CN116510085A

CN116510085A - 声学细胞外基质水凝胶及其用途

Info

Publication number: CN116510085A
Application number: CN202310410850.8A
Authority: CN
Inventors: S·F·巴迪拉克; G·S·赫西
Original assignee: University of Pittsburgh
Current assignee: University of Pittsburgh
Priority date: 2019-03-13
Filing date: 2020-03-12
Publication date: 2023-08-01
Also published as: KR20210142003A; WO2020186082A1; CN113557040A; US20220143265A1; CN113557040B; AU2020235627A1; CA3130684A1; EP3937994A1; JP2022524380A

Abstract

本文中公开了制造哺乳动物声学细胞外基质(ECM)水凝胶的方法。在另外的实施方案中，公开了使用所公开的方法制造的哺乳动物声学ECM水凝胶。还公开了哺乳动物声学ECM水凝胶，其中所述水凝胶是热致可逆的。还公开了使用这些声学ECM水凝胶的方法。

Description

声学细胞外基质水凝胶及其用途

相关申请的交叉引用

本申请是2020年3月12日提交的中国专利申请202080020191.1的分案申请，其全部内容通过引用并入本文。

本发明要求2019年3月13日提交的美国临时申请62/817,787和2019年12月19日提交的美国临时申请62/950,565的权益，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及水凝胶领域，具体地涉及使用超声从哺乳动物细胞外基质(ECM)制造的声学ECM水凝胶及其用途。

背景技术

由纯化的ECM组分例如胶原、透明质酸、丝纤蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白组成的水凝胶已广泛用于组织工程应用。然而，这些纯化的单组分ECM生物材料缺乏天然组织ECM的复杂生物化学。整个组织或器官的脱细胞化(decellularization)提供了另一种采集ECM的方法，该方法保留了天然组织ECM的生物化学。ECM应用的主要进步是形成水凝胶的能力，从而扩展了ECM的临床适应性。由ECM制造水凝胶的已知技术主要专注于用酸性溶液中的酸蛋白酶消化ECM材料；使用α-淀粉酶消化以制造ECM泡沫；或使用离液提取缓冲液和长透析程序。根据这种技术制得的ECM水凝胶不可避免地发生蛋白质降解和变性，从而减弱ECM分子的全部补体(full complement)和组织特异性ECM组分的生物活性。此外，制造ECM水凝胶的基于酶的方法需要24-72小时的长孵育时间以实现ECM组分的充分溶解。需要在不使用酸性或碱性溶液和蛋白酶消化的情况下形成ECM水凝胶的方法。

发明内容

本文公开了用于制造生物相容的哺乳动物声学细胞外基质(ECM)水凝胶的方法。这些方法包括在30至43℃的温度下，用频率为约20kHz至约100kHz的超声将浓度为25毫克/毫升至600毫克/毫升在液体中的哺乳动物ECM溶解在液体如缓冲盐水溶液中足够长的时间以制造液相中的声学ECM水凝胶。在一些实施方案中，所述方法包括将液相中的声学ECM水凝胶冷却至37℃或更低的温度以制造凝胶相中的声学ECM水凝胶。在另外的实施方案中，公开了使用所公开的方法制造的声学ECM水凝胶。

还公开了热致可逆的声学ECM水凝胶。在一些非限制性实例中，声学ECM水凝胶在低于约37℃的温度处于固相，并且在高于约37℃的温度处于液相。这些水凝胶由哺乳动物ECM制造。

还公开了使用这些声学ECM水凝胶的方法。

从参考附图进行的数个实施方案的以下详细描述中，本发明的前述和其它特征和优点将变得更加明显。

附图说明

图1A-1D：使用声处理制备声学ECM水凝胶。(A)在15毫升锥形管中粉碎的真皮ECM。(B)将ECM粉末再悬浮于PBS中后，将锥形管置于冰水浴中，并将声波仪探针插入管中。(C，D)在通过声处理脉冲溶解ECM之后，将预凝胶溶液移液至3D模具中或在特氟龙片上薄薄地铺展，并在≤37℃的温度孵育以诱导胶凝。

图2A-2D：声学ECM水凝胶、冻干凝胶、超薄ECM片和ECM油灰(putty)的典型图像。(A)浇铸为圆柱体的声学ECM水凝胶。(B)冻干的声学ECM水凝胶保持其3D形态。(C)通过将ECM凝胶浇铸在特氟龙片上制备的超薄声学ECM片。(D)通过声处理浓度低于25毫克/毫升的ECM制备的ECM油灰。

图3：扫描电子显微照片(SEM)。通过声处理制备的ECM水凝胶显示出有纹理的和纤维状的表面。

图4A-4B：流动扫描(flow sweep)。在(A)25℃，(B)4至37℃和37至4℃，在声学ECM凝胶上进行稳态流动扫描测试。将恒定应力施加到凝胶上，并测量所产生的变形。数据显示凝胶的粘度随着更大的应力而降低，这暗示剪切稀化材料。

图5A-5B：时间扫描测试。在(A)25℃，(B)4至37℃，和37至4℃，在50毫克/毫升声学ECM凝胶上进行时间扫描测试，以确定最大G'(储能模量)和G"(损耗模量)值。数据显示在所有温度下的储能模量＞损耗模量；也就是说，它保持水凝胶的品质。

图6A-6C：50毫克/毫升声学ECM水凝胶的储能模量、损耗模量和复合粘度的典型图。在25℃(A)、4℃(B)或通过施加小的0.5％振荡应变从37℃快速降低至4℃的温度(C)测量的对数-对数标度上，将数据对角频率作图。数据显示G'＞G"大约一个数量级；这表明该材料符合水凝胶的标准。

图7：流动扫描。在声学ECM凝胶上在15℃、25℃、或37℃对三种不同浓度(25、100和150毫克/毫升)进行稳态流动扫描测试。数据显示，在25-150毫克/毫升的浓度范围和15-37℃的温度范围，在1处，凝胶的粘度随着更大的应力而降低，这暗示剪切稀化材料。剪切稀化是指粘度随着流动的增加而降低(例如，越快地将材料"推"过类似针或注射器的末端的开口，"越容易"迫使材料通过该开口，这对于临床应用是有利的)。

图8：时间扫描测试。进行时间扫描测试以确定在15℃、25℃或37℃和三种不同浓度(25、100和150毫克/毫升)下声学水凝胶的最大G'(储能模量)和G"(损耗模量)值。数据显示，对于所有浓度，在所有温度下，储能模量＞损耗模量；也就是说，它保持水凝胶的品质。

图9A-9B：细胞相容性分析。(A)将3T3成纤维细胞接种在对照(未涂布的)或涂布有由UBM、SIS或真皮(Dermis)制备的声学ECM水凝胶的培养皿上，并培养24小时。使用MTT细胞增殖分析试剂盒(Thermo Fisher)来评估细胞的存活力。结果显示所有ECM对于3T3成纤维细胞是无细胞毒性的(n＝3)。(B)活/死分析。用马间充质干细胞接种水凝胶涂布的板，并与在组织培养塑料上生长的细胞进行比较。用活/死分析试剂盒(Invitrogen)评价存活力。在3个技术重复(technical replicates)中拍摄5个200X范围的图像。使用Cell Profiler定量活死细胞百分比。误差棒代表标准偏差。

图10：使用Lee White凝固方法以测定通过声学方法制备成水凝胶的止血粉AVITENE^TM和XENMATRIX^TMECM的凝固时间(止血)。XENMATRIX^TM是从猪真皮中采集的ECM产物。数据显示，与未处理相比，AVITENE^TM和XENMATRIX^TM凝胶实现快速止血。

图11：使用大鼠肝撕裂模型的凝固时间的体内评价。大鼠经受肝撕裂并用止血剂处理。将Sprague-Dawley大鼠随机分配到5个实验组中(每组n＝5)：Arista粉(BD/CRBard)，AVITENE^TM粉(BD/CR Bard)，Micromatrix粉(ACell)，所指示浓度的使用声学方法制备成水凝胶的食道ECM，所指示浓度的使用声学方法制备成水凝胶的XenMatrix(BD/CRBard)。数据显示，使用声学方法制备成水凝胶的哺乳动物ECM可以在体内诱导止血。

图12A-12C：声学水凝胶可以通过使用20-100％的振幅以20kHz频率对ECM进行声处理来制备。样品均为50毫克/毫升，并声处理10分钟，然后在15℃进行实验。(A)在所指示的振幅形成的水凝胶的图像。(B)流动粘度。流变数据表明，在所有测试的振幅，凝胶的粘度随着更大的应力而降低，这暗示剪切稀化材料。(C)时间扫描。流变数据显示，对于所有浓度，在所有振幅下，储能模量＞损耗模量；也就是说，它保持水凝胶的品质。

图13。UBM声学水凝胶促进M2样巨噬细胞表型。用2毫克/毫升UBM声学水凝胶处理小鼠骨髓衍生的巨噬细胞24小时，固定并免疫标记促炎M1样标记(iNos，TNFa)或预先-重塑M2样标记(Izz1，精氨酸酶)的强指示物，并用DAPI复染。用IFNg和脂多糖(LPS)处理细胞用作M1样表型的阳性对照，和IL-4用作M2样表型的阳性对照。F4/80染色用作巨噬细胞的阳性对照。细胞在200X下成像。数据显示，与对照相比，UBM声学水凝胶促进M2样巨噬细胞表型。

图14A-14F。粉碎的ECM的声处理和温度诱导的胶凝。(A)在50毫升锥形管中声波仪尖端浸入深度的证明。(B，C)在声处理之前(B)和之后(C)在1X PBS中的粉碎的皮肤ECM粉末。(D)在低于25℃的温度孵育后，管的倒置显示溶解的ECM聚合成硬质凝胶。(E)聚合的凝胶可符合3D几何形状。(F)可将溶解的ECM转移至注射器(顶板)，然后冷却至低于25℃的温度以产生可注射形式的凝胶(底板)。

图15A-15D。胶原和硫酸化糖胺聚糖(sGAG)的溶解。(A)作为声处理振幅的函数的溶解的胶原的浓度。将粉碎的dECM在所指示的振幅下声处理300秒。使用SIRCOL^TM分析测量溶解的胶原的浓度。对于每组n＝3个样品，数据以均值±s.d.的形式呈现。*代表p＜0.05。上标标示成对比较。(B)作为声处理振幅的函数的sGAG的浓度。将粉碎的dECM在所指示的振幅下声处理300秒。使用BLYSCAN^TM分析测量溶解的sGAG的浓度。对于每组n＝3个样品，数据以均值±s.d.的形式呈现。(C)作为声处理时间的函数的溶解的胶原的浓度。将粉碎的dECM以100％振幅声处理所述所指示的时间。使用SIRCOL^TM分析测量溶解的胶原的浓度。对于每组n＝3个样品，数据以均值±s.d.的形式呈现。*代表p＜0.05。上标标示成对比较。(D)作为声处理时间的函数的溶解的sGAG的浓度。将粉碎的dECM以100％振幅声处理所述所指示的时间。使用BLYSCAN^TM分析测量溶解的sGAG的浓度。对于每组n＝3个样品，数据以均值±s.d.的形式呈现。

图16A-16C。温度和声处理振幅对使用超声空化制备的ECM水凝胶的胶凝时间的影响。(A)温度对胶凝时间的影响。将25、50和100毫克/毫升dECM在100％振幅声处理300秒，然后在所指示的温度孵育以诱导胶凝。对于每组n＝3个样品，数据以均值±s.d.的形式呈现。*代表p＜0.05。上标标示成对比较。(B)声处理振幅对胶凝时间的影响。将25、50和100毫克/毫升dECM在所指示的振幅声处理300秒，然后在4℃孵育以诱导胶凝。对于每组n＝3个样品，数据以均值±s.d.的形式呈现。*代表p＜0.05。上标标示成对比较。(C)胶凝分析评价温度对UBM、SIS、eECM、tECM或LECM的胶凝时间的影响。将100毫克/毫升浓度的所指示的组织ECM在100％振幅下声处理300秒，然后在4℃或25℃孵育以诱导胶凝。对于每组n＝3个样品，数据以均值±s.d.的形式呈现。*代表p＜0.05。上标标示成对比较。

图17A-17C。使用超声空化制备的ECM水凝胶的粘弹性表征。(A)dECM和eECM在3个温度曲线下的ECM水凝胶胶凝动力学的典型图。当温度快速降低时(37→4℃)，储能模量(G')S形增加。当温度快速升高(4→37℃和25→37℃)时，水凝胶劲度(G')得以保持。(B)在3个温度曲线下的平均储能模量(n＝3，均值±SD)。(C)对于S形温度曲线37→4℃(n＝3，均值±SD)，达到50％胶凝的平均时间。*p≤0.05，**p≤0.01。

图18A-18E。体外细胞响应。(A)将3T3成纤维细胞接种在对照(未涂布的)或涂布有由UBM、SIS或真皮(Dermis)制备的ECM水凝胶的培养皿上，并培养24小时。使用MTT细胞增殖分析试剂盒评价细胞代谢活性。对于每组n＝3个样品，数据以均值±s.d.的形式呈现。(B，C)活/死分析。将原代马间充质干细胞接种在对照(未涂布的)或涂布有由dECM或UBM制备的ECM水凝胶的培养皿上。使用活/死分析试剂盒评价存活力。细胞在200X下成像(B)，并且使用Cell Profiler量化活细胞和死细胞的百分比(C)。对于每组n＝3个样品，数据以均值±s.d.的形式呈现。(D)鼠骨髓衍生的巨噬细胞是未经处理的(对照)或用下列测试物品处理24小时：IFNγ+LPS、IL-4、dECM水凝胶或eECM水凝胶。用F4/80(巨噬细胞标记)、iNOS(M1样标记)或Fizz1(M2样标记)免疫标记细胞。细胞在200X下成像。(E)F4/80、iNOS和Fizz1免疫标记的量化。对于每组n＝3，数据以均值±s.d.的形式呈现。

图19A-19C。声学水凝胶作为粘膜下层流体衬垫物。(A)从皮肤ECM(dECM)和食道粘膜ECM(eECM)制备声学细胞外基质(ECM)水凝胶(100毫克/毫升)，并离体用作粘膜下层流体衬垫物。评价20kGyγ辐照(γ)对声学ECM水凝胶流体衬垫物高度的影响。临床标准Eleview和PBS用于对照。随着时间在猪食管中注射2毫升测试物品后测量流体衬垫物高度。数值以均值+/-SD(n＝3)来表达。(B)声学水凝胶样品是可通过16G注射器注射的。(C)75分钟后测试物品流体衬垫物高度的典型图片。

图20A-20B。声学水凝胶胶凝。测量γ辐照的(20kGy)和未灭菌的对照声学水凝胶(皮肤ECM100毫克/毫升)随着时间的水凝胶"劲度"。通过对样品施加小的0.5％振荡应变来测量储能模量("劲度")(G')和损耗模量(G")。测试了三种温度曲线：将温度从初始储存温度快速升高至最终温度：4至37℃、25至37℃或37至4℃。(A)显示时间扫描的典型图。(B)显示在测试的最后5分钟内平均的平均储能模量和损耗模量。

具体实施方式

ECM水凝胶已被用作3D类器官培养的基底，并且在许多临床前和临床应用中被用于促进多种组织的修复和重建。以前ECM水凝胶材料是使用冗长的方法制作的，这些方法专注于在酸性溶液中用酸蛋白酶对ECM进行酶消化；或者使用离液提取缓冲液和透析程序，其可以影响天然蛋白质的结构和功能。本文公开了一种使用超声空化从ECM生物支架制备水凝胶的方法。通过调节温度，可诱导溶解的ECM快速自组装成凝胶，并且通过调节ECM浓度和声处理参数，可定制凝胶的材料性质。ECM生物支架可以使用超声成功地被溶解，而不需要酶消化，并且被诱导再聚合成能够支持细胞生长的凝胶形式。这些水凝胶可被用于多种应用中，并且可最终用γ辐照灭菌。

