KR20210142003A - 음향 세포외 기질 하이드로겔 및 이의 용도 - Google Patents

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조지 에스. 허시
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유니버시티 오브 피츠버그 - 오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션
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Abstract

본 출원에서 포유류 음향 세포외 기질 (ECM) 하이드로겔 (acoustic extracellular matrix(ECM) hydrogel))을 생산하는 방법을 개시한다. 추가 실시예에서, 개시된 방법을 사용하여 생산된 포유류 음향 ECM 하이드로겔이 개시된다. 또한 개시되는 것은 포유류 음향 ECM 하이드로겔로, 여기서 하이드로겔은 열 가역적 (thermoreversible)이다. 이들 음향 ECM 하이드로겔을 사용하는 방법도 또한 개시된다.

Description

음향 세포외 기질 하이드로겔 및 이의 용도
관련된 츨원과 교차 참조
본 명세서는 여기 그 전문이 참고 문헌으로 병합된, 2019년 3월 13일에 출원된 미국 가출원 번호 62/817,787, 및 2019년 12월 19일에 출원된 미국 가출원 번호 62/950,565, 의 유익한 점을 청구한다.
본 발명은 하이드로겔 (hydrogels) 분야에 관한 것으로, 구체적으로 초음파를 사용하여 포유류 ECM으로부터 생산되는 음향 세포외 기질 (acoustic extracellular matrix) (ECM) 하이드로겔 및 이의 용도와 관련된다.
콜라겐 (collagen), 히알우로닉 에시드(hyaluronic acid), 실크 휘브로인 (silk fibroin), 라미닌 (laminin), 및 휘브로넥틴 (fibronectin)과 같은 정제된 ECM 성분으로 구성된 하이드로겔 (hydrogels)은 조직 공학 응용 (tissue engineering applications)에 널리 사용되어 왔다. 그러나 이러한 정제된, 단일 성분 ECM 바이오소재는 원래 조직 ECM의 복잡한 생화학이 부족하다. 전체 조직 또는 기관의 탈세포화는 원래 조직 ECM의 생화학을 보존하고 있는 ECM을 수확하는 다른 방법을 제공한다. ECM을 사용하는 데 있어서 주된 발전은 하이드로겔을 형성하는 능력이고, 이로써 ECM의 임상적 적용이 확장된다. ECM으로부터 하이드로겔을 생산하는 알려진 기술은 주로 ECM 재료를 산성 용액에서 산성 프로테아제 (acid protease)로 소화시키는 데 초점을 두고 있다: ECM 폼 (ECM forms)을 생산하기 위해 아밀레이즈 소화를 사용; 또는 교란성 추출 버퍼 (chaotropic extraction buffers) 및 오랫동안 투석 과정을 사용. 그러한 기술에 따라 만들어진 ECM 하이드로겔은 불가피하게 단백질 분해 및 단백질 변성이 되게 되고 이로써 ECM 분자의 전장 보체 및 조직 특이 ECM 성분의 생물학적 활성이 약화하게 된다. 더 나아가, ECM 하이드로겔을 생산하기 위한 효소에 근거한 방법은 ECM 성분이 충분히 용해되도록 하기 위하여 24-72시간 범위의 오랜 배양 시간을 요구한다. 산성 또는 알칼리 용액 및 프로테아제 소화를 사용하지 않고 ECM 하이드로겔을 형성하기 위한 방법이 필요하다. .
생체 적합한 포유류 음향 세포외 기질 (acoustic extracellular matrix) (ECM) 하이드로겔을 생산하는 방법을 여기서 공개한다. 이 방법들에는 액체 상에서 음향 ECM 하이드로겔을 생산하기 위하여 약 20kHz 내지 100kHz의 주파수의 초음파로 충분한 시간 동안 30 내지 43 ℃ 온도에서, 버퍼 된 생리 식염수와 같은, 액체에서 25mg/ml 내지 600mg/ml의 농도로 포유류 ECM을 액체에 용해하는 방법이 포함된다. 어떤 실시예에서, 이 방법에는 겔 상에서 음향 ECM 하이드로겔을 생산하기 위하여 액체 상에 있는 음향 ECM 하이드로겔을 온도 37 ℃ 또는 그 이하로 냉각시키는 것이 포함된다. 추가 실시예에서, 공개되는 방법들을 사용하여 생산된 음향 ECM 하이드로겔이 개시된다.
또한 공개되는 것은 열 가역적 (thermoreversible) 인 음향 ECM 하이드로겔이다. 어떤 비-제한적인 실시예에서, 음향 ECM 하이드로겔은 약 37 ℃ 아래 온도에서는 고체 상에 있으며 및 약 37 ℃ 위의 온도에서는 액체 상에 있다. 이들 하이드로겔들은 포유류 ECM으로부터 생산된다.
이러한 음향 ECM 하이드로겔들을 사용하는 방법도 또한 개시된다.
앞선 및 다른 특징 및 본 발명의 장점은 하기의 동반되는 도면을 참고하여 선행되는 몇가지 실시예의 상세한 설명에서 좀 더 분명해질 것이다.
도 1A-1D: 초음파 분해 ( sonication )를 사용한 음향 ECM 하이드로겔의 제조. (A) 15ml 원추형 튜브에 있는 세분한 피부 ECM. (B) ECM 분말을 PBS에 재현탁시킨 후, 원추형 튜브는 얼음물 베스 (ice water bath)에 넣고, 및 초음파발생기 탐침를 튜브에 삽입하였다. (C, D) 초음파 분해 펄스 (sonication pulses) 로 ECM을 용해시킨 후, 전-겔 용액 (pre-gel solution)을 3D 틀에 파이펫 하여 넣거나 또는 테플론 시트 (Teflon sheets) 위에 얇게 펼쳐 놓고, 및 겔화 (gelation) 를 유도하기 위하여 ≤37 C 온도에서 배양시켰다.
도 2A-2D: 음향 ECM 하이드로겔 , 동결건조된 하이드로겔 , 아주 얇은 ECM 시트 ( ultrathin ECM sheets) 및 ECM 퍼티 (ECM putty) 의 대표적 이미지. (A) 실린더로서 음향 ECM 하이드로겔 캐스트. (B) 동결건조된 음향 ECM 하이드로겔은 이의 3D 구조를 유지한다. (C)ECM 겔을 테플론 시트에 캐스트하여 제조된 아주 얇은 음향 ECM 하이드로겔 시트. (D) 25mg/ml 아래의 농도에서 ECM을 초음파 분해하여 제조한 ECM 퍼티.
도 3: 주사형 전자 현미경 (Scanning electron micrographs) ( SEM ). 초음파 분해에 의해 제조된 ECM 하이드로겔은 특별한 질감 및 섬유모양의 표면을 보여준다.
도 4A-4B: 흐름 스윕 (Flow sweep). 평형상태 흐름 스윕 (steady state flow sweep) 테스트가 음향 ECM 겔에 대해 (A) 25 ℃, (B) 4 내지 37 ℃ 및 37 내지 4 ℃에서 수행되었다. 일정한 스트레스가 겔에 적용되었으며 및 결과로 얻어진 변형이 측정되었다. 데이터는 스트레스가 많을수록 겔의 점도가 감소함을 보여 주며, 이는 전단 박리 (shear thinning) 재료임을 암시한다.
도 5A-5B: 시간 스윕 테스트(Time sweep test). 최대 G' (저장 계수) 및 G'' (손실 계수) 값을 결정하기 위하여, 시간 스윕 테스트가 50mg/ml 음향 ECM 겔에 대해 (A) 25 ℃, (B) 4 내지 37℃ 및 37 내지 4 ℃에서 수행되었다. 데이터는 모든 온도에서 저장 > 손실 계수를 보였으며; 즉, 하이드로겔의 질을 유지함을 보여준다.
도 6A-6C: 50mg/ml 음향 ECM 하이드로겔의 저장 계수 (storage modulus), 손실 계수(loss modulus), 및 복소 점도(complex viscosity) 의 대표적인 그래프. 데이터는 로그-로그 스케일 (log-log scale) 로 각 진동수 (angular frequencies)에 대하여 플럿되었으며, 적은 양의 0.5% 진동하는 스트레인 (oscillatory strain)을 첨가하여 25 ℃ (A), 4 ℃ (B), 또는 37 ℃ 에서 빠르게 4 ℃로 낮춘 온도 (C)에서 측정되었다. 데이터는 약 한 자리 수로 G' > G"임을 보여주며; 이는 재료는 하이드로겔의 기준을 충족함을 제시한다.
도 7: 흐름 스윕 (Flow sweep). 평형상태 흐름 스윕 (steady state flow sweep) 테스트가 음향 ECM 에 대해 15℃, 25℃, 또는 37℃ 에서 세 가지 다른 농도: 25, 100, 및 150mg/ml 에서 수행되었다. 데이터는 농도 범위 25 및 150mg/ml 사이 및 온도 범위 15-37℃ 사이에서 겔의 점도는 1 에서 스트레스가 많으면 감소하는 것으로 보이며, 이는 전단 박리 (shear thinning) 재료임을 암시한다. 전단 박리는 흐름이 증가함에 따라 점도가 감소함을 의미한다 ((예를 들어, 바늘 또는 주사기 끝과 같은 구멍을 통해 재료를 더 빨리 "밀어 넣을수록 (push)", 구멍을 통해 재료가 들어가도록 하기 "더 쉬우며(easer)", 이는 임상적용에서 유리하다)).
도 8: 시간 스윕 테스트. 시간 스윕 테스트는 15℃, 25℃, 또는 37℃에서 및 25, 100, 및 150mg/ml의 세 가지 다른 농도에서 음향 하이드로겔의 최대 G' ( 저장 계수) 및 G'' (손실 계수) 값을 결정하기 위하여 수행되었다. 데이터는 모든 농도에 대해 모든 온도에서 저장 > 손실 계수임을 보였다; 즉 하이드로겔의 질을 유지하였다.
도 9A-9B: 세포학적 호환성 에세이. (A) 3T3 섬유아세포 (Fibroblast)를 대조군 접시 (코팅되지 않은), 또는 UBM, SIS 또는 피부 (Dermis)로부터 제조된 음향 ECM 하이드로겔로 코팅된 접시에 접종시키고 및 24시간 동안 배양시켰다. 세포의 생존력을 평가하기 위하여 VYBRANT® MTT 세포 증식 에세이 키트 (VYBRANT® MTT Cell Proliferation Assay Kit) (Thermo Fisher)를 사용하였다. 결과는 모든 ECM 들은 3T3 섬유아세포에서 비 독성인 것으로 보였다 (n=3). (B) 생존/사멸 에세이 (Live/Dead assay). 하이드로겔로 코팅된 플레이트는 말 간엽 줄기세포로 접종시키고 및 조직 배양 플라스틱에서 자라고 있는 세포와 비교되었다. 생존력은 생존/사멸 에세이 키트 (Live/Dead assay kit) (Invitrogen)로 평가되었다. 이미지는 5, 200X 시야에서 3개의 기술적 복제에 걸쳐 찍었다. 퍼센트 생존 사멸 세포는 세포 프로화일러 (Cell Profiler)를 사용하여 정량되었다. 에러 바는 표준 편차를 나타낸다.
도 10: 지혈 분말, 음향 방법으로 하이드로겔로 제조된 AVITENETM 및XENMATRIXTM ECM의 응고 시간 (지혈) 을 측정하기 위하여 이 화이트 응고 방법 (Lee White clotting method)이 사용 되었다. XENMATRIXTM은 돼지 피부로부터 수확된 ECM 산물이다. 이 데이터는 처치하지 않은 것에 비교하여, AVITENETM 및 XENMATRIXTM 겔은 빠른 지혈을 이루었다.
도 11: 쥐 간 찢긴 상처 모델을 사용한 응고 시간의 생체 내 평가. 쥐는 간이 찢어지도록 하였으며 및 지혈제로 처치되었다. 스프라그 다우레이 쥐 (Sprague Dawley Rats)는 무작위로 5개 실험 그룹으로 나뉘었다 (그룹당 n=5): 아리스타 분말 (Arista powder) (BD/CR Bard) AVITENETM 분말 (BD/CR Bard), 마이크로기질 분말 (Micromatrix powder)(ACell); 음향 방법을 사용하여 하이드로겔로서 제조된 제시된 농도의 식도 ECM; 음향 방법을 사용하여 하이드로겔로서 제조된 제시된 농도의 XenMatrix (BD/CR Bard). 데이터는 음향 방법을 사용하여 하이드로겔로서 제조된 포유류 ECM 은 생체 내에서 지혈을 유도할 수 있음을 보여준다.
도 12A-12C: 음향 하이드로겔은 ECM을 20-100% 범위의 진폭을 사용하여 20kHz 주파수로 초음파 분해로 제조될 수 있다. 샘플은 모두 50mg/mL이었으며 및 실험을 진행하기 전에 15℃에서 10분 동안 초음파 분해 시켰다. (A) 제시된 진폭에서 형성된 하이드로겔 이미지. (B) 흐름 점도. 유동학 데이터는 테스트 된 모든 진폭에서, 겔의 점도는 스트레스가 많을수록 감소함을 보여주며, 이는 전단 박리 (shear thinning) 재료임을 암시한다. (C) 시간 스윕. 유동학 데이터는 모든 농도에 대해 모든 진폭에서 저장 > 손실 계수를 보여준다; 즉, 이는 하이드로겔의 질을 유지함을 보여 준다.
도 13. UBM 음향 하이드로겔은 M2-유사 대식세포 (macrophage) 표현형을 촉진한다. 생쥐 골수에서 유래한 대식세포를 2mg/ml UBM 음향 하이드로겔로 24시간 동안 처치하고, 고정 시키고, 및 친 염증 M1-유사 마커 (pro-inflammatory M1- like markers) (iNos, TNFa) 또는 친 리모델링 M2-유사 마커 (pro-remodeling M2 -like markers) (izz1, Arginase)의 강한 지표에 대해 면역-라벨 시키고, 및 DAPI로 대조 염색하였다. 세포를 IFNg 및 리포폴리삭카라이드 (lipopolysaccharide) (LPS)로 처리하여 M1-유사 표현형의 양성 대조군으로서 사용하였고, 및 IL-4는 M2- 유사 표현형의 양성 대조군으로서 사용되었다. F4/80 염색은 대식세포에 대한 양성대조군으로서 사용되었다. 세포는 200X에서 이미지화하였다. 데이터는 대조군에 비교하여, UBM 음향 하이드로겔은 M2-유사 대식세포 (macrophage) 표현형을 촉진함을 보였다.
도 14A-14F. 분쇄한 ECM의 초음파 분해 및 온도 유도된 겔화. (A) 50ml 원추형 튜브에 초음파분쇄기 팁의 담금 깊이의 데모. ( B,C ) 1X PBS에 있는 분쇄된 피부 ECM 분말의 초음파 분해 전 (B) 및 (C) 후. (D) 25℃ 아래의 온도에서 배양한 후, 튜브를 거꾸로 놓았을 때 용해된 ECM이 단단한 겔로 중합됨을 보였다. (E) 중합된 겔은 3D 기하학적 구조로 될 수 있다. (F) 용해된 ECM은 주사기로 옮겨질 수 있으며 (위쪽 패널), 그 후 25℃ 아래의 온도로 차게 하여 주사 가능한 형태의 겔을 얻었다 (아래 패널).
도 15A-15D. 콜라겐 (collagen) 및 설페이티드 글라이코사미노글라이칸 (sulfated glycosaminogylcans ) ( sGAG )의 용해화 . (A) 초음파 분해 진폭의 함수에 따른 용해된 콜라겐의 농도. 분쇄된 dECM은 제시된 진폭에서 300초 동안 초음파 분해되었다. 용해된 콜라겐의 농도는 SIRCOLTM 에세이를 사용하여 측정되었다. 데이터는 그룹당 n=3 샘플에 대해 평균± 표준 편차 (means ± s.d)로서 나타낸다. * 는 p<0.05를 대표한다. 윗 글자 (superscript)는 쌍으로서 비교를 의미한다. (B) 초음파 분해 진폭의 함수에 따른 sGAG의 농도. 분쇄된 dECM은 제시된 진폭에서 300초 동안 초음파 분해되었다. 용해된 sGAG의 농도는 BLYSCANTM 에세이를 사용하여 측정되었다. 데이터는 그룹당 n=3 샘플에 대해 평균± 표준 편차 (means ± s.d)로서 나타낸다. (C) 초음파 분해 시간의 함수에 따른 용해된 콜라겐의 농도. 분쇄된 dECM은 100% 진폭으로 제시된 시간 동안 초음파 분해 시켰다. 용해된 콜라겐의 농도는 SIRCOLTM 에세이를 사용하여 측정되었다. 데이터는 그룹당 n=3 샘플에 대해 평균± 표준 편차 (means ± s.d)로서 나타낸다. *는 p<0.05를 대표한다. 윗글자 (superscript)는 쌍으로서 비교를 의미한다. (D) 초음파 분해 시간의 함수에 따른 용해된 sGAG의 농도. 분쇄된 dECM은 100% 진폭으로 제시된 시간 동안 초음파 분해 시켰다. 용해된 sGAG의 농도는 BLYSCANTM 에세이를 사용하여 측정되었다. 데이터는 그룹당 n=3 샘플에 대해 평균± 표준 편차 (means ± s.d)로서 나타낸다.
도 16A-16C. 초음파 공동화 (ultrasonic cavitation)를 사용하여 제조된 ECM 하이드로겔의 겔화 시간에 대한 온도 및 초음파분쇄 진폭 효과. (A) 겔화 시간에 대한 온도 효과. 25, 50 및 100mg/ml의 dECM이 100% 진폭에서 300초 동안 초음파 분해되었으며, 및 그 후 겔화를 유도하기 위하여 제시된 온도에서 배양시켰다. 데이터는 그룹당 n=3 샘플에 대해 평균± 표준 편차 (means ± s.d)로서 나타낸다. * 는 p<0.05를 대표한다. 윗 글자 (superscript)는 쌍으로서 비교를 의미한다. (B) 겔화 시간에 대해 초음파분쇄 진폭의 효과. 25, 50 및 100mg/ml의 dECM을 100% 진폭에서 300초 동안 초음파 분해 시켰으며, 및 그 후 겔화를 유도하기 위하여 4℃ 에서 배양시켰다. 데이터는 그룹당 n=3 샘플에 대해 평균± 표준 편차 (means ± s.d)로서 나타낸다. * 는 p<0.05를 대표한다. 윗 글자 (superscript)는 쌍으로서 비교를 의미한다. (C) UBM, SIS, eECM, tECM 또는 LECM 의 겔화 시간에 대한 온도 효과를 평가하기 위한 겔화 에세이. 100mg/ml 농도의 제시된 조직 ECM을 100% 진폭으로 300초 동안 초음파 분해 시켰으며 및 그 후 겔화를 유도하기 위하여 4℃ 또는 25℃에서 배양시켰다. 데이터는 그룹당 n=3 샘플에 대해 평균± 표준 편차 (means ± s.d)로서 나타낸다. * 는 p<0.05를 대표한다. 윗 글자 (superscript)는 쌍으로서 비교를 의미한다.
도 17A-17C. 초음파 공동화 (ultrasonic cavitation)를 사용하여 제조된 ECM 하이드로겔의 점탄성의 규명. (A) dECM 및 eECM에 대한 세 가지 온도 프로화일에서 ECM 하이드로겔 겔화 키네틱스의 대표적인 그래프. 온도가 빠르게 감소했을 때 (37→4℃) 저장 계수 (G')는 S자 모양으로 증가했다. 온도가 빠르게 증가 되었을 때 (4 →37℃ 및 25→37℃) 하이드로겔 견고도 (G')는 유지되었다. (B) 세 가지 온도 프로화일에서 평균 저장 계수 (n=3, 평균 ± 표준 오차). (C) S자형 온도 프로화일 37 →4℃ 에서 50% 겔화의 평균 시간 (n=3, 평균 ± 표준 오차). *p ≤ 0.05, **p ≤0.01.
도 18A-18E. 시험관 내 세포 반응. (A) 3T3 섬유아세포 (Fibroblast)를 대조군 접시 (코팅되지 않은), 또는 UBM, SIS 또는 피부 (Dermis)로부터 제조된 ECM 하이드로겔로 코팅된 접시에 접종시키고, 및 24시간 동안 배양시켰다. 세포 대사 활성은 VYBRANT® MTT 세포 증식 에세이 키트 (VYBRANT® MTT Cell Proliferation Assay Kit)를 사용하여 평가되었다. 데이터는 그룹당 n=3 샘플에 대해 평균± 표준 편차 (means ± s.d)로서 나타낸다. (B, C) 생존/사멸 에세이 (Live/Dead assay). 일차 말 간엽 줄기세포를 대조군 (코팅되지 않은), 또는 dECM 또는 UBM으로부터 제조된 ECM 하이드로겔로 코팅된 접시에 접종시켰다. 생존력은 생존/사멸 에세이 키트 (Live/Dead assay kit) (Invitrogen)로 평가되었다. 세포는 200X에서 이미지화되었고 (B), 및 퍼센트 생존 및 사멸 세포는 세포 프로화일러 (Cell Profiler)를 사용하여 정량되었다 (C). 데이터는 그룹당 n=3 샘플에 대해 평균± 표준 편차 (means ± s.d)로서 나타낸다. (D) 쥐 골수-유래 대식세포는 처리되지 않거나, 또는 하기의 테스트 물품으로 24시간 동안 처치했다: IFN+LPS, IL-4, dECM 하이드로겔, 또는 eECM 하이드로겔. 세포는 F4/80 ((대식세포 마커 (macrophage marker)), iNOS (M1-유사 마커), 또는 Fizz1 (M2-유사 마커)로 면역라벨 시켰다. 세포는 200X에서 이미지화되었다. (E) F4/80, iNOS 및 Fizz1 면역블럿팅의 정량. 데이터는 그룹당 n=3 샘플에 대해 평균± 표준 편차 (means ± s.d)로서 나타낸다.
도 19A-19C. 점막 하부 유액 쿠션으로서의 음향 하이드로겔 . (A) 음향 세포외 기질 (Acoustic extracellular matrix) (ECM) 하이드로겔 (100mg/mL) 은 피부EMC (dermal ECM) (dECM) 및 식도 점막 ECM (esophageal mucosa) ECM (eECM) 으로부터 제조되었으며 및 생체 외 점막 하부 유액 쿠션으로서 사용되었다. 음향 ECM 하이드로겔 유액 쿠션 높이에 대한 20 kGy 감마 조사(gamma irradiation) (γ)의 효과에 대하여 평가되었다. 임상적 표준 엘레비유 (standard Eleview) 및 PBS가 대조군으로 사용되었다. 유액 쿠션 높이는 돼지 식도에 2ml의 테스트 물질을 주사한 후에 시간에 따라 측정하였다. 값은 평균 +/- SD (n=3) 으로써 표현되었다. (B) 음향 하이드로겔 샘플은 16G 주사기를 통해 주사 가능하다. (C) 75분 후에 테스트 물질 유액 쿠션 높이의 대표적인 그림.
도 20A-20B. 음향 하이드로겔 겔화 . 감마 조사된 (20 kGy) 및 비-멸균된 대조군 음향 하이드로겔 (피부 ECM 100mg/mL) 에 대한 시간에 따른 하이드로겔 "견고도 (stiffness)"가 측정 되었다. 샘플에 적은, 0.5% 진동 스트레인 (oscillatory strain ) 을 적용하여 저장 계수 (storage modulus) (("견고도 (stiffness)") (G') 및 손실 계수 (loss modulus) (G'') 가 측정되었다. 세 가지의 온도 프로화일이 테스트 되었다: 온도는 초기 저장 온도로부터 최종 온도로 빠르게 올렸다: 4 내지 37℃, 25 내지 37℃, 또는 37 내지 4℃. (A) 시간 스윕(sweep)에 대한 대표적인 그래프를 보여준다. (B) 테스트의 최종 5분에 걸쳐 평균된, 평균 저장 및 손실 계수 값을 보여준다.
ECM 하이드로겔은 3D 오가노이드 배양 (organoid culture) 을 위한 기질로서, 및 다양한 조직의 수선 및 재구성을 촉진하기 위한 수많은 전 임상 및 임상적 적용에 사용되어 왔다. 전에는 ECM 하이드로겔 재료는 ECM을 산성 용액에서 산성 프로테아제로 효소적으로 소화시키는 너무 긴 방법 사용하여 제작하거나; 또는 원래의 단백질 구조 및 기능에 영향을 줄 수 있는 교란성 추출 버퍼 및 투석 과정을 사용하였다. 여기서 공개되는 것은 초음파 공동현상 (ultrasonic cavitation)를 사용하여 ECM 바이오스케폴드 (ECM bioscaffolds) 로부터 하이드로겔을 제조하는 방법이다. 용해시킨 ECM은 온도를 조정하여 빠르게 겔로 자가-집합되도록 (self-assemble) 유도할 수 있으며, 및 겔의 재료 성질은 ECM 농도 및 초음파 분해 계수를 조정하여 잘 맞도록 할 수 있다. ECM 바이오스케폴드는 효소적인 소화 없이 초음파를 사용하여 성공적으로 용해 시킬 수 있으며, 및 세포 성장을 지지할 수 있는 겔 형태로 재중합 (repolymerize) 되도록 유도할 수 있다. 이들 하이드로겔은 수많은 적용에 사용될 수 있으며 및 감마 방사선 조사 (gamma irradiation) 로 정기적으로 멸균될 수 있다.
개시되는 ECM 하이드로겔을 생산하기 위하여, 초음파 분해 기술은, 이것에만 국한하지 않으나, 피부 (dermis), 방광 기질 (urinary bladder matrix) (UBM), 및 소장 점막 하부 조직 (small intestinal submucosa) (SIS)을 포함하는 조직 특이적인 ECM의 넓은 범위에 적용될 수 있다. 이는 또한 상업적으로 구입 가능한 ECM 제제를 사용할 수도 있다. 어떤 실시예에서, 그 접근 방법은 분쇄한 ECM을, 예를 들어, 중성으로 버퍼 된 식염수 용액 버퍼와 같은 액체에 재현탁 시키고, 이어서 초음파를 사용하여 ECM을 용해 시키는 것이 관여된다. 어떤 실시예에서는, 버퍼 된 식염수 용액은 삼투압이 약 290 mOsm/L이다. 다양한 농도가 사용될 수 있으며, 및 ECM은 적어도 60초 동안 초음파처리 될 수 있다. ECM 용액의 빠른 겔화는 ECM 용액의 온도를 감소시켜 유도할 수 있다. 겔화 시간 및 ECM 겔 성질은 ECM 농도, 초음파 분해 진폭 및 시간을 조정하여 조율될 수 있다. 어떤 실시예에서, 음향 ECM 하이드로겔은, 외부 유래 펩신 (pepsin), 트립신 (trypsin), 또는 히알우로니데이즈 (hyaluronidase) 또는 불활성화된 형태의 외부 유래 펩신, 트립신, 또는 히알우로니데이즈와 같은, 외부 유래 프로테아제 또는 불활성화된 외부 유래 프로테아제를 함유하지 않는다.
