CN116515481B - 基于碳点的比率荧光探针、构建及对槲皮素的检测应用 - Google Patents
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Abstract
一种基于碳点的比率荧光探针，其具有双发射本征的荧光碳点，所述荧光碳点以氯化1‑羧甲基‑3‑甲基咪唑、水杨酸和邻苯二胺为碳源，以水为溶剂，经一步水热反应合成。本比率荧光探针中荧光碳点的具有双发射本征，稳定性好、检测速率快、灵敏度高，尤其对槲皮素具有特异性识别作用，能够高灵敏度地识别出环境样品中的痕量槲皮素。一种比率荧光探针的构建方法，在线性范围内得到荧光淬灭率与槲皮素浓度的线性关系，进而得到槲皮素的检出限，为槲皮素浓度的检测提供对比标准。一种对槲皮素的检测应用，提供了一套标准检测流程，通过与线性方程的对比，能够快速测得待检物中槲皮素的浓度。
Description
技术领域
本发明涉及荧光碳点纳米材料的合成及类黄酮化合物的检测识别，尤其是涉及一种基于碳点的比率荧光探针、该比率荧光探针的构建方法、以及该构建方法对槲皮素的检测应用。
背景技术
槲皮素是一种天然类黄酮，存在于大多数植物、水果和蔬菜中，具有独特的生物学特性，包括抗氧化、抗炎、抗增殖、抗病毒、抗菌和心血管保护作用。然而，体内高剂量的槲皮素可能被氧化产生一种剧毒物质，会导致严重的副作用，并导致肾癌。由于槲皮素在人体中较难代谢，会通过排泄等方式进入环境，在地表水体和土壤等环境介质中，槲皮素均已被检出。因此，开发一种快速、简单、灵敏、具有选择性的槲皮素检测方法对临床医学和天然药物化学具有重要意义。
目前较为常用的检测方法如高效液相色谱、二极管阵列检测器电泳、液相色谱-质谱法、电化学法、紫外-可见光谱法、电分析法等，这些方法存在操作复杂、检测成本高、检测耗时长，灵敏度和特异识别性较差等缺陷，难以直接对环境中残留的槲皮素进行快速检测。
荧光碳点作为一种新兴的荧光碳纳米材料，具有高稳定性、良好生物相容性和环境友好性，可作为高性能纳米荧光探针，迅速实现对目标物的高灵敏度检测分析，能够对环境中残留的槲皮素进行较为准确的检测。然而目前部分纳米荧光探针存在合成过程复杂、合成成本较高、选择性和灵敏度不高等问题，因此，如何通过简单的合成方法实现高性能荧光探针的制备已成为人们研究的热点。
参考专利：
一种荧光微米探针检测槲皮素的方法和应用(发明申请号202111036167.X)；
一种用于可视化检测槲皮素的纳米复合物荧光探针及其制备方法(发明申请号201910201441.0)。
发明内容
为了克服背景技术中的不足，本发明公开了一种基于碳点的比率荧光探针、该比率荧光探针的构建方法、以及该构建方法对槲皮素的检测应用。其目的在于：提供了一种合成简单且成本低廉的氯化1-羧甲基-3-甲基咪唑、水杨酸和邻苯二胺为碳源，通过一步水热法制备具有双发射本征荧光碳点的方法，该方法制得的荧光碳点，其最佳激发波长为252nm，双发射波长分别为368nm和587nm，具有稳定性好、检测速率快、灵敏度高，对槲皮素具有高选择性识别的性能。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于碳点的比率荧光探针，其具有双发射本征的荧光碳点，所述荧光碳点以氯化1-羧甲基-3-甲基咪唑、水杨酸和邻苯二胺为碳源，以水为溶剂，经一步水热反应合成。
采用上述技术方案后，取得的有益效果是，发明人发现以氯化1-羧甲基-3-甲基咪唑、水杨酸和邻苯二胺为碳源，以水为溶剂，经一步水热反应制备的荧光碳点，其具有双发射本征，尤其对槲皮素具有特异性识别作用，能够高灵敏度地识别出环境样品中的痕量槲皮素。此外，氯化1-羧甲基-3-甲基咪唑、水杨酸和邻苯二胺的采购成本低廉，荧光碳点的制备工艺简单、易于实现。
