CN116496402A - Mda5结合蛋白、制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了MDA5结合蛋白、制备方法和应用，涉及抗体技术领域。该结合蛋白具有重链可变区和/或轻链可变区，重链可变区包括互补决定区VH‑CDR1(SEQ ID NO：1～4任一种)、VH‑CDR2(SEQ ID NO：5～8任一种)和VH‑CDR3(SEQ ID NO：9～12)任一种；轻链可变区包括互补决定区VL‑CDR1(SEQ ID NO：13～14任一种)、VL‑CDR2(SEQ ID NO：15～16任一种)和VL‑CDR3(SEQ ID NO：17～20任一种)。该结合蛋白与MDA5具有良好的特异性结合能力；该MDA5结合蛋白的制备方法操作简单，耗时短，生产工艺可控，批间差小。

Description

MDA5结合蛋白、制备方法和应用
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，尤其是涉及一种MDA5结合蛋白、制备方法和应用。
背景技术
皮肌炎(dermatomyositis，DM)是一种主要累及横纹肌，以淋巴细胞浸润为主的非化脓性炎症病变，可伴有或不伴有多种皮肤损害。MDA5(抗黑色素瘤分化相关蛋白5)是一种胞质RNA解旋酶，是固有免疫防御病毒感染的重要蛋白。抗MDA5抗体是DM的特异性抗体，最常见于临床无肌病性皮肌炎患者中。MDA5抗体阳性皮肌炎指肺部影像学检查提示间质性肺炎，血清抗体检查可以发现抗MDA-5抗体阳性，这是一组以间质性肺炎和皮肤皮疹为特点的多系统炎性病变，属于皮肌炎的一个特殊亚型。有研究报道，62.5％的无肌病性皮肌炎患者血清中存在抗MDA5抗体。
抗MDA5抗体阳性皮肌炎是一种治疗难度比较大的疾病，患者早期病情比较轻微，随着时间的推移，如果不及时治疗可能会快速发展，而且预后效果比较差，对后期生活会有一定的影响，通过检测血清中该抗体水平，有助于对MDA5抗体阳性皮肌炎进行鉴别诊断，及时治疗。目前市面上常见的检测试剂盒中抗MDA5抗体多为免疫动物血清中提取纯化，或以人血清作为阴性或阳性对照，鉴于这两者的样本来源难度较大，操作复杂，开发出获取更简单，可规模化生产，广泛应用，尤其是可用于临床检测试剂盒中的高亲和力的抗MDA5的重组单抗，有着重要意义和价值。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供MDA5结合蛋白，该结合蛋白与MDA5具有良好的特异性结合能力。基于本发明提供的MDA5结合蛋白，本发明的目的还在于提供其应用。本发明的另一目的在于以操作更简单的方法开发结合活性好的MDA5结合蛋白，可用于MDA5抗原的鉴定，以及辅助进行MDA5抗体阳性皮肌炎诊断检测。
名词定义：
在本发明中“结合蛋白”此技术术语是指结合特定抗原的蛋白，其泛指包含互补决定区(CDR区)的一切蛋白及蛋白片段。蛋白及蛋白片段可以为抗体，“抗体”特别指全长抗体。“抗体”和“全长抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)和人源化(humanized)抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。非天然发生的抗体在本文中也被称为“重组抗体”，“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。
蛋白及蛋白片段也可以是包含抗体CDR的一部分或全部的抗原结合片段，其缺乏至少一些存在于全长链中的氨基酸但仍能够特异性结合至抗原。此类片段具生物活性，因为其结合至靶抗原，且可与其他抗原结合分子(包括完整抗体)竞争结合至给定表位。此类片段选自但不限于F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv(由VH和VL构成)，ScFv(单链抗体，VH和VL之间由一连接肽连接而成)、单域抗体(仅由VH组成)、dsFv(二硫键稳定性Fv抗体(disulfidestabilized Fv fragments,dsFv))、双特异抗体、纳米抗体和抗体最小识别单位中的任意一种。除上述功能片段外，还包括半衰期已增加的任何片段。
结合蛋白的“可变区(variable region)”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端识别并结合抗原的结构域，该区段氨基酸的组成和排列决定了抗体识别抗原的特异性。重链可变结构域可以被称为“VH”。轻链的可变结构域可以被称为“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分，并含有抗原结合位点。重链和轻链的可变区各自通过4个骨架区(framework region，FR)连接的3个互补性决定区(complementarity-determiningregion，CDR)(也被称作高变区)组成。骨架区和CDR的范围已被精确定义，例如在Kabat(参见《免疫重要的蛋白质的序列》((Sequences of Proteins of Immunological Interest)，E.Kabat等)和Chothia中，本领域众所周知的任何CDR确定方法，包括方法的组合，可以鉴别可变结构域的CDR。每个链中的CDR通过FR保持紧密靠在一起构成可变区，通常情况下，重链和轻链的可变区VL/VH可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
