TWI784194B - 抑制具萬古黴素抗藥性腸球菌之益生菌組合與其用途 - Google Patents

抑制具萬古黴素抗藥性腸球菌之益生菌組合與其用途 Download PDF

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一種抑制具萬古黴素抗藥性腸球菌之益生菌組合，係由凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、鼠李糖乳桿菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、及嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)所組成，且此益生菌組合用於製備抑制具萬古黴素抗藥性腸球菌生長、貼附宿主細胞或毒力之醫藥保健品，且可用於抑制具萬古黴素抗藥性腸球菌之毒力基因的表現。

Description

抑制具萬古黴素抗藥性腸球菌之益生菌組合與其用途
本案係關於一種益生菌組合，尤指一種抑制具萬古黴素抗藥性腸球菌之益生菌組合。
腸球菌(enterococci)是人類腸道內常駐的一種腸內菌，現在已成為全球最主要的伺機性感染病原菌之一，當病人的免疫狀況低下，例如嚴重的潛在性疾病、白血球數目低下、尿道或血管導管置放、住院日數過長時，就可能造成泌尿道感染、心肌炎、腦膜炎、或敗血症，造成醫療上連後線抗生素都無法有效治療的嚴重問題。在全世界各地的腸球菌臨床分離株發現對於萬古黴素有抗藥性的腸球菌(vancomycin-resistant enterococci，簡稱VRE)的比例在歐洲為4.0%，在加拿大為6.0%，在亞洲為11.9%，在南美洲為12.9%，在美國甚至高達35.5%，且各地加護病房病人對於VRE的帶原率近年來不斷攀升已達4.4-12.3%不等。台灣在1996年發現第一株VRE，而在2013年的台灣伺機感染監測系統的年度報告中，從加護病房病人的腸球菌分離株中已高達28.7%對萬古黴素具有抗藥性，且在台大醫院加護病房住院高達每1000人日的住院當中就有21.9人新得到VRE的發生率，可見VRE已經成為全球人類健康和醫療上極重大的威脅。
近年來有少數利用益生菌將人類腸道中VRE的定植(colonization)去除的研究，但是所用的益生菌株不盡相同，是否有效尚未有定 論。例如鼠李糖乳桿菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG，簡稱LGG)在兩個臨床試驗中看到了定植在人類腸道VRE的下降(Manley et al.(2007)Med J Aust 186：454-457；Szachta et al.(2011)J Clin Gastroenterol 45：872-877)，但是在另一個小型試驗中卻沒有看出有效的去除效應(Doron et al.(2015)Antimicrob Agents Chemother.59(8)：4593-9)。此外，另一株鼠李糖乳桿菌Lcr35(Lactobacillus rhamnosus Lcr35)在成人的小型試驗中也沒看到具體效果(Vidal et al.(2010)J Clin Microbiol 48：2595-2598)。另外兩個研究顯示出多重組合的益生菌株對VRE在人類定植腸道沒有預防效果，甚至有將抗生素傳播給腸內菌的疑慮(de Regt et al.(2010)Antimicrob Agents Chemother 54：2801-2805；Topcuoglu et al.(2015)J Matern Fetal Neonatal Med 28：1491-1494)。
由於這些少數的臨床研究所使用的菌株、劑量、時間、研究方法不一，所以目前仍亟需找到能有效抑制或去除VRE定植效果的益生菌組合。
本案之目的在於提供一種益生菌組合，其可抑制具萬古黴素抗藥性腸球菌之生長、貼附宿主細胞或毒力，進而減少具萬古黴素抗藥性腸球菌對人體的危害。
為達上述目的，本案提供一種抑制具萬古黴素抗藥性腸球菌之益生菌組合，該益生菌組合係由凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、鼠李糖乳桿菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、及嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)所組成。