进一步地改进技术方案，所述水热反应的温度为140-220℃。
采用上述技术方案后，取得的有益效果是，实验证明，在140-220℃的温度下，水热反应的效果最佳。
进一步地改进技术方案，所述水热反应的时间为8-16h。
采用上述技术方案后，取得的有益效果是，实验证明，在8-16h的水热反应时间下，水热反应的效果最佳。
进一步地改进技术方案，氯化1-羧甲基-3-甲基咪唑、水杨酸和邻苯二胺的投料摩尔比为0.6-1.4:1:1。
采用上述技术方案后，取得的有益效果是，实验证明，氯化1-羧甲基-3-甲基咪唑、水杨酸和邻苯二胺的投料摩尔比为0.6-1.4:1:1时，得到的荧光碳点对槲皮素的识别检测具有更高的灵敏度和准确性。
进一步地改进技术方案，水热反应合成后，使用0.22μm的滤膜对荧光碳点进行提纯，然后将提纯后的荧光碳点放置于棕色瓶中，并在4℃的环境下保存。
采用上述技术方案后，取得的有益效果是，将提纯后的荧光碳点放置于棕色瓶中，并在4℃的环境下保存，能够使荧光碳点的性能长期保持稳定。
进一步地改进技术方案，所述荧光碳点的最佳激发波长为252nm，发射波长分别为368nm和587nm。
一种比率荧光探针的构建方法，用于识别环境样品中的痕量槲皮素，所述构建方法包括以下步骤：
S1：制备荧光碳点；
S2：将稀释后的荧光碳点与不同浓度梯度的槲皮素水溶液放置于离心管中，在室温下混合反应N分钟，然后将混合液置于荧光分光光度计中，在252nm的激发波长下，检测荧光强度并计算相应的荧光淬灭率ΔF368/ΔF587，最后在线性范围内得到荧光淬灭率ΔF368/ΔF587与槲皮素浓度的线性关系，进而得到槲皮素的检出限。
采用上述技术方案后，取得的有益效果是，在线性范围内得到荧光淬灭率ΔF368/ΔF587与槲皮素浓度的线性关系，进而得到槲皮素的检出限，为槲皮素浓度的检测提供对比标准。
进一步地改进技术方案，S1中，在高温反应釜中分别加入0.0893g氯化1-羧甲基-3-甲基咪唑、0.0691g水杨酸、0.0541g邻苯二胺和20mL纯水，在180℃的温度下水热反应12h，经提纯后得到荧光碳点；S2中，将荧光碳点稀释50倍后与不同浓度梯度的槲皮素水溶液置于离心管中，并稀释至2mL，在室温下混合反应2min；然后将混合液置于荧光分光光度计中，在252nm的激发波长下，检测荧光强度并计算相应的荧光淬灭率ΔF368/ΔF587，最后在0.01-10mgL-1的线性范围内得到荧光淬灭率ΔF368/ΔF587与槲皮素浓度的线性方程，进而得到槲皮素的检出限为6μgL-1。
采用上述技术方案后，取得的有益效果是，为槲皮素浓度的检测提供可实操的线性方程和检出限，作为槲皮素浓度检测的对比标准。
一种对槲皮素的检测应用，将稀释后的荧光碳点与待检物水溶液置于离心管中，并稀释至2mL，在室温下混合反应2min；然后将混合液置于荧光分光光度计中，在252nm的激发波长下，检测荧光强度并计算相应的荧光淬灭率ΔΔF368/ΔF587，最后将荧光淬灭率ΔF368/ΔF587代入线性方程，得到待检物中槲皮素的浓度。
采用上述技术方案后，取得的有益效果是，提供一套标准检测流程，通过与线性方程的对比，快速得到待检物中槲皮素的浓度。
附图说明
图1示出的是本荧光碳点在不同pH下的荧光强度图。
图2示出的是本荧光碳点在不同pH下对槲皮素的荧光淬灭效果图。
图3示出的是本荧光碳点在室温下对槲皮素的荧光响应线性变化曲线。
图4示出的是本荧光碳点在槲皮素结构类似物中对槲皮素的选择性识别检测图。
具体实施方式
下面参照附图来描述本发明的优选实施方式。本领域技术人员应当理解的是，这些实施方式仅仅用于解释本发明的技术原理，并非旨在限制本发明的保护范围。
实施例1：
一种基于碳点的比率荧光探针，其具有双发射本征的荧光碳点，该荧光碳点的制备方法为：