일단 중합되면, 이들 ECM 하이드로겔은 실온에서 안정적이며 및 주문에 따라 만들 수 있는 3D 기하학적 구조의 형태가 될 수 있다. 초음파 분해로 생산된 ECM 하이드로겔은 (("음향 ECM 하이드로겔 (acoustic ECM hydrogels)")) 전체적인 3D 기하학적 구조가 유지되고 및 다공성이 증가 되는 냉동 및 동결건조 공정에 의해 고체 스케폴드로 만들어질 수 있다. 이 기술은 시험관 내 및 생체 내 적용을 위한 세포 또는 화합물의 병합을 지지할 수 있다. 이것에만 국한하지 않으나, 지혈을 증가하기 위한 것과 같은, 공개되는 음향 EMC 하이드로겔을 사용하는 방법 또한 공개된다.
ECM 하이드로겔은 대규모 스케일로 제조하는 데에는 상대적으로 진전이 거의 없어 왔다 (Brown et al., supra, 2012). 이 공개 되는 방법들은 몇 가지 관점에서 대규모 스케일로 제조하는데 유용하다. 어떤 관점에서, ECM 하이드로겔 농도 범위는 초음파 공동화 방법 (ultrasonic cavitation method) 을 사용하여 2-20mg/ml (효소적 방법의 한계) 에서부터 25-100mg/ml로 확장될 수 있으며, 이는 특정한 임상적 적용을 위하여 ECM 하이드로겔의 점탄성 성질을 미세 조정 (fine tuning) 할 수 있도록 한다. 다른 실시예에서, 공정 시간이 48-72 시간으로부터, 분의 순으로 현저하게 감소 된다. 추가 실시예에서, ECM 하이드로겔은 주문에 따라 만들 수 있는 3D 기하학적 구조의 형태가 될 수 있으며, 및 시험관 내 및 생체 내 적용을 위한 세포 또는 치료적 약물의 병합을 지지 할 수 있다.
용어 (Terms)
달리 기록되지 않는 한, 기술적인 용어는 전통적인 사용법에 따라 사용된다. 분자 생물학에서 공통 용어의 정의는 Jones & Bartlett Publishers에서 발행된 ㅋ크랩 (Krebs) 등 (Eds.)의 , Lewin's Genes XII, 2017; 및 Wiley-VCH 에서 발행된 16 volumes 의 Meyers 등 (eds.), The Encyclopedia of Cell Biology and Molecular Medicine, 2008; 및 다른 비슷한 참고문헌에서 발견될 수 있다.
이 공개의 다양한 실시예의 리비유를 촉진하기 위하여, 특별한 용어의 설명이 하기에 제공된다:
산성 프로테아제 (Acid Protease): 펩티드 결합을 쪼개는 효소이며, 여기서 이 효소는 산성 pH에서 펩티드 결합을 쪼개는 데 있어 증가 된 활성을 가진다. 예를 들어 및 제한 없이, 산성 프로테아제는 펩신 및 트립신이 포함될 수 있다.
항생제 (Antibiotic): 박테리아, 곰팡이 또는 어느 다른 미생물을 죽이거나 또는 이들의 성장을 상당히 늦추는 화합물 또는 물질. "항 박테리아 (antibacterial)" 는 박테리아를 죽이거나 또는 이의 성장을 상당히 늦추는 화합물 또는 물질이다.
항 박테리아성 항생제는 이들의 작용 기전, 화학적 구조, 또는 활성의 스펙트럼에 근거하여 보통 분류된다. 대부분은 박테리아 기능 또는 성장 과정을 타겟으로 한다. 박테리아 세포벽 ((예를 들어, 페니실린 (penicillins) 및 세파로스포린 (cephalosporins)) 또는 세포 멤브레인 ((예를 들어, 폴리믹신 (polymixins))을 타겟하는 그런 것, 또는 필수 박테리아 효소 ((예를 들어, 퀴놀론(quinolones) 및 설폰아마이드 (sulfonamides))를 방해하는 그런 것들은 살균적이다. 단백질 합성을 타겠으로 하는 것 ((예를 들어, 아미노글리코사이드 (aminoglycosides), 마크로리드 (macrolides), 및 테트라사이클린 (tetracyclines))은 일반적으로 세균발육억제적이다. 더 나아간 분류는 이들의 타겟 특이성에 근거한다.
"좁은-스펙트럼 (Narrow-spectrum)"의 항 박테리아 항생제는 그람-음성 (Gram-negative) 또는 그람-양성 (Gram-positive) 과 같은 특정한 타입의 박테리아를 타겟한다. "넓은-스펙트럼 항생제 (Broad-spectrum antibiotics)" 는 많은 다른 타입의 박테리아에 영향을 준다. 항 박테리아 제제에는 또한 사이클릭 리포펩티드 (cyclic lipopeptides) ((답토마이신 (daptomycin)과 같은)), 글리실사이클린 (glycylcyclines) ((티게사이클린 (tigecycline) 과 같은)), 및 옥사졸리디논 ( oxazolidinones) ((리네졸리드 (linezolid)와 같은))이 포함된다.
국부 항생제 (Topical antibiotics) 는, 피부 또는 눈과 같은, 신체 표면에 적용하는 항생제이다. 국부 항생제는 자주 연고 또는 크림으로 제형화되며, 및 마크로리드 항생제 (macrolide antibiotic) ((에리스로마이신 (erythromycin) 과 같은)), 설파 항생제 (sulfa antibiotic) ((설파아세타민 (sulfacetamide)과 같은)), 사이클릭 펩티드(cyclic peptide) ((바시트라신 (bacitracin) 폴리믹신 (polymyxin) 과 같은)), 슈도모닉 에시드 (psuedomonic acid) ((뮤피로신 (mupirocin)과 같은)), 아미노글리코사이드 (aminoglycoside) ((네오마이신 (neomycin) 같은)), 또는 퀴놀론 (quinolone) ((시프로플록사신 (ciprofloxacin) 또는 오플록사신 (ofloxacin)과 같은)), 니트로이미다졸 (nitroimidazole) ((메트러니다즐로 (metronidazloe)와 같은)), 또는 이 약물들의 조합 ((바시트라신/폴리믹신 (bacitracine/polymyxin) 또는 네오마이신/폴리믹신 B/바시트라신 (neomycin/polymyxin B/bacitracin) 과 같은)) 과 같은 활성제를 함유한다.
생체 적합성 ( Biocompatible ): 포유류 개체에 이식했을 때, 개체에서 부정적인 반응을 자극하지 않는 임의의 어느 재료. 생체 적합한 재료는, 한 개인에게 도입되었을 때, 이의 의도된 기능을 수행할 수 있고, 및 그 개인에게 독성이 없거나 또는 해가 되지 않으며, 또한 그 개체에서 그 재료에 대한 면역학적 거부를 유도하지 않는다.
바이오스케폴드 ( Bioscaffold ): 보통 고체 지지체 또는 겔로, 생체 적합성이 있는 스케폴드. 바이오스케폴드는 자연적으로 존재하는 재료로 구성된다. "바이오 합성 스케폴드 (bio-synthetic scaffold)" 는 비-자연적으로 존재하는 및 자연적으로 존재하는 재료로 구성된다.
원심분리 (Centrifugation): 혼합물에 원심력이 적용되는 공정으로, 이로써 혼합물 중 좀 더 밀도가 있는 성분은 혼합물 중에 있는 다른 밀도가 좀 더 적은 성분에 비해 원심분리기의 중심축으로부터 멀리 이동한다. 혼합물에 적용되는 힘은 원심분리 로터의 속도, 및 회전 (spin) 반경 (radius)의 함수이다. 대부분의 적용에서, 회전력은 침전물 ((펠렛 (pellet))이 원심분리 튜브 바닥에 모이게 되는 결과를 가져올 것이고, 여기서 나머지 용액은 적절하게 "상등액 (supernate)" 또는 "상등액 (supernatant)"이라고 불린다. 다른 비슷한 적용에서, 원하는 성분보다 밀도가 좀 더 높고 및 좀 더 낮은 성분 둘 다를 함유하고 있는 혼합물로부터 특별한 성분을 분리하기 위하여 밀도-근거한 분리 (density-based separation) 또는 "구배 원심분리 (gradient centrifugation)" 기술이 사용된다.
원심분리기 로터의 원운동 동안에, 적용되는 힘은 반경과 회전의 각 속도의 산물이고, 여기서 힘은 전통적으로, 지구 표면에의 중력 때문인 표준 가속도, "g"에 상대적인 가속으로 표현된다. 적용되는 원심력은 "상대적 원심력 (relative centrifugal force)" (RCF), 이라고 불리고, 및 "g "의 배수로서 표현된다.
분쇄하다 (분쇄 및 분쇄하는) ((Comminute (comminution and comminuting)): 커다란 입자를 더 작은 입자로 감소시키는 공정으로, 제한 없이, 빻기 (grinding), 혼합하기 (blending), 찢기 (shredding), 얇게 자르기(slicing), 으깨기(milling), 자르기 (cutting), 찍기 (shredding) 에 의함을 포함한다. ECM은 이것에만 국한하지 않으나, 수화물 형태, 냉동, 공기-건조, 동결건조, 분말, 시트-형태를 포함하는 임의의 어느 형태에서 분쇄될 수 있다.
접촉하는 (Contacting): 직접적인 물리적 상관관계에 놓는 것으로, 이는 고체 또는 액체 형태일 수 있다.
사이토카인 ( Cytokine ): "사이토카인 (cytokine) " 이라는 용어는 나노 몰에서 피코몰 농도에서 체액 조절자로서 작용하는 다양한 그룹의 용해성 단백질 및 펩티드에 대한 일반적인 이름으로서 사용되며 및 이는, 정상 또는 병적인 컨디션 하에서, 개개의 세포 및 조직의 기능적 활성을 조정한다. 이들 단백질들은 또한 세포 사이의 상호작용을 직접적으로 매개하고 및 세포외 환경에서 일어나는 과정을 조절한다. 사이토카인의 예들에는, 이것에만 국한하지 않으나, 종양 괴사인자-α (tumor necrosis factor-α), 인터루킨(IL)-6 ((interleukin (IL)-6)), IL-10, IL-12, 형질전환 성장 인자 (transforming growth factor), 및 인터페론-γ (interferon-γ) 가 포함된다.
진단 (Diagnosis): 질병의 징후, 증상 및 여러 가지 검사 (test)결과로 질병을 동정하는 과정. 이 과정을 통해 도달하는 결론은 "진단 (diagnosis)" 이라고 불린다. 보통 수행되는 검사의 형태에는 혈액 검사, 의학적 이미징, 및 생체검사 (biopsy)가 포함된다.
세포외 기질 ( Extracellular Matrix) (ECM): 세포 성장을 위한 자연적인 무세포 스케폴딩 (틀). 자연적인 ECMs (이것에만 국한하지 않으나, 포유류 및 인간과 같은, 다세포 생물에서 발견되는 ECMs) 은, 이것에만 국한하지 않으나, 콜라겐 (collagens), 엘라스틴 (elastins), 라미닌 (laminins), 글라이코사미노글라이칸 (glycosaminoglycans), 프로테오글라이칸 (proteoglycans), 항미생물제 (antimicrobials), 화학유인물질 (chemoattractants), 사이토카인 (cytokines), 및 성장 인자 (growth factors) 를 포함하는, 구조적 및 비-구조적 생체 분자의 복합 혼합물이다. 포유류에서, ECM은 자주 다양한 형태의, 약 90% 콜라겐을 포함한다. ECM의 조성 및 구조는 조직의 소스에 따라 다양하다. 예를 들어, 소장 점막 하부 조직 (small intestinal submucosa) (SIS), 방광 기질 (urinary bladder matrix) (UBM), 식도 (esophagus) (E) 및 간 기질 (liver stroma) ECM은 각 조직이 요구하는 세포 니치 (cellular niche)가 특유하기 때문에 이들의 전반적인 구조 및 조성은 각각 다르다. 온전한 "세포외 기질 (extracellular matrix)" 및 "온전한 ECM (intact ECM") 은, 이것에만 국한하지 않으나, 콜라겐 (collagens), 엘라스틴 (elastins), 라미닌 (laminins), 글라이코사미노글라이칸 (glycosaminoglycans), 프로테오글라이칸 (proteoglycans), 항미생물제 (antimicrobials), 화학유인물질 (chemoattractants), 사이토카인 (cytokines), 및 성장 인자 (growth factors) 를 포함하는, 이들의 구조적 및 비-구조적인 생체 분자의 활성을 유지하고 있는 세포외 기질이다.
ECM 내에서 생체분자의 구조 및/또는 활성은, 예를 들어, ECM을 교차 연결 (cross-linking) 또는 투석하여, 변화되게 하거나 또는 화학적으로 또는 기계적으로 제거되게 할 수 있다. 온전한 ECM은 근본적으로 효소적으로 소화되거나, 교차-연결되고 및/또는 투석되지 않았으며, 이는 ECM이 소화, 투석 및/또는 교차-연결 과정을 거치게 하지 않았거나, 또는 용해하기 이전에 ECM을 저장 및 다루는 동안에 자연적으로 일어나는 과정 이외의 컨디션을 거치게 하지 않았음을 의미한다. 그러므로 상당히 교차-연결되고 및/또는 투석된 ECM (여기서 서술된 이의 용도에서 ECM의 겔화 및 기능적 성질에 상당히 영향을 주지 않는 사소한 방식을 제외한 임의의 어떤 것)은 "온전하다 (intact)"고 간주하지 않는다. "무세포적 (Acellular)"은 ECM이 남아있도록 세포를 제거하기 위하여 처리된 소스 조직 (source tissue)으로부터 생산된 ECM을 의미한다. ECM 하이드로겔을 생산하기 위하여 세포가 제거된 조직이 사용된다.
겔 (Gel): 액체 및 고체 사이의 물질의 상태이며, 및 일반적으로 액체 배지에서 팽창된 교차-연결된 폴리머 넷트워크로서 정의한다. 전형적으로, 겔은 고체 및 액체 둘 다를 함유하는 두-상 (two-phase)의 콜로이드성 분산이며, 여기서 고체의 양은 "졸 (sol)"이라고 불리는 두-상의 콜로이드성 분산에서의 고체보다 더 크다. 그러므로, "겔 (gel)"은 액체의 어떤 성질 (즉, 그 모양은 탄력이 있고 및 변형할 수 있다) 및 고체의 어떤 성질 (예를 들어, 그 모양은 2차원 표면에 3차원을 유지하기에 충분하도록 분명하다)을 가진다. "겔화 시간 (Gelation time)" 은, 또한 "겔 시간 (gel time)이라고도 언급되며, 조성물이 중증 정도의 스트레스 하에서, 조성물이 비-유동적이 되는데 걸리는 시간을 의미한다.
겔화 (gelation): 졸 (sol)로부터 겔이 형성되는 것.
지혈 (Hemostasis): 출혈을 억제 또는 정지하는 것.
하이드로겔 (Hydrogel ): 친수성인 폴리머 체인의 네트워크로서, 때로는 물이 분산 매체인 콜로이드성 겔로서 발견된다. 하이드로겔은 매우 흡수력이 있는 자연 또는 합성 폴리머 네트워크이다. 하이드로겔은 또한, 자연 조직과 비슷한 유연성 정도를 소유한다. 음향 ECM 하이드로겔과 같은, "음향적 (acoustic)" 하이드로겔은 초음파 에너지를 사용하여 생산된다. 이러한 하이드로겔들의 성질이 여기서 공개된다. 하이드로겔에서, G'(저장 계수)(storage modulus)는 전형적으로 G'' (손실 계수)(loss modulus) 보다 약 한 자릿수 더 크다.
분리된 (Isolated): "분리된(isolated)" 생물학적 성분(세포외 기질과 같은)은 다른 생물학적 성분들, 세포 또는 성분이 자연적으로 존재하는 생물, 즉 살아 있는 세포, 다른 크로모좀 및 크로모좀외 DNA, RNA, 및 단백질로부터 상당히 분리되고, 별도로 생산되고, 또는 정제된다. "분리된 (isolated)" 핵산, 펩티드 및 단백질은 그러므로 표준 정제 방법으로 정제된 핵산 및 단백질을 포함한다. 이 용어는 숙주 세포에서 재조합적인 발현으로 제조된 핵산, 펩티드 및 단백질은 물론 화학적으로 합성된 핵산도 또한 포용한다. 분리된 ECM은 ECM을 생산하는 세포로부터 분리된 것이다.
등장 버퍼 된 용액 (Isotonic Buffered Solution): pH7.2에서 7.8사이로 버퍼 되고 및 등장 환경을 촉진하기 위하여 균형된 농도의 염을 지닌 용액.
대식세포 (Macrophage): 세포 잔해, 이 물질, 미생물, 및 암세포를 식균작용하고 및 분해하는 백혈구의 한 타입. 식균 작용에서의 이들의 역할 이외에 추가로, 이들 세포들은 발달, 조직 유지 및 보수에 중요한 역할을 하며, 및 림프구와 같은 면역세포를 포함하는 다른 세포를 영입하고 및 영향을 주는 선천성 및 적응 면역계 둘 다에서 중요한 역할을 한다. 대식세포는, M1 및 M2라고 언급된, 또한 "M1-유사 (M1-like)" 및 "M2-유사 (M2-like)" 라고도 불리는 표현형을 포함하는, 많은 표현형으로 존재할 수 있다. 일차적으로 친-염증 기능을 수행하는 대식세포는 M1 대식세포 (CD86+/CD68+)라고 불리고, 반면에 염증을 감소하고 및 조직 수선을 북돋우고 및 조절하는 대식세포는 M2 대식세포 (CD206+/CD68+) 라고 불린다. 대식세포의 여러 가지 표현형을 동정하는 마커들은 종 (species) 들 사이에서 다양하다. 대식세포 표현형은 극도의 M1에서 M2 사이의 범위의 스펙트럼으로 대표된다.
포유류 (Mammal): 이 용어는 인간 및 비-인간 포유류 둘 다를 포함한다. 비슷하게, "개체 (subject)" 라는 용어는 인간 및 수의과 개체 둘 다를 포함한다.
질병의 예방 또는 치료 (Preventing or treating a disease): 질병의 "예방 (Preventing)"은 예를 들어 암과 같은 질병의 소인을 가졌다고 알려진 인간에서 질병 전개의 일부 또는 전부를 억제함을 의미한다. 알려진 소인을 가진 인간의 한 예는 가족 내에 유방암 역사를 가진 어떤 인간, 또는 개체를 흑색종과 같은 컨디션에 놓이게 하는 인자들에 노출된 인간이다. "치료 (treatement)"는 질병의 징후 또는 증상 또는 질병이 전개되기 시작한 후의 병리적이 컨디션을 경감하는 치료적 중재를 의미한다. 몇 가지 실시예에서, 치료는 종양의 크기의 감소, 전이의 숫자 및/또는 크기의 감소, 또는 종양의 증상의 감소를 의미한다.
치료 제제 (Therapeutic agent): 일반적인 의미로 사용되고, 여기에는 치료제, 예방제, 및 대체요법 제제가 포함된다. "치료(처치) (treatment)" 또는 "치료(처치)하는 (treating)"은 환자에게, 지혈을 증가시키는 것과 같은, 생물학적 계수에 측정할만한 영향을 주기에 충분한 양의, 음향 ECM 하이드로겔과 같은, 물질을 제공함을 의미한다.
치료적으로 효과적인 양 (Therapeutically effective amount): 음향 ECM 하이드로겔과 같은, "치료적으로 효과적인 양(therapeutically effective amount)"의 조성물은, 환자에게 투여되었을 때, 증상의 경감, 감소된 질병 진전, 또는 질병 퇴행 야기와 같은 치료적 유익 점을 제공하는 효과적인 양을 의미한다. 일정량의 음향 ECM 하이드로겔은 치료될 개체에서 바람직한 효과를 달성하기에 충분하다. 치료적으로 효과적인은 양 전신적으로 또는, 상처에와 같은, 국부적으로 투여될 수 있다. 추가로, 음향 ECM 하이드로겔의 한 효과적인 양은 단일 용량으로, 또는 시간에 걸쳐서 몇 번의 용량으로 투여될 수 있다. 그러나 효과적인 양은 적용되는 제제, 치료될 개체, 고통의 심각성 정도 및 타입, 및 그 화합물의 투여 방식에 의존될 것이다. 여기서 공개되는 방법에서 사용되는 음향 ECM 하이드로겔은 의료적 및 수의과적 환경에서 동등하게 적용된다. 그러므로, 일반적인 용어 "개체 (subject)" 또는 "환자 (patient)"는, 이것에만 국한하지 않으나, 인간 또는, 다른 영장류, 개, 고양이, 말, 및 소와 같은, 수의과적 개체를 포함하는, 모든 동물을 포함하는 것으로 이해된다.
열 가역적 하이드로겔 (Thermoreversible hydrogel ): 폴리머 체인의 얽힘 때문에 형성된 하이드로겔로서 여기서 점도 (viscosity)는 겔화 (gelation)의 특정한 온도에서 바뀐다. 공개되는 음향 ECM 하이드로겔은 냉각시켰을 때 겔화 ((솔(sol)에서 겔 (gel) 로 변환))를 보여주는 열가역적 하이드로겔이다.
국소적 적용 (Topical application): 국소적으로 적용되는 제제는 단지 특정한 부위에만 적용되고, 및 신체 전체에는 적용되지 않는다. 특별한 실시예에서 조성물은 지혈이 바람직한 부분의 피부 또는 눈에 적용된다. 예를 들어 약학적 조성물은, 예를 들어, 피부 또는 각막 찰과상 또는 외과적인 절개와 같은, 외상적 (traumatic) 또는 수술적 (surgical) 상처인, 상피 상처 또는 결손과 같은 상처에, 국소적 제제로서 적용될 수 있다.
"초음파 분해 ( Ultrasonication )" 20kHz 보다 높은 주파수로 초음파 파장에 노출시키는 과정.
달리 설명하지 않는 한, 여기서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 공개가 속하는 기술 분야에서 통상 전문가 중 하나에 의해 보통 이해되는 것과 같은 동일한 의미가 있다. 단수 형태 "a," "an, "및 "the"의 단수 용어는 문맥이 달리 확실하게 제시하지 않는 한, 복수 참고 군(referents)을 포함한다. 비슷하게, "또는 (or)'은 문맥이 달리 확실하게 제시하지 않는 한, "및 (and)" 을 포함하려는 의도가 있다. 더 나아가, 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기, 및 핵산 및 폴리펩티드에 주어진 모든 분자량 또는 분자 질량 값은, 대략의 값이며, 및 서술 목적으로 제공된다. "약 (about)" 은 목록화된 값의 5% 이내를 의미한다. 여기서 서술된 비슷하거나 또는 동등한 방법 및 재료들이 실제로 사용되거나 또는 본 공개를 테스트하는데 사용될 수 있다고 하더라도, 적절한 방법 및 재료들이 하기에 서술된다. "포함하다 (comprise)" 라는 용어는 "포함하다 (include)"를 의미한다. 여기서 언급된 모든 발표논문, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참고 문헌으로 병합되었다. 상충 될 경우, 용어의 설명을 포함하는, 현 명세서는, 조절될 것이다. 추가로, 재료, 방법, 및 실시예들은 단지 실지로 보여 주려는 것이며 및 제한하려는 의도는 아니다.
세포외 기질 (Extracellular Matrix) (ECM)
하이드로겔을 생산하기 위하여 어느 타입의 세포외 기질도 사용될 수 있다 (ECM과 연관된 미국 특허 번호 4,902,508; 4,956,178; 5,281,422; 5,352,463; 5,372,821; 5,554,389; 5,573,784; 5,645,860; 5,771,969; 5,753,267; 5,762,966; 5,866,414; 6,099,567; 6,485,723; 6,576,265; 6,579,538; 6,696,270; 6,783,776; 6,793,939; 6,849,273; 6,852,339; 6,861,074; 6,887,495; 6,890,562; 6,890,563; 6,890,564; 및 6,893,666 를 참조). 어떤 실시예에서, ECM은 척추동물, 예를 들고 및 제한 없이, 이것에만 제한하지 않고, 인간, 원숭이, 말, 돼지, 소 및 양을 포함하는 온혈 포유류 척추동물로부터 분리된다. 특별한 비-제한적인 실시예에서는, ECM은 돼지 또는 인간이다.
ECM은, 제한 없이, 방광, 장 (소장 또는 대장과 같은), 심장, 신장, 자궁, 뇌, 혈관, 폐, 뼈 근육, 췌장, 위, 비장 지방 조직, 간, 식도 및 피부를 포함하는 어느 기관 또는 조직으로부터 유래할 수 있다. ECM은 세포 배양으로부터 얻을 수 있다. 한 실시예에서, ECM은 방광으로부터 분리된다. 다른 실시예에서, ECM은 식도로부터 분리된다. 다른 실시예에서, ECM은 피부로부터 분리된다. ECM은 ECM의 기저 막 부분 (basement membrane portion) 을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 어떤 실시예에서, ECM은 적어도 기저 막의 한 부분을 포함한다. ECM을 생산하기 위하여, 조직은, 예를 들어 소스 조직 또는 기관으로부터, 세포 및 세포 물질을 제거하기 위하여 탈세포화 할 수 있다. 예를 들어, 여기서 공개되는 하이드로겔의 성분으로서 개체에 ECM을 이식할 때와 같은, 면역 반응을 예방하기 위하여 탈세포화된 재료를 사용하는 것이 바림직하다.