為達上述目的，本案更提供一種益生菌組合之用途，其係用於製備抑制具萬古黴素抗藥性腸球菌生長、貼附宿主細胞或毒力之醫藥保健品，其中該益生菌組合係由凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、鼠李糖乳桿菌GG (Lactobacillus rhamnosus GG)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、及嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)所組成。
為達上述目的，本案更提供一種益生菌組合之用途，其係用於抑制具萬古黴素抗藥性腸球菌之毒力基因的表現，且該毒力基因包含asa1、acm、ebpA、ebpB、ebpC、efaA、sagA、esp、sgrA及scm的至少其中之一，其中該益生菌組合係由凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、鼠李糖乳桿菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、及嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)所組成。
為達上述目的，本案更提供一種抑制具萬古黴素抗藥性腸球菌之益生菌，該益生菌包含凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、鼠李糖乳桿菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、及嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)的至少其中之一。
為達上述目的，本案更提供一種益生菌之用途，其係用於製備抑制具萬古黴素抗藥性腸球菌生長、貼附宿主細胞或毒力之醫藥保健品，其中該益生菌包含凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、鼠李糖乳桿菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、及嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)的至少其中之一。
為達上述目的，本案更提供一種益生菌之用途，其係用於抑制具萬古黴素抗藥性腸球菌之毒力基因的表現，且該毒力基因包含asa1、acm、ebpA、ebpB、ebpC、efaA、sagA、esp、sgrA及scm的至少其中之一，其中該益生菌包含凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、鼠李糖乳桿菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、及嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)的至少其中之一。
在一實施例中，益生菌或益生菌組合係抑制具萬古黴素抗藥性腸球菌貼附於宿主的腸道上皮細胞。
在一實施例中，具萬古黴素抗藥性腸球菌包含屎腸球菌(Enterococcus faecium)及糞腸球菌(Enterococcus faecalis)。
在一實施例中，醫藥保健品為一膠囊，且膠囊包含一賦形劑。
在一實施例中，賦形劑為玉米澱粉。
S1:步驟1
S2:步驟2
S3:步驟3
S4:步驟4
S5:步驟5
第1圖顯示本案挑選益生菌組合的方法流程圖。
第2圖顯示VRE與10種益生菌共同培養的結果。
第3圖顯示VRE與10種益生菌共培養時的微生物相對表現量。
第4圖顯示所預測的微生物交互作用關係圖。
第5圖顯示含有Lactobacillus acidophilus或Lactobacillus plantarum在益生菌組合中與VRE共同培養的結果。
第6圖顯示VRE與不同菌株來源之益生菌組合的共同培養結果。
第7圖至第11圖顯示VRE分別與四種益生菌組合及個別單一菌種的共同培養結果。
第12圖至第15圖顯示VRE與四種益生菌於不同組合比例下的共同培養結果。
第16圖顯示第一來源之益生菌組合對屎腸球菌之acm基因表現的影響。
第17圖顯示第一來源之益生菌組合對糞腸球菌之asa1基因表現的影響。
第18圖顯示第二來源之益生菌組合對屎腸球菌之acm基因及糞腸球菌之asa1基因表現的影響。
第19圖即顯示以競爭分析法比較不同比例之益生菌組合對屎腸球菌貼附於上皮細胞的影響。