在高温反应釜中分别加入0.0893g氯化1-羧甲基-3-甲基咪唑、0.0691g水杨酸、0.0541g邻苯二胺和20mL纯水，在220℃的温度下水热反应12h，得到荧光碳点。使用0.22μm的滤膜对荧光碳点进行提纯，然后将提纯后的荧光碳点稀释50倍后放置于棕色瓶中，并在4℃的环境下保存备用。
实施例2：
一种基于碳点的比率荧光探针，其具有双发射本征的荧光碳点，该荧光碳点的制备方法为：
在高温反应釜中分别加入0.0536g氯化1-羧甲基-3-甲基咪唑、0.0691g水杨酸、0.0541g邻苯二胺和20mL纯水，在220℃的温度下水热反应12h，得到荧光碳点。使用0.22μm的滤膜对荧光碳点进行提纯，然后将提纯后的荧光碳点稀释50倍后放置于棕色瓶中，并在4℃的环境下保存备用。
实施例3：
一种基于碳点的比率荧光探针，其具有双发射本征的荧光碳点，该荧光碳点的制备方法为：
在高温反应釜中分别加入0.1072g氯化1-羧甲基-3-甲基咪唑、0.0691g水杨酸、0.0541g邻苯二胺和20mL纯水，在220℃的温度下水热反应12h，得到荧光碳点。使用0.22μm的滤膜对荧光碳点进行提纯，然后将提纯后的荧光碳点稀释50倍后放置于棕色瓶中，并在4℃的环境下保存备用。
实施例4：
一种基于碳点的比率荧光探针，其具有双发射本征的荧光碳点，该荧光碳点的制备方法为：
在高温反应釜中分别加入0.0893g氯化1-羧甲基-3-甲基咪唑、0.0691g水杨酸、0.0541g邻苯二胺和20mL纯水，在180℃的温度下水热反应12h，得到荧光碳点。使用0.22μm的滤膜对荧光碳点进行提纯，然后将提纯后的荧光碳点稀释50倍后放置于棕色瓶中，并在4℃的环境下保存备用。
实施例5：
一种基于碳点的比率荧光探针，其具有双发射本征的荧光碳点，该荧光碳点的制备方法为：
在高温反应釜中分别加入0.0893g氯化1-羧甲基-3-甲基咪唑、0.0691g水杨酸、0.0541g邻苯二胺和20mL纯水，在200℃的温度下水热反应12h，得到荧光碳点。使用0.22μm的滤膜对荧光碳点进行提纯，然后将提纯后的荧光碳点稀释50倍后放置于棕色瓶中，并在4℃的环境下保存备用。
实施例6：
一种基于碳点的比率荧光探针，其具有双发射本征的荧光碳点，该荧光碳点的制备方法为：
在高温反应釜中分别加入0.0893g氯化1-羧甲基-3-甲基咪唑、0.0691g水杨酸、0.0541g邻苯二胺和20mL纯水，在160℃的温度下水热反应12h，得到荧光碳点。使用0.22μm的滤膜对荧光碳点进行提纯，然后将提纯后的荧光碳点稀释50倍后放置于棕色瓶中，并在4℃的环境下保存备用。
实施例7：
一种基于碳点的比率荧光探针，其具有双发射本征的荧光碳点，该荧光碳点的制备方法为：
在高温反应釜中分别加入0.0893g氯化1-羧甲基-3-甲基咪唑、0.0691g水杨酸、0.0541g邻苯二胺和20mL纯水，于180℃的温度下水热反应8h，得到荧光碳点。使用0.22μm的滤膜对荧光碳点进行提纯，然后将提纯后的荧光碳点稀释50倍后放置于棕色瓶中，并在4℃的环境下保存备用。
实施例8：
一种基于碳点的比率荧光探针，其具有双发射本征的荧光碳点，该荧光碳点的制备方法为：
在高温反应釜中分别加入0.0893g氯化1-羧甲基-3-甲基咪唑、0.0691g水杨酸、0.0541g邻苯二胺和20mL纯水，于180℃的温度下水热反应10h，得到荧光碳点。使用0.22μm的滤膜对荧光碳点进行提纯，然后将提纯后的荧光碳点稀释50倍后放置于棕色瓶中，并在4℃的环境下保存备用。
实施例9：
一种基于碳点的比率荧光探针，其具有双发射本征的荧光碳点，该荧光碳点的制备方法为：
在高温反应釜中分别加入0.0893g氯化1-羧甲基-3-甲基咪唑、0.0691g水杨酸、0.0541g邻苯二胺和20mL纯水，于180℃的温度下水热反应14h，得到荧光碳点。使用0.22μm的滤膜对荧光碳点进行提纯，然后将提纯后的荧光碳点稀释50倍后放置于棕色瓶中，并在4℃的环境下保存备用。