미국 특허 번호 8,361,503 (여기 참고문헌으로 병합)는 다음과 같이 방광 ECM의 제조를 공개한다, 장막 (tunica serosa) 및 근육층 (tunica muscularis) 둘 다를 포함하는 외층을 제거하기 위하여 메스 손잡이 (scalpel handle) 및 적신 거즈로 세로 방향으로 닦는 동작으로 방광 조직을 연마하여 돼지 방광 ECM이 제조된다. 조직 조각을 밖으로 뒤집은 후에, 같은 닦는 동작을 사용하여 소장점막 (tunica mucosa)의 루미날 부분 (luminal portion) 은 밑에 있는 조직으로부터 얇은 조각 층으로 갈라진다. 어떤 실시예에서, 점막 하부 (submucosa)의 천공이 방지된다. 이 조직들이 제거된 후에, 결과로 얻어지는 ECM은 주로 점막 하부 층 (tunica submucosa)로 구성된다.
피부 ECM으로부터의 하이드로겔의 생산은 울프 등 (Wolf et al., Biomaterials 33: 7028-7038, 2012) 에 공개되며, 여기에 참고 문헌으로 병합되었다. 식도 조직으로부터의 ECM 생산은, 예를 들어, 바디락 등 ((Badylak et al. J Pediatr Surg. 35(7):1097-103, 2000 및 Badylak et al., J Surg Res. 2005 September; 128(1):87-97, 2005)) 에 공개되며, 둘 다 여기에 참고문헌으로 병합되었다. 여기에 참고 문헌으로 병합된, 미국 특허 번호 6,893,666 은 방광, 피부, 식도 및 소장으로부터의 ECM 생산을 공개한다. ECM은 이들 중 어느 조직으로부터 생산될 수 있다.
상업적으로 구입 가능한 ECM 제제도 또한 사용될 수 있다. 한 실시예에서, ECM은 소장 점막 하부 또는 SIS로부터 유래한다. 상업적으로 구입 가능한 ECM 제제에는, 이것에만 국한하지 않으나, SURGISISTM , SURGISIS-ESTM, STRATASISTM, 및 STRATASIS-ESTM (Cook Urological Inc.; Indianapolis, Ind.) 및 GRAFTPATCHTM (Organogenesis Inc.; Canton Mass.) 이 포함 된다. 다른 실시예에서는, ECM은 피부로부터 유래한다. 상업적으로 구입 가능한 ECM 제제에는, 이것에만 국한하지 않으나, PELVICOLTM (유럽에서는 PERMACOLTM 로서 팔린다; Bard, Covington, Ga.), REPLIFORMTM (Microvasive; Boston, Mass.) 및 ALLODERMTM (LifeCell; Branchburg, N.J.). 다른 실시예에서, ECM은 방광으로부터 유래한다. 상업적으로 구입 가능한 ECM 제제에는, 이것에만 국한하지 않으나, UBM (Acell Corporation; Jessup, Md.)이 포함된다.
ECM의 제조를 위한 조직은 많은 다양한 방식으로 수확될 수 있으며 및 일단 수확되면, 수확된 조직의 다양한 부분이 사용될 수 있다. ECM은 또한 식도 및 소장으로부터 제조되었다, 예를 들어, 여기에 참고문헌으로 병합된, 케엔 ((Keane et al., Tissue Eng. Part A, 21(17-18): 2293-2300, 2015)), 등 참조. 식도 ECM은 외 근육층 (muscularis externa)으로부터 점막(mucosa) 및 점막 하부 (submucosa)를 기계적으로 분리하고 및 트립신을 포함하는 버퍼에서 점막 층을 소화시키고, 이어서 슈크로즈 (sucrose), 트리톤-X100 (TRITON-X100®), 디옥시콜릭 에시드 (deoxycholic acid), 퍼아세틱 에시드 (peracetic acid) 및 DNAse에 노출시켜 제조될 수 있다. 소장 점막 하부 층 (Small intestine submucosa) (SIS)은 온전한 소장으로부터 소장 점막 (tunica mucosa), 장막 (tunica serosa), 및 외 근육층 (tunica muscularis externa)의 표피층을 기계적으로 제거하여, 점막 하부 (submucosa), 점막근 층 (muscularis mucosa), 및 기저 층 (basilar stratum compactum)을 온전하게 두면서 제조될 수 있다. 이 SIS는 그 후 퍼아세틱 에시드 (peracetic acid)로 처리한다. 예시적인 프로토콜은, 케엔 (Keane et al.)에서 제공된다. 피부 하이드로겔은, 예를 들어, 여기에 참고문헌으로 병합된, 울프 등에서 공개된 대로 ((Wolf et al, J Biomed Mater Res A. 2013. 35(25):6838-49. PMID: 23873846. PMCID: 3808505)), 생산될 수 있다.
한 실시예에서, 방광 기질 (urinary bladder matrix) (UBM)를 제조하기 위하여 ECM이 수확된 돼지 방광으로부터 분리된다. 과량의 연결 조직 및 잔여 소변은 방광으로부터 제거된다. 장막 (tunica serosa), 외 근육층 (tunica muscularis externa), 점막 하부 층(tunica submucosa) 및 대부분의 점막근 층(muscularis mucosa)은 기계적인 연마 (abrasion)에 의해 또는 효소 처치, 수화 (hydration) 및 연마의 조합으로 제거될 수 있다. 이 조직들의 기계적인 제거는 외층 ((특히 기저측부 평활근 층 (abluminal smooth muscle layers)) 및 소장 점막 (tunica mucosa) (상피층)의 루미날 부분 (luminal portions) 까지도 제거하기 위하여 세로로 닦는 동작을 사용하여 달성할 수 있다. 이 조직들의 기계적인 제거는 장간막 조직을, 예를 들어, 에디슨-브라운 겸자(Adson-Brown forceps) 및 멧젠바움 가위 (Metzenbaum scissors)로 제거하고 및 메스 손잡이 또는 다른 거친 물체를 적신 거즈로 감아 세로로 닦는 동작을 사용하여 근육 층 (tunica muscularis) 및 점막 하부 층 (tunica submucosa)을 닦아 내어 달성한다. 소장 점막 (tunica mucosa)의 상피 세포는 또한 조직을 탈-상피세포화 용액 (de-epithelializing solution)에, 예를 들어 및 제한 없이, 고장 식염수 (hypertonic saline) 에, 담가 분리되게 할 수 있다. 결과를 얻어진 UBM은 소장 점막의 기저막 (basement membrane) 및 인접한 기저막 (tunica propria)을 포함하고, 이는 더 나아가 퍼아세틱 에시드 (peracetic acid)로 처치되고, 동결건조 되고 및 가루 화 된다, 여기에 참고문헌으로 병합된, 미국 특허 8,361,503 참조.
피부 부분도 ECM 하이드로겔을 제조하기 위하여 사용될 수 있다, 여기에 참고 문헌으로 병합된, PCT 출원 번호 2015/15164728, 참조. 특별한 비-제한적인 실시예에서, 피부는 0.25% 트립신(Trypsin)/1% 트리톤-X-100 (TRITON-X® -100)(즉, SDS 없이)으로 볼텍스 진탕기 300 RPM에서 실온에서 하기의 용액에서 탈세포화 될 수 있다: 0.25% 트립신(trypsin)으로 6시간 동안, lx; 탈이온화 된 물 (deionized water), 15분, 3x; 70% 에탄올 (ethanol), 10 에서 12시간 lx; 3% H202, 15분, lx; 탈이온화 된 물(deionized water), 15분, 2x; 0.26% EDTA/0.69% 트리스 (Tris)에 있는 1% TRITON-X® -100에, 6시간, lx 및 그 후 하룻밤 동안 lx; 탈이온화 된 물, 15분, 3x; 0.1% 퍼아세틱 에시드 (peracetic acid)/4% 에탄올 (ethanol), 2시간, lx; PBS, 15분, 2x; 및 최종으로 탈이온화 된 물, 15분, 2x. 피부 시트 (Dermis sheets) 는 그 후 동결건조되고 및 이어서 워링 브랜더 (Waring blender) 및 #20 매쉬 스크린 (mesh screen) 이 있는 윌리 밀 (Wiley Mill)을 사용하여 미립자 형태로 감소시킨다.
어떤 실시예에서, 상피 세포는 먼저 조직을 탈-세포화 용액, 예를 들고 및 제한 없이, 1.0 N 식염수와 같은 고장 식염수에, 10분에서 4시간 범위의 시간 동안 먼저 담가서 탈루미네이트화 시킬 수 있다. 고장 식염수 용액에 노출은 밑에 있는 기저 막으로부터 상피 세포를 효과적으로 제거한다. 초기 탈루미네이트화 과정 후에 남은 조직은 상피 기저막 및 기저측부 (abluminal)에서 상피 기저 막의 조직층을 포함한다. 이 조직은 다음에 더 나아가 상피 기저 막이 아니고 대부분의 기저측부 조직을 제거하기 위한 처치를 받게 된다. 기계적인 연마로 또는 효소 처치, 수화 및 연마의 조합으로 남은 탈-상피세포화된 조직 (de-epithelialized tissue)으로부터 외부장막(outer serosal), 외막 (adventitial), 평활근 조직 (smooth muscle tissues), 점막하부 층 (tunica submucosa) 및 대부분의 근육층(muscularis mucosa) 이 제거된다.
ECM은, 이것에만 국한하지 않으나, 퍼아세틱 에시드 (peracetic acid)에 노출, 낮은 용량의 감마 방사선 조사(gamma radiation), 가스 플라즈마 멸균, 에틸렌 옥사이드 (ethylene oxide) 처치, 또는 전자빔 처치를 포함하는, 어느 수의 표준 기술들로 멸균될 수 있다. 좀 더 전형적으로, ECM의 멸균은 0.1% (v/v) 퍼아세틱 에시드 (peracetic acid), 4% (v/v)에탄올 및 95.9% (v/v) 멸균 수에 2시간 동안 담가서 얻을 수 있다. 퍼아세틱 에시드 잔류물은 PBS (pH=7.4)로 15분 동안 두 번 세척하고 및 멸균 수로 15분 동안 2번 세척하여 제거된다. ECM 재료는 프로필렌 옥사이드 (propylene oxide) 또는 에틸렌 옥사이드 (ethylene oxide) 처치, 감마 방사선조사 처치 (gamma irradiation treatment) (0.05 에서 4 mRad), 가스 플라즈마 멸균 (gas plasma sterilization), 퍼아세틱 에시드 멸균 (peracetic acid sterilization), 또는 전자빔 처치 (electron beam treatment}로 멸균될 수 있다. ECM은 또한, 단백질 재료를 교차 연결 (cross-linking) 하게 하는, 글루타르알데하이드 (glutaraldehyde)로 처치하여 멸균될 수 있다, 그러나 이 처치는 재료를 상당히 변경시켜 이것이 천천히 재흡수 되거나 또는 전혀 흡수되지 않도록 하고 및 건설적인 리모델링이기보다는 상처 흔적 조직 형성 또는 피막형성에 좀 더 가깝게 닮은 다른 타입의 숙주 리모델링을 일으키게 한다. 단백질 재료의 교차- 연결은 또한 카보디이미드 (carbodiimide) 또는 디하이드로터말 (dehydrothermal) 또는 광산화 (photooxidation) 방법으로 유도될 수 있다. 미국 특허 번호 8,361,503 에서 공개된 대로, ECM은 0.1% (v/v) 퍼아세틱 에시드 (peracetic acid) (a), 4% (v/v) 에탄올, 및 96% (v/v) 멸균 수로 2시간 동안 담가 놓아 소독된다. ECM 재료는 그 후 PBS (pH=7.4)로 15분 동안 두 번 세척되고 및 탈이온화 된 물로 15분 동안 세척된다.
일반적으로, 관심 있는 조직의 분리 후에, 탈세포화는 다양한 방법으로, 예를 들고 및 제한 없이, 고장 식염수 (hypertonic saline), 퍼아세틱 에시드 (peracetic acid), 트리톤-X(TRITON-X®) 또는 다른 세제 (detergents)에 노출로, 수행된다. 멸균 및 탈세포화는 동시일 수 있다. 예를 들고 및 제한 없이, 퍼아세틱 에시드로 멸균은, 위에서 서술한 대로, 또한 탈세포화에 사용될 수 있다. ECM은 그 후 건조되고, 동결건조되거나 (냉동-건조) 또는 공기 건조될 수 있다. 건조된 ECM은, 이것에만 국한하지 않으나, 찢기 (tearing), 으깨기 (milling), 자르기 (cutting), 빻기 (grinding), 및 깎기(shearing)를 포함하는 방법들로 가루로 만들 수 있다. 가루로 된 ECM은 또한 더 나아가, 예를 들고 및 제한 없이, 냉동 또는 냉동-건조 상태에서 빻기 또는 갈기와 같은 방법에 의해 분말 형태로 가공될 수 있다.
포유류 ECM은 또한 상업적으로 구할 수 있다. 이들에는 AVITENETM , MICROMATRIX® 및 XENMATRIXTM 가 포함된다.
음향 ECM 하이드로겔 및 이의 제조 (Acoustic ECM hydrogels and Their Preparation)
어떤 실시예에서, 포유류 ECM과 같은, 가루로 된 ECM은 액체에 희석시킨다. 이 ECM은 가로로 빻기 전에 동결건조 될 수 있거나 또는 아닐 수 있다. ECM은, 예를 들어, ECM을 갈고, 잘게 자르고 또는 잘라서 가루로 빻을 수 있다. 가루로 된 ECM은 약 10μm에서 약 5000μm, 약 10μm에서 약 4000μm, 약 10μm에서 약 3000μm, 약 10μm에서 약 2000μm, 약 10μm에서 약 1000μm, 약 10μm에서 약 500μm, 약 30μm에서 약 300μm, 약 40μm에서 약 400μm, 약 25μm에서 약 500μm, 약 50μm에서 약 500μm, 약 100μm에서 약 300μm, 약 10μm에서 약 50μm, 또는 약 10μm에서 약 100μm의 범위의 조각을 가져야 한다. 다른 실시예에서, ECM은 약 10μm에서 약 2000μm 까지의 범위를 가진 조각으로 제공된다. 한 비-제한적인 실시예에서, 이 조각은 약 30μm 에서 약 300μm 범위에 있다. 액체는, 예를 들어, pH 약 7.0에서 약 7.6 과 같은, 약 7.1에서 약 7.5와 같은, 약 7.2에서 약 7.4와 같은, 약 7.0에서 약 7.2와 같은, 약 7.0에서 약 7.4와 같은, 약 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5 또는 7.6와 같은, 중성 pH의 버퍼가 될 수 있다. ECM은, 이것에만 국한하지 않으나, 인산염 버퍼 된 식염수 (phosphate buffered saline) (PBS) 또는 트리스 버퍼 된 식염수 (Tris buffered saline) 와 같은, 등장 버퍼 된 식염수용액에 희석시킬 수 있다. 어떤 실시예에서, 버퍼 된 식염수 용액은 삼투압이 약 290 mOsm/L이다. 액체는 물일 수 있다. 어떤 실시예에서, 용액을 타겟 pH로 가져오기 위하여, 또는 겔의 pH 및 이온 강도를, 생리적 pH 및 이온 컨디션과 같은, 타겟 수준으로 유지하는데 도와 주기 위하여, 제한 없이, 인산염 버퍼 된 식염수 (Phosphate Buffered Saline) (PBS)를 포함하는, 등장 버퍼가 사용될 수 있다. 이는 액체 ECM 용액을 형성한다.
공개되는 방법은 일반적으로. 펩신, 트립신, 또는 히알우로니데즈 (hyaluronidase) 를 포함하는, 산성 프로테아제의 사용은 관여되지 않는다. 여기 참고 문헌으로 병합된 PCT 출원 번호 WO 2015/164728, 참조. 일반적으로, 본 방법에서, 액체에 용해시킨 ECM은 산성 프로테아제와 접촉되지 않는다.
어떤 실시예에서, ECM은 액체에서 약 25mg/ml보다 더 큰 농도에서 사용된다. ECM은, 버퍼와 같은, 액체에서 약 25mg/ml에서 약 600mg/ml의 농도에서 사용될 수 있다. 적절한 농도는 또한 약 25mg/ml에서 약 300mg/ml, 약 25mg/ml에서 약 200mg/ml, 및 약 25mg/ml에서 약 150mg/ml을 포함한다. ECM은 버퍼와 같은, 액체에서 약 50mg/ml에서 약 600mg/ml의 농도에서 사용될 수 있다. 적절한 농도는 또한 약 50mg/ml에서 약 300mg/ml, 약 50mg/ml에서 약 200mg/ml, 및 약 50mg/ml에서 약 150mg/ml을 포함한다. 적절한 농도는 약 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 및 200mg/ml을 포함한다. 예시적 농도는 약 25mg/ml, 100mg/ml, 및 150mg/ml를 포함한다. 한 비-제한적인 실시예에서, 액체에서 ECM의 농도는 약 25mg/ml 에서 약 150mg/ml 이다. 한 비-제한적인 실시예에서, ECM은 액체에서 100mg/ml 농도이다.
버퍼 된 식염수 용액과 같은, 액체에 있는 ECM은, 초음파 주파수로 처치된다. 한 실시예에서, 초음파는 주파수 약 20kHz에서 약 100kHz이다. 액체에 있는 ECM은 초음파로 주파수 약 20kHz에서 약 30kHz로, 약 20kHz에서 약 40kHz로, 약 20kHz에서 약 50kHz로, 약 20kHz에서 약 60kHz로, 약 20kHz에서 약 70kHz로, 약 20kHz에서 약 80kHz로, 또는 약 20kHz에서 약 90kHz로 처치된다. 액체에 있는 ECM은 초음파로 주파수 약 20kHz, 30kHz, 40kHz, 50kHz, 60kHz, 70kHz, 80kHz, 90kHz 또는 100kHz로 처치될 수 있다. 한 비-제한적인 실시예에서, 액체에 있는 ECM은 초음파로 주파수 약 20kHz에서 처치될 수 있다
버퍼 된 식염수 용액과 같은, 액체에 있는 ECM은 적어도 30초와 같은, 적어도 20초 동안 초음파로 처치한다. 버퍼 된 식염수 용액과 같은, 액체에 있는 ECM은 적어도 60초 동안 초음파로 처치한다. 어떤 실시예에서, 액체에 있는 ECM은 적어도 60초에서 약 1시간 동안 초음파로 처치한다. 추가 실시예에서, 액체에 있는 ECM은 적어도 60초에서 약 30분 동안 초음파로 처치한다. 추가 실시예에서, 액체에 있는 ECM은 적어도 30초에서 약 30분 동안 초음파로 처치한다. 좀 더한 실시예에서, 액체에 있는 ECM은 적어도 60초에서 약 15분 동안 초음파로 처치한다. 좀 더한 실시예에서, 액체에 있는 ECM은 적어도 30초에서 약 15분 동안 초음파로 처치한다. 어떤 실시예에서, 액체에 있는 ECM은 적어도 60초에서 약 10분 동안 초음파로 처치한다. 어떤 실시예에서, 액체에 있는 ECM은 적어도 30초에서 약 10분 동안 초음파로 처치한다. 어떤 실시예에서, 액체에 있는 ECM은 적어도 60초에서 약 5분 동안 초음파로 처치한다. 어떤 실시예에서, 액체에 있는 ECM은 적어도 30초에서 약 5분 동안 초음파로 처치한다. 액체에 있는 ECM은 초음파로 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 또는 60분 동안 처치될 수 있다. 어떤 실시예에서, 액체에 있는 ECM은 여기에 리스트 된 대로 총시간 동안 펄스로 초음파 처리한다. 그러므로, 어떤 실시예에서, 버퍼 된 식염수 용액과 같은, 액체에 있는 ECM은 펄스로, 약 30, 약 40, 또는 약 60초의 길이 동안과 같은, 적어도 약 30초 길이 동안, 초음파로 처치된다. 버퍼 된 식염수 용액과 같은 액체에 있는 ECM은, 총 처치 시간이 60초에서 1시간까지, 또는 리스트 된 어느 총시간까지와 같이, 초음파로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10번 처치될 수 있다. 버퍼 된 식염수 용액과 같은 액체에 있는 ECM은 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 또는 60초 동안 처치될 수 있다. 버퍼 된 식염수 용액과 같은 액체에 있는 ECM은 적어도 30초 동안 처치될 수 있다. 일반적으로, 복수의 처치가 사용된다면, 이는 1시간보다 적은 기간에 일어난다. 예시적인 방법은 30초의 초음파 펄스, 이어서 30에서 45초 동안 처치하지 않고, 이후 또 다른 처치가 이어진다. 이러한 처치는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10번 또는 그 이상 적용된다. 비-제한적인 한 예시적인 방법은, 약 20kHz에서와 같은, 초음파로 30초의 펄스, 이어서 45초 동안 무 처치가 6번 반복되는 6번의 펄스로, 총 3분 동안의 초음파 처치이다.
초음파는 약 20μm 에서 약 320μm의 진폭을 가질 수 있다. 일반적으로, 진폭은 초음파를 생산하기 위하여 사용하는 탐침 (probe)의 중앙으로부터 측정된다. 탐침의 진동 표면의 진폭 (amplitude)은, 탐침이 완전히 확장된 위치와 완전히 수축된 상태 사의의 거리, 마이크론 (μm)으로 측정된다. 어떤 실시예에서, 진폭은 약 30μm 에서 약 200μm이다. 추가 실시예에서, 진폭은 약 36μm에서 약 180μm까지 이다. 진폭은 약 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 150, 160, 70, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 또는 300 μm 이 될 수 있다. 어떤 실시예에서, 진폭은 약 30-40 μm, 40-50 μm, 50-60 μm, 60-70 μm, 70-80 μm, 80-90 μm, 90-100 μm, 100-110, 110-120 μm, 120-130 μm, 130-140 μm, 140-150 μm, 150-160 μm, 160-170 μm, 170-180 μm, 180-190 μm, 190-200 μm, 200-210 μm, 210-220 μm 220-230 μm, 230-240 μm, 240-250 μm, 250-260 μm, 260-270 μm, 270-280 μm, 280-290 μm 또는 290-300 μm가 될 수 있다. 한 특정한, 비-제한적인 실시예에서, 초음파는 주파수 (frequency) 약 20kHz이며, 및 진폭 (amplitude) 은 약 36μm 에서 약 180μm 까지다. 더 나아간 비-제한적인 실시예에서, 초음파는 주파수 (frequency) 약 20kHz이며, 및 진폭 (amplitude) 은 약 36μm 에서 약 180μm 까지이며, 및 처치는 약 3분과 같이, 총 약 1, 2, 3, 4, 또는 5분 동안이다. 초음파 분해 (sonication) 는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20분 동안일 수 있다. 초음파 분해는 약 30초에서부터 약 5분까지일 수 있다. 초음파 분해는 예를 들어, 약 1에서 약 5분 사이 일 수 있다. 초음파 분해는 약 1에서 약 10분 사이 일 수 있다. 초음파 분해는, 예를 들어, 약 1에서 약 20분 사이 일 수 있다. 추가 실시예에서, 초음파 분해는 약 1시간 미만, 약 30분 미만, 약 20분 미만, 또는 약 10분 미만 동안일 수 있다. 어떤 실시예에서, 초음파 분해는 적어도 30초 동안일 수 있다. 다른 실시예에서, 초음파 분해는 약 10분에서 약 24시간 동안까지, 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24시간까지, 일수 있다. 어떤 실시예에서, 초음파 분해는 48시간 동안까지 일 수있다.
어떤 실시예에서, 액체에 있는 ECM은 초음파로 약 30 ℃ 에서 약 43 ℃ 까지의 온도 범위에서 처치된다. 한 실시예에서, 액체에 있는 ECM은 초음파로 약 35 ℃ 에서 약 40℃ 까지의 온도 범위에서 처치된다. 한 실시예에서, 액체에 있는 ECM은 초음파로 약 36 ℃ 에서 약 38℃ 까지의 온도 범위에서 처치된다. 다른 실시예에서, 액체에 있는 ECM은 초음파로, 약 37 ℃ 에서 약 55℃ 와 같은, 약 37 ℃ 에서 약 50 ℃ 와 같은, 약 37 ℃ 에서 약 45 ℃ 와 같은, 약 37 ℃ 에서 약 40　℃와 같은, 약 37 ℃ 또는 그 이상의 온도 범위에서 처치된다. 액체에 있는 ECM은 초음파로 약 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 또는 55 ℃의 온도에서 처치된다. 추가 실시예에서, 액체에 있는 ECM은, 약 38 ℃ 에서 약 50℃ 까지와 같은, 약 38℃ 에서 약 45℃ 까지와 같은, 약 38 ℃ 에서 약 40℃ 까지와 같이, 약 38℃ 이상에서 초음파로 처치된다.
초음파로 처치는 음향 ECM 하이드로겔을 생산한다. 이 음향 ECM 하이드로겔은 일반적으로 37℃ 근처에서 졸(sol)로부터 겔(gel)로 상 전이(phase transition)를 경험하며 및 그러므로 37℃ 보다 더 크면 액체 상으로 전이되고 및 37℃ 이하에서는 겔 상으로 전이된다. 37℃에서 음향 ECM 하이드로겔은 겔과 비슷하게 충분히 점액성이나, 그러나 온도가 37　℃ 이상으로 증가하면, 겔은 졸로 전이된다. 음향 ECM 하이드로겔은 온도가 37　℃ 이하로 감소하면 겔 (졸에서 겔로 전이)을 형성한다. 그러므로, 어떤 실시예에서, 초음파 분해 후에, 음향 ECM 하이드로겔은, 약 4℃ 에서 약 36℃ 까지와 같이, 37℃ 이하의 온도로 냉각된다. 음향 ECM 하이드로겔은, 일반적으로 25 ℃ 인, 실온으로 냉각될 수 있다. 어떤 실시예에서, 음향 ECM 하이드로겔은 약 15 ℃ 에서 약 25℃ 까지 냉각된다. 음향 ECM 하이드로겔은 약 23℃ 에서 약 27℃ 까지 냉각된다. 음향 ECM 하이드로겔은 겔 상으로 유도하기 위하여 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 29 또는 30℃로 냉각될 수 있다.