第20圖顯示以競爭分析法比較不同的益生菌對屎腸球菌貼附於上皮細胞的影響。
第21圖顯示以取代分析法比較不同的益生菌對屎腸球菌貼附於上皮細胞的影響。
第22圖至第30圖顯示第二來源之益生菌組合對屎腸球菌各毒力基因在宿主細胞存在環境下之影響。
體現本案特徵與優點的一些實施例將在後段的說明中詳細敘述。應理解的是本案能夠在不同的態樣上具有各種的變化，其皆不脫離本案的範圍，且其中的說明及圖式在本質上為說明之用，而非用以限制本案。
本案乃利用有方向性的微生物交互作用網路結合生物實驗挑選出能有效抑制具萬古黴素抗藥性腸球菌(vancomycin-resistant enterococci，簡稱VRE)生長、貼附宿主細胞或毒力(virulence)，及抑制其毒力基因(virulence gene)表現的益生菌組合。此益生菌組合係由凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、鼠李糖乳桿菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG，簡稱LGG)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、及嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)所組成，可以有效地在體外實驗中明顯抑制VRE生長，同時明顯抑制VRE毒力基因的表現，以及減少VRE貼附於人類腸道上皮細胞株。本案提供之益生菌組合將有助於在臨床上治療之應用，以及將VRE從宿主腸道中去定植(decolonization)，進而減少VRE對人體的危害。
以下實施例將進一步說明本案挑選益生菌組合的方法及相關實驗驗證。第1圖顯示本案挑選益生菌組合的方法流程圖。如第1圖所示，本案挑選益生菌組合的方法包含挑選菌種(步驟S1)、共同培養(步驟S2)、微生物體分析(步驟S3)、選出益生菌組合(步驟S4)、以及實驗驗證(步驟S5)等步驟，分別說明如下。
首先說明，本案用以進行測試的具萬古黴素抗藥性腸球菌(VRE)是由臺北醫學大學附設醫院感染管制室所取得，且經紙錠擴散法(disc diffusion assay)確認對於萬古黴素(vancomycin)之抗藥性，並以PCR確認vanA、vanB、vanC、vanD、vanE、vanG等抗藥基因是否存在。其中，VRE包含至少兩種菌種，分別為屎腸球菌(Enterococcus faecium)及糞腸球菌(Enterococcus faecalis)。
在步驟S1中，為達到微生物種類的多樣性，本案從目前台灣衛生福利部食品藥物管理署公告列舉之可供食用之益生菌種中，利用分類，並考慮菌種的可得性以及共同培養的可行性，在當中不同屬各挑兩種，初步篩選出表1所列10種益生菌。
Figure 108131776-A0305-02-0007-1
接著在步驟S2中，將初步篩選出的10種益生菌以震盪方式培養，各取1×108CFU的菌數等量混合，並與VRE共同培養一定時間。在益生菌與VRE共同培養過程中，以VRE顯色培養基(CHROM VRE agar)定量VRE數量，檢驗這10種益生菌是否能有效抑制VRE。第2圖顯示VRE與10種益生菌共同培養的結果。如第2圖所示，相較於VRE的單獨培養，VRE與10種益生菌共同培養後第二天，VRE菌量即大幅下降，第三天則幾乎無存活的VRE，顯示這10種益生菌的組合可抑制VRE的生長。
隨後選取共同培養過程三天中的11個時間點(作兩重複)的菌液，抽取細菌genomic DNA，並利用次世代定序(Next Generation Sequencing，NGS)技術鑑別並定量所有細菌的16s rDNA。
接著在步驟S3中，利用微生物體分析(microbiome analysis pipeline,MAP)技術，使用分析軟體QIIME(Caporaso et al.(2010)Nat Methods.7(5)：335-336)進一步得到各個培養時間點的各菌種族群之相對豐富度分析結果。第3圖顯示VRE與10種益生菌共培養時的微生物相對表現量，可觀察各時間點當下各種細菌物種於整體之相對比例。其中，Enterococcus_s代表VRE，Lactobacillus_s代表植物乳桿菌(L.plantarum)或嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)，Lactobacillus_rhamnosus代表LGG。另外，原本實驗中有加入唾液鏈球菌(Sporolactobacillus inulinus)，但次世代定序(NGS)分析時沒有能被QIIME分類到，故第3圖中沒有這隻菌。