为制造所公开的ECM水凝胶，声处理技术可应用于广泛的组织特异性ECM，包括但不限于真皮(dermis)、膀胱基质(UBM)和小肠粘膜下层(SIS)。它也可与市售可得的ECM制剂一起使用。在一些实施方案中，该方法包括将粉碎的ECM再悬浮于液体中，例如缓冲液，例如中性缓冲盐水溶液，然后用超声进行ECM溶解。在一些实施方案中，缓冲盐水溶液具有约290mOsm/L的同渗容摩。可以使用各种浓度，并且ECM可以被声处理至少60秒。ECM溶液的快速胶凝可以通过降低ECM溶液的温度来诱导。胶凝时间和ECM凝胶性质可以通过调节ECM浓度、声处理振幅和时间来调整。在一些实施方案中，声学ECM水凝胶不含有外源蛋白酶或失活的外源蛋白酶，例如外源胃蛋白酶、胰蛋白酶或透明质酸酶，或者外源胃蛋白酶、胰蛋白酶或透明质酸酶的失活形式。

一旦聚合，这些ECM水凝胶在室温下是稳定的，并且可以符合可定制的3D几何形状。通过声处理制造的ECM水凝胶("声学ECM水凝胶")可通过冷冻和冻干程序加工成固体支架，其保持整体3D几何形状并增加孔隙率。这种技术可以支持细胞或化合物的掺入，用于体外和体内应用。还公开了使用所公开的声学ECM水凝胶的方法，例如但不限于增加止血。

在大规模生产ECM水凝胶方面有相对小的进步(Brown等，同上，2012)。所公开的方法在几个方面用于大规模生产。在一些实施方案中，ECM水凝胶的浓度范围可利用超声空化方法从2-20毫克/毫升(酶方法的限度)扩展到25-100毫克/毫升，这允许ECM水凝胶粘弹性质的精细调整以用于特定的临床应用。在其它实施方案中，处理时间从48-72小时显著减少到数分钟的量级。在另外的实施方案中，ECM水凝胶可符合可定制的3D几何形状，并可支持细胞或治疗药物的掺入，以用于体外和体内应用。

术语

除非另有说明，技术术语根据常规用法使用。分子生物学中常用术语的定义可见于：Krebs等人(编),Lewin's Genes XII,由Jones&Bartlett Publishers出版,2017；和Meyers等人(编),The Encyclopedia of Cell Biology and Molecular Medicine,由Wiley-VCH出版,16卷,2008；以及其它类似的参考文献。

为了便于述评本公开内容的各种实施方案，提供特定术语的以下解释：

酸蛋白酶：一种切割肽键的酶，其中所述酶在酸性pH下具有增加的切割肽键的活性。例如并且不限于，酸蛋白酶可包括胃蛋白酶和胰蛋白酶。

抗生素：一种杀死细菌、真菌或任何其它微生物或显著减缓细菌、真菌或任何其它微生物的生长的化合物或物质。"抗菌剂"是杀死细菌或显著减缓细菌生长的化合物或物质。

抗菌抗生素通常基于其作用机制、化学结构或活性谱进行分类。大多数靶向细菌功能或生长过程。靶向细菌细胞壁(例如青霉素类和头孢菌素类)或细胞膜(例如多粘菌素类)或干扰必需细菌酶(例如喹诺酮类和磺酰胺类)的那些是杀菌性的。靶向蛋白质合成的那些(例如氨基糖苷、大环内酯和四环素)通常是抑菌的。另外的分类基于它们的目标特异性。

"窄谱"抗菌抗生素靶向特定类型的细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌。"广谱抗生素"影响许多不同类型的细菌。抗菌剂还包括环脂肽(cyclic lipopeptides)(例如达托霉素(daptomycin))、甘氨酰环素(glycylcyclines)(例如替加环素(tigecycline))和噁唑烷酮(oxazolidinones)(例如利奈唑胺(linezolid))。

局部抗生素是施用于身体表面，例如皮肤或眼睛的抗生素。局部抗生素通常配制成软膏或乳膏，并且包含活性剂，例如大环内酯抗生素(例如红霉素)、磺胺抗生素(例如磺胺醋酰胺(sulfacetamide))、环肽(例如杆菌肽(bacitracin)、多粘菌素)、假单胞菌酸(psuedomonic acid)(例如莫匹罗星)、氨基糖苷(例如新霉素)、或喹诺酮(例如环丙沙星(ciprofloxacin)或氧氟沙星(ofloxacin))、硝基咪唑(例如甲硝唑(metronidazloe))或药物组合(例如杆菌肽(bacitracine)/多粘菌素或新霉素/多粘菌素B/杆菌肽(bacitracin))。

生物相容性：当植入哺乳动物受试者时，不会在受试者中引起不良响应的任何材料。一种生物相容性材料，当被引入个体时，能够执行其预期功能，并且对该个体无毒或无损，也不在受试者中诱导该材料的免疫排斥。

生物支架：生物相容的支架，通常是固体支持体或凝胶。生物支架由天然存在的材料组成。"生物合成支架"由非天然存在的和天然存在的材料组成。

离心：该方法由此将离心力施加至混合物，由此混合物中的较致密组分相对于混合物中的其它较不致密组分迁移远离离心机的轴线。施加到混合物上的力是离心机转子的速度和旋转半径的函数。在大多数应用中，旋转力将导致沉淀物(小粒)聚集在离心管的底部，其中剩余的溶液被适当地称为"上清液"或"上层清液"。在其它类似的应用中，基于密度的分离或"梯度离心"技术用于从含有比所需组分更致密和更不致密的组分的混合物中分离特定物质。

在离心机转子的圆周运动期间，施加的力是旋转的半径和角速度的乘积，其中力传统上被表达为相对于"g"的加速度，g是在地球表面处的标准重力加速度。所施加的离心力被称为"相对离心力"(RCF)，并且以"g"的倍数表示。

粉碎：将较大颗粒减小为较小颗粒的过程，包括但不限于通过研磨、共混、切碎、切片、碾磨、切割、切碎。ECM可以被粉碎，虽然以任何形式，包括但不限于，水合形式、冷冻、风干、冻干、粉末、片形式。

接触：以直接物理结合的方式放置，其可以是固体或液体形式。

细胞因子：术语"细胞因子"用作各种各样的组的可溶性蛋白和肽的类名，所述可溶性蛋白和肽在纳摩尔至皮摩尔浓度下充当体液调节剂，并且在正常或病理条件下调节个体细胞和组织的功能活性。这些蛋白还直接介导细胞间的相互作用并调节在细胞外环境中发生的过程。细胞因子的实例包括但不限于肿瘤坏死因子-α、白介素(IL)-6、IL-10、IL-12、转化生长因子和干扰素-γ。

诊断：通过疾病的征兆、症状和各种测试的结果来鉴定疾病的过程。通过该过程得出的结论也被称为"诊断"。通常进行的测试形式包括血液测试、医学成像和活组织检查。

细胞外基质(ECM)：一种用于细胞生长的天然无细胞支架。天然ECM(在多细胞生物体，例如但不限于哺乳动物和人中发现的ECM)是结构和非结构生物分子的复杂混合物，所述生物分子包括但不限于胶原、弹性蛋白、层粘连蛋白、糖胺聚糖、蛋白聚糖、抗微生物剂、化学引诱物、细胞因子和生长因子。在哺乳动物中，ECM通常包含约90％的以其各种形式的胶原。ECM的组成和结构根据组织来源而变化。例如，小肠粘膜下层(SIS)、膀胱基质(UBM)、食管(E)和肝基质ECM由于每种组织所需的独特的细胞生态位(niche)而各自在它们的整体结构和组成上不同。完整的"细胞外基质"和"完整的ECM"是保留其结构和非结构生物分子活性的细胞外基质，所述生物分子包括但不限于胶原、弹性蛋白、层粘连蛋白、糖胺聚糖、蛋白聚糖、抗微生物剂、化学引诱物、细胞因子和生长因子。

ECM中生物分子的结构和/或活性可化学地或机械地改变或去除，例如，通过交联和/或通过透析ECM。完整的ECM基本上没有经过酶消化、交联和/或透析，这意味着ECM在溶解之前没有经过消化、透析和/或交联过程，或者除了在ECM的储存和处理过程中自然发生的过程之外的条件。因此，显著交联和/或透析的ECM(以任何但微不足道的方式，其不显著影响ECM在本文所述的其用途中的胶凝和功能特性)不被认为是"完整的"。"无细胞"是指由来源组织制造的ECM，该组织已被处理以除去细胞，从而保留ECM。脱细胞组织用于制造ECM水凝胶。

凝胶：在液体和固体之间的物质状态，并且通常定义为在液体介质中溶胀的交联聚合物网络。通常，凝胶是含有固体和液体的两相胶态分散体，其中固体的量大于称为"溶胶"的两相胶态分散体中的量。因而，"凝胶"具有液体的一些特性(即，形状是弹性的和可变形的)和固体的一些特性(例如，形状是足够离散的以在二维表面上保持三维)。"胶凝时间"，也称为"凝胶时间"，是指对于组合物在适度应力下变得不可流动所花费的时间。

胶凝：由溶胶形成凝胶。

止血：抑制或停止出血。

水凝胶：亲水性聚合物链的网络，有时以胶态凝胶(其中水是分散介质)的形式被发现。水凝胶是高吸收性的天然或合成聚合物网络。水凝胶也具有类似于天然组织的挠性度。使用超声能量制造"声学"水凝胶，例如声学ECM水凝胶。这些水凝胶的特征在此公开。对于水凝胶，G'(储能模量)通常比G"(损耗模量)大大约一个数量级。

分离："分离的"生物组分(例如细胞外基质)已经与其它生物组分、细胞或生物体(其中该组分天然存在，即活细胞、其它染色体和染色体外DNA和RNA以及蛋白质)基本上分离、分开制造或分开纯化。因此，已经"分离"的核酸、肽和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸、肽和蛋白质以及化学合成的核酸。分离的ECM已与制造ECM的细胞分离。

等渗缓冲溶液：一种溶液，其被缓冲至7.2-7.8的pH，并且具有平衡浓度的盐以促进等渗环境。

巨噬细胞：一类吞噬和降解细胞碎屑、外来物质、微生物和癌细胞的白细胞。除了它们在吞噬作用中的作用之外，这些细胞还在发育、组织维持和修复以及先天性和适应性免疫中起重要作用，因为它们募集和影响包括免疫细胞如淋巴细胞在内的其它细胞。巨噬细胞可以以许多表型存在，包括被称为M1和M2的表型，也被称为"M1样"和"M2样"。主要执行促炎功能的巨噬细胞被称为M1巨噬细胞(CD86+/CD68+)，而减少炎症并促进和调节组织修复的巨噬细胞被称为M2巨噬细胞(CD206+/CD68+)。鉴定巨噬细胞各种表型的标记物在物种之间是不同的。应注意，巨噬细胞表型由范围在M1和M2极值之间的谱表示。

哺乳动物：该术语包括人和非人哺乳动物。类似地，术语"受试者"包括人和兽医受试者。

预防或治疗疾病："预防"疾病是指例如在已知具有疾病如癌症的易感性的人中抑制疾病的部分或完全发展。具有已知易感性的人的实例是具有家族乳腺癌症史的某人，或已经暴露于使受试者易患病症如黑素瘤的因素的某人。"治疗"是指在疾病或病理状况开始发展后改善其征兆或症状的治疗性干预。在一些实施方案中，治疗指肿瘤尺寸的减小、转移的数量和/或尺寸的减少或肿瘤症状的减轻。

治疗剂：一般意义上使用的，它包括治疗剂、预防剂和替代剂。"治疗"或"处理"是指向患者提供一种物质，例如声学ECM水凝胶，其量足以可测量地影响生物参数，例如增加止血。

治疗有效量：组合物如声学ECM水凝胶的"治疗有效量"是指当施用于患者时，有效提供治疗益处如症状改善、减少进展或引起疾病消退的量。声学ECM水凝胶的量足以在被治疗的受试者中实现预期效果。治疗有效量可全身或局部施用，例如施用至伤口。此外，有效量的声学ECM水凝胶可以以单剂量或随时间以若干剂量施用。然而，有效量将取决于所施用的制剂、所治疗的受试者、痛苦的严重性和类型、以及化合物的给药方式。用于本文公开的方法中的声学ECM水凝胶在医学和兽医环境(settings)中具有同等的应用。因此，一般术语"受试者"或"患者"应理解为包括所有动物，包括但不限于人或兽医受试者，例如其它灵长类动物、狗、猫、马和牛。

热致可逆水凝胶：由于聚合物链的缠结而形成的水凝胶，其中粘度在胶凝的特征温度下改变。所公开的声学ECM水凝胶是热致可逆水凝胶，其在冷却时显示出胶凝(溶胶至凝胶转变)。

局部施用：局部施用的药剂仅施用于特定区域，而不是遍布全身。在具体的实例中，将组合物施用于需要止血的区域中的皮肤或眼睛。例如，药物组合物可以以局部制剂的形式施用于伤口，例如上皮伤口或缺损，例如创伤或手术伤口，例如皮肤或角膜擦伤或手术切口。

超声处理：暴露频率高于20kHz的超声波的过程。

除非另有说明，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。单数术语"一种(a)"、"一种(an)"和"该(the)"包括复数对象，除非上下文另有明确说明。类似地，除非上下文另外清楚地指示，否则词语"或"旨在包括"和"。进一步还应理解，对于核酸或多肽给出的所有碱基尺寸或氨基酸尺寸以及所有分子量或分子质量值是近似的，并且提供用于描述。"约"表示在所列数值的5％内。尽管与本文所述的那些类似或等同的方法和材料可用于本公开的实践或测试，但下文描述了合适的方法和材料。术语"包括(comprises)"是指"包括(includes)"。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都通过引用以其整体并入。在冲突的情况下，以本说明书为准，包括术语的解释。此外，材料、方法和实例仅是说明性的，而不意欲是限制性的。

细胞外基质(ECM)

任何类型的细胞外基质组织都可用于制造水凝胶(参见涉及ECM的美国专利4,902,508；4,956,178；5,281,422；5,352,463；5,372,821；5,554,389；5,573,784；5,645,860；5,771,969；5,753,267；5,762,966；5,866,414；6,099,567；6,485,723；6,576,265；6,579,538；6,696,270；6,783,776；6,793,939；6,849,273；6,852,339；6,861,074；6,887,495；6,890,562；6,890,563；6,890,564；和6,893,666)。在某些实施方案中，ECM分离自脊椎动物，例如并且不限于温血哺乳动物脊椎动物，包括但不限于人、猴、马、猪、牛和羊。在具体的非限制性实例中，ECM是猪的或人的。

ECM可源自任何器官或组织，包括但不限于膀胱、肠(例如小肠或大肠)、心脏、肾、子宫、脑、血管、肺、骨骼肌、胰腺、胃、脾、脂肪组织、肝、食管和真皮。ECM可从细胞培养物中获得。在一种实施方案中，ECM从膀胱中分离。在另一种实施方案中，ECM来自食管。在另一种实施方案中，ECM来自真皮。ECM可以包括或可以不包括ECM的基底膜部分。在某些实施方案中，ECM包括基底膜的至少一部分。组织可以被脱细胞化以从例如源组织或器官中除去细胞和细胞物质，从而制造ECM。希望使用脱细胞物质来防止免疫响应，例如当ECM被植入受试者时，例如作为本文公开的水凝胶的组分。细胞物质的去除，例如当使用ECM形成水凝胶时，防止了这种免疫响应。

美国专利8,361,503(通过引用并入本文)公开了膀胱ECM的制备，例如通过使用解剖刀手柄和湿润的纱布利用纵向擦拭运动，摩擦膀胱组织以除去包括浆膜和肌层的外层来制备猪膀胱ECM。在组织段外翻之后，使用相同的擦拭运动将粘膜的腔部分从下面的组织剥离。在一些实施方案中，防止粘膜下层穿孔。在除去这些组织后，所得的ECM主要由粘膜下层组成。

从皮肤ECM制造水凝胶公开于Wolf等人,Biomaterials 33:7028-7038,2012，通过引用并入本文。从食管组织制造ECM公开于例如Badylak等人，J Pediatr Surg.35(7):1097-103,2000和Badylak等人,J Surg Res.2005年9月；128(1):87-97,2005，两者通过引用并入本文。美国专利6,893,666，通过引用并入本文，公开了从膀胱、皮肤、食管和小肠制造ECM。ECM可从这些组织中的任何一种制造。