어떤 실시예에서, 공개되는 것은 음향 포유류 ECM 하이드로겔이고, 여기서 이 하이드로겔은 열 가역적이며, 상기 하이드로겔은 약 37℃ 이하의 온도에서 고체(겔) 상에 있으며 및 37℃ 보다 높은 온도에서는 액체 (졸) 상에 있다. 음향 하이드로겔은 여기서 공개된 어느 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 어떤 실시예에서, 음향 ECM 하이드로겔에서 저장 계수 (storage modulus) (G')는 손실 계수(loss modulus)(G'') 보다 약 한 자리 수 크기만큼 더 크다. 추가 실시예에서, 상기 약 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 및/또는 36℃ 에서와 같이, 약 15 에서 약 37℃ 까지의 온도에서 스트레스가 증가함에 따라 음향 ECM 하이드로겔의 점성은 감소한다. 추가 실시예에서, 음향 ECM 하이드로겔의 점성은 실온에서, 및/또는 약 23℃ 에서 약 27℃ 까지에서, 및/또는 약 15℃ 에서 약 25℃ 까지에서 스트레스가 증가함에 따라 감소한다. 한 실시예에서, 음향 ECM 하이드로겔의 겔에서 졸로의 전이는 약 37℃ 에서이며, 그러므로 체온에서 충분히 점액성이 있기 때문에 이 하이드로겔은 점막 하부의 쿠션으로서 사용될 수 있다.
이 음향 하이드로겔들은 상기 공개된 포유류 ECM 어느 것으로부터 만들어질 수 있다. 특정하고, 비-제한적인 실시예에서, ECM은 인간 ECM 이다. 다른 비-제한적인 실시예에서, ECM은 방광 ECM, 소장 점막 하부 ECM, 식도 ECM, 또는 피부 ECM 이다. 한 실시예에서, ECM은 방광 ECM 이다. 다른 실시예에서, ECM은 피부 ECM 이다. 또한 다른 실시예에서, ECM은 식도 ECM 이다. ECM의 소스는, 예를 들어, 돼지, 소, 또는 양 (ovine) 일 수 있다.
어떤 실시예에서, 음향 ECM 하이드로겔은 약 25mg/ml 에서 약 600mg/ml 까지 농도의 ECM을 포함한다. 추가 실시예에서, 음향 ECM 하이드로겔은 약 20mg/ml 에서 약 600mg/ml 까지, 약 25mg/ml에서 약 300mg/ml 까지, 약 25mg/ml 에서 약 200mg/ml 까지, 및 약 25mg/ml에서 약 150mg/ml 까지 농도의 ECM을 포함한다. 좀 추가 실시예에서, 음향 ECM 하이드로겔은, 버퍼에서와 같은 액체에서 약 50mg/ml 에서 600mg/ml까지의 농도의 ECM을 포함한다. 음향 ECM 하이드로겔은 또한 약 50mg/ml 에서 약 300mg/ml 까지, 약 50mg/ml 에서 약 200mg/ml 까지, 약 50mg/ml 에서 약 150mg/ml 까지, 약 50-100 mg/ml, 또는 약 100-150 mg/ml의 농도로 ECM을 가질 수 있다. 어떤 비-제한적인 실시예에서, 음향 ECM 하이드로겔은 약 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 및 200mg/ml 농도의 ECM을 포함한다. 어떤 비-제한적인 실시예에서, 음향 ECM 하이드로겔은 약 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-55, 55-60, 60-65, 65-70, 70-75, 75-80, 80-85, 85-90, 90-95, 95-100, 100-105, 105-110, 110-115, 115-120, 120-125, 125-130, 130-135, 135-140, 140-145, 145-150, 150-155, 155-160, 160-165, 165-170, 170-175, 175-180, 180-185, 185-190, 190-195, 및 195-200 mg/ml의 농도의 ECM을 포함한다. 예시적인 비-제한적인 농도의 ECM은 또한 약 25mg/ml, 100mg/ml, 및 150mg/ml을 포함한다. 한 비-제한적인 실시예에서, 음향 ECM 하이드로겔은 약 25mg/ml 에서 약 150mg/ml 까지 농도의 ECM을 포함한다. 한 실시예에서, ECM 농도는 약 100mg/ml이다.
어떤 실시예에서, ECM의 농도가 약 150mg/mL 일 때, 상기 음향 ECM 하이드로겔의 점성은 15℃ 에서 1400 Pa*s 및 25℃에서 점성 400 Pa*s이다. 다른 실시예에서, ECM의 농도가 약 150mg/mL 일 때, 음향 ECM 하이드로겔은 저장 계수 15℃ 에서 대략 2700 Pa*s, 25℃에서 대략 800 Pa*s, 및 37℃에서 600 Pa*s를 가진다.
액체 상에 있는 음향 ECM 하이드로겔은 냉각하기 전에 3차원 캐스트 (cast) 에 넣거나, 또는 필름을 형성하기 위하여, 테플론 시트 (TEFLON® sheet)에 펼쳐놓을 수 있다, 예를 들어, 도 1C 및 1D 참조. 음향 ECM 하이드로겔에서 높은 농도의 ECM (50 에서 600mg/ml)은 매우 얇은 시트, 예를 들어, 4마이크론 (microns)과 같이 얇은 시트를 형성하게 한다. 이 음향 ECM 하이드로겔은 4마이크론보다 큰 크기로 및 어느 2-차원 또는 3-차원 모양의 형태가 될 수 있다. 어떤 실시예에서, 시트는, 두께가 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10마이크론과 같은, 약 4 에서 10마이크론 까지의 두께로 형성될 수 있다. 이 음향 ECM 하이드로겔은, 제한 없이 실린더 (cylinder), 구 (sphere), 타원체 (ellipsoid), 디스크 (disk), 시트 (sheet), 정육면체 (cube), 직육면체 (cuboid), 원추 (cone), 삼각형 (triangular) 또는 사각형(rectangular) 프리즘 (prism)은 물론, 속이 빈 구(hollow spheres), 속이 빈 타원체 (hollow ellipsoids), 및 끝이 열린 속이 빈 실린더 (open-ended hollow cylinders), 등을 포함하는, 어느 3-차원 모양으로 형성될 수 있다. 예시적인 모양은 도 2A-2C에서 보여준다. 음향 ECM 하이드로겔은 또한, 이를 주사기에 넣고 및 겔 또는 졸 상에서 주사기로부터 압출하는 것과 같이, 주사 가능한 것으로서 사용될 수 있다.
어떤 실시예에서, 음향 ECM 하이드로겔은 생체 적합한 기질에 흡수되거나, 흡착되거나, 또는 달리 분산되거나 또는 흩어진다. 생체 적합한 기질의 비-제한적인 실시예에는: 매쉬 (mesh), 짜지 않은, 탈세포화된 조직 (non-woven, decellularized tissue), 폴리머 조성물 (polymer composition), 폴리머 구조체 (polymeric structure), 세포 성장 스케폴드 (cell growth scaffold), 임플란트 (implant), 정형외과용 임플란트 (orthopedic implant), 및 안구 내 렌즈 (intraocular lens), 봉합선 (sutures), 혈관 내 임플란트 (intravascular implants), 스텐트 (stents), 및 이식 (transplants) 을 포함한다. 어떤 실시예에서, 기질은 합성적이다. 다른 실시예에서, 기질은 자연적이다. 음향 ECM 하이드로겔은, 어느 적절한 방법으로, 붕대, 봉합선, 임플란트, 예를 들어, 보철 (prosthesis), 인공적으로 또는 달리-수정된 혈관, 밸브, 안구 내 렌즈, 또는 조직 임플란트의 세라믹, 금속, 또는 폴리머 임플란트와 같은, 짜지 않은 재료 (non-woven material)에 적용되거나 또는 병합될 수 있다. 여기서 사용된 대로, "코트 (coat)", 및 "코트 된 (coated)" 및 "코팅 (coating)" 과 같은 관련된 어원이 같은 용어는 여기서 서술된 조성물로 무기물 구조를, 부분적으로 또는 전체적으로, 덮는 것을 포함하는 과정이다. 예를 들고 및 제한 없이, 무기물 구조물을 음향 ECM 하이드로겔로, 액체 상에서, 코팅하기는 쏟아붓기 (pouring), 박기 (embedding), 층으로 하기 (layering), 담그기 (dipping), 분무하기 (spraying)와 같은 방법이 포함될 수 있다.
다른 실시예에서, 음향 ECM 하이드로겔을 포함하는 조성물은, 액체 상에서, 금속, 칼슘 하이드록사이드 (calcium hydroxide), 칼슘 포스페이트 (calcium phosphate) 또는 칼슘 카보네이트 (calcium carbonate) 와 같은 무기 칼슘 화합물, 또는 세라믹 조성물 (ceramic composition)과 같은, 생체 적합한 구조물 재료에 코팅된다. 적절한 금속의 비-제한적인 실시예는 코발트-크롬 합금 (cobalt-chrome alloys), 스테인레스 스틸 합금 (stainless steel alloys), 티타니움 합금 (titanium alloys), 탄탈륨 합금 (tantalum alloys), 티타늄-탄탈륨 합금 (titanium-tantalum alloys) 들이며, 이는, 제한 없이, 여러 가지 등급의 CP Ti ((상업적으로 순수한 티타니움 (commercially pure titanium)) 또는 Ti 6A1 4V (90% wt. Ti, 6% wt. Al 및 4% wt. V), 스테인레스 스틸 316 (stainless steel 316), 니티놀 (Nitinol) ((니켈-티타늄 합금 (Nickel-titanium alloy)), 하이드록시아파타이트 (hydroxyapatite)로 코팅된 티타늄 합금 (titanium alloys)을 포함하는, 몰리브데늄 (molybdenum), 탄탈륨 (tantalum), 니오븀 (niobium), 지르코늄 (zirconium), 철 (iron), 망간 (manganese), 크로뮴 (chromium), 코발트 (cobalt), 니켈 알루미늄(nickel aluminum) 및 란타늄 (lanthanum) 과 같은, 비-금속적 및 금속적 성분 둘 다를 포함할 수 있다. 금속은 높은 강도, 유연성, 및 생체 적합성 때문에 유용하다. 금속은 복잡한 모양으로 형성될 수 있으며 및 많은 것이 생물학적 환경에서 부식을 견딜 수 있으며, 마모를 줄이고 및 조직에 손상을 입히지 않을 수 있다. 세라믹스, 제한 없이, 아라고나이트 (aragonite) 와 같은, 칼슘 화합물을 포함하는, 다른 조성물들. 금속, 세라믹스 및/또는 다른 재료의 조합도 또한 유용하다.
어느 유용한 제제는 동시-전달되게, 동시-적용되게 혼합될 수 있거나 또는 달리 여기서 서술된 대로 어느 조성물과 조합될 수 있다. 예를 들어, 및 제한 없이, 유용한 제제에는 인터페론 (interferon), 인터루킨 (interlinking), 케모카인 (chemokines), 모노카인 (monokines), 호르몬 (hormones), 응고제 (coagulants), 화학요법제 (chemotherapeutics) 및 항생제 (antibiotics) 가 포함된다.
사용 방법 (Methods of Use)
대식세포 (Macrophages)는 상처 후에 정상적인 치유, 및 정상적인 조직 발달에 중요한 조절자인 것으로 보여왔다. 상기 공개되는 음향 ECM 하이드로겔은 전체 ECM의 대식세포 표현형에 대한 효과를 다시 말할 수 있으며, M2-유사 (M2-like), 조절적, 또는 친-리모델링 대식세포 (pro-remodeling macrophages) 의 증가를 초래한다. 그러므로 여기서 서술된 조성물 어느 것도, 조절적 M2 대식세포를 유도하기 위한 것과 같은, 대식세포 표현형을 수정하는데 사용될 수 있다.
어떤 실시예에서, 여기서 서술한 대로, 음향 ECM 하이드로젤은 포함하는 조성물의 치료적으로 효과 있는 양을 개체에 투여하여 M2 대식세포를 유도하고, 이로써 개체에서 M2 대식세포를 유도하는 방법이 공개된다. 추가 실시예에서, 개체에서 M1 ((친염증성)(proinflammatory)) 대식세포를 감소시키는 방법이 공개된다. 그 방법은 치료적으로 효과 있는 양의 음향 ECM 하이드로젤을 투여하고, 이로써 개체에서 M1 대식세포를 억제하는 방법이 포함된다. 이 개체는, 인간 및 수의과적 개체를 포함하는, 관심 있는 어느 개체가 될 수 있다.
공개되는 음향 ECM 하이드로겔은 개체에서 병변부위에 지혈을 증가시킨다. 그러므로 응고를 가속화시키고 및/또는 상처의 출혈 시간을 감소시키는 방법이 또한, 공개된다. 어떤 실시예에서, 지혈은 음향 ECM 하이드로겔을 개체에 투여한 후, 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100초와 같은, 약 10에서 약 100초 내에 유도된다.
어떤 실시예에서, 치료적으로 효과적인 양의 음향 ECM 하이드로겔은 지혈을 유도하기 위하여 개체에 있는 한 부위에 국부적으로 투여될 수 있다. 개체는 상처를 가질 수 있다. 상처는 외부적인 상처, 또는 환자의 외부로부터 보이지 않는 내부적 상처일 수 있다. 공개되는 음향 ECM 하이드로겔은 어느 타입의 상처에도 지혈 제제로서 유용하다. 그 방법에는 어느 상처가 있는 개체와 같은, 관심 있는 어느 한 개체의 선택을 포함할 수 있다.
도 10에서 보여준 대로, 음향 ECM 하이드로겔은 응고 시간을 감소시킨다. 응고는 이 분야 기술 전문가가 아는 어느 방법으로 측정될 수 있다. 이 및 화이트 시험관 방법(Lee and White test tube method) 에서, 정맥 혈액을 세 개의 시험관에 넣고, 워터 베스 (water bath)에서 37℃로 유지시킨다. 응고 시간은 첫 번째 시험관 및 그 후 두 번째 시험관을 1분 간격으로 기울이고 및 차례로 이들이 각각 단단한 응고가 형성된 시간을 기록하고, 및 그 후 세 번째 시험관에서 피의 응고를 검출하여 응고 시간을 측정하여 결정한다. 모세관 시험관 방법(capillary tube method) 에서는, 유리 모세관을 손가락 구멍으로부터 나온 혈액으로 채운다. 모세관의 짧은 조각을 정규적인 간격으로, 잘린 모세관 부분 사이에 혈액 응고가 나타낼 때까지 자른다. 응고가 나타나는 것을 결정하는 다른 방법은 혈액응고기능항진 방법 (thromboelastogram method) 이다. 이 방법에서, 점성을 감지하기 위하여, 혈액 또는 혈장 샘플에서 움직이는 포크 (fork) 가 사용되며, 이는 응고 시점에 증가한다. 응고가 일어나는 것을 기록하는 더 나아간 방법은 혈액 혈장 샘플이 혈액으로부터 분리된 후 이의 반투명성을 모니터하는 것이다. 응고가 나타나면 샘플은 불투명해진다.
어떤 실시예에서, 염증 또는 상처를 지닌 개체를 치료하는 방법을 공개한다. 이 방법에는 치료적으로 효과적인 양의 음향 ECM 하이드로겔을 염증 또는 상처에 국부적으로 적용하는 것을 포함한다. 어떤 비-제한적인 실시예에서, 개체는, 이것에만 제한하지 않으나, 궤양성 대장염 (ulcerative colitis) 또는 류머티스성 관절염 (rheumatoid arthritis) 과 같은, 염증성 장애를 갖고 있다. 이 방법은 조직 표면에 ECM 하이드로겔을 적용하는 것을 포함할 수 있다. 다른 비-제한적인 실시예에서, 개체는 기관 이식 수여자 (organ transplant recipient), 이식 편대 숙주질환 (graft versus host disease)을 가진 개체, 심근 경색을 가진 개체, 또는 이것에만 국한하지 않으나, 수술적인 상처 또는 비-수술적인 외상성 상처와 같은, 상처를 가진 개체이다. 그러므로 공개되는 것은 이를 필요로 하는 개체에서 상처 치유를 가속화하고 및/또는 지혈을 증가시키는 방법으로, 여기서 공개된 대로, 음향 ECM 하이드로겔을 포함하는 치료적으로 효과적인 양의 조성물의 투여를 포함한다. 투여는, 상처 또는 이식 부위로와 같은, 국부적일 수 있다.
하이드로겔은 지혈을 증가시키고 및/또는 상처 치유를 증가시키기 위하여 어떠한 상처 부위에도 적용될 수 있다. 상처는 피부에 있는 상처, 또는, 이것에만 국한하지 않으나, 눈을 포함하는 어느 표면의 상처일 수 있다. 허혈 및, 정맥 순환시스템 회귀의 손상 및/또는 부족이 원인이 되어 생긴 만성 정맥 다리 궤양 (chronic venous leg ulcers)과 같은, 허혈성 부상의 결과로부터 오는 상처를 위한 방법이 또한 제공된다. 그러므로 본 방법은 국부적 피부 또는 눈으로의 투여에 사용할 수 있다. 일반적으로, 이 적용에서, 조성물은 국부적 투여를 위하여 제조된다. 하이드로겔은 어느 기관의 조직 표면에 적용될 수 있다.
피부 상처와 같은, 상처를 치유하기 위한 국부적 조성물이 여기서 제공된다. 치유할 만한 이 상처들은 표피 상이거나 또는 깊은 상처일 수 있으며 및 피부 (skin)의 피부 (dermis) 및 외피의 (epidermis) 손상이 관여한다. 상처는 외과수술적인 상처가 될 수 있다. 그러므로, 개체에서 상처 치유를 촉진하고, 및/또는 개체에서 혈액 응고 (지혈 증가)를 촉진하기 위한 방법이 제공된다.
음향 하이드로겔은, 예를 들어 시트 (sheet), 플러그 (plug), 또는 드레싱 (dressing)의 일부 또는 반창고와 같은 국부적 제제로서, 타겟 부위에 직접 적용할 수 있다. 반창고 및 상처 드레싱은 음향 ECM 하이드로겔을 함유할 수 있다. 이들은 음향 ECM 하이드로겔을, 겔 또는 액체 상에서, 어느 다른 바람직한 첨가제와 함께, 반창고 또는 상처 드레싱에 적용하여 제조될 수 있다. 이들, 시트 (sheets), 플러그 (plugs), 반창고 (bandages) 또는 드레싱 (dressings)은 응고시간을 감소시키고 및 또는 상처 치유를 증가시키기 위하여 사용될 수 있다. 음향 하이드로겔은, 상처 치유를 촉진하기 위하여, 예를 들어, 겔상에서 고체로서 타겟 부위에 주사로 투여될 수 있거나, 또는 투여하기 전에 온도를 약 37o C 이상으로 올릴 수 있어 하이드로겔이 액체 상에서 투여될 수 있다.
상처 치료에 사용을 위해 및 또는 지혈을 증가시키기 위해, 음향 ECM 하이드로겔은 보통 상기에 서술된 범위의 농도를 가질 것이다. 음향 ECM 하이드로겔은 한 번 적용될 수 있다. 다른 한편으로, 음향 ECM 하이드로겔은 환부에, 예를 들어, 상처의 성질에 따라, 약 3일에서 14일의 기간에 걸쳐와 같이, 전형적으로 매일 1번에서 10번, 주기적으로 적용될 수 있다. 어떤 경우에, 조성물을 무기한으로 적용하는 것이 바람직할 수도 있다
음향 ECM 하이드로겔은 지혈 및 상처 치유 비율에 영향을 준다. 어떤 실시예에서, 이 조성물은, 표준 값, 처치 없이 달성된 상처 치유 또는 지혈의 비율, 또는 효소 방법에 의해 생산된 ECM 하이드로겔로 처치와 같은, 대조군에 비교하여, 지혈 및/또는 상처 치유를 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 200% 증가시킨다.
음향 ECM 하이드로겔은 또한, 외과적 수술 및 다른 의도적인 중재의 치료에 사용될 수 있으며 여기서 조성물은 수술 완료 후 바로 적용될 수 있다. 상처 치유를 촉진하는 방법, 및 수술적 상처, 절개 상처, 피부 및 외피의 손상을 포함하는 깊은 상처, 눈 조직 상처, 치아 조직 상처, 구강 상처, 당뇨성 궤양, 피부 궤양, 팔꿈치 궤양 (cubitus ulcers), 동맥 궤양 (arterial ulcers), 정맥 정체 궤양 (venous stasis ulcers), 및 열에 노출 또는 화학 약품으로 인한 화상을 포함하는, 상처 부위에서 지혈을 증가시키기 위한 방법들이 제공된다.
개체는, 인간 또는 어느 수의과적 개체를 포함하는, 관심 있는 임의의 어느 포유류일 수 있다. 개체는 어린이 또는, 젊은이, 중년, 또는 노인 개체와 같은, 성인 개체일 수 있다. 인간에서, 성인 개체는 나이가 18세보다 크며, 젊은 성인은 약 18세에서 약 35세까지의 나이이고, 중년 성인은 일반적으로 약 35세에서 약 55세까지의 나이이며, 및 고령(elderly) ((또는 노인 (aged)) 인간 개체는, 60세 이상, 65세 이상, 70세 이상, 75세 이상 또는 80세 이상과 같은, 약 55세 이상이다.
개체는 정상 속도로 상처를 치유할 수 있거나 또는 치유 장애일 수 있다. 여러 가지 고통 및 컨디션이 치유 장애의 결과가 될 수 있다. 이들에는 당뇨병 ((제2형 당뇨병 (Type II diabetes mellitus)과 같은)), 스테로이드 및 다른 약리학적 제제로 치료, 및 허혈성 장애 또는 부상 (말초 혈관 질환 또는 치명적인 혈관 폐색에서처럼)이 포함된다. 비정상적인 상처 치유를 유도하는 컨디션은, 이것에만 국한하지 않으나, 요독증 (uremia), 영양실조, 비타민 부족, 비만, 감염, 면역억제 및 스테로이드, 방사선 치료, 및 항종양 약물 및 항대사제로 전신 치료 (systemic treatment) 와 연관된 합병증을 포함한다. 상처 치유를 손상하는 것으로 나타난 스테로이드에는 코티손 (cortisone), 하이드로코티손 (hydrocortisone), 덱사메타손 (dexamethasone), 및 메틸프레드니졸론 (methylprednisolone) 이 포함 된다. 옥트레오티드 아세테이트 (octreotide acetate) 와 같은 비-스테로이드 화합물도 또한, 상처 치유를 손상하는 것으로 나타났다 (Waddell et al., Am. Surg. 63:446 449, 1997).
개체는 응고 장애를 가질 수 있거나, 또는, 이것에만 국한하지 않으나, 와파린 (warfarin) 또는 PLAAVIX®와 같은, 항응고제로 치료 중 일 수 있다. 개체는 인자 (Factor) II, V, VII, X, 또는 XII 결핍을 가질 수 있다. 개체는 혈우병 A (hemophilia A), 혈우병 B (hemophilia B), 본 윌리브랜드 병 (von Willebrand's disease), 피브리노겐 (fibrinogen), 또는 프로트롬빈 ( prothrombin) 의 결핍 또는 구조적 기형을 가질 수 있다. 그러므로 어떤 실시예에서, 이들 개체들은 치료를 위해 선택된다.
상처 배드 (wound bed)에 피부 이식의 부착을 증가시키고 및 상처 배드로부터 재-상피화 (re-epithelialization) 를 자극 시키는 방법이 여기서 제공된다. 이식의 타입에는, 이것에만 국한하지 않으나: 자가 피부이식 (autologous skin graft), 인공 피부 (artificial skin), 동종이식 (allografts), 자기피부 이식 (autodermic graft), 자기피부 이식 (autoepidermic grafts), 무혈관 이식 (avascular grafts), 블레어-브라운 이식 (Blair-Brown grafts), 뼈 이식 (bone graft), 브레포프라스틱 이식 ( brephoplastic grafts), 진피 이식 (cutis graft), 지연 이식 (delayed graft), 진피 이식 (dermic graft), 표피 이식 (epidermic graft), 근막 이식 (fascia graft), 전층피부 이식 (full thickness graft), 이종 이식 (heterologous graft), 이종 이식 (xenograft), 동종 이식 (homologous graft), 과다형성 이식 (hyperplastic graft), 층판 이식 (lamellar graft), 그물 피부이식 (mesh graft), 점막 이식 (mucosal graft), 올리어-티어리쉬 이식 (Ollier-Thiersch graft), 오멘팔 이식 (omenpal graft), 패치 이식 (patch graft), 경상 이식 (pedicle graft), 관통 이식 (penetrating graft), 스필트 피부이식 (split skin graft), 후층피부이식 (thick split graf) 이 포함 된다. 방법은 개체에게 여기서 공개된 조성물의 치료적으로 효과적인 양을 이식에 투여하는 것을 포함하며, 이로써, 이식의 부착 및 수용을 증가시키고 및 박테리아의 성장을 조절하거나 또는 제거한다. 어떤 실시예에서, 이 조성물로 처치된 세포 또는 조직을 개체에 이식한다. 한 특정한, 비-제한적인 실시예에서, 이 조성물은, 피부 이식과 같은, 이식에서, 이식하기 전에 투여한다.
찰과상 또는 화학적 상처로 인한 수포나 화상을 치료하기 위한 방법도 또한 제공된다. 이 방법들에는 피부 또는 내부 기관의 치료를 포함한다. 이 방법들에는, 예를 들어, 화학요법제로 치료 때문이거나 또는 사이클로포스파미드 (cyclophosphamide)로의 치료 때문인, 난소 상해; 방사선조사- 또는 화학요법으로-유도된 방광염 (cystitis); 또는 고-용량 화학요법으로-유도된 장내 상처 (intestinal injury)를 포함한다. 이 방법에는 수포 또는 화상의 치유를 촉진하고 및 박테리아의 성장을 감소시키거나 또는 제거시키기 위하여 개체에게 여기서 공개되는 대로 치료적으로 효과적인 양의 조성물의 투여를 포함한다.
개인에서 수술 과정에 의해 원인이 되는 연결 부위 (anastomotic) 및 다른 상처의 치유를 촉진하기 위한 방법이 제공된다. 이 방법들에는, 연결부위- 또는 다른 외과적 수술 후 및/또는 동안에, 여기서 공개되는 조성물의 치료적으로 효과적인 양의 투여를 포함한다. 연결 (Anastomosis)은 두 개의 튜브 구조(tubular structures)를 연결하는 것이다, 예를 들어, 장의 중간 부위가 제거되고 및 장관을 다시 재생시키기 위하여 남은 부분이 서로 연결되는 것이다. 피부 치유와는 달리, 연결 상처의 치유 과정은 일반적으로 보기가 애매하다. 더 나아가, 상처 치유는, 적어도 위장관 내에서는, 합병증 없이 빨리 일어난다; 그러나, 합병증은 가끔 추가의 수술로 정정되어야 한다 (Thornton and Barbul, Surg. Clin. North Am. 77:549 573 (1997)). 이 방법에는 연결 상처 치유를 필요로하는 개체의 선택을 포함할 수 있다. 이 개체는 상기 컨디션 중 하나 때문에 상처 치유가 손상된 개체이거나, 또는 상기 리스트 된 컨디션 중 아무것도 가지고 있지 않은 개체와 같은, 정상적인 상처 치유를 가진 개체일 수 있다.