在得到各個培養時間點的各菌株族群之相對豐富度分析結果後，利用以規則為基礎的微生物網路演算法(rule-based microbial network algorithm,RMN)(Tsai et al.,(2015)BMC Syst Biol 9：54)把任意三個微生物的相對表現量做數值分析，可得到微生物間的合作關係和競爭關係，進而產生微生物交互作用網路。第4圖顯示所預測的微生物交互作用關係圖，其中實心箭頭為抑 制效果，空心箭頭為協助效果。本案利用以規則為基礎的微生物網路演算法(RMN)推論出VRE與益生菌的合作關係和競爭關係，也推論出益生菌間的合作關係和競爭關係，接著去除與VRE有合作關係的益生菌，以及去除益生菌間為競爭關係的益生菌，最後選擇出如第4圖所示之具抑制VRE效果的益生菌組合(步驟S4)，包含凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、鼠李糖乳桿菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG，簡稱LGG)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、及Lactobacillus_s。
接著在步驟S5中，透過體外(in vitro)實驗來驗證找到的益生菌組合抑制VRE的效果。
首先，由於Lactobacillus_s包含植物乳桿菌(L.plantarum)及嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)，為了確認L.plantarum以及L.acidophilus何者較為有效，本案比較L.plantarum(ATCC14917菌株)搭配B.coagulans(ATCC7050菌株)、LGG(Hansen菌株)、L.reuteri(BioGaia菌株)，與L.acidophilus(Infloran菌株)搭配B.coagulans(ATCC7050菌株)、LGG(Hansen菌株)、L.reuteri(BioGaia菌株)這兩種不同的組合(四種菌皆以等比例組合)，在共培養過程中對VRE生長抑制的效果。同樣在共同培養過程中，以VRE顯色培養基(CHROM VRE agar)定量VRE數量。第5圖顯示含有L.acidophilus或L.plantarum在益生菌組合中與VRE共同培養的結果。由第5圖結果可知，L.acidophilus搭配B.coagulans、LGG、L.reuteri的組合相較於L.plantarum搭配B.coagulans、LGG及L.reuteri的組合而言，具有較佳的VRE生長抑制效果，同時也證明以規則為基礎的微生物網路演算法(RMN)所推斷出之益生菌組合確實可成功抑制VRE的生長。
由於L.acidophilus比L.plantarum具有較佳的VRE生長抑制效果，因此本案便選擇B.coagulans、LGG、L.reuteri及L.acidophilus這四種益生菌作為本案之益生菌組合。
為了使用此四種益生菌於臨床試驗及未來可能之產品開發，本案另外採購不同來源的菌株，包含B.coagulans之BC1031菌株、LGG之DSMZ32250菌株、L.reuteri之BR101菌株，及L.acidophilus之LA1063菌株進行實驗，並與原先之四株食用菌株進行16s rDNA序列比較。根據序列比對結果顯示，B.coagulans之ATCC7050菌株與BC1031菌株的16s rDNA在V3-V4區域具有99%的序列相似度，LGG之Hansen菌株與DSMZ32250菌株的16s rDNA在V3-V4區域具有100%的序列相似度，L.reuteri之BioGaia菌株與BR101菌株的16s rDNA在V3-V4區域具有100%的序列相似度，L.acidophilus之Infloran菌株與LA1063菌株的16s rDNA在V3-V4區域具有100%的序列相似度。換言之，不同來源的菌株其16s rDNA具有幾乎相同的V3-V4區域序列，故可預測不同來源的菌株也應具有相當之抑制效果。
第6圖顯示VRE與不同菌株來源之益生菌組合的共同培養結果，其中四種菌皆以等比例組合。根據第6圖結果可知，由不同來源的菌株組成的B.coagulans、LGG、L.reuteri及L.acid o philus等四種益生菌的組合具有相當之抑制效果，也證明了此一益生菌組合的效果確實並非只限於特定來源的菌株。