也可使用市售可得的ECM制剂。在一种实施方案中，ECM源自小肠粘膜下层或SIS。市售可得的制剂包括但不限于SURGISIS^TM,SURGISIS-ES^TM,STRATASIS^TM,和STRATASIS-ES^TM(Cook Urological Inc.；Indianapolis,Ind.)和GRAFTPATCH^TM(Organogenesis Inc.；Canton Mass.)。在另一种实施方案中，ECM源自于真皮。市售可得的制剂包括但不限于PELVICOL^TM(在欧洲以PERMACOL^TM销售；Bard,Covington,Ga.),REPLIFORM^TM(Microvasive；Boston,Mass.)和ALLODERM^TM(LifeCell；Branchburg,N.J.)。在另一种实施方案中，ECM源自于膀胱。市售可得的制剂包括但不限于UBM(Acell Corporation；Jessup,Md.)。

用于制备ECM的组织可以以多种方式采集，并且一旦采集，可使用采集组织的多个部分。还已经从食管和小肠制备ECM，参见例如Keane等人,Tissue Eng.部分A,21(17-18):2293-2300,2015，通过引用并入本文。食管ECM可以通过将粘膜和粘膜下层与外肌层机械分离，并在包括胰蛋白酶的缓冲液中消化粘膜层，然后暴露于蔗糖、脱氧胆酸、过乙酸和DNAse来制备。小肠粘膜下层(SIS)可通过从完整的小肠机械地除去粘膜、浆膜和外肌层的浅表层，保留粘膜下层、粘膜肌层和基底致密层完整来制备。然后用过乙酸处理SIS。Keane等人提供了示例性的方案。例如，可以制备皮肤水凝胶，如在Wolf等人,J BiomedMater Res A.2013.35(25):6838-49.PMID:23873846.PMCID:3808505中公开的，通过引用并入本文。

在一种实施方案中，ECM是从采集的猪膀胱中分离出来的，以制备膀胱基质(UBM)。从膀胱中除去过量的结缔组织和残余尿。浆膜、外肌层、粘膜下层和大部分粘膜肌层可通过机械磨蚀(abrasion)或通过酶处理、水合和磨蚀的组合去除。这些组织的机械去除可以通过使用纵向擦拭运动的磨蚀来完成，以去除外层(特别是近腔(abluminal)平滑肌层)和甚至粘膜的腔部分(上皮层)。机械去除这些组织是通过用例如Adson-Brown镊子和Metzenbaum剪刀去除系膜组织，并用解剖刀手柄或其它包裹在湿润纱布中的刚性物体利用纵向擦拭运动，擦拭掉肌层和粘膜下层来完成的。粘膜的上皮细胞也可以通过将组织浸泡在去上皮溶液中而解离，所述去上皮溶液例如并且不限于高渗盐水。所得到的UBM包含粘膜和邻近的固有膜的基底膜，其进一步用过乙酸处理、冻干和粉末化，参见美国专利8,361,503，其通过引用并入本文。

真皮部分可用于制备ECM水凝胶，参见PCT申请2015/15164728，通过引用并入本文。在具体的非限制性实例中，真皮可以用0.25％胰蛋白酶/1％(即没有SDS)在涡旋振荡器上以300RPM在室温下在以下溶液中去细胞化：0.25％胰蛋白酶，6小时，lx；去离子水，15分钟，3x；70％乙醇，10至12小时，lx；3％H₂O₂，15分钟，lx；去离子水，15分钟，2x；1％/>/0.26％EDTA/0.69％Tris，6小时，lx并且然后过夜，lx；去离子水，15分钟，3x；0.1％过乙酸/4％乙醇，2小时，lx；PBS，15分钟，2x；和最终去离子水，15分钟，2x。然后将真皮片冻干，并随后使用Waring混合器和具有#20目筛的Wiley磨缩小成颗粒形式。

在一些实施方案中，上皮细胞可以首先通过首先将组织浸泡在去上皮溶液(如高渗盐水，例如并且不限于1.0N盐水)中10分钟至4小时的时间段而被剥离。暴露于高渗盐水溶液有效地从下层基底膜除去上皮细胞。在初始分层程序之后剩余的组织包括上皮基底膜和相对于上皮基底膜近腔(abluminal)的组织层。然后对该组织进行进一步处理以除去大部分近腔(abluminal)组织而不是上皮基底膜。通过机械磨蚀或通过酶处理、水合和磨蚀的组合，从剩余的去上皮组织中去除外浆膜、外膜、平滑肌组织、粘膜下层和大部分粘膜肌层。

ECM可以通过许多标准技术灭菌，包括但不限于暴露于过乙酸、低剂量γ辐射、气体等离子体灭菌、环氧乙烷处理或电子束处理。更典型地，ECM的灭菌通过在0.1％(v/v)过乙酸、4％(v/v)乙醇和95.9％(v/v)无菌水中浸泡两小时来获得。通过用PBS(pH＝7.4)洗涤两次15分钟和用无菌水洗涤两次15分钟除去过乙酸残余物。ECM材料可通过环氧丙烷或环氧乙烷处理、γ辐照处理(0.05-4mRad)、气体等离子体灭菌、过乙酸灭菌或电子束处理来灭菌。ECM也可以通过戊二醛处理来灭菌，戊二醛处理引起蛋白质材料的交联，但这种处理显著改变了材料，使得其被缓慢地再吸收或根本不再被吸收，并引起不同类型的宿主重塑，这更接近地类似于疤痕组织形成或包封而不是建设性重塑(constructive remodeling)。蛋白质材料的交联也可以用碳二亚胺或脱水加热(dehydrothermal)或光氧化方法诱导。如美国专利8,361,503所公开，ECM是通过浸入0.1％(v/v)过乙酸(a)、4％(v/v)乙醇及96％(v/v)无菌水中2小时来消毒。然后ECM材料用PBS(pH＝7.4)洗涤两次15分钟，并用去离子水洗涤两次15分钟。

通常，在分离所考虑的组织后，通过各种方法进行去细胞化，例如并且不限于，暴露于高渗盐水、过乙酸、或其它洗涤剂。灭菌和去细胞化(decellularization)可以同时进行。例如并且不限于，上述用过乙酸灭菌也可用于去细胞化(decellularization)。然后可以将ECM干燥，冻干(冷冻干燥)或风干。干燥的ECM可以通过包括但不限于撕、磨、切、研和剪的方法粉碎。粉碎的ECM还可以通过例如并且不限于诸如在冷冻或冷冻干燥状态下研磨或碾磨的方法进一步加工成粉末形式。

哺乳动物ECM也是市售可得的。这些包括AVITENE^TM、和XENMATRIX^TM。

声学ECM水凝胶和其制备

在一些实施方案中，将粉碎的ECM，如哺乳动物ECM稀释在液体中。ECM在粉碎之前可以被冻干或可以不被冻干。ECM可通过例如研磨、切碎或切割ECM而粉碎。粉碎的ECM应当具有约10μm至约5000μm,约10μm至约4000μm,约10μm至约3000μm,约10μm至约2000μm,约10μm至约1000μm,约10μm至约500μm,约30μm至约300μm,约40至约400μm,约25μm至约500μm,约50μm至约500μm,约100μm至约300μm,约10μm至约50μm,或约10μm至约100μm范围内的碎片(pieces)。在一个实施方案中，ECM以具有约10μm至约1000μm范围的碎片的形式提供。在另一优选的实施方案中，ECM以具有约10μm至约2000μm范围的碎片的形式提供。在一个非限制性实例中，碎片在约30μm至约300μm范围之内。液体可以是中性pH的缓冲液，例如，pH为约7.0至约7.6，如约7.1至约7.5，如约7.2至约7.4，如约7.0至7.2，如约7.0至7.4，如约7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或7.6。ECM可以在等渗缓冲盐水溶液(如但不限于磷酸盐缓冲盐水(PBS)或Tris缓冲盐水)中被稀释。在一些实施方案中，缓冲盐水溶液具有约290mOsm/L的同渗容摩。液体可以是水。在一些实施方案中，等渗缓冲液，包括但不限于磷酸盐缓冲盐水(PBS)，可用于使溶液达到目标pH，或有助于将凝胶的pH和离子强度维持在目标水平，例如生理pH和离子条件。这形成了液体ECM溶液。

所公开的方法通常不涉及酸蛋白酶(包括胃蛋白酶、胰蛋白酶或透明质酸酶)的使用。参见PCT申请WO2015/164728，通过引用并入本文。通常，在本方法中，液体中溶解的ECM不与酸蛋白酶接触。

在一些实施方案中，ECM在液体中以大于约25毫克/毫升的浓度使用。ECM在液体如缓冲液中可以以约25毫克/毫升至约600毫克/毫升的浓度使用。合适的浓度还包括约25毫克/毫升至约300毫克/毫升，约25毫克/毫升至约200毫克/毫升，和约25毫克/毫升至约150毫克/毫升。ECM在液体如缓冲液中可以以约50毫克/毫升至约600毫克/毫升的浓度使用。合适的浓度还包括约50毫克/毫升至约300毫克/毫升，约50毫克/毫升至约200毫克/毫升，和约50毫克/毫升至约150毫克/毫升。合适的浓度包括约25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，105，110，115，120，125，130，135，140，150，155，160，165，170，175，180，185，190，195，和200毫克/毫升。示范性的浓度包括约25毫克/毫升，100毫克/毫升，和150毫克/毫升。在一个非限制性实例中，ECM在液体中的浓度为约25毫克/毫升至约150毫克/毫升。在一个非限制性实例中，ECM在液体中的浓度为100毫克/毫升。

用超声频率处理液体如缓冲盐水溶液中的ECM。在一个实施方案中，超声的频率为约20kHz至约100kHz。液体中的ECM可用频率为约20kHz至约30kHz，约20Hz至约40kHz，约20kHz至约50kHz，约20kHz至约60kHz，约20kHz至约70kHz，约20kHz至约80kHz，或约20kHz至约90kHz的超声处理。液体中的ECM可用频率为约20kHz，30kHz，40kHz，50kHz，60kHz，70kHz，80kHz，90kHz或100kHz的超声处理。在一个非限制性实例中，液体中的ECM可以用频率为约20kHz的超声处理。

用超声处理液体如缓冲盐溶液中的ECM至少20秒，如至少30秒。用超声处理液体如缓冲盐溶液中的ECM至少60秒。在一些实施方案中，用超声处理液体中的ECM至少60秒至约一小时。在另外的实施方案中，用超声处理液体中的ECM至少60秒至约30分钟。在另外的实施方案中，用超声处理液体中的ECM至少30秒至约30分钟。在更多的实施方案中，用超声处理液体中的ECM至少60秒至约15分钟。在更多的实施方案中，用超声处理液体中的ECM至少30秒至约15分钟。在一些实施方案中，用超声处理液体中的ECM至少60秒至约10分钟。在一些实施方案中，用超声处理液体中的ECM至少30秒至约10分钟。在一些实施方案中，用超声处理液体中的ECM至少60秒至约5分钟。在一些实施方案中，用超声处理液体中的ECM至少30秒至约5分钟。液体中的ECM可以用超声处理约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59或60分钟。在一些实施方案中，液体中的ECM用脉冲形式的超声处理如本文所列的总时间。因此，在一些实施方案中，用脉冲处理液体如缓冲盐水溶液中的ECM，所述脉冲的长度例如至少约30秒，所述脉冲的长度如约30、约40或约60秒。液体如缓冲盐水溶液中的ECM可用超声处理1，2，3，4，5，6，7，8，9，10次，使得总处理时间为60秒至一小时，或列出的总时间中的任一种。液体如盐水溶液中的ECM可被处理20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59或60秒。液体如盐水溶液中的ECM可被处理至少30秒。通常，如果使用多次处理，它们在少于1小时的时间内发生。示例性方法是超声的30秒的脉冲，随后30至45秒的无处理，随后是另一次处理。该处理被应用2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次。一个示例性的非限制性方法是超声的30秒的六次脉冲，例如大约20kHz，接着关闭45秒，重复六次，总共用超声处理3分钟。

超声可以具有约20μm至约320μm的振幅。通常，从用于产生超声的探针的中心测量振幅。探针振动表面的振幅为其在探针完全伸展和完全收缩状态中的位置之间的距离，以微米(μm)测量。在一些实施方案中，振幅为约30μm至约200μm。在另外的实施方案中，振幅是约36μm至约180μm。振幅可以是约30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150，150，160，70，180，190，200，210，220，230，240，250，260，270，280，290或300μm。在一些实施方案中，振幅可以是约30-40μm、40-50μm、50-60μm、60-70μm、70-80μm、80-90μm、90-100μm、100-110、110-120μm、120-130μm、130-140μm、140-150μm、150-160μm、160-170μm、170-180μm、180-190μm、190-200μm、200-210μm、210-220μm、220-230μm、230-240μm、240-250μm、250-260μm、260-270μm、270-280μm、280-290μm或290-300μm。在一个具体的非限制性实例中，超声的频率为约20kHz，并且振幅是约36μm至约180μm。在另一个非限制性实例中，超声的频率为约20kHz，且振幅为约36μm至约180μm，并且处理总共约1、2、3、4或5分钟，如约3分钟。声处理可以达约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20分钟。声处理可以是约30秒至约5分钟。声处理可以例如达约1至约5分钟。声处理可以达约1至约10分钟。声处理可以例如达1至约20分钟。在更多的实施方案中，声处理可以达小于约1小时，小于约30分钟，小于约20分钟，或小于约10分钟。在一些实施方案中，声处理可以达至少30秒。在其它实施方案中，声处理可以达约10分钟至约24小时，例如，约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，或24小时。在一些实施方案中，声处理可以达至多48小时。

在一些实施方案中，在约30℃至约43℃范围内的温度用超声处理液体中的ECM。在一个实施方案中，在约35℃至约40℃范围内的温度用超声处理液体中的ECM。在一个实施方案中，在约36℃至约38℃范围内的温度用超声处理液体中的ECM。在另一个实施方案中，在约37℃或更高范围内的温度，如约37℃至约55℃，如约37℃至约50℃，如约37℃至约45℃，如约37℃至约40℃的温度，用超声处理液体中的ECM。在约37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54或55℃的温度用超声处理液体中的ECM。在另一个实施方案中，在大于约38℃，如约38℃至约50℃，如约38℃至约45℃，如约38℃至约40℃用超声处理液体中的ECM。

用超声处理制造声学ECM水凝胶。声学ECM水凝胶通常在37℃左右经历从溶胶到凝胶的相变，并且因此在大于37℃时转变为液相，和在低于37℃时转变为凝胶相。在37℃，声学ECM水凝胶足够粘稠以类似于凝胶，然而当温度升高至高于37℃时，凝胶转变为溶胶。声学ECM水凝胶在温度降低至低于37℃时形成凝胶(溶胶至凝胶转变)。因此，在一些实施方案中，声处理后，将声学ECM水凝胶冷却至低于37℃的温度，例如约4℃至约36℃。可将声学ECM水凝胶冷却至室温，其通常为约25℃。在一些实施方案中，将声学ECM水凝胶冷却至约15℃至约25℃。声学ECM水凝胶可被冷却至约23℃至约27℃。声学ECM水凝胶可被冷却至约4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30℃以诱导凝胶相。

在一些实施方案中，公开了一种声学哺乳动物ECM水凝胶，其中，所述水凝胶是热致可逆的，其中，所述水凝胶在低于约37℃的温度处于固体(凝胶)相，并且在高于37℃的温度处于液体(溶胶)相。可使用本文所公开的方法中任一种来制造声学水凝胶。在一些实施方案中，声学ECM水凝胶的储能模量(G')比损耗模量(G")大大约一个数量级。在另外的实施方案中，其中声学ECM水凝胶的粘度在约15至约37℃，如在约15，15，16，17，18，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，和/或36℃的温度随着应力增加而降低。在另外的实施方案中，声学ECM水凝胶的粘度在室温、和/或在约23℃至约27℃和/或约15℃至约25℃随着应力增加而降低。在一个实施方案中，声学ECM水凝胶的凝胶至溶胶转变在约37℃，使得水凝胶可用作粘膜下层衬垫物，因为其在体温是足够粘的。

这些声学ECM水凝胶可由上文公开的任何哺乳动物ECM制成。在具体的非限制性实例中，ECM是人ECM。在其它非限制性实例中，ECM是膀胱ECM、小肠粘膜下层ECM、食管EMC或皮肤ECM(dermal ECM)。在一个实施方案中，ECM是膀胱ECM。在另一个实施方案中，ECM是皮肤ECM。在又一个实施方案中，ECM是食管ECM。ECM的来源可以是例如猪、牛或羊。