공개되는 ECM 하이드로겔은 실온에서는 고체 상이고, 및 약 37℃에서는 액체 상 쪽으로 전이한다. 그러므로, 어떤 실시예에서, 개체에 적용한 후에, 하이드로겔이 체열로부터 따듯해짐으로 시간이 감에 따라 음향 ECM 하이드로겔은 고체 상에서 액체 상으로 전이될 것이다. 어떤 실시예에서, 이 방법에는, 액체 상에서 씻어 낼 수 있는, 음향 ECM 하이드로겔을 제거하기 위하여, 상처의 세척을 포함한다.
어떤 실시예에서, 음향 ECM 하이드로겔은 멸균이 되도록 한다. 멸균은 본 발명의 음향 ECM 하이드로겔이 병원균으로부터 오염을 충분히 제거하도록 확실히 하고 및 인간 또는 동물의 신체에 이식하는 것과 같은, 의료상 용도에 적합하도록 하기 위하여 중요하다. 이 분야 기술에서 알려진 다른 멸균 방법이 또한 적절할 수도 있으나, 본 발명의 음향 ECM 하이드로겔의 멸균에는 감마 방사선조사, 에틸렌 옥사이드 (ethylene oxide), 초임계 이산화탄소 (supercritical CO2), 하이드로겐 퍼옥사이드 가스 플라즈마 (hydrogen peroxide gas plasma), 또는 오존(ozone) 이 적절할 수 있다. 여기서 보여준 대로, 본 발명의 음향 ECM 하이드로겔이 감마 멸균되었을 때 이의 단단함이 유지되므로 감마 멸균은 수용할만한 멸균 방법이다. 한 실시예에서, 음향 ECM 하이드로겔은 ECM 용액이 겔을 형성하기 전에 멸균되게 한다, 예를 들어, 액체에 있는 ECM은 초음파 분해 이전에, 또는 초음파 분해 후 겔이 형성되기 전에 멸균될 수 있다. 다른 실시예에서, 음향 ECM 하이드로겔은 겔이 형성된 후에 감마 멸균되게 한다. 어떤 실시예에서, 음향 ECM 하이드로겔은 겔 형태로 남아 있거나, 또는 감마 방사선조사에 의해 멸균된 후에 겔을 형성할 수 있다.
반면에, 효소적으로 생산된 하이드로겔에서, 감마 방사선조사는 조성물을 불안정하게 만든다. 그러므로 감마 방사선조사 후에는 겔이 형성되지 않거나, 또는 불안정하게 된다.
점막 하부의 쿠션으로서의 음향 하이드로겔 (Acoustic ECM Hydrogels as a Submucosal Cushion)
내시경술 (endoscopy)은 외과적인 수술을 적용하지 않고 내시경이라고 불리는 기기를 통해 움푹 꺼진 기관의 내부 또는 신체의 구멍을 조사하도록 하는 과정이다. 내시경술은 출혈하는 혈관의 지짐 (cauterization), 폴립 (polyps), 선종 및 작은 종양 제거, 생체검사 수행 또는 외부 물체 제거와 같은 수술 과정에 사용될 수 있다. 내시경술 과정은 위장관 내, 호흡기관, 귀, 요로, 여성 생식기 시스템에서 및, 작은 절개를 통하여, 배 또는 복강 (pelvic cavity)과 같은 정상적으로는 닫힌 신체 구멍 ((복강경 검사법 (laparoscopy)), 관절의 내부 ((관절경 검사 (arthroscopy)) 및 가슴의 기관들 ((융강경 검사 (thoracoscopy) 및 종격내시경술( mediastinoscopy))에서 수행될 수 있다. 내시경술은 상부 위장관 내 또는 하부 위장관 내에서 수행될 수 있다. 내시경은, 진단 또는 치료 목적으로 움푹 꺼진 기관의 내부 또는 일부(방관, 식도, 위 또는 장과 같은)를 보기 위한, 조명이 된, 통상적으로 광 섬유인, 유연하거나 또는 뻣뻣한 튜브 형태의 기기이며, 이는 기기 (겸자, 전기수술 칼, 내시경 주사바늘 또는 가위와 같은)의 통과가 가능하도록 또는 생체 시료 제거를 촉진하기 위하여 전형적으로 하나 또는 그 이상의 작업 찬넬 (working channels)을 가지고 있다. 이는 적절한 램프 및 이미지 장치가 이의 먼 쪽 부위 (distal portion)에 포함되어 있으며, 및 입, 항문, 귀, 코와 같은 신체에 자연적으로 존재하는 열린 곳 또는 작은 수술적인 절개를 통하여 삽입될 수 있다. 내시경적 수술 과정을 통해 검사될 수 있는 신체의 기관 또는 구멍이 다양한 것을 감안하면, 예를 들어, 후두경 (laryngoscope), 융강경 (thoracoscope), 혈관현미경 (angioscope), 결장경 (colonoscope), 소장내시경 (enteroscope), S자 결장경(sigmoidoscope), 직장경(rectoscope), 직장경 (proctoscope), 항문경 (anoscope), 관절경(arthroscope), 비경 (rhinoscope), 복강경(laparoscope), 자궁내시경 (hysteroscope), 뇌관찰경 (encephaloscope), 신장경 (nephroscope), 식도경ehsophagoscope), 기관지경 (bronchoscope), 위내시경 (gastroscope), 양막 내시경(amnioscope), 방광경(cystoscope)과 같은, 여러 타입의 특정한 내시경이 존재한다.
내시경적인 과정은 상부 및 하부 위장관을 포함한 위장관에 널리 적용된다. 예를 들어, 내시경적인 과정은 위장관 구멍을 덮고 있는 점막을 검사하기 위하여, 및 염증성 조직 (inflammatory tissue), 폴립 (polyps), 가-폴립 (pseudo-polyps), 톱니모양의 병변부위 (serrated lesions), 아데노마 (adenomas), 궤양 (ulcerations), 형성장애 (dysplasias), 종양 전 (pre-neoplastic) 및 신생 종양 (neoplastic) 형성, 및 종양 (tumors)과 같은, 작은 및 큰 병리적 병변부위를 검출하기 위하여, 사용될 수 있다. 내시경적인 과정은 생체 검사 및 병리적 병변부위 (폴립, 아데노마, 형성장애, 종양 전 및 신생 종양 형성, 종양)의 제거를 위하여 사용될 수 있다. 수술적인 중재에는 위장관 내시경술에서 병리적 병변을 제거하기 위하여 보통 사용되는 두 가지 타입의 내시경적 절제 과정이 포함된다: 내시경적 점막절제 (endoscopic mucosal resection) (EMR) 및 내시경적 점막 하부 절개 (endoscopic submucosal dissection) (ESD). 이들 두 기술은 위장관 폴립, 아데노마, 형성장애, 및 림프-결절 전이의 최소한의 위험이 관련되는 초기-단계 암의 최소한의 침습 치료 (minimally invasive treatment)를 하게한다.
개체의 기관의 한 부분의 근육조직으로부터 점막 및 점막 하부를 해부하는 방법이 여기에 공개된다. 기관은 위장관, 예를 들어, 식도, 십이지장, 위, 소장, 대장 (결장) 또는 직장 (rectum) 이 될 수 있다. 기관은 방광, 구강-호흡기 시스템 ((폐, 목(인두), 혀, 콧구멍, 부비강(sinus)), 피부, 또는 자궁 및 질 관이 될 수 있다. 특별한 조직의 예에는 호흡기 상피, 코 상피, 피부 또는 상피 조직 및 자궁 상피가 있다. 한 예시적인 기관은 식도이다. 다른 예시적인 기관은 결장이다. 이 방법은 점막 및 점막 하부를 가진 어느 기관에서도 유용하며, 여기서 악성 또는 악성 전 병변부위와 같은, 표피 상의 병변이 형성될 수 있다.
EMR은 위장관 ((gastrointestinal (GI) tract))의 표피층 (점막 및 점막 하부) 에 한정된 무경 (sessile) 또는 평평한 종양을 제거하기 위하여 개발된 내시경적 기술이다. EMR은 전형적으로 2cm 미만의 작은 병변부위 또는 더 큰 병변부위를 조금씩 제거하기 위하여 사용된다. EMR은 또한 절개된 시료의 정확한 병리적 단계를 평가하는데 주요한 역할을 한다. 폴립절제술 (polypectomy)과는 반대로, EMR은 보통 정상 생리 식염수 용액 ((normal saline (NS) solution))과 같은 액체 제제를 점막 하부 층에 주사하여 병변부위를 근육층으로부터 들어올리는 것이 관련된다. EMR은 림프-절 전이의 위험도를 결정하기 위하여 정확한 조직병리학적 단계 결정을 위한 시료 채취에 또한 유용하다. EMR은 장벽 (gut wall) 점막 하부의 중간 또는 더 깊은 부분을 통과하여 잘라 냄으로써 병변이 있는 점막의 완전한 제거를 촉진한다. 여러 가지 EMR 기술이 서술되었으며 및 올가미 절제술 (snare resection)이 관련된 4가지 방법이 보통 사용된다: (1) 주사 및 절제 방법 (the inject and cut method); (2) 주사, 올림, 및 절단 방법 (the inject, lift, and cut method); (3) 뚜껑-보조가 있는 EMR (cap-assisted EMR) (EMRC); 및 (4) 결찰과 함께하는 EMR (EMR with ligation) (EMRL). 주사 및 절제 방법에서, 질병이 있는 점막은 점막 하부의 액체 쿠션을 만들어서 근육층으로부터 올려지고, 포획되고, 전기수술용 올가미를 사용하여 꽉 조여지고, 및 그 후 절제된다. 그러나 얇은 점막 하부 층으로의 주사는 섬세한 과정이고, 주사된 용액은 빨리 퍼지는 경향이 있으며, 평평하고 및 침체 된 병변부위는 돌출된 병변부위에 비교하여 올가미로 포획하기는 어려우며, 및 크고 및 이상하게 위치한 병변부위는 제거하기 어려울 수 있다 (Uraoka et al., Drug Design, Development and Therapy 2008:2 131-138). 크고 평평한 결장 폴립에 대해서는 주사-보조 된 EMR (Injection-assisted EMR)이 자주 사용된다.
내시경적인 점막 하부 절개(endoscopic submucosal dissection) (ESD) 는 더 큰 병변부위를 제거하기 위하여 특별히 개발되었다. 병변부위는 수술용 전기 칼을 사용하여 점막 하부 층을 따라 직접 잘리고, 큰 병변부위조차도 일괄 절개 (en-bloc resection)의 결과가 된다. ESD는 특정 암 단계를 치료하는 데 있어서 전통적인 수술을 대체하기를 기대한다, 그러나, 이는 전통적인 EMR보다 천공 및 출혈 합병증 비율이 더 높기 때문에, EMR보다 더 큰 정도의 내시경적 기술 및 경험이 요구된다. ESD는, 절연-팁이 있는 투열성 칼 (insulation-tipped diathermic knife), 바늘 칼 (needle knife), 갈고리 칼 (hook knife), 구부러진 칼 (flex knife), 삼각형 팁이 있는 칼 (triangle tipped knife), 수세식 칼 (flush knife), 스플래쉬 바늘 (splash needle), 및 작은 캘리버-팁 투명한 후드(small-caliber tip transparent hood)와 같은, 수많은 수술용 전기 칼을 사용할 수 있다. 이러한 칼들은 고 주파수 전기수술용 전류 (high frequency electrosurgical current) (HF EC) 발생기와 함께 사용될 수 있다. ESD는 세 단계로 특징지어질 수 있다: (1) 근육 층으로부터 병변부위를 올리기 위하여 점막 하부 쿠션을 형성하기 위한 액체의 주사; (2) 병변부위 주변 점막을 둘러싸게 절단; 및 (3) 병변부위 밑에 있는 점막 하부의 결합조직의 절개 (여기 참고 문헌으로 병합된, Kakushima et al., Wold J. Gstroenterol. 14(9): 2962-2967, 2008, 참조). 여러 가지 점막 하부 주사 용액이 이전에 개발되었으며 및 EMR 동안에 사용하는데 만족한 것으로 보였다, 그러나 좀 더 오랜 시간의 ESD 과정의 도입은 점막 하부 층을 절개하는 동안 절개하는 선의 동정을 돕기 위하여 더 오랫동안 지속하는 용액을 필요로한다 (Uraoka et al., Drug Design, Development and Therapy 2008:2 131-138). 본 공개되는 방법은 이 요구를 충족한다.
점막 하부 쿠션으로의 액체 주사는, 올가미와 같은 것으로 타겟 병변부위를 포획하기 바로 전에 제거될 조직의 분리를 촉진 시키고, 그럼으로써 열에 의한 손상 및 천공 및 출혈의 위험을 감소시키고 및 또한 절단을 촉진하기 때문에, 점막 하부 주사가 EMR에서 사용된다. 용액은 충분한 기간 동안 제 장소에 남아 있어야 하고 및 올가미 씌우기를 촉진하기 위하여 반구체 모양을 형성할 필요가 있어야 하므로, 점막 하부 주사는 EMR 과정에서 중요한 역할을 한다. 추가로, 점막 하부를 충분히 높게 올리도록 제공하는 것은 ESD 과정 동안에 점막 하부를 안전하게 절개하는 결과가 된다 (Uraoka et al., Drug Design, Development and Therapy 2008:2 131-138). 더 나아가, 이 과정으로부터 염증이 야기 되므로, 이 과정 부위에 남아 있는 어느 쿠션은 항-염증성 성질을 가지고 있어야 한다. 음향 ECM 하이드로겔은 협착을 완화하고 및 재-상피화 (re-epithelialization)를 촉진한다. 현재 공개되는 방법은 또한 이를 충족시킨다.
어떤 실시예에서, 이 공개되는 방법은 항-염증성 성질을 가지고 있는 음향 ECM 하이드로겔을 사용하며, 및 값이 비싸지 않으며, 비-독성이고, 주사하기 쉽고 및 높고, 오래-지속하는 점막 하부 쿠션을 제공한다. 이 음향 하이드로겔은 쿠션을 형성하기 위하여 주사 부위에 겔 상태로 투여된다. 이 쿠션은 과정 동안에 절개될 수 있어 얼마 간의 하이드로겔이 밑의 근육 조직에 남아 있도록 하여, 이로써 치유를 돕게 한다. 이 공개되는 음향 ECM 하이드로겔은 절개된 점막/점막 하부의 제거로 생긴 상처가 닫히는 것을 촉진한다. 어떤 실시예에서, 이 과정은 ESD이다. 다른 실시예에서, 이 과정은 EMR이다.
정상 생리 식염수 용액(NS) 및 희석제 용액 (thinner solutions) (예를 들어, ELEVIEWTM, 여기 참고문헌으로 병합된 미국특허 번호 9,226,996, 참조) 이 내시경적 절개를 위해 점막 하부 쿠션으로써 사용되었으나, 이들 용액들의 고유의 성질은, 용액을 빠르게 분산시키기 때문에, 적절한 점막 하부 쿠션을 생산하기를 어렵게 만들고, 바람직한 높이를 유지하기, 및 바람직한 위치에 쿠션을 있게 하기 어렵게 한다. 더 나아가, ESD에서, 일단 점막/점막 하부가 제거되면, 이 제제들은 밑에 있는 근육 조직에 남아있지 않을 것이다. 더 나아가, 이 제제들은, 염증을 감소시키는 것과 같은, 치유 과정을 돕지 않는다. 음향 ECM 하이드로겔의 사용은 이러한 요구를 충족시킨다.
여기서 공개된 음향 ECM 하이드로겔은 어느 ESD 또는 ESR 에서 처럼 사용될 수 있다. 여기에 참고문헌으로 병합된, 미국 특허 번호 9,364,580에서 공개된 것처럼, 내시경적 주사바늘은 길 수 (약 230까지) 있는 장치이고 및 내부에 먼 부위 주사바늘을 가지고 있는 내부 주사 튜브가 미끄러지게 제거되는 상대적으로 긴 카테터(catheter)를 포함하는 장치이다. 가까운 구동 핸들은 (actuating handle) 필요할 때 하나를 다른 것에 상대적으로 이동하기 위해 카테터 및 주사 튜브에 연결된다. 주사 튜브에 액체의 접촉은 전형적으로 핸들에 있는 리어 커넥터 (leer connector)를 통해 제공된다. 내시경 주사바늘 장치는 전형적으로 내시경의 워킹 챈넬 (working channel) 을 통해 주사 부위로 전달된다. 내시경 워킹 챈널의 루멘 (lumen) 이 손상되는 것으로부터 보호하기 위하여, 주입 바늘 장치의 핸들은 장치를 내시경으로 삽입하기 전에 먼 부위 주사바늘을 카테터 루멘으로 빼도록 조작된다. 이는 장치가 내시경의 루멘을 따라 이동할 때 주사바늘의 예리한 포인트의 노출을 예방한다. 내시경 주사바늘 장치의 먼 부위 끝은 주사 장소에 위치하여 있으며, 이의 핸들은 다시 주사바늘이 카테터의 루멘으로부터 멀리 이동하도록 조작된다. 가장 먼 위치로 전진했을 때, 주사바늘의 노출된 부분은 대략 그 길이가 4-6 mm이다.
주사 부위가 구멍이 뚫린 후에, 통상으로, 주사바늘의 핸들로 연결된 루어-록 피팅 (luer-lock fitting)을 제공하는 5ml에서 10ml 주사기에 함유된, 음향 ECM 하이드로겔이, 주사 튜브를 통해, 점막 하부 및 밑의 근육 조직 사이와 같은, 주사 부위로 전달될 수 있다.
주사바늘 및, 폴립제거를 위한 올가미(snare), 고정하는 장치 (clipping device), 생체검사 겸자 및 이와 비슷한 것과 같은, 내시경술 과정에서 흔히 사용되는 다른 부속품들은, 내시경의 하나 또는 그 이상의 특별한 챈넬, 보통 워킹 챈넬 또는 수술용 챈넬이라고 불리는, 챈넬을 통과한다. GI 내시경 술에서 사용되는 내시경의 타입에 따라 ((예를 들어, 위내시경 (gastroscope), 장내시경 (enteroscope), 결장경 (colonoscope), 십이지장경 (duodenoscope), S형 내시경 (sigmoidoscope) 및 이와 비슷한 것)), 워킹 챈넬의 내부 직경은 상당히 다를 수 있다. 그러나 GI 내시경 술에서 사용되는 가장 보편적인 내시경은 내부 직경이 약 2mm에서 약 5mm의 범위를 가진 워킹 챈넬을 가진다. 일반적으로, 내시경 부속품 생산자들은 모든 위킹 챈넬에 맞도록 된 외부 직경을 갖는 내시경 부속품들을 생산한다. 한 실시예에서, 내시경 주사바늘, 카테터의 외부 직경은, 약 1.9. 2.0, 2.1, 2.2, 또는 2.3cm 와 같은 1.9mm로부터 2.3mm의 범위이다. 그러므로 내부 주사 튜브가 외부 카테터 내에 함유된다는 것을 고려하면, 이의 내부 직경은 보통 1mm 또는 그 이하이다. 겔 또는 액체 상태의 공개되는 음향 ECM 하이드로겔은 이 카테터를 충분히 쉽게 통과할 수 있다.
주사기를 통해 일차 용기로부터 일정 부피의 하이드로겔을 빨아들이고, 적절한 부피의 상기 하이드로겔을 표피 점막 층 바로 아래에 있는 내시경의 워킹 챈넬에 삽입된 내시경 주사바늘로 주사하여, 하이드로겔을 점막 하부 층에 쏟아 부어 제자리에 있을 때 쿠션이 되게 함으로써 음향 ECM 하이드로겔은 내시경적인 절개 과정에 사용될 수 있다: 점막 표면을 올리는 것은 내시경검사자가 내시경적 과정을 수행하는 동안에 발견된 점막 병변부위를, 병변부위가 평평하고 및 그러므로 장, 식도, 또는 위 루멘과 같은, 루멘 쪽으로 돌출되어 있지 않더라도, 쉽게 절개하도록 한다. 체온에서, 음향 ECM 하이드로겔은 점액성이나 그래도 액체 상으로 전이되는 흐를 수 있는 겔이며 및 표피 점막 층 아래에 쉽게 주사될 수 있어 이 과정에서 쿠션을 형성한다. 겔-솔 (gel - sol) 전이는 시간이 걸리므로, 이 쿠션은 제 장소에 절개가 일어나기에 충분한 시간 동안 남아 있다.
이 쿠션에 적어도 하나의 염료의 존재는 내시경검사자가 점막 밑의 구조(예를 들어, 점막 하부 층 및 외부 근육 벽) 를 볼 수 있게 도와줄 수 있으며, 이로써 절개 과정을 수행하는, 내시경검사자가, 상기 언급한 구조에 손상을 입힐 수 있는 위험도를 낮춘다. 염료의 사용은 쿠션 구멍 (cushion cavity) 및 점막 기저 (mucosal basement)를 볼 수 있게 할 수 있다. 점막 표면으로부터 병변부위의 제거는 점막 상처를 일으키게 한다. 주사된 약학적 조성물의 부피에 의해 생긴 쿠션의 지속성은 내시경적 절제 과정이 다시-주사 (re-inject) 할 필요없이 수행하도록 한다. 음향 ECM 하이드로겔은 개체의 기관의, 병변부위 또는 종양과 같은, 관심 있는 부위에 점막 하부로 주사되어 점막 하부와 그 기관 부위 밑에 있는 근육 조직 사이에 쿠션을 형성한다. 이 쿠션은, 음향 ECM 하이드로겔의 일부분이 밑에 있는 근육 조직에서 유지되고 및 치유 과정에서 도움이 되도록, 절개될 수 있다.
공개되는 이 방법들은 식도에서 유용하다. 비-제한적인 실시예에서, 이 방법은 식도 육종 (esophageal carcinoma) 또는 식도로부터 아데노마 (adenocarcinoma) 를 절개하는 방법을 포함한다. 다른 비-제한적인 실시예에서, 이 방법은 바렛씨 식도 (Barrett's esophagus) 를 지닌 개체의 식도로부터 점막 및 점막 하부를 절개하는 것을 포함한다. 이들 실시예들에서, 음향 ECM 하이드로겔은 방광, 소장 점막 하부 (small intestinal submucosal), (SIS), 식도, 기도, 간 또는 피부 음향 ECM 하이드로겔일 수 있다.
공개되는 이 방법들은 다른 기관에도 또한 유용하다. 기관은, 위장관의 기관과 같은 상부 위장관 일수 있다. 이 기관은, 방광, 질 관, 또는 자궁 일수 있다. 어떤 실시예에서, 기관은 결장 (colon), 십이지장 (duodenum), 위 (stomach), 맹장 (cecum), 결장 (colon), 시그모이드 결장 (sigmoid colon), 직장 (rectum), 소장 (small intestine) 또는 대장 (large intestine) 이다. 한 비-제한적인 실시예에서, 기관은 위, 소장 또는 대장이고, 및 그 방법은 위로부터 육종 또는 아데노마를 절개하는 방법을 포함한다. 더 나아간 비-제한적인 실시예에서, 기관은 결장이고, 및 상기 그 방법은 결장으로부터 폴립 (용정) 또는 육종 (carcinoma)을 절개하는 것을 포함한다. 이 실시예들에서, 음향 ECM 하이드로겔은 방광, 소장 점막 하부, 식도, 기도, 간, 또는 피부 음향 ECM 하이드로겔이 될 수 있다.
음향 ECM 하이드로겔은, 여기서 공개된 대로, 점막 하부 쿠션으로서 적용되기 위한 겔이 되는 온도 또는 그 이하의 온도에서 유지된다.
음향 ECM 하이드로겔은 투여하기 전에, 예를 들어, 약 4 ℃ 에서 또는 약 실온에서 유지될 수 있다. 한 실시예에서, 음향 ECM 하이드로겔은, 예를 들어, 4℃로부터 37℃ 이하까지, 또는 4℃ 로부터 25℃까지의 온도에서 투여될 수 있다. 한 실시예에서, 음향 ECM 하이드로겔은 37℃ 이하의 온도에서 투여된다. 겔로서 효과적인 양의 음향 ECM 하이드로겔이 그 후 사용된다. 음향 ECM 하이드로겔은, 대략 37o C의 온도인, 개체의 조직에서 겔로서 유지된다. 한 실시예에서, 음향 ECM 하이드로겔의 겔에서 졸로의 전이는 약 37℃에서 이며, 그래서 이 하이드로겔은 체온에서 충분히 점성이 있기 때문에 점막 하부 쿠션으로서 사용될 수 있다.
어떤 실시예에서, 하이드로겔 내에 ECM 농도는 25mg/ml 에서 약 200mg/ml 이며, ECM 하이드로겔은 25mg/ml 에서 약 100mg/ml 와 같다. 다른 실시예에서, 하이드로겔에서 ECM의 농도는, 약 75 에서 약 125mg/ml과 같이, 약 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120 또는 125mg/ml과 같이, 약 50 에서 약 150mg/ml 이다. 특별한 비-제한적인 실시예에서, 하이드로겔에서 ECM의 농도 약 100mg/ml 이다.
음향 ECM 하이드로겔은 동결건조된 형태로 실온에서, 저온에서 (예를 들어 약 4℃) 또는 냉동 (예를 들어, 약 -20℃에서)에서 제공될 수 있으며, 및 개체에서 관심있는 해부상의 부위에 투여하기 바로 전에 재구성될 수 있다.