另外將四種益生菌的等比例組合與個別單一菌種在等菌量(4×108CFU)的情況下，比較抑制VRE生長的效果。第7圖至第11圖顯示VRE分別與四種益生菌組合及個別單一菌種的共同培養結果。根據第7圖至第11圖所示結果可知，不論是由B.coagulans_ATCC7050、LGG_Hansen、L.reuteri_BioGaia、及L.acidophilus_Infloran所組成的益生菌組合，或是由B.coagulans_BC1031、LGG_DSMZ32250、L.reuteri_BR101、及L.acidophilus_LA1063所組成的益生菌組合的VRE抑制效果都優於個別單一菌種。單獨的B.coagulans_ATCC7050沒有抑制VRE生長的效果(如第7圖所示)，單獨的LGG_Hansen、L.reuteri_BioGaia或L.acidophilus_Infloran雖然也有抑制VRE生長的效果，但抑制速度較慢(如第8圖及 第9圖所示)。單獨的B.coagulans_BC1031同樣沒有抑制VRE生長的效果，單獨的LGG_DSMZ32250效果也遜於四種菌的組合，至48小時才使VRE數量明顯下降(如第10圖所示)。單獨的L.reuteri_BR101抑制VRE生長的效果在41小時的時間點略遜於四種菌的組合，而單獨的L.acidophilus_LA1063則沒有抑制VRE生長的效果(如第11圖所示)。因此，本案包含B.coagulans、LGG、L.reuteri及L.acidophilus這四種益生菌的益生菌組合抑制VRE生長的效果優於個別單一菌種，更確認本案提供的益生菌組合確實可有效地在體外實驗中明顯抑制VRE的生長。
為了找出四種益生菌的較佳組合比例，以進一步應用於臨床人體試驗，本案將四種菌以不同比例組合，並進行共同培養的實驗，以比較不同組合比例的VRE抑制效果。由於預測的微生物交互作用關係圖(如第4圖所示)顯示L.reuteri為最主要抑制VRE之菌種，故調整後之比例皆以L.reuteri為主要菌種，其他三種菌為次要。第12圖至第15圖顯示VRE與四種益生菌於不同組合比例下的共同培養結果。在一些實施例中，B.coagulans、LGG、L.reuteri及L.acidophilus四種益生菌以四種組合比例進行實驗，分別為1：1：1：1(亦即四種菌之含量分別為25%、25%、25%及25%)、1.2：0.5：1.8：0.5(亦即四種菌之含量分別為30%、12.5%、45%及12.5%)、0.5：0.5：1.8：1.2(亦即四種菌之含量分別為12.5%、12.5%、45%及30%)、以及0.5：1.2：1.8：0.5(亦即四種菌之含量分別為12.5%、30%、45%及12.5%)。換言之，B.coagulans、LGG、L.reuteri及L.acidophilus等四種菌之含量分別為12.5~30%、12.5~30%、25~45%及12.5~30%。
如第12圖及第13圖所示，由B.coagulans_ATCC7050、LGG_Hansen、L.reuteri_BioGaia及L.acidophilus_Infloran所組成的益生菌組合(以第一來源表示)，其在1：1：1：1、1.2：0.5：1.8：0.5、0.5：0.5：1.8：1.2、或0.5：1.2：1.8：0.5的組合比例下，抑制VRE生長的效果皆相近。又如第14圖及第15圖所示，由另一來源的B.coagulans_BC1031、LGG_DSMZ32250、L. reuteri_BR101及L.acidophilus_LA1063所組成的益生菌組合(以第二來源表示)，其在1：1：1：1或0.5：1.2：1.8：0.5的組合比例下，抑制VRE生長之效果相當，0.5：0.5：1.8：1.2組合比例的抑制效果則略遜一籌，而1.2：0.5：1.8：0.5組合比例的抑制效果也在第41小時的時間點略遜於等比例組合。
根據上述實驗結果可知，B.coagulans、LGG、L.reuteri及L.acidophilus等四種菌分別以12.5~30%、12.5~30%、25~45%及12.5~30%之含量所組成的益生菌組合，對於VRE的生長有明顯的抑制效果，其中大致上以等比例的組合具有較佳的VRE生長抑制效果。由於前述組合比例對於VRE的生長皆有明顯的抑制效果，並未因組合比例不同而顯著影響此益生菌組合限制VRE生長的效果，故可合理推論不論等比例或不等比例的組合皆能有效限制VRE的生長，而上述實施例所採用的組合比例僅用以示範可能實施的範圍，並非用以限制本案，故同樣四種菌的其他組合比例亦當不脫離本案的保護範圍。