在一些实施方案中，声学ECM水凝胶包括浓度为约25毫克/毫升至约600毫克/毫升的ECM。在另外的实施方案中，声学ECM水凝胶包括浓度为约20毫克/毫升至约600毫克/毫升，约25毫克/毫升至约300毫克/毫升，约25毫克/毫升至约200毫克/毫升，和约25毫克/毫升至约150毫克/毫升的ECM。在更多的实施方案中，声学ECM水凝胶包括在液体中，例如在缓冲液中，浓度为约50毫克/毫升至600毫克/毫升的ECM。声学ECM水凝胶还可具有约50毫克/毫升至约300毫克/毫升，约50毫克/毫升至约200毫克/毫升，约50毫克/毫升至约150毫克/毫升，约50-100毫克/毫升，或约100-150毫克/毫升的ECM浓度。在一些非限制性实例中，声学ECM水凝胶包括浓度为约20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，105，110，115，120，125，130，135，140，150，155，160，165，170，175，180，185，190，195，和200毫克/毫升的ECM。在一些非限制性实例中，声学ECM水凝胶包括浓度为约20-25，25-30，30-35，35-40，40-45，45-50，50-55，55-60，60-65，65-70，70-75，75-80，80-85，85-90，90-95，95-100，100-105，105-110，110-115，115-120，120-125，125-130，130-135，135-140，140-145，145-150，150-155，155-160，160-165，165-170，170-175，175-180，180-185，185-190，190-195和195-200毫克/毫升的ECM。ECM的示例性非限制性浓度还包括约25毫克/毫升、100毫克/毫升和150毫克/毫升。在一个非限制性实例中，声学ECM水凝胶包括浓度为约25毫克/毫升至约150毫克/毫升的ECM。在一个实施方案中，ECM浓度为约100毫克/毫升。

在一些实施方案中，其中，当ECM的浓度为约150毫克/毫升时，声学ECM水凝胶在15℃具有约1400Pa*s的粘度，并且在25℃的温度具有约400Pa*s的粘度。在其它实施方案中，当ECM的浓度为约150毫克/毫升时，声学ECM水凝胶具有在15℃大约2700Pa*s、在25℃大约800Pa*s和在37℃600Pa*s的储能模量。

液相的声学ECM水凝胶可在冷却前置于三维铸模(cast)中，或铺展在片上以形成膜，参见例如图1C和ID。声学ECM水凝胶中ECM的高浓度(50至600毫克/毫升)允许形成非常薄的片，例如薄至4微米的片。声学ECM水凝胶可被构造为大于4微米的任何尺寸并且为任何2维或3维形状。在一些实施方案中，形成厚度为约4至约10微米，例如厚度约4、5、6、7、8、9或10微米的片。声学ECM水凝胶可成形为任何三维形状，其包括但不限于圆柱体、球体、椭圆体、圆盘、片、立方体、长方体、圆锥体、三角形或矩形棱柱，以及中空球体、中空椭圆体和末端开口的中空圆柱体等。图2A-2C中示出了示例性的形状。声学ECM水凝胶也可用作可注射的，例如通过将其放置在注射器中并将其以凝胶相或溶胶相从注射器中挤出。

在一些实施方案中，声学ECM水凝胶被吸收到生物相容性基底中、吸附到生物相容性基底上、或以其它方式分散到生物相容性基底上或生物相容性基底中。生物相容性基底的非限制性实例包括：网状物(mesh)、非织造物(non-woven)、去细胞组织、聚合物组合物、聚合物结构、细胞生长支架、植入物、矫形外科植入物和眼内透镜、缝合线、血管内植入物、支架和移植物。在一些实施方案中，基底是合成的。在其它实施方案中，基底是天然的。声学ECM水凝胶可通过任何合适的方法施加或结合到非织造材料，例如绷带、缝合线、植入物，例如陶瓷、金属或聚合物植入物，例如假体、人造或其它方式改造的血管(vessel)、瓣膜(valve)、眼内透镜或组织植入物中。如本文所用，术语"涂布"和相关同源词如"涂布的"和"正涂布着"是指包括用本文所述的组合物部分或全部覆盖无机结构的方法。例如并且不限于，在液相中用声学ECM水凝胶涂布无机结构可包括诸如浇注、包埋、成层、浸渍、喷雾的方法。

在另一个实施方案中，将包括声学ECM水凝胶的组合物以液相涂布到生物相容性结构材料(如金属、无机钙化合物如氢氧化钙、磷酸钙或碳酸钙、或陶瓷组合物)上。合适金属的非限制性实例是钴-铬合金、不锈钢合金、钛合金、钽合金、钛-钽合金，其可包括非金属和金属组分，例如钼、钽、铌、锆、铁、锰、铬、钴、镍铝和镧，包括但不限于各种等级的CP Ti(商品纯钛)或Ti 6A1 4V(90％重量的Ti、6％重量的Al和4％重量的V)、不锈钢316、Nitinol(镍-钛合金)、涂有羟基磷灰石的钛合金。由于高强度、挠性和生物相容性，金属是有用的。金属也可以成形为复杂的形状，并且许多可以在生物环境中经受住腐蚀，减少磨损，并且不引起组织损害。其它组合物，包括陶瓷、钙化合物，例如但不限于霰石(aragonite)。也可使用金属、陶瓷和/或其它材料的组合。

任何有用的试剂可以混合到本文所述的任何组合物、与本文所述的任何组合物共同递送、与本文所述的任何组合物共同施用或以其它方式与本文所述的任何组合物组合。例如且非限制性地，有用的试剂包括干扰素、白介素、趋化因子、单核因子、激素、促凝剂、化疗剂和抗生素。

使用方法

巨噬细胞已被证明是损伤后正常愈合和正常组织发育中的重要调节剂。所公开的声学ECM水凝胶可以概括(recapitulate)全体ECM对巨噬细胞表型的影响，导致M2样、调节性(regulatory)或预先-重塑(pro-remodeling)的巨噬细胞的增加。因此，本文公开的组合物中的任一种可用于修饰巨噬细胞表型，例如用于诱导调节性M2巨噬细胞。

在一些实施方案中，公开了在受试者中诱导M2巨噬细胞的方法，该方法通过给予治疗有效量的包括如本文公开的声学ECM水凝胶的组合物，从而在受试者中诱导M2巨噬细胞。在另外的实施方案中，公开了在受试者中减少M1(促炎)巨噬细胞的方法。该方法包括给予治疗有效量的声学ECM水凝胶，从而抑制受试者中的M1巨噬细胞。受试者可以是任何所考虑的受试者，包括人和兽医受试者。

所公开的声学ECM水凝胶增加受试者中的病变处的止血。因此，还公开了用于加速伤口的凝固和/或减少伤口的出血时间的方法。在一些实施方案中，在将声学ECM水凝胶给予受试者后约10至约100秒内，如约10，20，30，40，50，60，70，80，90或100秒内诱导止血。

在一些实施方案中，治疗有效量的声学ECM水凝胶可局部给药至受试者中的部位以诱导止血。受试者可以具有伤口。伤口可以是外部伤口，或者是从患者体外不能看见的(viable)内部伤口。所公开的声学ECM水凝胶用作任何类型的伤口的止血剂。该方法可以包括选择所考虑的受试者中的任一个，例如具有任何伤口的那些。

如图10所示，声学ECM水凝胶减少了凝固时间。凝固可以通过本领域技术人员已知的任何方法测量。在Lee和White试管方法中，将静脉血置于三个试管中，37℃水浴保存。通过以一分钟间隔倾斜第一和然后第二试管，并依次记录在它们的每一个中形成牢固凝固的时间，然后检测第三试管中血液的凝结，以得到凝结时间，从而确定凝固时间。在毛细管法中，玻璃毛细管充满来自手指穿刺的血液。每隔一定间隔，将短的数段的毛细管折断(broken off)，直到在毛细管的折断部分之间出现血液凝固。另一种确定凝固出现的方法是血栓弹性图方法。在该方法中，在血液或血浆样品中移动的叉子用于感测粘度，该粘度在凝结时增加。记录凝固发生的另一种方法是在血浆样品从血液中分离后，监测血浆样品的半透明度。随着凝固的出现，样品变得不透明。

在一些实施方案中，公开了用于治疗具有炎症或伤口的受试者的方法。该方法包括将治疗有效量的声学ECM水凝胶局部施加到炎症或伤口。在一些非限制性实例中，受试者具有炎性病症，例如但不限于溃疡性结肠炎或类风湿性关节炎。该方法可包括将ECM水凝胶施加至组织表面。在其它非限制性实例中，受试者是器官移植受体、具有移植物抗宿主疾病的受试者、具有心肌梗塞的受试者或具有伤口的受试者，例如但不限于具有手术伤口或非手术创伤伤口的受试者。因此，公开了在需要其的个体中加速伤口愈合和/或增加止血的方法，包括施用治疗有效量的包含如本文公开的声学ECM水凝胶的组合物。给药可以是局部的，例如在伤口或移植物的部位。

水凝胶可被施用于任何伤口部位以增加止血和/或增加伤口愈合。伤口可以是皮肤中的伤口，或任何表面上的伤口，包括但不限于眼睛。还提供了用于由局部缺血和局部缺血性损伤引起的伤口(如由静脉循环系统回流的伤害和/或功能不全引起的慢性静脉腿部溃疡)的方法。因此，本发明的方法可以利用局部皮肤或眼睛给药。通常，在这些施用中，组合物被配制用于局部给药。水凝胶可以被施用于任何器官的组织表面。

本文公开了愈合伤口，例如皮肤伤口的局部组合物。这些适于治疗的伤口可以是浅表性的，或者可以是深的，并且涉及皮肤的真皮和表皮的损害。伤口可以是外科伤口。因此，提供了促进受试者的伤口愈合和/或促进受试者的凝固(增加止血)的方法。

声学水凝胶可以被直接施用于目标位置，例如在局部制剂中，例如片、塞，或者作为敷料或绷带的一部分。绷带和伤口敷料可以包含声学ECM水凝胶。这些可通过将凝胶或液相的声学ECM水凝胶与任何其它所需添加剂一起施用于绷带或伤口敷料来制备。这些片、塞、绷带或敷料可用于减少凝固时间和/或增加伤口愈合。声学水凝胶可以通过注射到目标位置来给药以促进伤口愈合，例如，以凝胶相中的固体的形式，或者在给药之前温度可以被升高到高于37℃，使得水凝胶以液相给药。

为了用于伤口治疗和/或为了增加止血，声学ECM水凝胶通常将具有在上述范围内的浓度。声学ECM水凝胶可被施用一次。或者，可将声学ECM水凝胶周期性地施用至受影响区域，通常每天约1至10次，例如，在约3至14天的时间段内，这取决于伤口的性质。在一些情况下，可能期望无限期地施用组合物。

声学ECM水凝胶影响止血和伤口愈合速率。在一些实施方案中，与对照组，如标准值，在没有处理或使用通过酶催法制造的ECM水凝胶的处理所实现的伤口愈合或止血的速率相比，组合物使止血和/或伤口愈合提高至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％或至少200％。

声学ECM水凝胶也可用于治疗外科伤口和其它故意的干预，其中组合物可在手术完成后立即施用。提供了用于刺激伤口愈合和增加伤口部位的止血的方法，包括外科伤口、切除伤口、涉及真皮和表皮损害的深伤口、眼组织伤口、牙组织伤口、口腔伤口、糖尿病溃疡、皮肤溃疡、肘疮溃疡、动脉性溃疡、静脉郁积溃疡和由热暴露或化学品引起的烧伤。

受试者可以是任何所考虑的哺乳动物受试者，包括人或兽医受试者。受试者可以是儿童或成人受试者，例如年轻、中年或老年成人受试者。在人类中，成年受试者大于18岁，年轻成年人为约18至约35岁，中年成年人通常被认为是约35至约55岁，并且稍老(或老年)人类受试者大于约55岁，例如大于60岁、大于65岁、大于70岁、大于75岁或大于80岁。

受试者可以以正常速率愈合伤口或可以具有愈合障碍。许多痛苦和状况可导致愈合障碍。这些包括糖尿病(例如II型糖尿病)、用类固醇和其它药理学药剂治疗，以及缺血性阻断或损伤(如在周围性血管疾病或外伤性血管闭塞中)。诱导异常伤口愈合的病症包括但不限于尿毒症、营养不良、维生素缺乏、肥胖症、感染、免疫抑制和与用类固醇、放射疗法和抗肿瘤药物和抗代谢物的全身性治疗相关的并发症。已显示阻碍伤口愈合的类固醇包括可的松、氢化可的松、地塞米松和甲基强的松龙。非类固醇化合物，如醋酸奥曲肽，也已显示阻碍伤口愈合(Waddell等人,Am.Surg.63:446 449,1997)。

受试者可以具有凝固紊乱，或者可以经历用抗凝血剂如但不限于华法令或治疗。受试者可以具有凝血因子II、V、VII、X或XII缺乏。受试者可以具有甲型血友病、乙型血友病、冯·威利布兰德病、纤维蛋白原或凝血酶原的缺乏或结构异常。因此，在一些实施方案中，选择这些受试者进行治疗。

本文还提供了增加皮肤移植物与伤口床的粘附并刺激从伤口床再形成上皮的方法。移植物的类型包括但不限于：自体皮移植片(autologous skin graft)、人工皮(artificial skin)、同种异体移植物(allografts)、自体皮移植片(autodermic graft)、自体皮移植片(autoepidermic grafts)、无血管移植片(avascular grafts)、布-布二氏移植片(Blair-Brown grafts)、骨移植物(bone graft)、胚组织移植物(brephoplasticgrafts)、皮移植片(cutis graft)、延迟移植片(delayed graft)、真皮移植片(dermicgraft)、表皮移植片(epidermic graft)、筋膜移植片(fascia graft)、全层皮移植片(fullthickness graft)、异种移植片(heterologous graft)、异种移植物(xenograft)、同种异体移植片(homologous graft)、增生性皮移植片(hyperplastic graft)、角膜板层移植片(lamellar graft)、网孔皮移植片(mesh graft)、粘膜移植物(mucosal graft)、奥-提二氏移植物(Ollier-Thiersch graft)、网膜移植物(omenpal graft)、修补移植物(patchgraft)、带蒂移植片(pedicle graft)、全层角膜移植片(penetrating graft)、分层皮移植片(split skin graft)、厚分层皮移植片(thick split graft)。所述方法包括向具有移植物的受试者给予治疗有效量的本文公开的组合物，从而增加移植物的粘附和接受度并控制或消除细菌生长。在一些实施方案中，将用组合物处理的细胞或组织移植到受试者中。在一个具体的非限制性实例中，在移植之前将组合物给予至移植物，例如皮肤移植物。

还提供了治疗由于磨蚀或化学损伤引起的水疱和烧伤的方法。这些方法包括皮肤或内部器官的治疗。这些方法包括治疗卵巢损伤，例如，由于用化疗剂治疗或用环磷酰胺治疗；放射或化学疗法诱发的膀胱炎；或高剂量化疗诱发的肠损伤。所述方法包括向受试者给予治疗有效量的本文公开的组合物，以促进水疱或烧伤的愈合并减少或消除细菌生长。

提供了用于促进由个体中的外科程序引起的吻合伤口和其它伤口愈合的方法。这些方法包括在吻合或其它手术之后和/或期间给予有效量的本文公开的组合物。吻合是例如当肠的中段被移除并且剩余部分连接在一起以重建肠道时两个管状结构的连接。与皮肤愈合不同，吻合伤口的愈合过程通常从观察(view)来讲是模糊的。此外，至少在胃肠道中的伤口愈合在没有并发症的情况下迅速进行；然而，并发症通常需要通过额外的手术来矫正(Thornton和Barbul,Surg.Clin.North Am.77:549 573(1997))。该方法可以包括选择需要吻合伤口愈合的受试者。受试者可以是由于上述病症之一而具有伤口愈合障碍的受试者，或者可以是具有正常伤口愈合的受试者，例如不具有任何上述病症的受试者。

所公开的声学ECM水凝胶在室温下为固相，并且在约37℃向液相转变。因此，在一些实施方案中，在施用于受试者后，随着水凝胶因体温而变暖，声学ECM水凝胶将随时间推移从固相转变为液相。在一些实施方案中，该方法可包括清洗伤口，以去除声学ECM水凝胶，其可在液相中被冲洗掉。