术语抗体的“恒定区”或“恒定结构域”表示单独的或组合的抗体轻链的恒定区或抗体重链的恒定区。抗体的重链具有一个可变结构域(VH)，继之以许多恒定结构域或区域，例如铰链、CH1、CH2、CH3和CH4中的一个或多个，CH1结构域邻近VH结构域且在抗体重链的铰链区的氨基端，且不形成抗体的Fc区的部分；铰链区包括将CH1结构域连接至CH2结构域的重链分子的部分；CH2的N端通常为CH3结构域，CH3结构域通常形成抗体的C-端部分，在一些抗体类型中，例如IgM和IgE中恒定区还包括CH4结构域。抗体的恒定区可以源自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD，以及它们的亚类和突变形式的恒定区。
本发明不限制MDA5结合蛋白的获得方式。在一些可选的实施方式中，利用编码MDA5结合蛋白的多核苷酸与载体连接后，在细胞表达能够获得相应抗体。可以将上述载体导入到真核细胞、尤其是哺乳动物细胞中，构建获得能够表达所述MDA5结合蛋白。在另一些可选的实施方式中，结合蛋白还可以通过本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过肽合成，如自动肽合成仪获得(例如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪)；抗原结合片段还可选地通过抗原结合分子(包括完整抗体)的酶裂解产生，例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶裂解；或化学裂解产生，例如通过化学还原分裂二硫键的方法获得上述的抗原结合片段。
术语“特异性识别”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”或其类似表述是指结合蛋白对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，结合蛋白以大约小于10-5M，例如大约小于10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的Kd值结合。使用本领域中充分确立的方法可以确定抗体的Kd值。用于评价配体诸如抗体对靶标的结合能力的其它标准测定是本领域已知的，包括例如，ELISA、蛋白质印迹、RIA和流式细胞计量术分析。
本文中术语“多核苷酸”指的是任何长度的核苷酸的聚合物形式，多核苷酸包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。多核苷酸的实例包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体或者包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生化修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸编码上述MDA5结合蛋白，编码可选地为编码正义链或反义链。多核苷酸可以是天然存在的、合成的、重组的或它们的任意组合。术语“多核苷酸”和“核酸”本文中可互换地使用。
本文中术语“载体(vector)”是指，可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。
所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。
本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。后代可以由于天然的、偶然的或故意的突变不一定与原代细胞完全相同，在形态学上和/或在基因组DNA上与原代细胞存在差异。“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物。
本文中，与多肽或核酸相关联的术语“纯化的”或“分离的”是指多肽或核酸不是处于其天然介质中或天然形式下。因此，术语“分离的”包括从其原始环境，例如如果它是天然存在的，从天然环境取出的多肽或核酸。例如，分离的多肽通常不含通常与其结合或通常与其混合或在溶液中的至少某些蛋白质或其他细胞组分。分离的多肽包括细胞裂解物中包含的天然生产的所述多肽，纯化或部分纯化形式的所述多肽，重组多肽，被细胞表达或分泌的所述多肽，以及在异源宿主细胞或培养物中的所述多肽。与核酸相关联，术语分离的或纯化的指示例如所述核酸不在其天然的基因组背景中(例如在载体中，作为表达盒，连接到启动子，或人工引入到异源宿主细胞中)。
为解决上述技术问题，提供如下示例性实施方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种MDA5结合蛋白，其具有重链可变区和/或轻链可变区；
所述重链可变区包括互补决定区VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3；所述轻链可变区包括互补决定区VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3；
所述VH-CDR1的氨基酸序列为G-Y-X1-I-K-X2-Y-L，其中X1为A或T，X2为N或S，如SEQ ID NO：1～4所示；