实施例10：
各取12μL实施例1-9中制得荧光碳点材料，然后加入60μL摩尔浓度为100mg L-1槲皮素水溶液，在室温下分别充分混合反应2min、4min、6min、8min、10min后，在荧光分光光度计上测得荧光强度后计算相应的荧光淬灭率ΔF368/ΔF587(其中ΔF368为368nm处碳点初始荧光强度和加入槲皮素后碳点荧光强度的差值，ΔF587为587nm处碳点的初始荧光强度值)。
经计算，实施例1-9中制得的纳米碳点对槲皮素的荧光淬灭率ΔF368/ΔF587分别为：0.664、0、0.574、0.723、0、0、0.261、0.283、0，且荧光淬灭率在2min内即达到最大并保持稳定。分析结果发现，实施例7所制得的荧光碳点对槲皮素的识别检测具有更高的灵敏度和准确性，最佳反应时间为2min。
实施例11：
取12μL实施例7所制得的荧光碳点材料，然后分别加入到pH为2-12的水溶液中，于室温下充分混合反应2min，通过荧光分光光度计测定。结果如图1所示，该碳点的荧光强度在pH为3-10之间基本保持不变，表明本荧光碳点具有一定的耐酸碱性。
实施例12：
取12μL实施例1所制得的荧光碳点材料，然后分别加入到pH为3-10的槲皮素水溶液中，在室温下充分混合反应2min，通过荧光分光光度计测定。结果如图2所示，该本荧光碳点对槲皮素的荧光淬灭率ΔF368/ΔF587在pH为7时较好，后续实验均在中性条件下进行。
实施例13：
取12μL实施例1所制得的荧光碳点材料，然后分别加入到0-10mg L-1的槲皮素水溶液中，于室温下充分混合反应2min，通过荧光分光光度计测定。结果如图3所示，碳点荧光淬灭率ΔF368/ΔF587随槲皮素浓度的升高而变大，并且在0.01-10mg L-1浓度范围内，碳点荧光的淬灭率ΔF368/ΔF587与槲皮素浓度呈线性相关关系，计算得检出限为6μgL-1。
实施例14：
取12μL实施例1所制得的荧光碳点材料，然后分别加入浓度为0.1mgL-1的槲皮素、1mgL-1酒石酸、1mgL-1柠檬酸、1mgL-1抗坏血酸、1mgL-1尿素、1mgL-1葡萄糖、1mgL-1甘氨酸、1mgL-1水杨酸、1mgL-1咖啡酸、1mgL-1间苯二酚和2μM的Cr6+、Fe3+、Pb2+、Cr3+、Cd2+、Fe2+、Cu2+、Mg2+、Co2+、K+、Na+、Ba2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+、Ni2+、Ag+、Hg2+金属离子水溶液，于室温下充分混合反应2min，在荧光分光光度计上测荧光强度后计算相应的荧光淬灭率ΔF368/ΔF587。结果如图4所示，槲皮素对荧光碳点的淬灭率为0.218，而其他几种结构类似物则无明显淬灭效果，这表明制得的荧光碳点对槲皮素具有很强的特异性识别能力。
一种比率荧光探针的构建方法，用于识别环境样品中的痕量槲皮素，所述构建方法包括以下步骤：
S1：制备荧光碳点；
S2：将稀释后的荧光碳点与不同浓度梯度的槲皮素水溶液放置于离心管中，在室温下混合反应2分钟，然后将混合液置于荧光分光光度计中，在252nm的激发波长下，检测荧光强度并计算相应的荧光淬灭率ΔF368/ΔF587，最后在线性范围内得到荧光淬灭率ΔF368/ΔF587与槲皮素浓度的线性关系，进而得到槲皮素的检出限。
进一步地改进技术方案，S1中，在高温反应釜中分别加入0.0893g氯化1-羧甲基-3-甲基咪唑、0.0691g水杨酸、0.0541g邻苯二胺和20mL纯水，在180℃的温度下水热反应12h，经提纯后得到荧光碳点；S2中，将荧光碳点稀释50倍后与不同浓度梯度的槲皮素水溶液置于离心管中，并稀释至2mL，在室温下混合反应2min；然后将混合液置于荧光分光光度计中，在252nm的激发波长下，检测荧光强度并计算相应的荧光淬灭率ΔF368/ΔF587，最后在0.01-10mgL-1的线性范围内得到荧光淬灭率ΔF368/ΔF587与槲皮素浓度的线性方程，进而得到槲皮素的检出限为6μgL-1。