另一方面，本案也進一步分析由B.coagulans、LGG、L.reuteri及L.acidophilus所組成的益生菌組合，在共培養過程中對於VRE之宿主內黏附及存活相關的毒力基因acm和asa1的表現影響，其中，acm基因主要與屎腸球菌(E.faecium)的黏附和定植有關，而asa1基因主要與糞腸球菌(E.faecalis)的黏附和定植有關。此實驗係對於共培養過程中0小時及16小時的樣本進行取樣，並萃取細菌RNA，進行定量反轉錄聚合酶連鎖反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)，再計算acm基因或asa1基因於共培養16小時後相對於共培養剛開始時之表現量，以分析VRE與本案之益生菌組合共培養後，此兩個毒力基因的表現量變化。
第16圖顯示第一來源之益生菌組合對屎腸球菌之acm基因表現的影響，第17圖顯示第一來源之益生菌組合對糞腸球菌之asa1基因表現的影響，第18圖則顯示第二來源之益生菌組合對屎腸球菌之acm基因及糞腸球菌之asa1 基因表現的影響。由圖式結果可知，由B.coagulans_ATCC7050、LGG_Hansen、L.reuteri_BioGaia及L.acidophilus_Infloran所組成的益生菌組合(第一來源)，其在1：1：1：1及0.5：1.2：1.8：0.5的組合比例下，皆能有效抑制acm基因及asa1基因的表現量，且效果相近。另外，由B.coagulans_BC1031、LGG_DSMZ32250、L.reuteri_BR101及L.acidophilus_LA1063所組成的益生菌組合(第二來源)，其在1：1：1：1及0.5：0.5：1.8：1.2的組合比例下，較能顯著抑制acm基因的表現，而對asa1基因的表現，則是在1：1：1：1、0.5：1.2：1.8：0.5、及0.5：0.5：1.8：1.2的組合比例下，皆可有效抑制其表現。因此，本案提供的益生菌組合更可直接有效抑制VRE之毒力基因acm和asa1的表現，而由於acm基因和asa1基因與VRE在宿主腸道中的黏附和定植有關，故抑制acm基因和asa1基因的表現，將有助於將VRE從宿主腸道中去定植，進而減少VRE對人體的危害。
此外，本案也進一步觀察由B.coagulans、LGG、L.reuteri及L.acidophilus所組成的益生菌組合與VRE以及人類腸道上皮細胞株的互動，其係以競爭分析法(competition assay)進行比較，在人類腸道上皮細胞株Caco-2存在的情況下，同時加入益生菌組合與VRE進行共同培養後，再觀察益生菌組合減少VRE貼附於Caco-2細胞的效果。在一示範實驗中，為了簡化實驗設計，僅使用臨床上對萬古黴素抗藥性較為嚴重的屎腸球菌作為VRE代表來進行實驗。本案之益生菌組合係與屎腸球菌以及人類腸道上皮細胞株Caco-2進行共同培養，第19圖即顯示不同比例之益生菌組合對屎腸球菌貼附於上皮細胞的影響。由圖式結果可知，由B.coagulans_BC1031、LGG_DSMZ32250、L.reuteri_BR101及L.acidophilus_LA1063所組成的益生菌組合(第二來源)，其在1：1：1：1、1.2：0.5：1.8：0.5、0.5：1.2：1.8：0.5、及0.5：0.5：1.8：1.2的組合比例下，皆能以競爭方式顯著減少屎腸球菌貼附於Caco-2細胞的數量。亦即，本案提供之不同比例的益生菌組合皆可顯著減少VRE貼附於人類腸道上皮細胞。
另一方面，本案亦嘗試比較四種菌的組合及單一菌種在減少VRE貼附上皮細胞的效果差異。此一實驗可分為前述的競爭分析法(competition assay)及取代分析法(displacement assay)兩種不同的分析方法。競爭分析法係將益生菌與VRE同時加入與腸道上皮細胞株共同培養，一段時間後與沒有加入任何益生菌的對照組比較VRE貼附的數量是否有減少。取代分析法則係先將VRE與腸道上皮細胞株共同培養一段時間後，再加入益生菌共同培養，最後與沒有加入任何益生菌的對照組比較，觀察後續加入的益生菌能否減少先加入的VRE貼附於腸道上皮細胞株的效果。在此實驗中使用的腸道上皮細胞株為人類腸道上皮細胞株Caco-2，VRE則為屎腸球菌。