공개되는 이 방법은, 인간 및 수의과의 개체를 포함하는, 어느 개체에서도 유용하다. 개체는 어느 나이일 수 있다. 개체는 성인 또는 청소년일 수 있다. 한 실시예에서, 음향 ECM 하이드로겔을 포함하는 조성물은 기관에 있는 타겟 조직에 주사하여 쿠션을 형성하도록 하고 이는 그 후 선택적으로, 절개 과정과 같은, 내시경적 수술 과정 (endoscopic surgical procedure)을 거치게 된다. ECM은 치료될 개체와 같은 종으로부터 얻어질 수 있거나, 또는 다른 종으로부터 얻어질 수 있다. 어떤 실시예에서, 개체는 인간이고, 및 음향 ECM 하이드로겔은 인간 또는 돼지 ECM으로부터 유래한다. 다른 실시예에서, ECM 하이드로겔은 비-인간 영장류, 개, 고양이, 말, 또는 소로부터 유래한다. 음향 ECM 하이드로겔은 또한, 상업적인 소스로부터 일 수도 있다. 음향 ECM 하이드로겔은, 어떤 실시예에서, 이것에만 국한하지 않으나 돼지 또는 인간 조직과 같은, 어느 임의의 포유류 조직으로부터 유래할 수 있으며, 및 어떤 비-제한적인 실시예에서, 방광, 소장, 또는 식도로부터 유래할 수 있다. 상기 공개된, 어느 소스 조직으로부터 유래한, 어느 음향 ECM 하이드로겔은 점막 하부 쿠션으로서 사용될 수 있으며, 및/또는 공개되는 어느 방법에서도 사용될 수 있다. 음향 ECM 하이 드로겔은 식도 음향 ECM 하이드로겔 또는 방광 음향 ECM 하이드로겔일 수 있다.
이 방법들은 개체의 내장 기관의 한 부위로부터의 근육 조직으로부터 점막 및 점막 하부를 절개하는 주사가 필요하므로, 이 공개되는 방법들은 침습성이다. 어떤 실시예에서, 음향 ECM 하이드로겔은, 위장관의 기관과 같은, 식도와 같은, 기관의 표면에는 적용되지 않는다. 이 공개되는 방법은 식도에서 사용될 수 있으나, 다른 조직에도 또한 사용될 수 있다.
여기서 공개되는 임의의 어느 방법들은 개체의 기관에 음향 ECM 하이드로겔을 포함하는 약학적 조성물을 점막 하부로 주사하여 점막 하부 및 그 기관 부위 밑에 있는 근육 조직 사이에 쿠션을 형성하도록 하는 방법을 포함할 수 있다. 적절한 음향 ECM 하이드로겔이 상기에 공개된다. 음향 ECM 하이드로겔은 겔화되고 및 밑에 있는 근육 조직으로부터 점막 및 점막 하부를 절개하고 및 개체의 그 기관 부위의 염증을 억제한다. 겔로서의 음향 하이드로겔은 내시경적으로 또는 카테터 (catheter) 를 통해 투여될 수 있다. 어떤 실시예에서, 기관은 식도, 결장, 위 맹장, 결장, 시그모이드 결장 (sigmoid colon), 직장, 소장 또는 대장이다. 음향 ECM 하이드로겔은, 겔로서 또는 졸로서, 내시경적으로 또는 카테터를 통해 또한 투여될 수 있다. 추가 실시예에서, 음향 ECM 하이드로겔은 방광, 소장 점막 하부, 식도, 기도, 간 또는 피부 음향 ECM 하이드로겔 일 수 있다. 어떤 실시예에서, ECM은 인간 조직으로부터 일 수 있다. 다른 실시예에서, ECM은 돼지 조직으로부터 일 수 있다.
어떤 실시예에서, 절제 과정 (resection preocedure)은 내시경적 점막 절제 또는 식도의 내시경적 점막 하부 절개 (dissection)이고, 및 이 방법은 식도로부터 식도 육종 (esophageal carcinoma) 또는 아데노카르시노마 (adenocarcinoma)를 절개 하는 방법을 포함한다. 좀 더의 실시예에서, 이 방법은 이형성증 (dysplasia) 을 가지고 있는 환자의 식도로부터 점막 및 점막 하부의 절개를 포함한다. 좀 더의 실시예에서, 이 방법은 바렛씨 식도 (Barrett's esophagus)를 가지고 있는 개체의 식도로부터 점막 및 점막 하부의 절개를 포함한다.
어떤 실시예에서, 절제 과정은 내시경적 점막 절제 또는 내시경적 점막 하부 절개이다. 추가 실시예에서, 기관은 위, 소장 또는 대장이고, 및 이 방법은 결장으로부터 폴립 (polyp), 육종 (carcinoma) 또는 아데노카르시노마 (adenocarcinoma)를 절개하는 방법을 포함한다. 좀 더의 실시예에서, 이 방법은 이형성증 (dysplasia) 을 갖고 있는 환자의 기관으로부터 점막 및 점막 하부의 절개를 포함한다. 특별한 비-제한적인 실시예에서, 이 방법은 결장으로부터 폴립 또는 육종의 절개를 포함한다.
이 방법은 또한 쿠션에서 내시경적 절제 과정을 수행하는 것을 포함한다. 어떤 실시예에서, 이 방법은 하이드로겔이 식도의 밑에 있는 근육 조직에 남아있도록 쿠션을 나누고 및 점막 및 점막 하부가 식도 부위로부터 제거되는 것을 포함한다. 어떤 비-제한적인 실시예에서, 밑의 근육 조직에 남아 있는 하이드로겔 쿠션의 한 부분은 식도에서 친-염증성 대식세포 활성을 하향조절한다.
본 공개는 하기의 비-제한적인 실시예들로 분명히 보여준다.
실시예(EXAMPLES)
현재는, ECM으로부터 하이드로겔을 생산하는 방법에는 ECM 재료를 산성 프로테아제 (acid protease)로 산성 용액에서 소화시키고 ((Feyetes, Biomaterials 29 (11) 1603-7;Voytik-Harbin, Tissue Engineering 4 (2)(1998) 157-174)), α-아밀레이즈 소화를 사용하여 ECM 폼(form)을 생산하고 (Kommuller et al., JoVe (Journal of Visualized Experiments)(122)(2017) e55436); 또는 교란성 추출 버퍼 (chaotropic exrtraction buffer)의 사용 및 오랫동안의 투석 과정의 사용이 관여된다 (Uriel, Tissue Eng. Part C Methods 15 (3) (2009) 309-21; Uriel, Biomaterials 29 (27) (2008) 3712-9). 그러한 방법에 따라 만들어진 ECM은 불가피하게 단백질 분해 및 변성이 되게 되고 이는 ECM 분자의 전장 보체 (full complement of ECM molecule) 및 조직 특이적인 ECM 성분의 생물학적 활성을 약화 시킬 수 있다. 더 나아가, 효소-기반을 둔 ECM 하이드로겔 생산 방법은 ECM 성분의 충분한 용해를 달성하기 위하여 24-72 시간 범위의 오랜 배양시간을 요구하며, 및 소화를 위해 외부 유래 효소의 첨가를 필요로 한다 (Saldin et al., Acta Bioamter 49 (2017) 1-15;Spang et al., Acta biomaterialia 68 (2018) 1-14). 효소적인 소화를 사용하여 제조된 ECM 하이드로겔은 제한적인 농도-의존적인 유동성 성질에 의해 또한, 방해를 받는다 (Saldin et al., supra, 2017). ECM 하이드로겔의 전적인 임상적 잠재성을 인식하여, ECM 하이드로겔이 산성 또는 알칼리성 용액, 프로테아제 소화, 또는 화학적인 추출 및 투석의 사용 없이 빠르게 형성될 수 있는 근본적으로 다른 접근 방법이 개발되었다.
공개되는 것은 초음파 공동화 (ultrasonic cavitation)를 사용하여 음향 ECM 하이드로겔을 생산하는 방법, 및 이들 음향 ECM 하이드로겔의 점 탄성 성질, 세포적합성 및 생체 활성을 규명하는 것이다. 어떤 실시예에서, 가루로 만든 ECM을 시작 재료로서 사용하여, 이 방법은 ECM을 중성으로 버퍼 된 생리 식염수 용액에 재현탁시키고 이어서 20kHz 초음파 주파수 (ultrasonic frequency)를 사용하여 녹이는 것이 관여된다. ECM 용액을 빠르게 겔화하는 것은 ECM 용액의 온도를 25℃ 이하의 온도로 감소시켜 유도할 수 있다. 겔화 시간 및 ECM 겔 성질은 ECM 농도, 및 초음파 분해 진폭 및 시간을 조정하여 쉽게 조율할 수 있다. 일단 중합되면, ECM 겔은 4℃ 에서 37℃의 온도 범위에서 안정적이다. 더 나아가, 이 방법을 사용하여 제조된 ECM 하이드로겔은 생체 적합하고 및 아래쪽에 건설적인 조직 리모델링을 증진시키는 M2-유사, 친-리모델링 대식세포 형질 (pro-remodeling macrophage phenotype) 을 촉진할 수 있다 ((Hussey et al., Nature Reviews Materials, 3:159-173 (2018)). 이 방법들은, 다른 성질을 갖는 하이드로겔을 생산하는 전통적인 효소적인 방법에 비해 음향 ECM 하이드로겔의 대규모 스케일 제조를 위한 유리한 점을 제공한다. 지금 공개되는 방법에 의해 생산되는 음향 ECM 하이드로겔은 조직 공학에서 및 재생산 의학-기반한 임싱적 적용에 사용될 수 있다,
실시예 1
재료 및 방법 (Materials and Methods)
피부 ECM의 제조: 피부 ECM은 이전에 서술된 대로 제조되었다 (Reing JE, et al. Biomaterials. 2010; 31(33):8626-33). 간략하게, 전체-두께 피부 (full-thickness skin)를 시장성 (~110kg) 돼지 ((market-weight(~110kg) pigs)) (Tissue Source Inc.) 로부터 수확하고, 및 피하 지방 (subcutaneous fat) 및 표피 (epidermis)는 기계적인 판 분리 (delamination)로 제거되었다, 이 조직은 그 후 0.25% 트립신(Thermo Fisher Scientific)으로 6시간 동안, 70% 에탄올로 10시간 동안, 3% H2O2로 15분 동안 처치하고, 추가의 16시간 동안 용액 교환과 함께 0.26% EDTA/0.69% 트리스 (tris)에 있는 1% 트리톤 X-100 (Triton X-100) (Sigma-Aldrich)으로 6시간 동안 처치, 및 0.1% 퍼아세틱 에시드 (peracetic acid)/4% 에탄올 (Rochester Midland) 로 2시간 동안 처치하였다. 각 화학물 교환 사이에 물 세척이 수행되었으며 최종 단계 후에 물과 인산염-버퍼 된 생리 식염수 (phosphate-buffered saline) (PBS)로 번갈아가면서 세척되었다. 모든 화학물질에의 노출은 휘저으면서 궤도 진탕기 (orbital shaker)에서 300 rpm으로 수행되었다. 피부 ECM은 그 후 동결건조 되고 및 #60 매쉬 스크린 (mesh screen)을 가진 윌리 밀 (Wiley Mill)을 사용하여 미립자로 으깨졌다.
방광 기질 (urinary bladder matrix)( UBM ) 의 제조; UBM은 이전에 서술된 대로 제조되었다 ((Mase VJ, et al. Orthopedics. 2010; 33(7):511)). 시장성 동물 (market-weight animals)로부터 돼지 방광을 티슈 소스 (Tissue Source, LLC)에서 구했다. 간략하게, 장 막 (tunica serosa), 외 근육층 (tunica muscularis externa), 점막 하부 층 (tunica submucosa) 및 근육 층 점막 (tunica muscularis mucosa)은 기계적으로 제거되었다. 점막 층의 내강 요로 상피 세포 (luminal urothelial cells)는 탈 이온화된 물로 세척하여 기저막 (basement membrane) 으로부터 분리되었다. 남은 조직은 기저막 및 아래 점막 층의 고유판 (lamina propria)으로 구성되며 및 4% 에탄올을 함유하는 0.1% 퍼아세틱 에시드 (peracetic acid) 로 2시간 동안 300 rpm에서 휘저으면서 탈세포화 시켰다. 이 조직은 그 후 PBS와 멸균 수로 철저히 헹구었다. 이 UBM은 그 후 동결건조 되고 및 #60 매쉬 스크린 (mesh screen)을 가진 윌리 밀 (Wiley Mill)을 사용하여 미립자로 으깨졌다.
소장 점막 하부 (SIS)의 제조 (Preparation of small intestinal submucosa ) (SIS): SIS 는 이전에 서술된 대로 제조되었다 (Badylak SF, et al. J Surg Res. 1989; 47(1):74-80). 간략하게, 공장 (jejunum)이 6-개월 된 시장성 (market-weight) 돼지 (~110 에서 ~120kg) 로부터 수확되었으며 세로로 나누었다. 소장 점막 (tunica mucosa)의 표피층이 기계적으로 제거되었다. 비슷하게, 장막 (tunica serosa) 및 외 근육층 (tunica muscularis externa) 이 기계적으로 제거되었으며, 점막 하부 층 (tunica submucosa) 및 점막의 기조 부분 (basilar portions)은 남겨두었다. 조직의 탈세포화 및 살균은 4% 에탄올을 포함하고 있는 0.1% 퍼아세틱 에시드 (peracetic acid)로 2시간 동안 300 rpm에서 휘저어 완결했다. 조직은 PBS 및 멸균 수로 철저히 헹구었다. SIS는 그 후 동결건조 되고 및 #60 매쉬 스크린 (mesh screen)을 가진 윌리 밀 (Wiley Mill)을 사용하여 미립자로 으깨졌다.
식도 ECM의 제조 (Preparation of Esophageal ECM): 식도 ECM이 이전에 서술된 대로 제조되었다 (Keane TJ, etal al. Tissue Eng Part A. 2015;21(17-18):2293-300). 간략하게, 식도 ECM (esophageal ECM)(eECM)은 점막 및 점막 하부를 근육 외 층으로부터 기계적으로 분리하고 및 점막 층을 1% 트립신 (trypsin)/0.05% EDTA (Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 1시간 동안 37℃ 에서 록커 플레이트 위에서 처치하고, 탈이온화 된 물에서 15분 동안, 1M 슈크로즈 (sucrose) (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) 에서 30분 동안, 탈이온화 된 물에서 30분 동안, 3.0% 트리톤 (Triton) X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 에서 48시간 동안, 탈이온화 된 물에서 15분 동안, 인산염-버퍼 된 생리 식염수 (phosphate-buffered saline) (PBS; Fisher Scientific) 에서 15분 동안, 10% 데옥시콜레이트 (deoxycholate) (Sigma-Aldrich) 에서 4시간 동안, 탈이온화 된 물에서 30분 동안, 4.0% 에탄올을 함유하는 0.1% 퍼아세틱 에시드 (peracetic acid)(Rochester Midland Corp., Rochester, NY) 에서 4시간 동안, 100 U/mL DNAse (Invitrogen)로 2시간 동안 록커 플레이트에서 처치하고, 이어서 PBS, 탈이온화 된 물, PBS, 및 탈이온화 된 물로 15-분 세척되게 하여 제조하였다. 모든 세척은 300 rpm으로 쉐이커 플레이트 (shaker plate) 위에서 휘저어 수행하였다. 식도 ECM은 그 후 동결건조 되고 및 #60 매쉬 스크린을 가진 윌리 밀 (Wiley Mill)을 사용하여 미립자로 으깨졌다.
ECM의 초음파분쇄 ( Sonication of ECM): 100mg의 ECM 분말을 15ml 원추형 튜브에서 인산염 버퍼 된 생리 식염수 (PBS)에 재현탁시키고 및 1/8" 탐침로 장치되어 있는 FISHERBRANDTM　모델 120 소닉 디스멤브레이터 (Model 120 Sonic Dismembrator) 로 초음파 분해 시켰다. ECM 농도는 20-200mg (w/v)으로 다양하였다. 재현탁 된 ECM은 30초 켜고 및 45초 끄고의 사이클로 100% 진폭 세팅에서 초음파 분해 시켰다. 이 사이클을 6번 반복하여 용해성 ECM 용액이 만들어졌다. 이 사이클 펄스 세팅은 겔 용액이 온도를 34-40℃ 범위로 유자하도록 확실히 하였다.
초음파 분해 된 ECM 용액의 겔화 ( Gelation of sonicated ECM solutions); ECM 용액은 3D 몰드에 붓고 및 온도는 25℃ 또는 그 이하로 낮추어 겔화를 유도하였다. ECM 겔은 4℃에서 저장되거나 또는 냉동 건조시켜 3D 기하학적 구조를 유지하는 동결 건조된 ECM 구조물을 생산하였다. 다른 한편으로, ECM 용액은 테프론 시트 (Teflon sheet) 위에 골고루 펼쳐 놓고 및 4℃에서 배양하여 겔화를 유도시켰다. ECM 겔은 그 후 실온에서 24시간 동안 배양하여 물을 증발시켜 아주 얇은 ECM 시트로 되게 하였다.
ECM 퍼티 (putty)의 제조 (Preparation of an ECM putty); ECM 분말을 25mg/ml (w/v) PBS에 재현탁시키고 및 상기 서술한 대로 초음파 분해 시켰다. 농도 ≤25mg/ml에서, 및 온도 4-30℃ 사이에서, 용해된 ECM은 퍼티(putty)로 형성되었다.
ECM 하이드로겔 유동학 (ECM hydrogel rheology): 모든 유동학적인 데이터는 이전에 서술된 대로 ((Medberry CJ, et al. Biomaterials. 2013; 34(4):1033-40)) 40mm 평행 플레이트 기하학 (parallel plate geometry)으로 맞추어진 유량계(rheometer)를 사용하여 수집되었으며 및 미국 검사 및 재료 표준 학회 (ASTM) F2900-11 ((American Society for Testing and Materials (ASTM) standard F2900-11)) ((재생 의학 (regenerative medicine)에서 사용되는 하이드로겔의 성질 규명에 대한 지침))를 사용하여 분석되었다. 온도는 펠티어 플레이트 (Peltier plate)를 사용하여 0.1 ℃ 내로 조절되었다. 실온 (25℃) 또는 4℃에서, 겔 전구체는 평행 플레이트 유량계 (parallel plate rheometer)에 올려졌다. 샘플-플레이트 접속면의 가장자리를 봉인하기 위하여 미네랄 오일을 사용하여 샘플 증발은 최소화되었다.
스캐닝 전자 현미경 술 (Scanning electron microscopy): 스캐닝 전자 현미경사진은 ECM 하이드로겔의 표면 위상 (surface topology)을 조사하기 위하여 찍었다. 샘플은 PBS에 있는 찬 2.5% (v/v) 글루타르알데하이드 (glutaraldehyde) (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)에서 적어도 24시간 동안 고정시키고, 이어서 PBS에서 3번 세척시켰다. 고정시킨 샘플은 그 후 시리즈의 등급 지어진 알코올 (30, 50, 70, 90, 100%)을 각각 15분씩, 이어서 헥사메틸렌디아민 (hexamethylenediamine)(Fisher)을 15분 동안 사용하고, 및 이어서 공기-건조로 탈수 시켰다. 건조된 샘플은 스퍼터 코팅기 108 자동 (Sputter Coater 108 Auto) (Cressington Scientific Instruments, Watford, UK)을 사용하여 3.5 nm 층의 금/팔라듐 합금 (gold/palladium alloy)으로 스퍼터 코팅 (sputter coat) 하였으며, 및 JEOL JSM6330f 스캐닝 전자 현미경 (JEOL JSM6330f scanning electron microscope) (JEOL, Peabody, MA)으로 100Х 및 500Х 배율에서 이미징하였다.
세포적합성 에세이 ( Cytocompatibility assay): 3T3 섬유아세포 (3T3 fibroblasts)를 UBM, SIS 또는 피부로부터 제조된 ECM 하이드로겔로 코팅된 96-웰 플레이트에 접종시켰다. 코팅되지 않은 웰은 대조군으로서 사용되었다. 세포는 10% 송아지 혈청 (fetal bovine serum), 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (penicillin-streptomycin)으로 보충된 둘베코의 수정된 최소 필수 배지 (Dulbecco's modified minimal essential medium)에서 배양되었다. 세포를 접종한 후 24시간에, 비브란트 MTT 세포 증식 에세이 키트 (VYBRANT® MTT Cell Proliferation Assay Kit)(Thermo Fisher)가 세포의 생존성을 위해 제조사의 프로토콜에 따라 사용되었다. 전환된 염료의 흡광도가 540nm 파장에서 측정되었다.
지혈 에세이 ( Hemostasis assay). 이-화이트 응고 에세이 (Lee White clotting assay) 가 사용되었다. 신선한 전 혈 (fresh whole blood)이 시험관에 수집되었으며 및 시험관은 응고가 관찰될 때까지 반복적으로 기울였다.
간 찢김 모델(Liver Laceration model): 6-8 주령의 스프라그-다우레이 쥐 (Sprague-Dawley Rats)를 이소플루렌 (Isoflurane) (1-3%) 으로 마취시켰다. 동물은 수술 면에서 산소에 있는 1.5-2.5% 이소플루렌으로 마취상태로 유지시키고 및 배 쪽으로 드러뉘었다. 멸균 기구를 사용하여, 작은 절개를 내고 및 간을 노출 시키기 위하여 밑에 있는 2cm 정중선 개복 수술이 수행되었다. 캘리 클램프에 (Kelly clamp)에 #11 메스 칼날 (scalpel blade)을 넣어 2mm의 칼날이 노출되도록 하여서, 2mm 깊이 및 5mm 길이의, 절개가 간의 배 쪽 표면에 만들어졌다. 상처는 3초 동안 출혈이 되게 하고 및 그 후 멸균 거즈로 닦아 내어 깨끗하게 하였다. 테스트 물품을 그후 결함 부위 (defect site)에 넣고, 및 응고 시간이 기록되었다.
대식세포 활성화 (Macrophage activation): 쥐, 골수가 6-8주령 B6 생쥐로부터 수확되었다. 골수로부터 수확된 세포는 세척시키고 및 2X 106 세포/mL로 플레이트 시키고 및 매 48시간 마다 완전한 배지 교환을 하면서 대식세포 콜로니-자극 인자 (macrophage colony-stimulating factor) (MCSF) 존재하에서 7일 동안 대식세포로 분화되도록 두었다. 대식세포는 그 후 하기 중의 하나로 24시간 동안 활성화시켰다: 1) MIFNγ+LPS 표현형 (M1-유사)을 촉진하기 위하여 20ng/mL 인터페론-γ (Interferon-γ) (IFNγ) 및 100ng/mL 리포폴리삭카라이드 (lipopolysaccharide) (LPS)(Affymetrix eBioscience, Santa Clara, CA; Sigma Aldrich)로; 2) MIL-4 표현형 (M2-유사)을 촉진하기 위하여 20ng/mL 인터루킨 (IL)-4 ((interleukin (IL)-4))(Invitrogen)로; 또는 3) 2mg/ml UBM 음향 겔로. 37℃ 에서 배양 기간 후에, 세포는 멸균 PBS로 세척시키고 및 면역라벨링을 위하여 세포는 2% 파라포름알데하이드로 (paraformalpdehyde) (PFA)로 고정시켰다. 비특이적인 결합을 막기 위하여, 세포는 PBS, 0.1% 트리톤-X (Triton-X), 0.1% 트윈-20 (Tween-20), 4% 염소 혈청 (goat serum), 및 2% 소 혈청 알부민 (bovine serum albumin)으로 구성된 차단 용액에서 실온에서 1시간 동안 배양시켰다. 차단 용액은 그 후 제거되고 및 세포는 일차 항체에 배양되었다. 세포는 4℃에서 16시간 동안 배양되었으며, 일차 항체는 제거되고, 및 세포는 PBS로 세척시켰다. 형광 물질-접합 된 (fluorophore-conjugated) 2차 항체 용액이 웰에 1시간 동안 실온에서 첨가되었다. 항체는 그 후 제거되고, 세포는 PBS로 세척시키고, 및 핵은 DAPI를 사용하여 대조염색시켰다. 사이토카인-활성화된 대식세포가 표준 노출 시간을 설정하기 위하여(양성 대조군) 사용되었으며, 이는 그 후 그룹 전체에 일정하게 유지되었다.
실시예 2
결과 (Results)
세포외 기질 (extracellular matrix)(ECM)로부터 하이드로겔을 제조하는 방법이 개발되었다. 탈세포화한 조직을 시작 재료로 사용하여, 초음파 분해 기술이 피부, 방광 기질 (rinary bladder matrix) (UBM), 및 소장 점막 하부 ( small intestinal submucosa)(SIS)를 포함하는 광범위한 조직 특이적인 ECM에 적용될 수 있다. 이 접근 방법은 중성 버퍼 된 생리 식염수에 분쇄된 ECM을 재현탁시키고 이어서, 예를 들어, 20-100% 범위의 진폭으로 20kHz 초음파 주파수 (ultrasonic frequency)를 사용하여 ECM을 용해하는 것이 관여된다 (도 1). 60초의 초음파 분해 후에, ECM 용액의 빠른 겔화는 ECM 용액의 온도를 37℃ 이하로 감소시켜 유도된다 (도 4, 도 5, 도 6). 유동학적 평가의 결과는 이 방법을 사용하여 ECM 농도 25mg/ml 에서부터 150mg/ml의 범위를 사용하여 ECM 하이드로겔이 제조될 수 있음을 보여준다 (도 7, 도 8). 일단 중합되면, ECM 겔은 실온에서 안정적이고 및 주문에따라 만들 수 있는 3D 기하학적 구조를 형성할 수 있다 (도 2). 초음파 분해로 제조된 ECM 하이드로겔은 시험관 내에서 세포 배양의 기질로서 사용될 때 세포 적합성이 있음을 보였다 (도 9, 도 13). 겔의 스캐닝 전자 현미경 사진은 밀집한 섬유성 네트워크 (fibrillary network) 를 보여준다 (도 3). 추가로, ECM 하이드로겔은 지혈을 돕기 위하여 환자에 해부 부위에 적용될 수 있는 지혈제로서 사용될 수 있다 (도 10, 도 11). 결과들은 수반되는 도면에서 제공된다.
실시예 3
실시예 4-7을 위한 재료 및 방법 (Materials and Methods for Examples 4-7)
ECM 바이오스케폴드의 제조 (Preparation of ECM bioscaffolds ) : 돼지 피부 ECM (dECM)이 이전에 서술된 대로 제조되었다 (Reing et al., Biomaterials 31(33) (2010) 8626-33. 간략하게, 전체-두께 피부 (full-thickness skin)를 시장성 (~110kg) 돼지 ((market-weight(~110kg) pigs))로부터 수확하고, 및 피하 지방 (subcutaneous fat) 및 표피 (epidermis)는 기계적인 판 분리 (delamination)로 제거되었다, 이 조직은 그 후 0.25% 트립신(Thermo Fisher Scientific)으로 6시간 동안, 70% 에탄올로 10시간 동안, 3% H2O2로 15분 동안 처치하고, 추가의 16시간 동안 용액 교환과 함께 0.26% EDTA/0.69% 트리스 (tris)에 있는 1% 트리톤 X-100 (Triton X-100) (Sigma-Aldrich)으로 6시간 동안 처치, 및 0.1% 퍼아세틱 에시드 (peracetic acid)/4% 에탄올 (Rochester Midland) 로 2시간 동안 처치하였다. 각 화학물 교환 사이에 물 세척이 수행되었으며 최종 단계 후에 물과 인산염-버퍼 된 생리 식염수 (phosphate-buffered saline) (PBS)로 번갈아가면서 세척되었다. 모든 화학물질에의 노출은 휘저으면서 궤도 진탕기 (orbital shaker)에서 300 rpm으로 수행되었다. 피부 ECM은 그 후 동결건조 되고 및 #40 매쉬 스크린 (mesh screen)을 가진 윌리 밀 (Wiley Mill)을 사용하여 미립자로 으깨졌다.