一种对槲皮素的检测应用，将稀释后的荧光碳点与待检物水溶液置于离心管中，并稀释至2mL，在室温下混合反应2min；然后将混合液置于荧光分光光度计中，在252nm的激发波长下，检测荧光强度并计算相应的荧光淬灭率ΔF368/ΔF587，最后将荧光淬灭率ΔF368/ΔF587代入线性方程，进而测得待检物中槲皮素的浓度。
未详述部分为现有技术。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的保护范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (6)
1.一种基于碳点的比率荧光探针，其特征是：其具有双发射本征的荧光碳点，所述荧光碳点以氯化1-羧甲基-3-甲基咪唑、水杨酸和邻苯二胺为碳源，以水为溶剂，经水热反应合成；其中，氯化1-羧甲基-3-甲基咪唑、水杨酸和邻苯二胺的投料摩尔比为0.6-1.4:1:1，水热反应的温度为140-220℃，水热反应的时间为8-16h。
2.如权利要求1所述的一种基于碳点的比率荧光探针，其特征是：水热反应合成后，使用0.22μm的滤膜对荧光碳点进行提纯，然后将提纯后的荧光碳点放置于棕色瓶中，并在4℃的环境下保存。
3.如权利要求1所述的一种基于碳点的比率荧光探针，其特征是：所述荧光碳点的最佳激发波长为252nm，发射波长分别为368nm和587nm。
4.一种比率荧光探针的构建方法，其特征是：用于识别环境样品中的痕量槲皮素，所述构建方法包括以下步骤：
S1：在高温反应釜中分别加入氯化1-羧甲基-3-甲基咪唑、水杨酸、邻苯二胺和纯水，经水热反应后得到荧光碳点；其中，氯化1-羧甲基-3-甲基咪唑、水杨酸和邻苯二胺的投料摩尔比为0.6-1.4:1:1，水热反应的温度为140-220℃，水热反应的时间为8-16h；
S2：将稀释后的荧光碳点与不同浓度梯度的槲皮素水溶液放置于离心管中，在室温下混合反应1-3分钟，然后将混合液置于荧光分光光度计中，在252nm的激发波长下，检测荧光强度并计算相应的荧光淬灭率ΔF368/ΔF587，最后在线性范围内得到荧光淬灭率ΔF368/ΔF587与槲皮素浓度的线性关系，进而得到槲皮素的检出限。
5.如权利要求4所述的一种比率荧光探针的构建方法，其特征是：S1中，在高温反应釜中分别加入0.0893g氯化1-羧甲基-3-甲基咪唑、0.0691g水杨酸、0.0541g邻苯二胺和20mL纯水，在180℃的温度下水热反应12 h，经提纯后得到荧光碳点；S2中，将荧光碳点稀释50倍后与不同浓度梯度的槲皮素水溶液置于离心管中，并稀释至2mL，在室温下混合反应2min；然后将混合液置于荧光分光光度计中，在252nm的激发波长下，检测荧光强度并计算相应的荧光淬灭率ΔF368/ΔF587，最后在0.01-10 mgL-1的线性范围内得到荧光淬灭率ΔF368/ΔF587与槲皮素浓度的线性方程，进而得到槲皮素的检出限为6μgL-1。
6.权利要求5中所述构建方法对槲皮素的检测应用，其特征是：将稀释后的荧光碳点与待检物水溶液置于离心管中，并稀释至2mL，在室温下混合反应2min；然后将混合液置于荧光分光光度计中，在252nm的激发波长下，检测荧光强度并计算相应的荧光淬灭率ΔF368/ΔF587，最后将荧光淬灭率ΔF368/ΔF587代入线性方程，得到待检物中槲皮素的浓度。
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