第20圖顯示以競爭分析法比較不同的益生菌對屎腸球菌貼附於上皮細胞的影響，第21圖則顯示以取代分析法比較不同的益生菌對屎腸球菌貼附於上皮細胞的影響。由第20圖結果可知，由B.coagulans_BC1031、LGG_DSMZ32250、L.reuteri_BR101及L.acidophilus_LA1063以等比例所組成的益生菌組合(第二來源)、或是單獨的B.coagulans_BC1031、單獨的LGG_DSMZ32250、單獨的L.reuteri_BR101皆能將屎腸球菌對Caco-2細胞的貼附降至沒有加入益生菌對照組的30%至40%，且這幾組間沒有顯著差異，而單獨使用L.acidophilus_LA1063的組別則沒有明顯減少屎腸球菌對Caco-2細胞的貼附。此外，由第21圖結果可知，四種菌的組合或是單獨的B.coagulans_BC1031、單獨的LGG_DSMZ32250、單獨的L.reuteri_BR101皆能將先行貼附於Caco-2細胞的屎腸球菌數量降至沒有加入益生菌的對照組的65%至77%，且這幾組間沒有顯著差異，而單獨使用L.acidophilus_LA1063的組別則無法明顯減少屎腸球菌的貼附。根據前述實驗，除了四種菌的組合可顯著減少VRE貼附於宿主細胞之外，單獨的B.coagulans、LGG及L.reuteri亦可顯著減少VRE貼附於宿主細胞。
為瞭解本案益生菌組合影響VRE貼附於宿主細胞之原因，本案進一步於VRE與人類腸道上皮細胞株Caco-2共同培養後，觀察VRE之貼附宿主細胞及生物膜相關的毒力基因之表現量，所分析的毒力基因包含acm、ebpA、ebpB、ebpC、efaA、sagA、esp、sgrA及scm等九個，並觀察益生菌組合的加入是否會影響這些VRE毒力基因的表現量。在一示範實驗中，本案之益生菌組合由B.coagulans_BC1031、LGG_DSMZ32250、L.reuteri_BR101及L.acidophilus_LA1063以等比例組合，並與屎腸球菌以及人類腸道上皮細胞株Caco-2進行共同培養2.5小時，之後進行採樣並分析各毒力基因的表現量。
第22圖至第30圖顯示第二來源之益生菌組合對屎腸球菌各毒力基因在宿主細胞存在環境下之影響，主要分析VRE與Caco-2進行共同培養(VRE+Caco-2)後，各毒力基因相對於VRE未與Caco-2接觸之對照組(VRE)的表現量，以及當益生菌組合也存在於培養環境中時(VRE+Caco-2+益生菌組合)的表現量。表現量以對照組(VRE)為基準，呈現實驗組之相對值，並將數值取Log2。從第23圖至第25圖可觀察到，VRE與Caco-2共同培養時(VRE+Caco-2)，ebpA、ebpB及ebpC基因之表現量有大約2倍的增加。另一方面，從第22圖至第30圖可明顯得知，在共同培養的過程中若同時加入本案之益生菌組合，則acm、ebpA、ebpB、ebpC、efaA、sagA、esp、sgrA及scm等九個基因的表現量都有明顯的下降，推測這可能是競爭分析法中同時加入益生菌組合能有效減少VRE貼附於腸道上皮細胞株Caco-2之原因。換言之，本案之益生菌組合具有向下調控(抑制)VRE毒力基因(virulence gene)表現的功效，可有效減少VRE貼附於宿主細胞，有助於將VRE從宿主腸道中去定植，降低VRE的毒力(virulence)，進而減少VRE對人體的危害。
因此，本案提供之益生菌組合確實可明顯抑制VRE生長、貼附宿主細胞或毒力，故可進一步開發製備為醫藥保健品，以有效預防或治療VRE感染。例如，本案提供之益生菌組合可進一步製備為益生菌膠囊，包含B. coagulans、LGG、L.reuteri及L.acidophilus四種菌，以及賦形劑。在一實施例中，四種菌係以等比例組合，且賦形劑可為玉米澱粉，但不以此為限。在一些其他實施例中，四種菌係分別以12.5~30%、12.5~30%、25~45%及12.5~30%之含量組成，且賦形劑可為玉米澱粉，但不以此為限。而除了在感染VRE後服用益生菌組合來治療VRE感染外，亦可在病人住院或免疫狀況低下時即先服用益生菌組合來預防VRE感染，甚或是日常服用來促進腸道健康。
值得注意的是，本案最重要精神在於利用有方向性的微生物交互作用網路挑選出能有效抑制VRE生長的益生菌組合，並結合生物實驗進一步驗證其抑制VRE之功效。而上述實施例所採用之四種菌的組合比例僅用以示範可能實施的範圍，並非用以限制本案，且同樣四種菌的其他組合比例亦當不脫離本案的保護範圍。
此外，除了本案提供之四種菌的益生菌組合可有效抑制VRE生長、貼附宿主細胞、或毒力之外，單獨的B.coagulans、LGG、L.reuteri或L.acidophilus也有抑制VRE生長、貼附宿主細胞、或毒力的效果，例如第8圖至第11圖可看出單獨的LGG、L.reuteri或L.acidophilus抑制VRE生長的效果，又如第20圖及第21圖可看出單獨的B.coagulans、LGG或L.reuteri抑制VRE貼附宿主細胞的效果。因此，單一菌種抑制VRE的功效亦當涵蓋在本案的保護範圍。