돼지 방광 기질 (Porcine urinary bladder matrix) (UBM)은 이전에 서술된 대로 제조되었다 ((Maser VJ, et al. Orthopedics 33(7):511 (2010)). 간략하게, 장막 (tunica serosa), 외 근육층 (tunica muscularis externa), 점막 하부 층 (tunica submucosa) 및 근육 층 점막(tunica muscularis mucosa)은 기계적으로 제거되었다. 점막 층의 내강 요로 상피 세포 (luminal urothelial cells)는 탈 이온화된 물로 세척하여 기저막 (basement membrane) 으로부터 분리되었다. 남은 조직은 기저막 및 아래 점막 층의 고유판 (lamina propria)으로 구성되며 및 4% 에탄올을 함유하는 0.1% 퍼아세틱 에시드 (peracetic acid) 로 2시간 동안 300 rpm에서 휘저으면서 탈세포화 시켰다. 이 조직은 그 후 PBS와 멸균 수로 철저히 헹구었다. 이 UBM은 그 후 동결건조 되고 및 #40 매쉬 스크린 (mesh screen)을 가진 윌리 밀 (Wiley Mill)을 사용하여 미립자로 으깨졌다.
돼지 소장 점막 하부 (porcine small intestinal submucosa) (SIS)는 이전에 서술된 대로 제조되었다 (Badylak SF, et al. J Surg Res. 1989; 47(1):74-80). 간략하게, 공장 (jejunum)이 6-개월 된 시장성 (market-weight) 돼지 (~110 에서 ~120kg) 로부터 수확되었으며 세로로 나누었다. 소장 점막 (tunica mucosa)의 표피층이 기계적으로 제거되었다. 비슷하게, 장막 (tunica serosa) 및 외 근육층 (tunica muscularis externa) 이 기계적으로 제거되었으며, 점막 하부 층 (tunica submucosa) 및 점막의 기조 부분 (basilar portions)은 남겨두었다. 조직의 탈세포화 및 살균은 4% 에탄올을 포함하고 있는 0.1% 퍼아세틱 에시드 (peracetic acid)로 2시간 동안 300 rpm에서 휘저어 완결했다. 이 조직은 그 후 PBS 및 멸균 수로 철저히 헹구었다. SIS는 그 후 동결건조 되고 및 #40 매쉬 스크린 (mesh screen)을 가진 윌리 밀 (Wiley Mill)을 사용하여 미립자로 으깨졌다.
돼지 식도 ECM (porcine esophageal ECM) 이 이전에 서술된 대로 제조되었다 (Keane TJ, etal al. Tissue Eng Part A. 2015;21(17-18):2293-300). 간략하게, 식도 ECM (esophageal ECM)(eECM)은 점막 및 점막 하부를 근육 외 층으로부터 기계적으로 분리하고 및 점막 층을 1% 트립신 (trypsin)/0.05% EDTA (Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 1시간 동안 37℃ 에서 록커 플레이트 위에서 처치하고, 탈이온화 된 물에서 15분 동안, 1M 슈크로즈 (sucrose) (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) 에서 30분 동안, 탈이온화 된 물에서 30분 동안, 3.0% 트리톤 X-100 (Triton X-100) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 에서 48시간 동안, 탈이온화 된 물에서 15분 동안, 인산염-버퍼 된 생리 식염수 (phosphate-buffered saline) (PBS; Fisher Scientific) 에서 15분 동안, 10% 데옥시콜레이트 (deoxycholate) (Sigma-Aldrich) 에서 4시간 동안, 탈이온화 된 물에서 30분 동안, 4.0% 에탄올을 함유하는 0.1% 퍼아세틱 에시드 (peracetic acid)(Rochester Midland Corp., Rochester, NY) 에서 4시간 동안, 100 U/mL DNAse (Invitrogen)로 2시간 동안 록커 플레이트에서 처치하고, 이어서 PBS, 탈이온화 된 물, PBS, 및 탈이온화 된 물로 15-분 세척되게 하여 제조하였다. 모든 세척은 300 rpm으로 쉐이커 플레이트 (shaker plate) 위에서 휘저어 수행하였다. eECM은 그 후 동결건조 되고 및 #40 매쉬 스크린을 가진 윌리 밀 (Wiley Mill)을 사용하여 미립자로 으깨졌다.
돼지 기도 ECM (porcine tracheal ECM)(tECM)은 조금 수정하여 이전에 서술된 대로 제조되었다 (Lange et al., Journal of tissue engineering and regenerative medicine 11(3) (2017) 800-811). 간략하게, 기도는 0.25% 트리톤 X-100 (Triton X-100) + 0.25% 소듐 데옥시콜레이트 (sodium deoxycholate)를 함유하는 세제에서 30분 동안 음압 진공 사이클링 (negative pressure vacuum cycling) 으로 배양시키고 (15 사이클, -0.95 kPa max vacuum) 그 후 신선한 세제 용액에 하룻밤 동안 담갔다. 이 과정은 매일 반복하고, 2 째 및 3 째 날에는 세제 용액은 멸균 DI 물로 대체되었고, 4 째 날에는 2000 KU/ml DNase의 물 용액, 및 5 째 날에는 멸균 DI 물로 대체되었다. 이 사이클은 한 번 더 반복되어 총 10일의 진공 사이클, 이어서 15% 퍼아세틱 에시드 (peracetic acid) + 4% 에탄올 (ethanol)에서 하룻밤 동안 멸균, 및 PBS에서 세척 및 저장되었다. 기도 ECM은 그 후 동결건조 되고 및 #40 매쉬 스크린을 가진 윌리 밀 (Wiley Mill)을 사용하여 미립자로 으깨졌다.
돼지 간 ECM (porcine liver ECM)(LECM) 은 이전에 서술된 대로 제조되었다 (Loneker et al., Journal of Biomedical Materials Research Part A 104(4) (2016) 957-965). 간은 시장성 돼지 (market weight pigs) (110-130 kg)로부터 수확되었다. 이 조직은 메스 (scalple) 로 0.5 cm3 조각으로 자르고 및 궤도 진탕기 (orbital shaker)에서 기계적인 휘저음으로 탈 이온화된 물에서 15분 동안 세척을 세 번 하게 하였다. 이 조각들은 그 후 살살 마사지하여 세포 용해를 돕도록 하였으며 및 0.02% 트립신 (trypsin)/0.05% EGTA 에 37℃ 에서 2시간 동안 담갔다. 이 조직을 타입 1물로 헹구고, 및 마사지를 반복하고 이어서 이 간 조각을 3% 트리톤 X-100 (Triton X-100) 에서 18-24시간 동안 기계적으로 휘저었다. 헹굼은 모든 눈에 보이는 세포 물질 잔여물이 제거될 때까지 반복되었다. 이 과정 후에, 간 ECM은 0.1% 퍼아세틱 에시드 (peracetic acid) 용액에 담그고 이어서 타입 1물 또는 pH 7.4의 PBS에 헹굼을 반복하였다. 간 ECM은 그 후 동결건조 되고 및 #40 매쉬 스크린을 가진 윌리 밀 (Wiley Mill)을 사용하여 미립자로 으깨졌다.
초음파 공동화에 의한 ECM 용해 (Solubilization of ECM by ultrasonic cavitation): 분쇄된 ECM은 50mL 원추형 튜브에서 1X 인산염 버퍼 된 생리 식염수 (phosphate buffered saline)(PBS) 10ml에 재현탁 시켰으며 및 1/8" 탐침로 장치되어 있는 FISHERBRANDTM　모델 120 소닉 디스멤브레이터 (Model 120 Sonic Dismembrator) 로 초음파 분해 시켰다. ECM 농도는 25에서부터 100mg (w/v)까지 다양하였으며 및 초음파 분해 시간은 진폭 범위 20%-100%에서 30-500초로 다양했다. 실험적인 셋업의 그림이 도 14에 보여진다.
콜라겐 및 sGAG 정량 (Collagen and sGAG quantification); 분쇄된 dECM (100mg/ml)을 초음파분쇄시키고, 및 샘플은 10,000x g에서 30분 동안 원심분리시켜 불용성 ECM 성분을 압축시켰다. 용해성 ECM 성분을 함유하는 투명한 상등액은 새로운 튜브에 옮겼다. 상등 용액의 콜라겐 농도는 서콜 에세이 키트 (Sircol Assay Kit) (Biocolor Ltd., UK)로 제조사가 추천하는 프로토콜에 따라 측정되었다. 설페이티드 글리코사미노글라이칸 (Sulfated glycosaminoglycan) (sGAG) 농도는 블리스칸 설페이티드 글리코사미노글라이칸 에세이 키트 (Blyscan Sulfated Glycosaminoglycan Assay Kit) (Biocolor Ltd., UK)를 사용하여 제조사의 추천된 프로토콜에 따라 측정되었다.
겔화 에세이 ( Gelation assay); 시험관 역전 방법 (test tube inversion method) (Quin et al., Frontiers in chemistry 6 (2018); El-Fiqi et al., Acta biomaterialia 9(12) (2013) 9508-9521) 이 겔화 시간을 측정하기 위하여 사용되었다. 샘플 재료 (25, 50, 또는 100mg/ml)를 초음파 분해 바로 후에, 0.5ml의 샘플을 시험관에 옮기고 및 4℃ 및 25℃의 일정한 온도에서 배양시켰다. 샘플의 유동성을 1분마다 튜브를 거꾸로 하여 관찰하였다. 샘플이 흐르기를 멈춘 시간을 겔화 시간으로서 정하고 및 이 값을 기록하였다.
스캐닝 전자 현미경 술 (Scanning electron microscopy): 스캐닝 전자 현미경 사진은 50 및 100mg/ml에서 dECM 하이드로겔의 표면 위상 (surface topology)을 조사하기 위하여 찍었다. 샘플은 PBS에 있는 찬 2.5% (v/v) 글루타르알데하이드 (glutaraldehyde) (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)에서 적어도 24시간 동안 고정시키고, 이어서 PBS에서 3번 세척시켰다. 고정시킨 샘플은 그 후 시리즈의 등급 지어진 알코올 (30, 50, 70, 90, 100%)을 각각 15분씩 사용하고, 이어서 헥사메틸렌디아민 (hexamethylenediamine)을 15분 동안 사용하고 및 이어서 공기-건조로 탈수시켰다. 건조된 샘플은 스퍼터 코팅기 108 자동 (Sputter Coater 108 Auto) (Cressington Scientific Instruments, Watford, UK)을 사용하여 3.5 nm 층의 금/팔라듐 합금 (gold/palladium alloy)으로 스퍼터 코팅 (sputter coat) 하였으며, 및 JEOL JSM6330f 스캐닝 전자 현미경 (JEOL JSM6330f scanning electron microscope) (JEOL, Peabody, MA)으로 이미징하였다.
점 탄성 측정 (Viscoelastic measurements): 모든 유동학적인 데이터는 이전에 서술된 대로 ((Medberry CJ, et al. Biomaterials 34(4)(2013):1033-40)), 40mm 평행 플레이트 기하학적 (parallel plate geometry)로 맞추어진 유량계(rheometer)(AR2000ex, TA instruments, New Castle, DE)를 사용하여 수집되었으며 및 미국 검사 및 재료 표준 학회 (ASTM) F2900-11 ((American Society for Testing and Materials (ASTM) standard F2900-11)) ((재생 의학 (regenerative medicine)에서 사용되는 하이드로겔의 성질 규명에 대한 지침))를 사용하여 분석되었다. 각 조직 타입(dECM 및 eECM, 100mg/ml)의 샘플은 테스트 되는 온도 프로화일 각각에 대하여, 테스트하기 전 1시간 동안 시작 온도(4, 25, 또는 37℃)로 있게 하였다. 샘플은 시작 온도로 세트 되어 있는 40mm 평행 플레이트 기하학적(parallel plate geometry)로 맞추어진 AR-2000ex 유량계에 올려졌다. 테스트 동안에 샘플 증발은 최소화하기 위하여 샘플-플레이트 접속 면의 가장자리를 봉인하기 위하여 미네랄 오일이 사용되었다. 초음파 분해된 하이드로겔 겔화 키네틱스를 측정하기 위하여 작은, 0.5% 진동 스트레인 (oscillatory strain)을 1rad/s 주파수로 적용하고 및 테스트하는 온도 프로화일에 따라 빠르게 온도를 바꾸어 (37 또는 4℃) 진동시간 그윕 (oscillatory time sweep)를 1시간 동안 수행하였다. 데이터는 트리오즈 소프트웨어(Trios software) (TA Instruments)를 사용하여 전하였으며 (exported) 및 프리즘 v8 소프트웨어 (Prism v8 software) (GraphPad, San Diego, CA)를 사용하여 분석되었다. "평균 저장 계수 (Average storage modulus)"는 G' 정체기 (plateau) 를 대표하는, 60분 테스트의 최종 10분에 대해 평균한 저장 계수 G'이다. 50% 겔화까지의 시간은 50% 평균 저장 계수까지의 시간으로서 결정된다.
시험관 내 대사 에세이 (In vitro metabolic assay): 3T3 섬유아세포 (3T3 fibroblasts)를 UBM, SIS 또는 dECM 로부터 제조된 100mg/ml의 ECM 하이드로겔로 코팅된 96-웰 플레이트에 접종시켰다. 코팅되지 않은 웰은 대조군으로서 사용되었다. 세포는 10% 송아지 혈청 (fetal bovine serum), 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (penicillin-streptomycin)으로 보충된 둘베코의 수정된 최소 필수 배지 (Dulbecco's modified minimal essential medium)에서 배양되었다. 세포를 접종한 후 24시간에, 비브란트 MTT 세포 증식 에세이 키트 (Vybrant® MTT Cell Proliferation Assay Kit)(Thermo Fisher)가 세포의 생존성을 평가하기 위하여 제조사의 프로토콜에 따라 사용되었다. 전환된 염료의 흡광도가 540nm 파장에서 측정되었다.
시험관 내 세포 적합성 (In vitro cytocompatibility ): 일차 말 간엽 줄기세포 (equine mesenchymal stem cells)가 이전에 서술된 대로 분리되었다 ((Adams et al., Equine veterinary journal 45(3) (2013) 372-375)). 세포는 UBM 또는 dECM으로부터 제조된 ECM 하이드로겔 100mg/ml로 코팅된 6-웰 플레이트에 접종시켰다. 코팅되지 않은 웰은 대조군으로서 사용되었다. 접종한 후 24시간에, 시험관 내 세포적합성은 생존/사멸 생존성/세포독성 키트 (LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit) (Invitrogen) 를 사용하여 제조사의 지시에 따라 측정되었다. 이미지는 3개의 기술적인 복제 (technical replica)에 걸쳐 5개의 200X 필드(field)에서 얻었다. 산 세포 및 죽은 세포의 퍼센트는 셀프로파일러 (CellProfiler)를 사용하여 정량되었다. 이미지는 자이스 엑시오버트 현미경 (Zeiss Axiovert microscope) 으로 5개의 무작위 필드 (field) 에서 200X 배율로 포착하여 얻었다. 산 및 죽은 세포의 퍼센트의 정량은 맞춤 셀프로파일러 파이프라인(custom CellProfiler pipeline)을 사용하여 완성하였다.
시험관 내 대식세포 반응 (In vitro macrophage response): 쥐 골수 세포가 6- 에서 8-주령 B6 생쥐로부터 수확되었다. 골수로부터 수확된 세포는 세척시키고 및 2X 106 세포/mL로 플레이트 시키고 및 매 48시간 마다 완전한 배지 교환을 하면서 대식세포 콜로니-자극 인자 (macrophage colony-stimulating factor) (MCSF) 존재하에서 7일 동안 대식세포로 분화되도록 두었다. 대식세포는 그 후 하기 중의 하나로 24시간 동안 활성화시켰다: 1) MIFNγ + LPS 표현형 (M1-유사)을 촉진하기 위하여 20ng/mL 인터페론-γ (Interferon-γ) (IFNγ) 및 100ng/mL 리포폴리삭카라이드 (lipopolysaccharide) (LPS)(Affymetrix eBioscience, Santa Clara, CA; Sigma Aldrich)로; 2) MIL-4 표현형 (M2-유사)을 촉진하기 위하여 20ng/mL 인터루킨 (IL)-4 ((interleukin (IL)-4))(Invitrogen)로; 3) 2mg/ml dECM 하이드로겔로, 또는 4) 2mg/ml eECM 하이드로겔로. 37℃ 에서 24시간 동안의 배양 기간 후에, 세포는 멸균 PBS로 세척시키고 및 면역라벨링을 위하여 세포는 2% 파라포름알데하이드로 (paraformalpdehyde) (PFA)로 고정시켰다. 비특이적인 결합을 막기 위하여, 세포는 PBS, 0.1% 트리톤-X (Triton-X), 0.1% 트윈-20 (Tween-20), 4% 염소 혈청 (goat serum), 및 2% 소 혈청 알부민 (bovine serum albumin)으로 구성된 차단 용액에서 실온에서 1시간 동안 배양시켰다. 차단 용액은 그 후 제거되고 및 세포는 일차 항체에 배양되었다. 세포는 4℃에서 16시간 동안 배양되었으며, 일차 항체는 제거되고, 및 세포는 PBS로 세척시켰다. 형광 물질-접합 된 (fluorophore-conjugated) 2차 항체 용액이 웰에 1시간 동안 실온에서 첨가되었다. 항체는 그 후 제거되고, 세포는 PBS로 세척시키고, 및 핵은 DAPI를 사용하여 대조염색시켰다. 사이토카인-활성화된 대식세포 (양성 대조군)가 나머지 처치 그룹의 이미지를 위한 표준 노출 시간을 설정하기 위하여(양성 대조군) 사용되었다.
통계학적 방법 (Statistical Methods): 모든 분석은 프리즘 소프트웨어 (Prism software) (GraphPad Software Inc) 를 사용하여 유의성 p <0.05로 정의되어 수행되었다. 용해된 콜라겐 및 sGAG 결과는 ANOVA 및 포스트 혹 터키의 다중 비교 테스트 (post hoc Tukey's multiple comparisons test)와 함께 쌍 비교 (pairwise comparisons)를 사용하여 분석되었다. 겔화 시간의 결과는 포스트 혹 터키의 다중 비교 테스트 (post hoc Tukey's multiple comparisons test)와 함께 ANOVA를 사용하여 분석되었다. 단일 비교를 위하여, 스튜던트 쌍-없는 t-테스트 (student's unpaired t-test)가 수행되었다. 유동학적 데이터는 독립적인 변수 온도 및 ECM 타입을 위해 투-웨이 ANOVA로 분석되었고 및 의존적인 변수 저장 계수는, 온도의 주 효과를 위해 포스트 혹 터키의 다중 비교 테스트로 분석되었다. 스튜던트 쌍-없는 t-테스트 (student's unpaired t-test)는 dECM 및 eECM의 겔화 시간을 비교하기 위하여 수행되었다.
실시예 4
콜라겐 및 sGAG 용해 (Solubilization of collagen and sGAG)
콜라겐 및 셀페이티드 글라이코사미노글라이칸 (sulfated glycosaminogylcans)(sGAG)의 용해에 대한 초음파 분해 진폭의 효과를 평가하기 위하여, 분쇄된 dECM을 300초 동안 20%, 40%, 60%, 80% 및 100% 진폭으로 초음파 분해 시켰다. 결과는 용해되는 콜라겐은 증가한 진폭에 따라 상당히 증가함을 보여준다 (도 15A). 반면에, 초음파 분해의 진폭은 sGAG의 용해에 상당한 효과는 보이지 않았다 (도 15B). 콜라겐 sGAG의 용해에 대한 초음파 분해 시간의 효과를 평가하기 위하여, 분쇄된 dECM은 100% 진폭에서 30초에서부터 500초의 범위 시간 동안 초음파 분해 시켰다. 결과는 증가하는 초음파 분해 시간과 함께 용해되는 콜라겐이 의미 있게 증가함을 보였다 (도 15G). 반면에, 초음파 분해 시간은 sGAG의 용해에 의미 있는 효과는 없었다 (도 15D).
실시예 5
겔화 키네틱스 및 정성적 평가 (Gelation kinetics and qualitative assessment)
dECM 하이드로겔의 겔화 키네틱스에 대한 초음파 분해 시간 및 진폭의 효과가 25, 50 또는 100mg/ml 농도에서 계산되었다. 결과는 테스트 된 모든 농도에서, 25℃에 비교하여 4℃에서 배양된 전-겔 용액 (pre-gel solutions)은 겔을 형성하는데 요구되는 시간을 상당히 의미 있게 감소시킴을 보였다 (도 16A). 더 나아가, 100mg/ml 농도는 4℃ 에서 배양시켰을 때 25mg/ml 농도에 비교하여 겔화 시간의 상당한 감소를 보였다 (도 16A). 테스트 한 모든 농도에서, 초음파 분해 진폭을 20 또는 40에서 80 또는 100으로 진폭은 의미 있는 겔화 시간 감소의 결과가 되었다 (도 16B). 40 또는 100% 진폭으로 초음파 분해 된 25 에서 100mg/ml 농도 사이의 겔화 시간에는 상당한 차이가 관찰되었다 (도 16B). 100mg/ml 농도로 제조된 UBM, SIS, eECM, tECM, 및 LECM에서 겔화 키네틱스 (Gelation kinetics) 가 측정되었다 (FIG. 16C). 결과는 테스트한 모든 ECM 조직 타입에서, 전-겔 (pre-gel) 용액을 4℃에서 배양하면 25℃에서의 배양에 비교하여 겔을 형성하는데 요구되는 시간이 상당히 감소함을 보여주었다. 더 나아가, eECM 하이드로겔은 모든 다른 ECM 조직 타입에 비교하여 4℃에서 상당히 감소한 겔화 시간을 보여주었다. 25℃에서 배양시켰을 때, eECM은 tECM 및 LECM에 비교하여 상당히 감소한 겔화 시간을 보여주었다. 50mg/ml 및 100mg/ml dECM의 스캐닝 전자 현미경 사진은 조직화된 콜라겐 소섬유 (fibril)와 함께 밀집한 소섬유 네트워크를 보여주었다 (도 3).
실시예 6
유동학적 측정 (Rheological measurements)
ECM 하이드로겔의 두 가지 조직 타입 (dECM 및 e ECM, 100mg/ml)이 세 가지 온도 프로화일에서 테스트 되었다: 1) 4 →37℃, 2) 25 →37℃, and 3) 37 →4℃ (도 17A). ECM 하이드로겔은 온도가 감소하였을 때 (37 →4℃) 겔화에서 시그모이드 증가 (sigmoidal increase) ((저장 계수 (storage modulus), G'))를 보였다. 하이드로겔은 시그모이드 겔화 커브의 정체기 (plateau)에서 저장 계수 G '(storage modulus G') > 손실 계수 G'' (loss modulus G'')를 보였다. 온도가 증가 되었을 때 (4 →37℃, 또는 25 →37℃), 하이드로겔의 견고도사 시간에 따라 유지되었다 (G' >> G'') (도 17A). 끝 온도가 37 →4℃ 로 빠르게 감소하였을 때 (3447.3 ± 3340.1Pa), 끝 온도가 4 →37℃(234.4 ± 215.7 Pa) (p=0.04), 또는 25 →37℃ (245.8± 94.5 Pa) (p=0.04)로 증가 되었을 때와 비교하여 저장 계수 G'은 dECM 하이드로겔에서 증가 되었다 (도 17B). eECM에 대한 견고도도 또한 끝 온도가 빠르게 37 →4℃ 로 감소하였을 때 (2237.4 ± 227.1 Pa), 4 →37℃ (733.0 ± 363.7 Pa), 또는 25 →37℃ (624.1 ± 133.5Pa)에 비교하여, 증가하는 경향이나, 그러나 의미 있지는 않았다 ((p=0.4) (도 17B). dECM 및 eECM의 37 →4℃ 의 시그모이드 겔화 프로화일에서 겔화 시간이 (50% 겔화 까지의 시간) 측정되었다 (도 18C). 겔화시간은 스튜던트 쌍 없는 t-테스트 (student's unpaired t-test) (p=0.006)에서 dECM (2.5± 0.5 분)(p=0.006)에 비교하여 ECM에서 (0.5± 0.4 분) 더 짧았다. 37℃로 올려진 온도 프로화일에서는 겔화가 유지되고 있으므로 겔화 시간은 결정되지 않았다.
