物保藏中心(DSMZ)，保藏编号为DSM 34122，该副干酪乳杆菌JJ102是于2022年01月12日保藏在DSMZ，保藏编号为DSM 34123，且该胚芽乳酸菌JJ103是于2022年01月12日保藏在DSMZ，保藏编号为DSM 34124，且该乳酸菌组合物抑制抗药性肠杆菌的生长。
2.如权利要求1所述的乳酸菌组合物，其特征在于，更包含益生元，其中该益生元包含乳果糖及/或异麦芽寡糖。
3.如权利要求2所述的乳酸菌组合物，其特征在于，其中该益生元的含量为1重量％至5重量％。
4.如权利要求1所述的乳酸菌组合物，其特征在于，其中该乳酸菌组合物为口服组合物。
5.如权利要求1所述的乳酸菌组合物，其特征在于，其中该抗药性肠杆菌具有克雷伯氏肺炎菌的碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae carbapenemase，KPC)-2。
6.如权利要求1所述的乳酸菌组合物，其特征在于，其中受试对象是投予具有有效剂量的该乳酸菌至少7天。
7.如权利要求6所述的乳酸菌组合物，其特征在于，其中当该受试对象是小鼠时，该有效剂量是5.0×1010CFU/kg体重/天至1.5×1011CFU/kg体重/天。
8.一种乳酸菌组合物用于制备抑制抗药性肠杆菌的口服组合物的用途，其特征在于，其中该口服组合物是以乳酸菌组合物作为有效成分，该乳酸菌组合物包含乳酸菌，该乳酸菌是选自于由鼠李糖乳杆菌JJ101、副干酪乳杆菌JJ102、胚芽乳酸菌JJ103及上述任意组合所组成的组，该鼠李糖乳杆菌JJ101的保藏编号为DSM 34122，该副干酪乳杆菌JJ102的保藏编号为DSM 34123，该胚芽乳酸菌JJ103的保藏编号为DSM 34124，且该乳酸菌组合物是投予受试对象至少7天。
9.如权利要求8所述的乳酸菌组合物用于制备抑制抗药性肠杆菌的口服组合物的用途，其特征在于，其中该抗药性肠杆菌具有KPC-2。
10.如权利要求8所述的乳酸菌组合物用于制备抑制抗药性肠杆菌的口服组合物的用途，其特征在于，其中该乳酸菌组合物更包含乳果糖及/或异麦芽寡糖。
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