綜上所述，本案利用有方向性的微生物交互作用網路結合生物實驗挑選出能有效抑制具萬古黴素抗藥性腸球菌(VRE)生長的益生菌組合，包含凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、鼠李糖乳桿菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG，簡稱LGG)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、及嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)等四種菌。此益生菌組合可以有效地在體外實驗中明顯抑制VRE生長，且四種益生菌不限於特定來源的菌株，而四種菌的組合比例亦不受限。此外，此益生菌組合更可減少VRE貼附於人類腸道上皮細胞，且明顯抑制VRE毒 力基因，包含asa1、acm、ebpA、ebpB、ebpC、efaA、sagA、esp、sgrA及scm等基因的表現。綜合以上，本案提供之益生菌組合可有效抑制VRE生長、貼附宿主細胞或毒力，可望進一步開發製備為醫藥保健品，將有助於在臨床上治療或預防之應用，以及將VRE從宿主腸道中去定植，降低VRE的毒力，進而減少VRE對人體的危害。
縱使本發明已由上述實施例詳細敘述而可由熟悉本技藝人士任施匠思而為諸般修飾，然皆不脫如附申請專利範圍所欲保護者。

Claims (10)

  1. 一種益生菌組合之用途，其係用於製備抑制具萬古黴素抗藥性腸球菌生長、貼附宿主細胞或毒力之醫藥保健品，其中該益生菌組合係由凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、鼠李糖乳桿菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、及嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)所組成。
  2. 如請求項1所述之益生菌組合之用途，其中該益生菌組合係抑制具萬古黴素抗藥性腸球菌貼附於宿主的腸道上皮細胞。
  3. 如請求項1所述之益生菌組合之用途，其中該具萬古黴素抗藥性腸球菌包含屎腸球菌(Enterococcus faecium)及糞腸球菌(Enterococcus faecalis)。
  4. 如請求項1所述之益生菌組合之用途，其中該醫藥保健品為一膠囊，且該膠囊包含一賦形劑。
  5. 如請求項4所述之益生菌組合之用途，其中該賦形劑為玉米澱粉。
  6. 一種益生菌組合之用途，其係用於抑制具萬古黴素抗藥性腸球菌之毒力基因的表現，且該毒力基因包含asa1、acm、ebpA、ebpB、ebpC、efaA、sagA、esp、sgrA及scm的至少其中之一，其中該益生菌組合係由凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、鼠李糖乳桿菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、及嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)所組成。
  7. 如請求項6所述之益生菌組合之用途，其中該具萬古黴素抗藥性腸球菌包含屎腸球菌(Enterococcus faecium)及糞腸球菌(Enterococcus faecalis)。
  8. 一種抑制具萬古黴素抗藥性腸球菌之益生菌組合，該益生菌組合係由凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、鼠李糖乳桿菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、及嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)所組成。
  9. 如請求項8所述之益生菌組合，其中該益生菌組合係抑制具萬古黴素抗藥性腸球菌貼附於宿主的腸道上皮細胞。
  10. 如請求項8所述之益生菌組合，其中該具萬古黴素抗藥性腸球菌包含屎腸球菌(Enterococcus faecium)及糞腸球菌(Enterococcus faecalis)。
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