在一些实施方案中，对声学ECM水凝胶进行灭菌。灭菌对于确保本发明的声学ECM水凝胶充分除去病原体的污染并适于医学应用，例如植入人或动物体内是重要的。诸如γ辐照、环氧乙烷、超临界CO2、过氧化氢气体等离子体或臭氧的方法可适用于本发明的声学ECM水凝胶的灭菌，尽管本领域已知的其它灭菌方法可能也是合适的。如本文所示，γ灭菌是可接受的灭菌方法，因为本发明的声学ECM水凝胶在γ灭菌时保持其劲度(stiffness)。在一个实施方案中，在ECM溶液形成凝胶之前，对声学ECM水凝胶进行γ灭菌，例如，液体中的ECM可以在声处理之前灭菌，或者在声处理之后形成凝胶之前灭菌。在另一个实施方案中，在形成凝胶后，对声学ECM水凝胶进行γ灭菌。在一些实施方案中，声学ECM水凝胶在通过γ辐照灭菌后保持凝胶形式，或可以形成凝胶。

相反，对于酶促制造的水凝胶，γ辐照使组合物不稳定。因此，在γ辐照之后，不形成凝胶，或使凝胶不稳定。

作为粘膜下层衬垫物的声学ECM水凝胶

内窥镜检查是一种允许在不采用侵入性手术的情况下通过被称为内窥镜的仪器来检查身体的中空器官或空腔的内部的程序。内窥镜检查可以用于外科程序，例如烧灼出血血管、切除息肉、腺瘤和小肿瘤、进行活组织检查或切除外物。内窥镜检查程序可以在胃肠道、呼吸道、耳朵、泌尿道、雌性生殖系统中进行，并且通过小切口在通常闭合的体腔，例如腹腔或盆腔(腹腔镜检查)、关节内部(关节镜检查)和胸腔器官(胸腔镜检查和纵隔镜检查)中进行。内窥镜检查可以在上胃肠道或下胃肠道中进行。内窥镜是用于诊断或治疗目的用于使中空器官或部分(例如膀胱、食管、胃或肠)的内部可视化的被照亮的、通常为光纤的、柔性或刚性的管状器械，其通常具有一个或多个工作通道以使得器械(例如镊子、手术用电刀、内窥镜注射针或剪刀)能够通过或便于活检样品的取出。它包括在其远侧部分的合适的灯和成像装置，并且它可以通过身体的天然存在的开口(如嘴、肛门、耳、鼻)或通过小的手术切口插入。考虑到可以通过内窥镜检查程序检查的身体器官或体腔的广泛多样性，存在几种类型的专用内窥镜，例如喉镜、胸腔镜、血管镜、结肠镜、肠镜、乙状结肠镜、直肠镜(rectoscope)、直肠镜(proctoscope)、肛门镜、关节镜、鼻镜、腹腔镜、宫腔镜、脑窥镜、肾镜(nephroscope)、食管镜、支气管镜、胃镜、羊膜镜、膀胱镜。

内窥镜检查程序广泛应用于胃肠道，包括上胃肠道和下胃肠道。例如，内窥镜检查程序可以用于检查覆盖胃肠腔的粘膜，并且用于检测小的和大的病理病变，例如炎性组织、息肉、假息肉、锯齿状病变、腺瘤、溃疡、发育异常、肿瘤前和肿瘤形成以及肿瘤。内窥镜检查程序可以用于活组织检查和病理病变(息肉、腺瘤、发育异常、肿瘤前和肿瘤形成、肿瘤)的去除。外科手术包括通常用于胃肠内窥镜检查以去除病理病变的两种类型的内窥镜切除程序：内窥镜粘膜切除术(EMR)和内窥镜粘膜下层剥离术(ESD)。这两种技术允许最小侵入性处理胃肠息肉、腺瘤、发育异常和早期癌症，其涉及最小风险的淋巴结转移。

本文公开了用于从受试者的器官区域的固有肌层剥离粘膜和粘膜下层的方法。器官可以在胃肠道，例如食管、十二指肠、胃、小肠、大肠(结肠)或直肠中。器官可以是膀胱、口腔-呼吸系统的器官(肺、咽喉(咽)、舌、鼻道、鼻窦)、皮肤、或子宫和阴道。具体组织的实例是呼吸上皮、鼻上皮、真皮或表皮组织(dermal or epidermal tissue)和子宫上皮。一个示例性器官是食管。另一个示例性器官是结肠。所述方法用于具有粘膜和粘膜下层的任何器官，其中可形成浅表病变，例如恶性或前恶性病变。

这些方法包括将包含声学ECM水凝胶的药物组合物粘膜下层注射到受试者的器官中，以在器官区域的粘膜下层和下面的固有肌层之间形成衬垫物。在一个实施方案中，器官不是食管。在另一个实施方案中，器官是食管。所述方法可以是内窥镜粘膜切除术(EMR)或内窥镜粘膜下层剥离术(ESD)。

EMR是一种内窥镜技术，其被开发用于去除局限于胃肠(GI)道的浅表层(粘膜和粘膜下层)的固着的或扁平的赘生物。EMR通常用于去除小于2cm的病变或逐片去除较大病变。EMR还在评估切除的标本以进行准确的病理分期中起重要作用。与息肉切除术相反，EMR涉及通过将流体试剂，通常是生理盐水(NS)溶液，注入粘膜下层而从肌肉层上抬起病变。EMR也可用于获得用于精确组织病理学分期的标本以确定淋巴结转移的风险。EMR有助于通过穿过肠壁粘膜下层的中间或较深部分切除而完全除去受影响的粘膜。已经描述了各种EMR技术，并且通常使用涉及圈套切除的四种方法：(1)注射和切割方法；(2)注射、提升和切割方法；(3)帽辅助EMR(EMRC)；和(4)具有结扎的EMR(EMRL)。在注射和切割技术中，通过产生粘膜下层流体衬垫物将患病粘膜从肌肉层抬起，捕获，使用电外科勒除器勒束，然后切除。然而，注射到薄粘膜下层是一个精细的过程，注射的溶液趋于快速消散，与突出的病变相比，平坦和凹陷的病变难以被勒除器捕获，并且大或笨拙定位的病变可能难以去除(Uraoka等人,Drug Design,Development and Therapy 2008:2 131-138)。注射辅助的EMR常用于大的扁平结肠息肉。

内窥镜粘膜下层剥离术(ESD)被特别开发用于去除较大的病变。使用手术用电刀沿着粘膜下层直接剥离病变，导致整体(en-bloc)切除甚至大的病变。已经预测ESD在治疗某些癌症阶段中代替传统的手术，但是由于它具有比传统EMR更高的穿孔和出血并发症的比率，所以与EMR相比，需要更大程度的内窥镜技能和经验。ESD可以使用许多电外科手术刀(electrosurgical knives)，例如顶端绝缘的透热刀(insulation-tipped diathermicknife)、针刀(needle knife)、钩刀(hook knife)、弯刀(flex knife)、顶端三角形的刀(triangle tipped knife)、冲洗刀(flush knife)、防溅针(splash needle)和小口径顶端透明罩(small-caliber tip transparent hood)。这些刀可以与高频电外科电流(HFEC)发电机一起使用。ESD的特征在于三个步骤：(1)注入流体以形成粘膜下层衬垫物，从而从所述肌肉层提升所述病变；(2)对病变的周围粘膜进行周向切割；和(3)病变下粘膜下层结缔组织的剥离(参见Kakushima等人,Wold J.Gstroenterol.14(9):2962-2967,2008，通过引用并入本文)。以前已经开发了各种粘膜下层注射溶液，并且显示在EMR期间使用是令人满意的，但是引入更长的ESD程序需要更持久的溶液以帮助在粘膜下层剥离期间识别切割线(Uraoka等人,Drug Design,Development and Therapy 2008:2 131-138)。目前公开的方法满足这种需要。

粘膜下层注射用于EMR，因为将流体注射入粘膜下层衬垫物有利于临到捕获目标病变之前分离待除去的组织，如用勒除器，由此减少热损伤和穿孔和出血的风险，同时也有利于切除。粘膜下层注射在EMR程序中起到重要作用，因为溶液必须保持在适当位置足够的时间，并且需要形成半球形以便于勒除。此外，提供足够高的粘膜下层提升导致在ESD程序期间安全的粘膜下层切割(Uraoka等人,Drug Design,Development and Therapy2008:2131-138)。此外，由于该程序导致炎症，所以保留在该程序部位的任何衬垫物都应具有抗炎性质。声学ECM水凝胶将减轻狭窄并促进上皮再形成。目前公开的方法也满足这种需要。

在一些实施方案中，所公开的方法利用声学ECM水凝胶，其具有抗炎性质，并且廉价、无毒、易于注射并提供高的持久的粘膜下层衬垫物。将声学ECM水凝胶以其凝胶状态给予在注射部位以形成衬垫物。在该程序期间可以剥离衬垫物以便一些水凝胶保留在下面的固有肌层上，从而帮助愈合。所公开的声学ECM水凝胶促进了通过移除被切除的粘膜/粘膜下层而产生的伤口的闭合。在一些实施方案中，该程序是ESD。在其它实施方案中，该程序是EMR。

生理盐水溶液(NS)和稀释剂溶液(例如，ELEVIEW^TM，参见美国专利9,226,996，通过引用并入本文)已被用作内窥镜切除术的粘膜下层衬垫物，但由于溶液的快速分散，这些溶液的固有特性使得难以制造适当的粘膜下层流体衬垫物，保持所需高度，并将衬垫物保持在所需位置。此外，在ESD中，一旦粘膜/粘膜下层被除去，这些药剂将不会保留在下面的固有肌层上。此外，这些药剂没有帮助愈合过程，例如通过减少炎症。声学ECM水凝胶的使用满足这些需求。

本文公开的声学ECM水凝胶可用于任何ESD或ESR中。如在美国专利9,364,580中公开的，通过引用并入本文，内窥镜注射针是可以长(高达大约230)cm并且包括相对长的导管的装置，在所述导管内具有远侧注射针的内部注射管可滑动地布置。近端致动手柄连接到导管和注射管，以便在需要时使一个相对于另一个运动。通常通过手柄上的leer连接器提供通向注射管的流体通路。内窥镜注射针装置通常通过内窥镜的工作通道被输送到注射部位。为了保护内窥镜工作通道的内腔不受损害，在将装置插入内窥镜之前，操纵输液针装置的手柄以将远侧注射针缩回到导管的内腔中。这防止了当装置移动通过内窥镜的内腔时注射针的锋利尖端的暴露。当内窥镜注射针装置的远端位于注射部位处时，再次操纵其手柄以使注射针向远侧运动到导管的内腔外。当前进到最远侧位置时，注射针的暴露部分的长度为大约4-6mm。

在注射部位被刺穿后，通常包含在5毫升至10毫升注射器中的声学ECM水凝胶可通过注射管和针输送到注射部位，例如粘膜下层和下面的固有肌层之间，所述注射器设有连接到注射针的手柄的鲁尔锁配件(luer-lock fitting)。

在内窥镜检查程序期间通常使用的注射针和其它附件，例如用于息肉切除术的勒除器、夹持装置、活检钳等，穿过内窥镜的一个或多个特定通道，通常称为工作通道或操作通道。根据GI内窥镜检查中使用的内窥镜的类型(例如胃镜、肠镜、结肠镜、十二指肠镜、乙状结肠镜等)，工作通道的内径可以显著地变化。然而，用于GI内窥镜检查的最普通的内窥镜具有内径在大约2mm到大约5mm范围内的工作通道。通常，内窥镜附件的制造商生产具有允许它们配合所有工作通道的外径的附件。在一些实施方案中，内窥镜注射针，导管的外径范围从1.9mm至2.3mm，例如约1.9、2.0、2.1、2.2或2.3cm。因此，考虑到内部注射管包含在外部导管中，其内径通常为1mm或更小。所公开的凝胶或液体形式的声学ECM水凝胶可容易地通过这些导管。

声学ECM水凝胶可用于内窥镜切除程序，通过注射器从其主容器中吸取一定体积的水凝胶，通过插入内窥镜工作通道中的内窥镜注射针将合适体积的所述水凝胶直接注射在浅表粘膜层下方，以将水凝胶沉积到粘膜下层中，所述粘膜下层在就位时成为衬垫物：粘膜表面的升高允许内窥镜师容易地切除在内窥镜检查程序的执行期间发现的粘膜病变，即使病变是平坦的并且因此不伸入到诸如肠、食管或胃腔的内腔中。在体温下，声学ECM水凝胶是粘性但可流动的凝胶，其转变为液相，并且可以容易地注射到浅表粘膜层下方以形成用于该程序的衬垫物。因为凝胶-溶胶转变需要时间，所以衬垫物保持在适当位置足够的时间以进行切除。

衬垫物中存在至少一种染料可以帮助内窥镜师可视化粘膜下面的结构(例如粘膜下层和外部肌肉壁)，从而降低执行切除程序的内窥镜师可能对所述结构造成损害的风险。染料的使用可以允许衬垫物空腔和粘膜基底的可视化。从粘膜表面除去病变产生粘膜伤口。由注射体积的药物组合物产生的衬垫物的持久性允许在不需要再注射的情况下执行内窥镜切除程序。将声学ECM水凝胶粘膜下注射到受试者器官的所考虑的区域中，例如在病变或肿瘤的区域，以在器官区域处在粘膜下层和下面的固有肌层之间形成衬垫物。衬垫物可被剥离，使得声学ECM水凝胶的一部分保持在下面的固有肌层上并有助于愈合过程。

所公开的方法用于食管。在一个非限制性实例中，所述方法包括从食管剥离食管癌或腺癌的方法。在另一个非限制性实例中，所述方法包括从具有巴雷特食管的受试者的食管剥离粘膜和粘膜下层。在这些实施方案中，声学ECM水凝胶可以是膀胱、小肠粘膜下层(SIS)、食管、气管、肝脏或皮肤声学ECM水凝胶。

所公开的方法也用于其它器官。该器官可以是任何所考虑的器官，例如胃肠道的器官。所述器官可以在上胃肠道中，例如咽、舌或口。所述器官可以是膀胱、阴道或子宫。在一些实施方案中，所述器官是结肠、十二指肠、胃、盲肠、结肠、乙状结肠、直肠、小肠或大肠。在一个非限制性实例中，所述器官是胃、小肠或大肠，并且所述方法包括从胃剥离癌或腺癌的方法。在另外的非限制性实例中，所述器官是结肠，并且其中所述方法包括从结肠剥离息肉或癌。在这些实施方案中，声学ECM水凝胶可以是膀胱、小肠粘膜下层、食管、气管、肝脏或皮肤声学ECM水凝胶。

如本文所公开的声学ECM水凝胶被保持在一定温度，在该温度或低于该温度，其胶凝从而以粘膜下层衬垫物的形式施用。

声学ECM水凝胶可在给予(administration)前保持在例如约4℃或约室温。在一个实施方案中，声学ECM水凝胶可在例如4℃至低于37℃，或4℃至25℃的温度给予。在一个实施方案中，声学ECM水凝胶在低于37℃的温度给予。然后使用有效量的作为凝胶的声学ECM水凝胶。声学ECM水凝胶在处于约37℃的温度的受试者的组织中保持为凝胶。在一个实施方案中，声学ECM水凝胶的凝胶至溶胶转变在约37℃，使得水凝胶可用作粘膜下层衬垫物，因为其在体温是足够粘的。

在一些实施方案中，水凝胶中ECM的浓度为25毫克/毫升至约200毫克/毫升，如约ECM水凝胶为25毫克/毫升至约100毫克/毫升。在其它实施方案中，水凝胶中ECM的浓度为约50至约150毫克/毫升，如约75至约125毫克/毫升，如约75，80，85，90，95，100，105，110，115，120或125毫克/毫升。在一个具体的非限制性实例中，水凝胶中ECM浓度为约100毫克/毫升。

声学ECM水凝胶可以在室温、冷温(例如约4℃)或冷冻(例如约-20℃)下以冻干形式提供，并且恰好在给予至受试者的所考虑的解剖区域之前重构。

所公开的方法用于任何受试者，包括人和兽医受试者。受试者可以是任何年龄的。受试者可以是成年人或青少年。在一个实施方案中，将包含声学ECM水凝胶的组合物注射到器官中的靶组织中以形成衬垫物，然后任选地对其进行内窥镜外科手术程序，例如切除程序。ECM可以来自与被治疗的受试者相同的物种，或者可以来自不同的物种。在一些实施方案中，所述受试者是人，并且所述声学ECM水凝胶源自于人或猪ECM。在其它实施方案中，ECM水凝胶源自于非人灵长类动物、狗、猫、马或牛。声学ECM也可来自商业来源。在一些实施方案中，声学ECM水凝胶可源自于任何哺乳动物组织，例如但不限于猪或人组织，并且在一些非限制性实例中，可以源自于膀胱、小肠或食管。源自任何源组织的以上公开的声学ECM水凝胶中的任一种可用作粘膜下层衬垫物和/或用于任何所公开的方法中。声学ECM水凝胶可为食管声学ECM水凝胶或膀胱声学ECM水凝胶。