실시예 7
시험관 세포 반응 ( In vitro cell response)
MTT 세포 증식 에세이는 dECM, UBM 또는 SIS로부터 제조된 ECM 하이드로겔이 NIH 3T3 섬유아세포 (NIH 3T3 fibroblasts)에 대해 비-독성임을 보였다 (도 18A). 비슷하게, 생존/사멸 에세이 (live/dead assay)로부터의 결과도 ECM 또는 UBM으로부터 제조된 ECM 하이드로겔에 접종되었을 때 일차 말 간엽 줄기세포는 거의 100% 생존력을 유지함을 보였다 (도 18B, C). 이들 처치와 조직 배양 플라스틱 (대조군)에서 24시간 동안 배양된 세포와 비교하였을 때 증식 및 생존력에 차이를 보이지 않았다 (도 18B, C). 펩신 소화 방법을 사용하여 제조된 ECM 하이드로겔은 이전에 M2-유사 대식세포 표현형을 촉진하는 것으로 나타났다 ((Huleihel et al., "Macrophage phenotype in response to ECM bioscaffolds," Seminars in immunology, Elsevier, 2017, pp. 2-13; Sicari et al., Biomaterials 35(30) (2014) 8605-8612; Dziki et al., Journal of biomedical materials research Part A 105(1) (2017) 138-147)). 초음파 공동화 방법을 사용하여 제조된 ECM 하이드로겔이 대식세포에 비슷한 효과를 보이는지 평가하기 위하여, 일차 쥐 골수-유래 대식세포를 M1-유사 표현형을 유도하기 위하여 인터페론-γ (interferon-γ) (IFN-γ) 및 리포폴리삭카라이드 (lipopolysaccharide)(LPS) 로 자극 시키고, M2-유사 표현형을 유도하기 위하여 인터루킨-4 (interleukin-4) (IL-4) 로, dECM 또는 dECM 하이드로겔로 자극했다. 모든 실험 그룹은 균일한 F4/80 염색을 보였다. 대조군은 대식세포가 IFNγ/LPS 로 처치되었을 때 기대되는 iNOS 증가를 보였으며 IL-4로 처치되었을 때 Fizz1 증가를 보였다 (도 18B, D, E). dECM 및 eECM 하이드로겔 처치 둘 다, 조금의 iNOS 발현을 수반하는 Fizz1 발현으로 보여준 대로 IL-4-처치된 대식세포와 비슷하게, M2-유사 대식세포 활성화를 촉진하는 것으로 나타났다 (도 18 D, E),
그러므로 초음파 공동화로 제조된 ECM 하이드로겔의 겔화 키네틱스, 유동성 성질, 및 세포 적합성 및 생체 활성이 평가되었다. 본 연구가 초음파 공동화를 개발하고 및 평가하기 위하여 dECM의 사용에 일차적으로 초점을 두었으나, 초음파 공동화 방법이, 표 1에 요약된 대로, 넓은 범위의 탈세포화된 조직으로부터 유래한 ECM에 적용될 수 있음을 보여 주기 위하여, 다섯 개의 추가의 소스 조직으로부터의 ECM이 선택적인 에세이에서 사용되었다.
ECM 소스(source) 조직, 및 ECM 하이드로겔을 생산하기 위한 초음파 공동화 방법 (ultrasonic cavitation method)을 평가하기 위하여 사용된 선택적 에세이 요약. 평가된 ECM 조직 소스는 피부 (dermal) ECM (dECM), 식도 (esophageal) ECM (eECM), 방광 기질 (urinary bladder matrix) (UBM), 소장 점막 하부 (small intestinal submucosa) (SIS), 기도 (trachea) ECM (tECM), 및 간(liver) ECM (LECM)이다.
ECM 조직 타입 사용된 에세이
dECM · 용해 에세이 (Solubilization Assay)
· 겔화 에세이 (Gelation Assay)
· 스캐닝전자현미경술 (Scanning Electron Microscopy)
· 유동성 평가 (Rheological assessment)
· 시험관 대사 (In-vitro metabolic)
· 시험관 세포적합성 (In-vitro cytocompatibility)
· 시험관대식세포 반응(In vitro macrophage response)
eECM · 겔화 에세이 (Gelation Assay)
· 유동성 평가 (Rheological assessment)
· 시험관대식세포반응(In vitro macrophage response)
UBM · 겔화 에세이 (Gelation Assay)· 시험관 대사 에세이 (In-vitro metabolic assay)
· 시험관 세포적합성 (In-vitro cytocompatibility )
SIS · 겔화 에세이 (Gelation Assay)· 시험관 대사 에세이 (In-vitro metabolic assay)
tECM · 겔화 에세이 (Gelation Assay)
LECM · 겔화 에세이 (Gelation Assay)
본 연구에서, ECM 스케폴드 (ECM scaffolds)는 산성 용액에서 산성 프로테아제로 소화할 필요없이; 또는 ECM 분자 조성물에 악영향을 끼칠 수 있는 교란성 추출 버퍼 및 투석 과정을 사용할 필요없이 용해된다. 초음파 분해된 ECM은 25℃ 또는 그 이하에서 배양시켰을 때 겔로 자체-집합(self-assembled) 된다. 이론에 얽매이지 않고, 겔화는 콜라겐과 같은 자체-집합되는 분자의 존재 때문일 수 있다. 정말로, ECM 스케폴드 재료의 초음파 분해는 초음파 분해 시간 및 진폭이 증가하면서 용해되는 콜라겐이 상당히 증가하는 결과가 되었다. 펩신 소화를 사용하여 제조되고 및 25℃에서 액체를 및 37℃에서 겔을 유지하는 ECM 하이드로겔과는 달리, 초음파 공동화 방법을 사용하여 제조한 하이드로겔은 온도가 25℃ 또는 그 이하로 낮추어졌을 때 안정적인 겔을 형성한다. 초음파 분해 된 ECM의 이 열 기계적 성질 (thermomechanical property)은, 온도 30℃ 이하로 냉각시 겔을 형성할 수 있는, 가수분해된 콜라겐에서 보고된 것과 비슷하다 (Tosh et al., Applied Physics Letters 84(21) (2004) 4242-4244). 그러나, 소 힘줄 (bovine tendons)로부터 추출된 콜라겐에 대하여 원편광이색성 분석 (circular dichroism analysis), 원자력 현미경 (atomic force microscopy) 및 FTIR 를 사용한 최근 연구는 콜라겐의 삼중 헤릭스 구조 (triple helix structure)가 초음파 분해에 의해 영향을 받지 않고 및 온전하게 남아 있음을 보여주었다 (Li et al., Sonochemistry 16(5) (2009) 605-609). 비슷하게, 농어 (sea bass) Lateolabrax japonicus 의 피부로부터의 콜라겐 추출은 80% 진폭에서 3시간 동안 초음파 분해는 콜라겐 분자의 구조적 완전성에 검출할만한 변화는 유도하지 않았음을 보였다. 본 연구에서는, 초음파 분해된 ECM의 스캐닝 전자 현미경 사진에서 조직화된 콜라겐 소 섬유를 가진 밀집된 소 섬유의 네트워크를 보였다. 추가로, 초음파 공동화를 사용하여 생산된 ECM 하이드로겔의 겔화 및 온도 사이의 역 관계에도 불구하고, 온도가 증가할 때 (4→37℃ 또는 25→37℃), 하이드로겔의 견고도는 시간에 따라 유지 되었다(G' >> G''). 이 발견은 초음파 분해된 ECM의 겔화 과정은 단순히 콜라겐 화학의 산물은 아니고, 오히려, 라미닌 (laminins) 및 프로테오글라이칸 (proteoglycans)과 같은 다른 자체-집합분자를 포함하는, 용해된 ECM 내의 여러 가지 성분들 사이에 상호작용의 결과임을 암시한다.
NIH 3T3 섬유아세포 및 일차 말 간엽 줄기세포는 초음파 공동화를 사용하여 생산된 ECM 하이드로겔에 부착될 수 있고 및 여기서 증식될 수 있다. 더 나아가, ECM-매개하는 조직 리모델링의 활성 기전 (들)이 단지 부분적으로 이해되지만, 친염증 (proinflammatory), M1-유사 표현형으로부터 구조적이고 및 친-리모델링인 (pro-remodeling) 인 M2-유사 대식세포 표현형으로 리모델링 부위에 침투하는 대식세포의 활성 상태는 우호적인 아래쪽 (downs-tream)의 리모델링 결과의 예측인자로 보였다 (Brown et al., Acta Biomater 8(3) (2012) 978-87). 여기서 보여주는 결과는 초음파 공동화를 사용하여 생산된 ECM 하이드로겔은 M2-유사 대식세포 표현형을 촉진하는 능력을 유지함을 보여준다.
실시예 8
음향 하이드로겔의 감마 방사선 조사 (Gamma Irradiation of Acoustic Hydrogels)
음향 하이드로겔 (100mg/mL) 을 20kGy 감마 방사선 조사(gamma irradiation)로 실온에서 멸균시켰다. 시간에 따른 하이드로겔 "견고도 (stiffness)" 가 감마 방사선 조사 (20 kGy)된 및 비-멸균된 대조군 음향 하이드로겔 (피부 ECM 100mg/mL)에 대해 측정되었다. 샘플에 작은, 0.5% 진동 스트레인 (oscillatory strain)을 적용하여 저장 계수 (storage modulus) (("견고도 (stiffness)")) (G') 및 손실 계수 (loss modulus) (G'') 가 측정되었다. 세 가지 온도 프로화일이 테스트 되었다: 온도는 초기 저장 온도로부터 최종 온도로 빠르게 올렸다: 4 내지 37℃, 25 내지 37℃, 또는 37 내지 4℃ (도 20A). 시간 스윕 (time sweep)의 대표적인 그래프가 보인다 (도 20B). 테스트의 최종 5분에 걸쳐서 평균된, 평균 저장 및 손상 계수를 보여준다.
음향 하이드로겔의 형성 후에, 겔은 세슘-137 방사선조사기(Cesium-137 irradiator)에 넣었으며 및 실온에서 16시간 동안 2065 rads/분의 이온화 방사선 (ionizing radiation) 조사 되게 하여, 최종 방사선 용량이 20kGy되게 하였다.
놀랍게도 및 예기치 않게, 감마 방사선 조사는 음향 하이드로겔의 겔 형태로 남아 있는 능력에 영향을 주지 않았다. 반면에, 효소적으로 생산된 ECM 하이드로겔은 감마 방사선 조사되었을 때 겔로서 남아 있지 못하고 및 감마 방사선 조사된 ECM의 전-겔 (pre-gels)은 겔화 전에 감마 방사선 조사될 때 겔을 형성할수 없다.
실시예 9
점막 하부 액체 쿠션으로서의 음향 하이드로겔 (Acoustic Hydrogel as a Submucosal Fluid Cushion)
점막 하부 쿠션으로서 용도에 대해 평가되는 음향 하이드로겔은 피부 ECM (dECM) 분말 또는 식도 ECM (eECM) 분말 1그램 (실시예 3에서 서술된 대로 제조)을 50mL 원추형 튜브에서 10ml의 인산염 버퍼 된 생리 식염수 (phosphate buffered saline) (PBS)에 재현탁시켜 제조되었다. 샘플은 3분 동안 100% 진폭으로 1/8" 탐침로 장치되어 있는 FISHERBRANDTM 모델 120 소닉 디샘브레이터 (Model 120 Sonic Dismembrator) 를 사용하여 초음파 분해 하였다. 초음파 분해 후에, 샘플은 5ml 주사기로 옮기고 및 겔 형성을 유도하기 위해 4℃에서 배양시켰다.
마취는 아세프로마진 (Acepromazine) (0.01 mg/kg, SC) 및 케타민 ( ketamine) (5-11 mg/kg)으로 유도되었으며, 및 수술 면 (surgical plane) 마취는 기관 내의 튜브 (endotracheal tube)를 통하여 1-5% 이소플루오란 (Isofluorane) 으로 유지되었다. 과정 전체를 통하여 및 수술 후 기간 바로, 돼지는 2ml/kg/h의 락테이트된 링거액 (lactated Ringer's solution)을 I.V.로 투여하였다. 온도는 동물 밑에 놓인 히팅 패드 (heating pads)를 재순환하는 따듯한 물을 통해 조절되었다. 심장, 호흡률, 체온, 및 반응력과 같은 생리 계수들은 과정 동안에 모니터 되었다. 과정을 시작하기 전에 항생제 프로필락시스 (antibiotic prophylaxis)가 25mg/kg의 세파졸린 (Cefazolin)으로 투여되었다.
돼지는 반듯이 뉘 운 위치 (supine position)로 Pentax EG3430K 내시경과 함께 놓고 및 관으로 된 기관의 점막을 평가하기 위하여 Pentax EG3430K 내시경을 사용되었다. 기관에서 참고 지점을 동정한 후에, 점막 및 점막 하부는, 시각적인 대조를 제공하기 위하여 청색으로 염색한 음향 ECM 하이드로겔을 겔 형태로, 8mg/ml로, 점막 하부 공간에 올림퍼스 인젝터훠스 (Olympus Injectorforce) 4mm 23G 바늘로 주사하여, 절개 부위에 있는 밑에 층으로부터 분리시켰다. 대략 2-5 ml의 청색 겔이 한 부위당 주사되었다. 5cm 길이의 점막 전 둘레 (100%)가 밴드-라이게이션 EMR (band-ligation EMR) 기술을 사용하여 제거되었다. EMR을 위하여, 라이게이션 밴드 (ligation band)가 있는 쿡 두에테 키트 (Cook Duette Kit)가 사용되었다. 점막은 그 후 올가미 (snare)를 사용하여 절개되었다. 결과는 도 19A-19C에 보여준다.
우리의 발명의 원리가 적용되는 많은 가능한 실시예 관점에서, 제시된 실시예는 단지 본 발명의 실시예들이며 및 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주하여서는 안된다. 오히려, 본 발명의 범위는 하기의 청구항에서 정의된다. 우리는 그러므로 이 청구항의 범위 및 정신 내에 오는 모든 것을 우리의 발명으로서 청구한다.

Claims (77)

  1. 액상의 음향(acoustic) ECM 하이드로겔을 생성하기 위해 초음파 주파수를 사용하여 액체에 포유류 ECM을 가용화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  2. 상기 초음파 주파수는 온도 30℃ 내지 43℃사이에서 적용되는 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  3. 상기 초음파 주파수는 온도 35℃ 내지 40℃사이에서 적용되는 것을 특징으로 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 초음파 주파수는 온도 36℃ 내지 48℃사이에서 적용되는 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  5. 상기 초음파 주파수는 온도 약 37℃에서 적용되는 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포유류 ECM은 약 25mg/ml내지 약 600 mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 초음파 주파수는 20kHz 또는 그 이상인 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 초음파 주파수는 약 20kHz 내지 약 100 kHz 인 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 초음파 주파수는 적어도 30초 동안 적용되는 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  10. 액상의 음향(acoustic) ECM 하이드로겔을 생성하기 위해 약 37°C 이상의 온도에서 적어도 약 30초 동안 약 20 kHz 내지 약 100 kHz 주파수의 초음파를 사용하여 약 25 mg/ml 내지 약 600 mg/ml 의 농도로 액체에 포유류 ECM을 가용화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포유류 ECM은 적어도 약 60초 동안 초음파로 처리되는 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포유류 ECM은 동결건조된 포유류 ECM인 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 동결건조된 포유류 ECM은 분말로 분쇄된 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ECM은 약 10 μm 내지 약 2000 μm 범위의 조각으로서 제공되는 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ECM은 약 10 μm 내지 약 1000 μm 범위의 조각으로서 제공되는 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    약 37℃ 또는 그 이하로 온도로 액체상에서 상기 음향 ECM 하이드로겔을 냉각시켜, 이로써 음향 ECM 하이드로겔을 겔 상으로 생산하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 냉각은 4°C 내지 25°C 온도로 시키는 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 냉각은 온도 4°C 내지 37°C 이하로 시키는 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 초음파는 주파수가 약 20 kHz.인 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 초음파는 약 20 μm 내지 약 320 μm 의 진폭을 갖는 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 초음파는 약 36 μm 내지 약 180 μm 의 진폭을 갖는 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용해된 포유류 ECM을 액체에서 약 60초 내지 약 1시간동안 초음파로 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용해된 포유류 ECM을 액체에서 약 60초 동안 초음파로 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    포유류 ECM을 액체에서 25 mg/ml 내지 150 mg/ml 의 농도로 제공하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용해된 포유류 ECM을 액체에서 약 30 내지 45℃ 의 온도에서 초음파를 처리하는 것을단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용해된 포유류 ECM을 액체에서 약 35℃내지 40℃ 의 온도에서 초음파를 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  27. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용해된 포유류 ECM을 액체에서 약 36℃ 내지 38℃ 의 온도에서 초음파를 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  28. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용해된 포유류 ECM을 액체에서 약 37° C의 온도에서 초음파를 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  29. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용해된 포유류 ECM을 액체에서 약 40° C 의 온도에서 초음파를 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ECM은 인간 ECM 인 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 액체는 인산염 버퍼된 생리 식염수 (phosphate buffered saline) 인 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ECM은 방광 ECM (urinary bladder ECM), 소장 점막 하부 ECM (small intestinal submucosal ECM), 식도 ECM (esophageal ECM), 기도 ECM (trachea ECM), 간 ECM (liver ECM) 또는 피부 ECM (dermal ECM) 인 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ECM은 돼지 ECM 또는 소 ECM 인 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ECM은 돼지 식도 ECM 인 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ECM은 돼지 방광 ECM 인 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    액상의 상기 음향 ECM 하이드로겔을 냉각하기 전에 3차원 캐스트 (cast)에 넣는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  37. 제36항에 있어서,
    상기 캐스트는 적어도 4마이크론 (microns) 두께의 시트 (sheet)를 생산하는 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 음향 ECM 하이드로겔은 감마 방사선조사(irradiate)되는 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 음향 ECM 하이드로겔은 약 20 kGy로 감마 방사선조사되는 것을 특징으로 하는 세포외 기질(extracellular matrix (ECM)) 하이드로겔 제조 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 음향 ECM(acoustic ECM) 하이드로겔.
  41. 음향 ECM하이드로겔로서, 상기 하이드로겔은 열 가역적 (thermoreversible) 이고, 상기 하이드로겔은 온도 약 37℃ 이하에서 겔 상에 있고 및 온도 약 37℃ 이상에서 액체 상에 있는 것을 특징으로 하는 음향ECM 하이드로겔.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서,
    상기 저장 계수 (storage modulus)(G')는 손실 계수 (loss modules) (G'') 보다 약 10배 (an order of magnitude) 더 큰 것을 특징으로 하는 음향 ECM 하이드로겔.
  43. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 음향 하이드로겔의 점성은 온도 약 15°C 내지 약 37°C까지에서 증가하는 스트레스에 따라 감소하는 것을 특징으로하는 음향 ECM하이드로겔.
  44. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포유류 ECM 하이드로겔은 인간 ECM 하이드로겔인 것을 특징으로 하는 음향 ECM하이드로겔.
  45. 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ECM은 방광 ECM, 소장 점막 하부 ECM, 식도 ECM, 기도 ECM, 간 ECM 또는 피부 ECM 인 것을 특징으로 하는 음향 하이드로겔.
  46. 제40항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ECM 은 돼지 ECM 인 것을 특징으로 하는 음향 ECM 하이드로겔.
  47. 제40항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 음향 ECM 하이드로겔은 15℃에서 약 1400Pa*s 및 25℃에서 약 400Pa*s의 점성을 갖고, 및 상기 음향 ECM 하이드로겔은 ECM을 약 150mg/mL 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 음향 ECM 하이드로겔.
  48. 제40항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 음향 하이드로겔은 15℃에서 대략 2700Pa*s, 25℃에서 대략 800Pa*s 및 37℃에서 대략 600Pa*s의 저장 계수를 갖으며, 및 상기 음향은 ECM을 약 150mg/ml의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 음향 ECM 하이드로겔.
  49. 제40항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하이드로겔은 감마 방사선조사되는 것을 특징으로 하는 음향 ECM 하이드로겔.
  50. 제40항 내지 제49항 중 어느 한 항겔에 있어서,
    상기 하이드로겔은 외부 유래(exogenous) 프로테아제(protease) 또는 불활성화된(inactivated) 외부 유래 프로테아제를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 음향 ECM 하이드로겔.
  51. 제40항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하이드로겔은 외부 유래 펩신(pepsin), 트립신(trypsin) 또는 히알우로니데이즈(hyaluronidase) 또는 불활성화된 형태의 외부 유래 펩신, 트립신 또는 히알우로니데이즈를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 음향 ECM 하이드로겔.
  52. 제40항 내지 제51항 중 어느 한 항의 음향 ECM 하이드로겔의 치료적 유효량을 병변에 국소적으로 투여하여, 이로써 지혈을 증가시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 대상체의 병변에서 지혈을 증가시키는 방법.
  53. 제52항에 있어서,
    상기 병변부위는 수술적인 상처(surgical wound), 화상, 또는 외상성 손상(traumatic injury)인 것을 특징으로 하는 대상체의 병변에서 지혈을 증가시키는 방법.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서,
    상기 대상체는 인간인 것을 특징으로 하는 대상체의 병변에서 지혈을 증가시키는 방법.
  55. 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 병변부위는 대상체의 혈관, 간, 폐, 또는 피부인 것을 특징으로 하는 대상체의 병변에서 지혈을 증가시키는 방법.
  56. 제52항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 지혈은 대상체에 음향 ECM 하이드로겔을 투여한 후 약 10에서 약 100초 이내에 유도되는 것을 특징으로 하는 대상체의 병변에서 지혈을 증가시키는 방법.
    .
  57. 제40항 내지 제51항 중 어느 한 항의 음향 ECM 하이드로겔의 유효량으로 대식세포(macrophage)를 처리하여 M2 표현형을 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 대식세포에서 M2 표현형을 유도하는 방법.
  58. 제57항에 있어서,
    상기 개체는 인간인 것을 특징으로 하는 대식세포에서 M2 표현형을 유도하는 방법.
  59. 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 대상체의 기관(organ) 영역(region)의 고유근층으로부터 점막 및 점막 하부를 절개하는 방법:
    제40항 내지 제51항 중 어느 한 항의 음향 ECM 하이드로겔을 포함하는 약학적 조성물을 대상체의 기관에 점막 하부로 주사하여 기관 영역의 점막 하부와 기저 고유근층 사이에 쿠션을 형성하고, 기저 고유근층으로부터 점막 및 점막 하부를 절개하고 대상체의 기관 영역에서 염증을 억제하는 단계.
  60. 제59항에 있어서,
    상기 음향 ECM 하이드로겔은 방광 ECM, 소장 점막 하부 ECM, 식도 ECM, 기도 ECM, 간 ECM 또는 피부 ECM 으로부터 생산되는 것을 특징으로 하는 대상체의 기관(organ) 영역(region)의 고유근층으로부터 점막 및 점막 하부를 절개하는 방법.
  61. 제59항 또는 제60항에 있어서,
    상기 음향 ECM 하이드로겔에서 ECM 농도는 25 mg/ml 내지 약 600 mg/ml 인 것을 특징으로 하는 대상체의 기관(organ) 영역(region)의 고유근층으로부터 점막 및 점막 하부를 절개하는 방법.
  62. 제59항 또는 제60항에 있어서,
    상기 음향 ECM 하이드로겔에서 ECM 농도는 25 mg/ml 내지 약 100 mg/ml 인 것을 특징으로 하는 대상체의 기관(organ) 영역(region)의 고유근층으로부터 점막 및 점막 하부를 절개하는 방법.
  63. 제59항 내지 제62중 어느 한 항에 있어서,
    상기 음향 ECM 하이드로겔은 내시경적으로(endoscopically) 또는 카테터 (catheter)를 통하여 투여되는 것을 특징으로 하는 대상체의 기관(organ) 영역(region)의 고유근층으로부터 점막 및 점막 하부를 절개하는 방법.
  64. 제59항 내지 제63항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기관은 식도(esophagus), 위(stomach), 결장(colon), 직장(rectum) 또는 소장(small intestine)인 것을 특징으로 하는 대상체의 기관(organ) 영역(region)의 고유근층으로부터 점막 및 점막 하부를 절개하는 방법.
  65. 제64항에 있어서,
    상기 결장은 상행결장(ascending colon), 횡행결장(transverse colon), 하행결장(descending colon) 또는 시그모이드 결장(sigmoid colon)인 것을 특징으로 하는 대상체의 기관(organ) 영역(region)의 고유근층으로부터 점막 및 점막 하부를 절개하는 방법.
  66. 제64항에 있어서,
    상기 소장은 공장 (jejunum), 맹장(cecum), 또는 회장 (ileum)인 것을 특징으로 하는 대상체의 기관(organ) 영역(region)의 고유근층으로부터 점막 및 점막 하부를 절개하는 방법.
  67. 제59항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 기관으로부터 아데노카르시노마 (adenocarcinoma) 또는 육종 (carcinoma)을 절개하는 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 대상체의 기관(organ) 영역(region)의 고유근층으로부터 점막 및 점막 하부를 절개하는 방법.
  68. 제67항에 있어서,
    상기 기관은 위, 소장, 또는 결장인 것을 특징으로 하는 대상체의 기관(organ) 영역(region)의 고유근층으로부터 점막 및 점막 하부를 절개하는 방법.
  69. 제64항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기관은 결장인 것을 특징으로 하는 대상체의 기관(organ) 영역(region)의 고유근층으로부터 점막 및 점막 하부를 절개하는 방법.
  70. 제64항, 제65항, 또는 제69항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기관은 결장이고, 및 여기서 상기 방법은 폴립 (polyp) 또는 육종 (carcinoma) 을 결장으로부터 절개하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 대상체의 기관(organ) 영역(region)의 고유근층으로부터 점막 및 점막 하부를 절개하는 방법.
  71. 제59항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기관은 식도이고, 및 여기서 상기 방법은 식도의 고유근층으로부터 점막 및 점막 하부를 절개하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 대상체의 기관(organ) 영역(region)의 고유근층으로부터 점막 및 점막 하부를 절개하는 방법.
  72. 제71항에 있어서,
    상기 대상체는 바렛식도(Barrett's esophagus)를 가진 것을 특징으로 하는 대상체의 기관(organ) 영역(region)의 고유근층으로부터 점막 및 점막 하부를 절개하는 방법.
  73. 제59항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서,
    절개된 점막 및 점막 하부를 제거하기 위하여 상기 쿠션에 대한 내시경적 절제(resection) 과정을 수행하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 대상체의 기관(organ) 영역(region)의 고유근층으로부터 점막 및 점막 하부를 절개하는 방법.
  74. 제73항에 있어서,
    상기 절제 과정은 내시경적인 점막 절제 (endoscopic mucosal resection) 또는 내시경적인 점막 하부 절개 (endoscopic submucosal dissection) 인 것을 특징으로 하는 대상체의 기관(organ) 영역(region)의 고유근층으로부터 점막 및 점막 하부를 절개하는 방법.
  75. 제74항에 있어서,
    상기 방법은 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 대상체의 기관(organ) 영역(region)의 고유근층으로부터 점막 및 점막 하부를 절개하는 방법:
    음향 ECM 하이드로겔이 기관의 밑에 있는 근육층에 남아 있도록 이 쿠션을 나누고 및 점막 및 점막 하부를 기관의 부위로 부터 제거하는 것을 포함하는 방법.
  76. 제59항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체는 인간인 것을 특징으로 하는 대상체의 기관(organ) 영역(region)의 고유근층으로부터 점막 및 점막 하부를 절개하는 방법.
  77. 제59항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기관은 위장관(gastrointestinal tract)에 있는 것을 특징으로 하는 대상체의 기관(organ) 영역(region)의 고유근층으로부터 점막 및 점막 하부를 절개하는 방법.
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