所公开的方法是侵入性的，因为它们需要从受试者肠道的器官区域的固有肌层剥离粘膜和粘膜下层的注射。在一些实施方案中，声学ECM水凝胶不被施加至器官(例如胃肠道的器官，例如食管)的表面。所公开的方法可以用于食管，但也可以用于其它组织。

本文公开的方法中的任一个可包括将包括声学ECM水凝胶的药物组合物从粘膜下层注射到受试者的器官中，以在器官区域的粘膜下层和下面的固有肌层之间形成衬垫物。上文公开了合适的声学ECM水凝胶。声学ECM水凝胶胶凝并从下面的固有肌层剥离粘膜和粘膜下层，并抑制受试者中的器官区域中的炎症。作为凝胶的声学ECM水凝胶可通过内窥镜或通过导管给予。在一些实施方案中，所述器官是食管、结肠、胃、盲肠、结肠、乙状结肠、直肠、小肠或大肠。声学ECM水凝胶，作为凝胶或溶胶，也可以通过内窥镜或通过导管给予。在另外的实施方案中，声学ECM水凝胶可以是膀胱、小肠粘膜下层、食管、气管、肝脏或皮肤声学ECM水凝胶。在一些实施方案中，ECM可以来自人组织。在其它实施方案中，ECM可以来自猪组织。

在一些实施方案中，切除程序是内窥镜粘膜切除术或食管内窥镜粘膜下层剥离术，并且所述方法包括从食管剥离食管癌或腺癌的方法。在更多的实施方案中，所述方法包括从患有发育异常的患者的食管剥离粘膜和粘膜下层。在更多的实施方案中，所述方法包括从具有巴雷特食管的受试者的食管剥离粘膜和粘膜下层。

在一些实施方案中，切除程序是内窥镜粘膜切除术或内窥镜粘膜下层剥离术。在另外的实施方案中，所述器官是胃、小肠或大肠，并且所述方法包括从结肠剥离息肉、癌或腺癌的方法。在更多的实施方案中，所述方法包括从患有发育异常的患者的器官剥离粘膜和粘膜下层。在具体的非限制性实例中，该方法包括从结肠剥离息肉或癌。

该方法还可以包括在衬垫物上进行内窥镜切除程序。在一些实施方案中，所述方法包括分开衬垫物，使得水凝胶保留在食管的下层固有肌层上，并且从食管区域移除粘膜和粘膜下层。在一些非限制性实例中，保留在下层固有肌层上的水凝胶衬垫物的部分下调食管中的促炎性巨噬细胞活化。

公开内容通过以下非限制性实施例说明。

实施例

目前，由ECM制造水凝胶的方法涉及用酸性溶液中的酸蛋白酶消化ECM材料(Feyetes,Biomaterials 29(11)(2008)1630-7；Voytik-Harbin,Tissue Engineering 4(2)(1998)157-174)，使用α-淀粉酶消化以制造ECM泡沫(Kommuller等人,JoVE(Journal ofVisualized Experiments)(122)(2017)e55436)；或使用离液提取缓冲液和长透析程序(Uriel,Tissue Eng Part C Methods 15(3)(2009)309-21；Uriel,Biomaterials 29(27)(2008)3712-9)。根据这种方法制备的ECM水凝胶不可避免地经历蛋白质降解和变性，这可以减弱ECM分子的全部补体(full complement)和组织特异性ECM组分的生物活性。此外，制造ECM水凝胶的基于酶的方法需要24-72小时的长孵育时间以实现ECM组分的充分溶解，并且需要添加外源酶用于消化(Saldin等人,Acta Biomater 49(2017)1-15；Spang等人,Actabiomaterialia 68(2018)1-14)。使用酶消化制备的ECM水凝胶也受到有限的浓度依赖性流变性质的阻碍(Saldin等人,同上,2017)。为了实现ECM水凝胶的全部临床潜力，开发了根本不同的方法，由此ECM水凝胶可以快速形成，而不使用酸性或碱性溶液、蛋白酶消化、或化学提取和透析。

公开了使用超声空化制造声学ECM水凝胶的方法，以及这些声学ECM水凝胶的粘弹性质、细胞相容性和生物活性的表征。在一些实施方案中，使用粉碎的ECM作为起始材料，该方法包括将ECM再悬浮于中性缓冲盐水溶液中，然后使用20kHz超声频率溶解。ECM溶液的快速胶凝可通过将ECM溶液的温度降低至低于25℃的温度来诱导。胶凝时间和ECM凝胶性质可以通过调节ECM浓度、及声处理振幅和时间来容易地调整。一旦聚合，ECM凝胶在4℃至37℃范围内的温度是稳定的。此外，使用该方法制备的ECM水凝胶是生物相容的，并且能够促进M2样、预重塑巨噬细胞表型，其有益于下游建设性组织重塑(Hussey等人,Nature ReviewsMaterials,3:159-173(2018))。相比于制造具有不同性质的水凝胶的传统酶促方法，这些方法提供了大规模制造声学ECM水凝胶的优势。通过本发明公开的方法制造的声学ECM水凝胶可用于基于组织工程和再生医学的临床应用。

本发明涉及以下方案：

方案1.制造细胞外基质(ECM)水凝胶的方法，包括使用超声频率将哺乳动物ECM溶解在液体中以制造液相中的声学ECM水凝胶。

方案2.方案1的方法，其中在30℃至43℃之间的温度施加超声频率。

方案3.方案1或2的方法，其中在35℃至40℃之间的温度施加超声频率。

方案4.方案1-3中任一项的方法，其中在36℃至38℃之间的温度施加超声频率。

方案5.方案1-4中任一项的方法，其中在约37℃的温度施加超声频率。

方案6.方案1-5中任一项的方法，其中，哺乳动物ECM以约25毫克/毫升至约600毫克/毫升的浓度存在。

方案7.方案1-6中任一项的方法，其中超声频率是20kHz或更大。

方案8.方案1-7中任一项的方法，其中超声频率是20kHz至约100kHz。

方案9.方案1-8中任一项的方法，其中施加超声频率至少30秒。

方案10.制造细胞外基质(ECM)水凝胶的方法，包括在大于约37℃的温度用频率为约20kHz至约100kHz的超声溶解浓度为约25毫克/毫升至约600毫克/毫升的在液体中的哺乳动物ECM至少约30秒以制造液相中的声学ECM水凝胶。

方案11.方案1-10中任一项的方法，其中用超声处理哺乳动物ECM至少约60秒。

方案12.方案1-11中任一项的方法，其中哺乳动物ECM是冻干的哺乳动物ECM。

方案13.方案12的方法，其中冻干的哺乳动物ECM被粉碎成粉末。

方案14.方案1-13中任一项的方法，其中ECM以约10μm至约2000μm范围的碎片的形式提供。

方案15.方案1-13中任一项的方法，其中ECM以约10μm至约1000μm范围的碎片的形式提供。

方案16.方案1-15中任一项的方法，进一步包括将液相的声学ECM水凝胶冷却到约37℃或更低的温度，由此制造凝胶相的声学ECM水凝胶。

方案17.方案16的方法，其中冷却是到4℃至25℃的温度。

方案18.方案16的方法，其中冷却是到4℃至小于37℃的温度。

方案19.方案1-18中任一项的方法，其中超声的频率为约20kHz。

方案20.方案1-19中任一项的方法，其中超声具有约20μm至约320μm的振幅。

方案21.方案20的方法，其中超声具有约36μm至约180μm的振幅。

方案22.方案1-21中任一项的方法，包括用超声处理在液体中的溶解的哺乳动物ECM约60秒至约1小时。

方案23.方案1-22中任一项的方法，包括用超声处理在液体中的溶解的哺乳动物ECM约60秒。

方案24.方案1-23中任一项的方法，包括提供浓度为25毫克/毫升至150毫克/毫升的在液体中的哺乳动物ECM。

方案25.方案1-24中任一项的方法，包括在约30-45℃的温度用超声处理在液体中的溶解的哺乳动物ECM。

方案26.方案1-24中任一项的方法，包括在约35℃至40℃的温度用超声处理在液体中的溶解的哺乳动物ECM。

方案27.方案1-24中任一项的方法，包括在约36℃至38℃的温度用超声处理在液体中的溶解的哺乳动物ECM。

方案28.方案1-24中任一项的方法，包括在约37℃的温度用超声处理在液体中的溶解的哺乳动物ECM。

方案29.方案1-24中任一项的方法，包括在约40℃的温度用超声处理在液体中的溶解的哺乳动物ECM。

方案30.方案1-29中任一项的方法，其中ECM是人ECM。

方案31.方案1-30中任一项的方法，其中液体是磷酸盐缓冲盐水。

方案32.方案1-31中任一项的方法，其中ECM是膀胱ECM、小肠粘膜下层ECM、食道ECM、气管ECM、肝脏ECM或皮肤ECM。

方案33.方案1-32中任一项的方法，其中ECM是猪ECM或牛ECM。

方案34.方案1-33中任一项的方法，其中ECM是猪食道ECM。

方案35.方案1-33中任一项的方法，其中ECM是猪膀胱ECM。

方案36.方案1-35中任一项的方法，进一步包括在冷却前将液相的声学ECM水凝胶置于三维铸模中。

方案37.方案36的方法，其中所述铸模制造至少4微米厚的片。

方案38.方案1-37中任一项的方法，其中声学ECM水凝胶是γ辐照的。

方案39.方案38的方法，其中声学ECM水凝胶是用约20kGyγ辐照的。

方案40.通过方案1-39中任一项的方法制造的声学ECM水凝胶。

方案41.声学ECM水凝胶，其中所述水凝胶是热致可逆的，其中所述水凝胶在低于约37℃的温度处于凝胶相，并且在高于约37℃的温度处于液相。

方案42.方案40或41中任一项的声学ECM水凝胶，其中储能模量(G')比损耗模量(G")大大约一个数量级。

方案43.方案40-42中任一项的声学ECM水凝胶，其中在约15℃至约37℃的温度，随着增加的应力，声学ECM水凝胶的粘度降低。

方案44.方案40-43中任一项的声学ECM水凝胶，其中哺乳动物ECM水凝胶是人ECM水凝胶。

方案45.方案40-44中任一项的声学ECM水凝胶，其中ECM是膀胱ECM、小肠粘膜下层ECM、食道ECM、气管ECM、肝脏ECM或皮肤ECM。

方案46.方案40-45中任一项的声学ECM水凝胶，其中ECM是猪ECM。

方案47.方案40-46中任一项的声学ECM水凝胶，其中声学ECM水凝胶在15℃具有约1400Pa*s的粘度，并且在25℃的温度具有约400Pa*s的粘度，并且其中声学ECM水凝胶包括浓度为约150毫克/毫升的ECM。

方案48.方案40-47中任一项的声学ECM水凝胶，其中声学水凝胶具有在15℃大约2700Pa*s、在25℃大约800Pa*s和在37℃600Pa*s的储能模量，并且其中声学水凝胶包括浓度为约150毫克/毫升的ECM。

方案49.方案40-48中任一项的声学ECM水凝胶，其中水凝胶是γ辐照的。

方案50.方案40-49中任一项的声学ECM水凝胶，其中水凝胶不含有外源蛋白酶或失活的外源蛋白酶。

方案51.方案40-50中任一项的声学ECM水凝胶，其中水凝胶不含有外源胃蛋白酶、胰蛋白酶或透明质酸酶或者失活形式的外源胃蛋白酶、胰蛋白酶或透明质酸酶。

方案52.增加受试者中病变处的止血的方法，包括向病变局部给予治疗有效量的方案40-51中任一项的声学ECM水凝胶，由此增加止血。

方案53.方案52的方法，其中病变是外科伤口、烧伤、或外伤性损伤。

方案54.方案52或53的方法，其中受试者是人。

方案55.方案52-54中任一项的方法，其中病变在受试者的血管、肝脏、肺或皮肤中。

方案56.方案52-55中任一项的方法，其中，在将声学ECM水凝胶给予受试者后约10至约100秒内诱导止血。

方案57.诱导巨噬细胞中的M2表型的方法，包括用有效量的方案40-51中任一项的声学ECM水凝胶处理巨噬细胞，由此诱导M2表型。

方案58.方案57的方法，其中受试者是人。

方案59.用于从受试者的器官区域的固有肌层剥离粘膜和粘膜下层的方法，包括：

将包含方案40-51中任一项的声学ECM水凝胶的药物组合物粘膜下层注射到受试者的器官中，以在器官区域的粘膜下层和下面的固有肌层之间形成衬垫物，

由此从下面的固有肌层剥离粘膜和粘膜下层，并抑制受试者中的器官区域中的炎症。

方案60.方案59的方法，其中声学ECM水凝胶是由膀胱ECM、小肠粘膜下层ECM、食道ECM、气管ECM、肝脏ECM或皮肤ECM制造的。

方案61.方案59或方案60的方法，其中声学ECM水凝胶中的ECM浓度为25毫克/毫升至约600毫克/毫升。

方案62.方案59或方案60的方法，其中声学ECM水凝胶中的ECM浓度为25毫克/毫升至约100毫克/毫升。

方案63.方案59-62中任一项的方法，其中声学ECM水凝胶通过内窥镜或通过导管给予。

方案64.方案59-63中任一项的方法，其中所述器官是食道、胃、结肠、直肠、或小肠。

方案65.方案64的方法，其中所述结肠是升结肠、横结肠、降结肠或乙状结肠。

方案66.方案64的方法，其中所述小肠是空肠、盲肠、或回肠。

方案67.方案59-66中任一项的方法，其中所述方法包括从器官剥离腺癌或癌的方法。

方案68.方案67的方法，其中所述器官是胃、小肠、或结肠。

方案69.方案64-65中任一项的方法，其中所述器官是结肠并且所述方法

方案70.方案64、65、或69中任一项的方法，其中所述器官是结肠，并且其中所述方法包括从结肠剥离息肉或癌。

方案71.方案59-64中任一项的方法，其中所述器官是食管，并且其中所述方法包括从食管的固有肌层剥离粘膜和粘膜下层。

方案72.方案71的方法，其中受试者具有巴雷特食管。

方案73.方案59-72中任一项的方法，进一步包括在衬垫物上进行内窥镜切除程序以除去被剥离的粘膜和粘膜下层。

方案74.方案73的方法，其中切除程序是内窥镜粘膜切除术或内窥镜粘膜下层剥离术。

方案75.方案74的方法，其中该方法包括：

分开衬垫物，使得声学ECM水凝胶保留在所述器官的下面的固有肌层上，并且从器官区域移除粘膜和粘膜下层。

方案76.方案59-75中任一项的方法，其中受试者是人。

方案77.方案59-76中任一项的方法，其中所述器官在胃肠道中。

实施例1

材料和方法

皮肤ECM的制备：如先前所述制备皮肤ECM(Reing JE,等人.Biomaterials.2010；31(33):8626-33)。简言之，从上市重量(约110kg)的猪(Tissue Source Inc.)采集全厚度皮肤，并通过机械分层除去皮下脂肪和表皮。然后用0.25％胰蛋白酶(Thermo FisherScientific)处理该组织6小时，用70％乙醇处理10小时，用3％H₂O₂处理15分钟，用1％TritonX-100(Sigma-Aldrich)/0.26％EDTA/0.69％tris处理6小时，溶液更换另外16小时，和用0.1％过乙酸/4％乙醇(Rochester Midland)处理2小时。在每次化学变化之间进行水洗，其中在最后的步骤之后，交替进行水和磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。所有化学暴露在定轨摇床上以300rpm搅拌下进行。然后将皮肤ECM冻干，并使用具有#60目筛网的Wiley磨机研磨成颗粒。

膀胱基质(UBM)的制备：UBM如前所述制备(Mase VJ,等人.Orthopedics.2010；33(7):511)。来自上市重量的动物的猪膀胱获自Tissue Source,LLC。简言之，机械地除去浆膜、外肌层、粘膜下层和肌层粘膜。通过用去离子水洗涤将粘膜的腔尿道上皮细胞从基底膜上分离。剩余的组织由基底膜和粘膜的下层固有层组成，并通过在0.1％过乙酸与4％乙醇中以300rpm搅拌2小时进行脱细胞。然后用PBS和无菌水充分冲洗组织。然后将UBM冻干，并使用具有#60目筛网的Wiley磨机研磨成颗粒。

小肠粘膜下层(SIS)的制备：如先前所述制备SIS(Badylak SF,等人.J SurgRes.1989；47(1):74-80)。简言之，从6月龄上市重量(约110至约120kg)的猪采集空肠并纵向分割。机械地除去粘膜的浅表层。同样，浆膜和外肌层被机械地移除，留下粘膜的粘膜下层和基底部分。通过在0.1％过乙酸与4％乙醇中以300rpm搅拌2小时完成组织的脱细胞和消毒。然后用PBS和无菌水充分冲洗组织。然后将SIS冻干，并使用具有#60目筛网的Wiley磨机研磨成颗粒。

食道ECM的制备：如先前所述制备食道ECM(Keane TJ,等人Tissue Eng PartA.2015；21(17-18):2293-300)。简言之，通过将粘膜和粘膜下层与外肌层机械地分离，并使粘膜层经受以下条件而制备食道ECM(eECM)：在37℃在摇板(rocker plate)上的1％胰蛋白酶/0.05％EDTA(Invitrogen,Carlsbad,CA)1小时，去离子水15分钟，1M蔗糖(FisherScientific,Pittsburgh,PA)30分钟，去离子水30分钟，3.0％Triton X-100(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)48小时，去离子水15分钟，磷酸盐缓冲盐水(PBS；FisherScientific)15分钟，10％脱氧胆酸盐(Sigma-Aldrich)4小时，去离子水30分钟，0.1％过乙酸(Rochester Midland Corp.,Rochester,NY)/4.0％乙醇4小时，在摇板上的100U/毫升DNAse(Invitrogen)2小时，随后用PBS、去离子水、PBS和去离子水洗涤15分钟。所有洗涤在摇动板(shaker plate)上以300rpm搅拌。然后将食道的ECM冻干，并使用具有#60目筛网的Wiley磨机研磨成颗粒。

ECM的超声处理：在15毫升锥形管中将100毫克ECM粉末再悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，并用装备有1/8"探针的FISHERBRAND^TM120型声波分离粉碎机(SonicDismembrator)进行声处理。ECM浓度在20-200毫克(w/v)变化。将再悬浮的ECM声处理，在100％振幅设置下进行30秒开和45秒关的循环脉冲。重复该循环六次以产生可溶的ECM溶液。这种循环脉冲设置确保凝胶溶液保持在34-40℃范围内的温度。

声处理的ECM溶液的胶凝：将ECM溶液倒入3D模具中，并且温度降至25℃或更低以诱导胶凝。ECM凝胶储存在4℃或冷冻干燥以产生保持其3D几何形状的冻干ECM构建体。备选地，将ECM溶液均匀地铺展在特氟龙片上，并在4℃孵育以诱导胶凝。然后将ECM凝胶在室温下孵育24小时以蒸发水，产生超薄ECM片。

ECM油灰的制备：将ECM粉末再悬浮于25毫克/毫升(w/v)PBS中，并如上所述进行声处理。在浓度≤25毫克/毫升和温度为4-30℃时，溶解的ECM形成油灰。

ECM水凝胶流变学：所有流变学数据使用流变仪(AR2000,TA instruments,NewCastle,DE)收集，该流变仪如前所述(Medberry CJ,等人.Biomaterials.2013；34(4):1033-40)装备有40mm平行板几何形状，并使用美国材料与试验协会(ASTM)标准F2900-11(用于再生医学的水凝胶表征指南)分析。使用Peltier板将温度控制在0.1℃内。在室温(25℃)或4℃，将凝胶前体装载到平行板流变仪上。使用矿物油密封样品-板界面的边缘，使样品蒸发最小化。

扫描电子显微术：拍摄扫描电子显微照片以检查ECM水凝胶的表面拓扑结构。将样品在冷的2.5％(v/v)戊二醛(Electron Microscopy Sciences,Hatfield,PA)/PBS固定至少24小时，然后在PBS中洗涤三次。然后使用分级系列的醇(30、50、70、90、100％)将固定的样品脱水，每次15分钟，随后在六亚甲基二胺(Fisher)中15分钟，并随后风干。使用溅射涂布机108Auto(Cressington Scientific Instruments,Watford,UK)将干燥的样品溅射涂覆3.5nm的金/钯合金层，并用JEOL JSM6330f扫描电子显微镜(JEOL,Peabody,MA)在100×和500×放大倍数下成像。

细胞相容性分析：将3T3成纤维细胞接种在用由UBM、SIS或真皮制备的ECM水凝胶涂布的96孔板上。未涂布的孔用作对照。将细胞培养在Dulbecco改良的最低必需培养基中，该培养基中提供有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素。接种细胞后二十四小时，根据制造商的方案使用MTT细胞增殖分析试剂盒(Thermo Fisher)测定细胞的存活力。在540nm波长处测量转化的染料的吸光度。

止血分析。使用Lee White凝固分析。将新鲜全血收集到试管中，并且反复倾斜试管直到观察到凝固。

肝撕裂模型：用异氟烷(1-3％)麻醉6-8周龄的Sprague-Dawley大鼠。用氧中的1.5-2.5％异氟烷将动物保持在麻醉的外科平面并将动物置于腹侧卧位。使用灭菌的器械，形成小切口，并进行向下延伸的(underlying)2cm中线剖腹术以暴露肝脏。通过将#11解剖刀片置于Kelly夹中使得暴露2mm的刀片，在肝脏腹面上切开2mm深和5mm长的切口。使伤口出血3秒，然后用无菌纱布擦干净。然后将测试制品放置在缺损部位，并记录凝固时间。

巨噬细胞活化：从6-8周龄的B6小鼠采集鼠骨髓。将从骨髓中采集的细胞洗涤并以2×106个细胞/毫升铺板，并且在巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)存在下允许分化成巨噬细胞7天，每48小时更换完全培养基。然后用下列之一活化巨噬细胞24小时：1)20纳克/毫升干扰素-γ(IFNγ)和100纳克/毫升脂多糖(LPS)(Affymetrix eBioscience,Santa Clara,CA；Sigma Aldrich)，以促进MIFNγ+LPS表型(M1样)；2)20纳克/毫升白细胞介素(IL)-4(Invitrogen)以促进MIL-4表型(M2样)；或3)2毫克/毫升UBM声学凝胶。在37℃孵育期后，用无菌PBS洗涤细胞，并用2％多聚甲醛(PFA)固定细胞用于免疫标记。为了防止非特异性结合，将细胞在由PBS、0.1％Triton-X、0.1％Tween-20、4％山羊血清和2％牛血清白蛋白组成的封闭溶液中于室温下孵育1小时。然后除去封闭缓冲液，并将细胞在一抗(primaryantibodies)中孵育。将细胞在4℃孵育16小时，除去一抗，并用PBS洗涤细胞。在室温下向孔中加入荧光团偶联的二抗的溶液1小时。然后除去抗体，用PBS洗涤细胞，并使用DAPI复染细胞核。细胞因子-活化的巨噬细胞用于建立标准化的暴露时间(阳性对照)，其此后在所有组中保持恒定。

实施例2

结果

开发了一种从细胞外基质(ECM)制备水凝胶的方法。使用脱细胞组织作为起始材料，声处理技术可应用于广泛的组织特异性ECM，包括真皮、膀胱基质(UBM)和小肠粘膜下层(SIS)。该方法包括将粉碎的ECM再悬浮于中性缓冲盐水溶液中，然后用例如20kHz超声频率，使用20-100％的振幅进行ECM溶解(图1)。声处理60秒后，通过将ECM溶液的温度降低到低于37℃诱导ECM溶液的快速胶凝(图4、图5、图6)。流变学评价的结果显示，使用该方法，ECM水凝胶可使用范围为25毫克/毫升至150毫克/毫升的ECM浓度来制备(图7，图8)。一旦聚合，ECM凝胶在室温下稳定，并且可以符合可定制的3D几何形状(图2)。当用作体外培养细胞的基底时，通过声处理制备的ECM水凝胶显示出细胞相容性(图9，图13)。凝胶的扫描电子显微照片显示致密的原纤网络(图3)。此外，ECM水凝胶可用作止血剂，其可被施加到患者的解剖部位以帮助止血(图10、图11)。结果提供在附图中。

实施例3

实施例4-7的材料和方法

ECM生物支架的制备：如先前所述制备猪皮肤ECM(dECM)(Reing等人,Biomaterials31(33)(2010)8626-33)。简言之，从上市重量(约110kg)的猪采集全厚皮肤，并通过机械分层除去皮下脂肪和表皮。然后用0.25％胰蛋白酶(Thermo FisherScientific)处理该组织6小时，用70％乙醇处理10小时，用3％H₂O₂处理15分钟，用1％Triton X-100(Sigma-Aldrich)/0.26％EDTA/0.69％tris处理6小时，溶液更换另外16小时，和用0.1％过乙酸/4％乙醇(Rochester Midland)处理2小时。在每次化学变化之间进行水洗，其中在最后的步骤之后，交替进行水和磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。所有化学暴露在定轨摇床上以300rpm搅拌下进行。然后将皮肤ECM冻干，并使用具有#40目筛网的Wiley磨机研磨成颗粒。

如先前所述制备猪膀胱基质(UBM)(Mase等人,Orthopedics 33(7):511(2010))。简言之，机械地除去浆膜、外肌层、粘膜下层和肌层粘膜。通过用去离子水洗涤将粘膜的腔尿道上皮细胞从基底膜上分离。剩余的组织由基底膜和粘膜的下层固有层组成，并通过在0.1％过乙酸与4％乙醇中以300rpm搅拌2小时进行脱细胞。然后用PBS和无菌水充分冲洗组织。然后将UBM冻干，并使用具有#40目筛网的Wiley磨机研磨成颗粒。

如先前所述制备猪小肠粘膜下层(SIS)(Badylak等人,J Surg Res 47(1)(1989)74-80)。简言之，从6月龄上市重量(约110至约120kg)的猪采集空肠并纵向分割。机械地除去粘膜的浅表层。同样，浆膜和外肌层被机械地移除，留下粘膜的粘膜下层和基底部分。通过在0.1％过乙酸与4％乙醇中以300rpm搅拌2小时完成组织的脱细胞和消毒。然后用PBS和无菌水充分冲洗组织。然后将SIS冻干，并使用具有#40目筛网的Wiley磨机研磨成颗粒。

如先前所述制备猪食道ECM(Keane等人,Tissue Eng Part A 21(17-18)(2015)2293-300)。简言之，通过将粘膜和粘膜下层与外肌层机械地分离，并使粘膜层经受以下条件而制备食道ECM(eECM)：在37℃在摇板(rocker plate)上的1％胰蛋白酶/0.05％EDTA(Invitrogen,Carlsbad,CA)1小时，去离子水15分钟，1M蔗糖(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)30分钟，去离子水30分钟，3.0％Triton X-100(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)48小时，去离子水15分钟，磷酸盐缓冲盐水(PBS；Fisher Scientific)15分钟，10％脱氧胆酸盐(Sigma-Aldrich)4小时，去离子水30分钟，0.1％过乙酸(Rochester MidlandCorp.,Rochester,NY)/4.0％乙醇4小时，在摇板上的100U/毫升DNAse(Invitrogen)2小时，随后用PBS、去离子水、PBS和去离子水洗涤15分钟。所有洗涤在摇动板(shaker plate)上以300rpm搅拌。然后将eECM冻干，并使用具有#40目筛网的Wiley磨机研磨成颗粒。

稍加改动，如先前所述制备猪气管ECM(tECM)(Lange等人,Journal of tissueengineering and regenerative medicine 11(3)(2017)800-811)。简言之，将气管在含有0.25％TritonX-100+0.25％脱氧胆酸钠的去污剂溶液中孵育30分钟的负压真空循环(15个循环，-0.95kPa最大真空)，然后在新鲜去污剂溶液中浸泡过夜。每天重复该过程，在第二天和第三天用无菌DI水、在第四天用2000KU/毫升DNase水溶液、和在第五天用无菌DI水替换去污剂溶液。将该循环重复一次，总共10天的真空循环，然后在15％过乙酸+4％乙醇中过夜灭菌，并洗涤和储存在无菌PBS中。然后将气管ECM冻干，并使用具有#40目筛网的Wiley磨机研磨成颗粒。

如先前所述制备猪肝脏ECM(LECM)(Loneker等人,Journal of BiomedicalMaterials Research Part A 104(4)(2016)957-965)。从上市体重猪(110-130kg)采集肝脏。用解剖刀将组织切成0.5cm³碎片(pieces)，并在定轨振荡器上在机械搅拌下在去离子水中进行三次15分钟洗涤。然后轻轻按摩各切片(sections)以帮助细胞溶解，并在0.02％胰蛋白酶/0.05％EGTA中于37℃浸泡2小时。用1型水冲洗组织，并重复按摩，接着在3％Triton X-100中机械搅拌肝切片18-24小时。重复冲洗直到除去所有可见的细胞物质残留。在处理后，将肝ECM浸入0.1％过乙酸溶液中，然后在1型水或pH7.4的PBS中重复冲洗。然后将肝ECM冻干，并使用具有#40目筛网的Wiley磨机研磨成颗粒。

通过超声空化溶解ECM：在50毫升锥形管中将粉碎的ECM再悬浮于10毫升1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，并用装备有1/8"探针的FISHERBRAND^TM120型声波分离粉碎机(SonicDismembrator)进行声处理。ECM浓度从25至100毫克/毫升(w/v)变化，并且声处理时间从30到500秒变化，振幅范围为20％-100％。图14示出了实验装置的示意图。

胶原和sGAG的定量：声处理粉碎的dECM(100毫克/毫升)，并且样品在10,000x g离心30分钟以压缩不溶性ECM组分。将含有溶解的ECM组分的澄清上清液转移到新的试管中。上清液溶液中的胶原浓度用Sircol分析试剂盒(Biocolor Ltd.UK)按照制造商推荐的方案确定。使用Blyscan硫酸化糖胺聚糖分析试剂盒(Biocolor Ltd.UK)，按照制造商推荐的方案，确定硫酸化糖胺聚糖(sGAG)浓度。

胶凝分析：使用试管倒置方法(Quin等人,Frontiers in chemistry 6(2018)；El-Fiqi等人,Acta biomaterialia 9(12)(2013)9508-9521)测量胶凝时间。在声处理样品材料(25、50或100毫克/毫升)后，立即将0.5毫升样品转移至试管中，并在4℃或25℃的恒温下孵育。通过颠倒试管每分钟观察样品的流动性。将样品停止流动的时间作为胶凝时间并记录该值。

扫描电子显微术：拍摄扫描电子显微照片以检查50和100毫克/毫升的dECM水凝胶的表面拓扑结构。将样品在冷的2.5％(v/v)戊二醛(Electron Microscopy Sciences,Hatfield,PA)/PBS中固定至少24小时，然后在PBS中洗涤三次。然后使用分级系列的醇(30、50、70、90、100％)将固定的样品脱水，每次15分钟，随后在六亚甲基二胺中15分钟，并随后风干。使用溅射涂布机108Auto(Cressington Scientific Instruments,Watford,UK)将干燥的样品溅射涂覆3.5nm的金/钯合金层，并用JEOL JSM6330f扫描电子显微镜(JEOL,Peabody,MA)成像。

粘弹性测量：所有流变学数据使用流变仪(AR2000ex,TA instruments,NewCastle,DE)收集，该流变仪如前所述(Medberry等人,Biomaterials 34(4)(2013)1033-40)装备有40mm平行板几何形状，并使用美国材料与试验协会(ASTM)标准F2900-11(用于再生医学的水凝胶表征指南)分析。在测试前，将各组织类型的样品(dECM和eECM，100毫克/毫升)置于起始温度(4、25或37℃)，各自测试温度曲线(temperature profile)，持续1小时。将样品装载到装配有设定为起始温度的40mm平行板几何结构的AR-2000ex流变仪上。使用矿物油密封样品-板界面的边缘，使在测试期间蒸发最小化。振荡时间扫描进行1小时，以通过以1rad/s的频率施加小的0.5％振荡应变并根据测试的温度曲线快速改变温度(37或4℃)来测量声处理的水凝胶胶凝动力学。使用Trios软件(TA Instruments)输出数据，并使用Prism v8软件(GraphPad,San Diego,CA)进行分析。"平均储能模量"是在60分钟测试的最后10分钟内平均的储能模量G'，表示G'平台。达到50％胶凝的时间被确定为达到平均储能模量的50％的时间。

体外代谢分析：将3T3成纤维细胞接种在用由UBM、SIS或dECM制备的100毫克/毫升ECM水凝胶涂布的96孔板上。未涂布的孔用作对照。将细胞培养在Dulbecco改良的最低必需培养基中，该培养基中提供有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素。接种细胞后二十四小时，根据制造商的方案使用MTT细胞增殖分析试剂盒(Thermo Fisher)评价细胞的存活力。在540nm波长处测量转化的染料的吸光度。

体外细胞相容性：如先前所述分离原代马间充质干细胞(Adams等人,Equineveterinary journal 45(3)(2013)372-375)。将细胞接种在用由UBM或dECM制备的100毫克/毫升ECM水凝胶涂布的6孔板上。未涂布的孔用作对照。接种后二十四小时，按照制造商的说明书，使用活/死存活力/细胞毒性试剂盒(Invitrogen)确定体外细胞相容性。在3个技术重复(technical replicates)中拍摄5个200X范围的图像。使用CellProfiler量化活细胞和死细胞的百分比。用Zeiss Axiovert显微镜拍摄图像，以200X放大率捕获五个随机范围。使用定制的CellProfiler管道完成活细胞和死细胞百分比的量化。

体外巨噬细胞响应：从6-8周龄的B6小鼠采集鼠骨髓细胞。将从骨髓中采集的细胞洗涤并以2×10⁶个细胞/毫升铺板，并且在巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)存在下允许分化成巨噬细胞7天，每48小时更换完全培养基。然后用下列之一活化巨噬细胞24小时：1)20纳克/毫升干扰素-γ(IFNγ)和100纳克/毫升脂多糖(LPS)(Affymetrix eBioscience,SantaClara,CA；Sigma Aldrich)，以促进M_IFNγ+LPS表型(M1样)；2)20纳克/毫升白细胞介素(IL)-4(Invitrogen)以促进M_IL-4表型(M2样)；3)2毫克/毫升dECM水凝胶；或4)2毫克/毫升eECM水凝胶。在37℃24小时孵育期后，用无菌PBS洗涤细胞，并用2％多聚甲醛(PFA)固定细胞用于免疫标记。为了防止非特异性结合，将细胞在由PBS、0.1％Triton-X、0.1％Tween-20、4％山羊血清和2％牛血清白蛋白组成的封闭溶液中于室温下孵育1小时。然后除去封闭缓冲液，并将细胞用一抗(primary antibodies)孵育。将细胞在4℃孵育16小时，除去一抗，并用PBS洗涤细胞。在室温下向孔中加入荧光团偶联的二抗的溶液1小时。然后除去抗体，用PBS洗涤细胞，并使用DAPI复染细胞核。细胞因子-活化的巨噬细胞(阳性对照)用于建立标准化的暴露时间(阳性对照)以对剩余的治疗组成像。

统计方法：所有分析都是使用Prism软件(GraphPad Software Inc)进行的，显著性定义为p＜0.05。使用方差分析(ANOVA)和成对比较与事后(post hoc)图基(Tukey)多重比较检验，分析溶解的胶原和sGAG结果。使用方差分析(ANOVA)与事后(post hoc)图基(Tukey)多重比较检验，分析胶凝时间结果。对于单次比较，进行学生不成对t检验(student'sunpaired t-test)。通过双向方差分析(ANOVA)，对于独立变量温度和ECM类型以及因变量储能模量，分析流变数据，对于温度的主要影响，使用事后(post hoc)图基(Tukey)多重比较检验。进行学生不成对t检验(student's unpaired t-test)以比较dECM和eECM的胶凝时间。

实施例4

胶原和sGAG的溶解

为了评价声处理振幅对胶原和硫酸化糖胺聚糖(sGAG)的溶解的影响，将粉碎的dECM以20％、40％、60％、80％和100％振幅声处理300秒。结果显示随着增加声处理振幅，溶解的胶原显著增加(图15A)。相反，声处理振幅对sGAG的溶解没有显著影响(图15B)。为了评价声处理时间对胶原sGAG的溶解的影响，将粉碎的dECM以100％振幅声处理30至500秒的时间。结果显示随着增加声处理时间，溶解的胶原显著增加(图15C)。相反，声处理时间对sGAG的溶解没有显著影响(图15D)。

实施例5

胶凝动力学和定性评价

计算声处理时间和振幅对以25、50或100毫克/毫升浓度制备的dECM水凝胶的胶凝动力学的影响。结果显示，对于所有测试浓度，与25℃相比，在4℃孵育预凝胶溶液显著减少形成凝胶所需的时间(图16A)。此外，与在4℃孵育时的25毫克/毫升浓度相比，100毫克/毫升浓度显示胶凝时间显著减少(图16A)。在所有测试浓度下，将声处理振幅从20或40％增加至80或100％振幅导致胶凝时间的显著减少(图16B)。在40或100％振幅声处理的25和100毫克/毫升浓度之间观察到胶凝时间的显着差异(图16B)。测定以100毫克/毫升浓度制备的UBM、SIS、eECM、tECM和LECM的胶凝动力学(图16C)。结果显示，对于所有测试的ECM组织类型，与在25℃孵育相比，在4℃孵育预凝胶溶液显著减少了形成凝胶所需的时间。此外，与所有其它ECM组织类型相比，eECM水凝胶在4℃显示出显著减少的胶凝时间。当在25℃孵育时，与tECM和LECM相比，eECM显示出显著减少的胶凝时间。50毫克/毫升和100毫克/毫升dECM水凝胶的扫描电子显微照片显示具有组织化胶原原纤维的致密原纤维网络(图3)。

实施例6

流变性测量

两种组织类型的ECM水凝胶(dECM和eECM，100毫克/毫升))在3个温度曲线下测试：1)4→37℃，2)25→37℃，和3)37→4℃(图17A)。当温度降低(37→4℃)时，ECM水凝胶显示出胶凝的S形增加(储能模量，G')。水凝胶在S形胶凝曲线的平台处显示储能模量G'＞损耗模量G"。当温度升高(4→37℃或25→37℃)时，水凝胶的劲度随着时间的推移而保持(G'>>G")(图17A)。当终点温度迅速降低37→4℃(3447.3±3340.1Pa)时，相比于当终点温度升高4→37℃(234.4±215.7Pa)(p＝0.04)或25→37℃(245.8±94.5Pa)(p＝0.04)时，dECM水凝胶的储能模量G'增加(图17B)。与4→37℃(733.0±363.7Pa)或25→37℃(624.1±133.5Pa)相比，当最终温度快速降低37→4℃(2237.4±227.1Pa)时，eECM的劲度也趋于增加，但不显著(p＝0.4)(图17B)。对于dECM和eECM，确定37→4℃的S形胶凝曲线的胶凝时间(达到50％胶凝的时间)(图18C)。通过学生不成对t-检验(p＝0.006)，与dECM(2.5±0.5min)相比，eECM(0.5±0.4min)的胶凝时间较短。对于升至37℃的温度曲线，没有确定胶凝时间，因为胶凝得以保持。

实施例7

体外细胞响应

MTT细胞增殖分析显示从dECM、UBM或SIS制备的ECM水凝胶对NIH 3T3成纤维细胞是非细胞毒性的(图18A)。类似地，活/死分析的结果显示，原代马间充质干细胞在接种于由dECM或UBM制备的ECM水凝胶上时保持几乎100％的存活力(图18B，C)。在这些处理之间并且当与在组织培养塑料(对照)上培养24小时的细胞相比时，增殖和存活力没有差异(图18B，C)。先前已显示使用胃蛋白酶消化方法制备的ECM水凝胶促进M2样巨噬细胞表型(Huleihel等人,"Macrophage phenotype in response to ECM bioscaffolds,"Seminars inimmunology,Elsevier,2017,pp.2-13；Sicari等人,Biomaterials35(30)(2014)8605-8612；Dziki等人,Journal of biomedical materials research Part A 105(1)(2017)138-147)。为了评价使用超声空化方法制备的ECM水凝胶是否对巨噬细胞表现出相似的影响，用干扰素-γ(IFN-γ)和脂多糖(LPS)刺激原代鼠骨髓衍生的巨噬细胞以诱导M1样巨噬细胞表型，用白介素-4(IL-4)刺激以诱导M2样表型，dECM水凝胶或eECM水凝胶。所有实验组显示均匀的F4/80染色。对照显示出当用IFNγ/LPS处理巨噬细胞时iNOS的预期增加，以及当用IL-4处理时Fizz1的增加(图18B，D，E)。发现dECM和eECM水凝胶处理都促进M2样巨噬细胞活化，类似于IL-4处理的巨噬细胞，如由少量iNOS表达所伴随的Fizz1表达所示的(图18B，D，E)。

因此，评价了使用超声空化制备的ECM水凝胶的胶凝动力学、流变性质和细胞相容性和生物活性。尽管本研究主要专注于使用dECM来开发和评价超声空化方法，但在选择性分析中使用来自五种其它来源组织的ECM以显示超声空化方法可应用于衍生自表1中概述的各类的脱细胞组织的ECM。

表1：ECM源组织的概述，以及用于评价制造ECM水凝胶的超声空化方法的选择性分析。所评价的ECM组织来源是皮肤ECM(dermal ECM,dECM)、食管ECM(eECM)、膀胱基质(UBM)、小肠粘膜下层(SIS)、气管ECM(tECM)、肝ECM(LECM)。

在本研究中，ECM支架在酸性溶液中溶解，而不需要用酸性蛋白酶消化；或者使用离液提取缓冲液和透析程序，这些可能对ECM的分子组成产生不利影响。当在等于或低于25℃的温度孵育时，声处理的ECM自组装成凝胶。不受理论束缚，胶凝可能是由于自组装分子如胶原的存在。事实上，ECM支架材料的声处理导致溶解的胶原随着声处理时间和振幅的增加而显著增加。不同于使用胃蛋白酶消化制备的ECM水凝胶，其在25℃保持液态并且在37℃凝胶，使用超声空化方法制备的水凝胶在温度降低至25℃或更低时形成稳定的凝胶。经声处理的ECM的这种热机械性能类似于对水解胶原所报道的热机械性能，所述的水解胶原能够在冷却至低于30℃的温度时形成凝胶(Tosh等人,Applied Physics Letters 84(21)(2004)4242-4244)。然而，利用圆二色性分析、原子力显微术和FTIR对从牛腱提取的胶原的最近研究显示，胶原的三螺旋结构不受声处理的影响并保持完整(Li等人,Sonochemistry16(5)(2009)605-609)。类似地，从海鲈Lateolabrax japonicus的皮肤中提取胶原显示，在80％振幅的声处理3小时没有诱导胶原分子的结构完整性发生可检测的变化(Kim等人,Fisheries science 79(5)(2013)849-856)。在本研究中，声处理的ECM的扫描电子显微照片显示出具有组织化的胶原原纤维的致密原纤维网络。此外，尽管使用超声空化制造的ECM水凝胶的胶凝和温度之间存在相反关系，但是当温度升高(4→37℃或25→37℃)时，水凝胶的劲度随时间而得以保持(G'>>G")。这些发现表明，声处理的ECM的胶凝过程不仅仅是胶原化学的产物，而是溶解的ECM中的各种组分之间的相互作用的结果，所述组分包括其它自组装分子如层粘连蛋白和蛋白聚糖。

NIH 3T3成纤维细胞和原代马间充质干细胞能够粘附到使用超声空化制造的ECM水凝胶并且在其上增殖。此外，尽管仅部分地理解ECM介导的组织重塑的作用机制，但已显示重塑部位处的浸润巨噬细胞从促炎性M1样表型至构建性和预先-重塑M2样巨噬细胞表型的活化状态是有利的下游重塑结果的预测因子(Brown等人,Acta Biomater 8(3)(2012)978-87)。本文提供的结果证明，使用超声空化制造的ECM水凝胶保持促进M2样巨噬细胞表型的能力。

实施例8

声学水凝胶的γ辐照

在室温下用20kGyγ辐照对声学水凝胶(100毫克/毫升)进行灭菌。测量γ辐照(20kGy)和未灭菌的对照声学水凝胶(皮肤ECM100毫克/毫升)随时间变化的水凝胶"劲度"。通过对样品施加小的0.5％振荡应变来测量储能模量("劲度")(G')和损耗模量(G")。测试了三种温度曲线：将温度从初始储存温度快速升高至最终温度：4至37℃、25至37℃或37至4℃。(图20A)示出了时间扫描的典型曲线图。(图20B)示出了在测试的最后5分钟平均的平均储能模量和损耗模量。

在形成声学水凝胶后，将凝胶置于铯-137辐照器中，并在室温经受2065rads/min的电离辐射16小时，导致20kGy的最终辐射剂量。

令人惊讶地和出乎意料地，γ辐照不影响声学水凝胶保留为凝胶形式的能力。相反，当γ辐照时，酶促制造的ECM水凝胶不能以凝胶形式保留，并且当胶凝前进行γ辐照时，ECM水凝胶的γ辐照的预凝胶不能形成凝胶。

实施例9

声学水凝胶作为粘膜下层流体衬垫物

在50毫升锥形管中，通过将1克皮肤ECM(dECM)粉末或食道ECM(eECM)粉末(如实施例3中所述制备)再悬浮于10毫升磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，制备用作粘膜下层衬垫物被评价的声学水凝胶。使用装备有1/8"探针的FISHERBRAND^TM120型声波分离粉碎机(SonicDismembrator)以100％振幅声处理样品3分钟。在声处理后，将样品转移到5毫升注射器中，并在4℃孵育以诱导凝胶形成。

用乙酰丙嗪(0.01毫克/千克，SC)和氯胺酮(5-11毫克/千克)诱导麻醉，并经气管内导管用1-5％异氟烷(Isofluorane)维持外科平面麻醉。在整个程序和紧接着的术后期间，对猪静脉给予2毫升/千克/小时的乳酸林格氏液。温度通过放置在动物下面的温水再循环加热垫来控制。在该程序期间监测生理参数如心脏、呼吸率、体温和响应性。在开始该程序前，给予使用25毫克/千克头孢唑啉的抗生素预防。

猪以仰卧姿势放置，并使用Pentax EG3430K内窥镜评价管状器官的粘膜。在确定器官中的参考点后，通过使用Olympus Injectorforce 4mm 23G针，以8毫克/毫升，将凝胶形式的声学ECM水凝胶(其染成蓝色以提供视觉对比)注射到粘膜下层空间中，在切除位点将粘膜和粘膜下层与下面各层分离。每个位点注射大约2-5毫升蓝色凝胶。使用带结扎EMR技术除去全圆周的长度5厘米的粘膜(100％)。对于EMR，使用具有结扎带的Cook Duette试剂盒。然后用勒除器切除粘膜。结果示于图19A-19C。

鉴于我们的发明的原理可能应用到的许多可能的实施方案，应当认识到，所示出的实施方案仅是本发明的实例并且不应当被认为是对本发明的范围的限制。相反，本发明的范围由所附权利要求限定。因此，我们要求保护落入这些权利要求的范围和精神内的所有内容作为我们的发明。

Claims

1.制造细胞外基质(ECM)水凝胶的方法，包括使用超声频率将哺乳动物ECM溶解在液体中以制造液相中的声学ECM水凝胶。

2.权利要求1的方法，其中在30℃至43℃之间的温度施加超声频率。

3.权利要求1或2的方法，其中，哺乳动物ECM以约25毫克/毫升至约600毫克/毫升的浓度存在。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中超声频率是20kHz或更大。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中施加超声频率至少30秒。

6.制造细胞外基质(ECM)水凝胶的方法，包括在大于约37℃的温度用频率为约20kHz至约100kHz的超声溶解浓度为约25毫克/毫升至约600毫克/毫升的在液体中的哺乳动物ECM至少约30秒以制造液相中的声学ECM水凝胶。

7.权利要求1-6中任一项的方法，其中用超声处理哺乳动物ECM至少约60秒。

8.权利要求1-7中任一项的方法，其中哺乳动物ECM是冻干的哺乳动物ECM。

9.权利要求8的方法，其中冻干的哺乳动物ECM被粉碎成粉末。

10.权利要求1-9中任一项的方法，其中ECM以约10μm至约2000μm范围的碎片的形式提供。