所述VH-CDR2的氨基酸序列为I-X3-T-Y-X4-G-N-T，其中X3为N或S，X4为S或G，如SEQ ID NO：5～8所示；
所述VH-CDR3的氨基酸序列为A-R-R-X5-P-E-X6-A-Y，其中X5为G或L，X6为F或G，如SEQ ID NO：9～12所示；
所述VL-CDR1的氨基酸序列为Q-S-I-V-X7-S-N-G-N-T-Y，其中X7为A或I，如SEQ IDNO：13或SEQ ID NO：14所示；
所述VL-CDR2的氨基酸序列为K-X8-S，其中X8为A，氨基酸序列为KAS(SEQ ID NO:15)；或X8为V，氨基酸序列为KVS(SEQ ID NO:16)；
所述VL-CDR3的氨基酸序列为Q-Q-S-X9-H-F-P-X10-T，其中X9为S或T，X10为P或Q，如SEQ ID NO：17～20所示。
所述MDA5结合蛋白可选自全长抗体、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、dsFv、双特异抗体、纳米抗体和抗体最小识别单位中的任意一种。
作为本发明的优选实施方式，所述MDA5结合蛋白与MDA5具有Kd≤2.2×10-6mol/L的亲和力。
作为本发明的优选实施方式，MDA5结合蛋白中各互补决定区的突变位点选自下述突变组合1～32中的任意一种：
作为本发明的优选实施方式，各互补决定区的突变位点选自上表中突变组合1～5，7～8，10～17，19～20，22～23，25～27或29～32中的任意一组，例如可以为但不限于为选自突变组合1、突变组合2、突变组合3、突变组合4、突变组合5、突变组合7、突变组合8、突变组合10、突变组合11、突变组合12、突变组合13、突变组合14、突变组合15、突变组合16、突变组合17、突变组合19、突变组合20、突变组合22、突变组合23、突变组合25、突变组合26、突变组合27、突变组合29、突变组合30、突变组合31或突变组合32中的任意一组；更优选上述突变组合14、16、19、23、30中的任意一组，包含突变组合14、16、19、23和30的抗体与MDA5具有Kd≤1×10-8mol/L的亲和力，Kd值依次分别为6.4×10-9mol/L，1.9×10-9mol/L，7.9×10- 9mol/L，6.4×10-9mol/L和6.4×10-9mol/L。
作为本发明的优选实施方式，MDA5结合蛋白还包括骨架区，骨架区的优选氨基酸序列组成如下：重链可变区包括骨架区WH-FR1、WH-FR2、WH-FR3和WH-FR4；
WH-FR1的氨基酸序列为QVQLQQSGVELVRPGTSVKVSCKAS(SEQ ID NO：21)；
WH-FR2的氨基酸序列为IEWLKQRPGQGLEWIGV(SEQ ID NO：22)；
WH-FR3的氨基酸序列为KYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFC(SEQ ID NO：23)；
WH-FR4的氨基酸序列为WGQGTLVTVSA(SEQ ID NO：24)。
重链可变区包括依次排列的如下结构域：WH-FR1、VH-CDR1、WH-FR2、VH-CDR2、WH-FR3、VH-CDR3和WH-FR4。
轻链可变区包括骨架区VL-FR1、VL-FR2、VL-FR3和VL-FR4；
VL-FR1的氨基酸序列为DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSS(SEQ ID NO：25)；
VL-FR2的氨基酸序列为LEWYLQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO：26)；
VL-FR3的氨基酸序列为NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC(SEQ ID NO：27)；
VL-FR4的氨基酸序列为FGGGTKLEIK(SEQ ID NO：28)。
轻链可变区包括依次排列的如下的结构域：VL-FR1、VL-CDR1、VL-FR2、VL-CDR2、VL-FR3、VL-CDR3、VL-FR4。
作为本发明的优选实施方式，MDA5结合蛋白为包括恒定区的抗体或抗原结合片段。
MDA5结合蛋白的恒定区可选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD任何其中之一恒定区的序列，以及它们的亚类和突变形式。恒定区的种属来源例如可以为但不限于为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。
作为本发明的可选的实施方式，重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：29、SEQID NO：31、SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：35。
作为本发明的可选的实施方式，轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：30、SEQID NO：32、SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：36。
具有上述重链可变区和/或轻链可变区氨基酸序列的MDA5结合蛋白，结合活性、表达量，以及纯化过程中蛋白稳定性(是否出现沉淀)均较优。
作为本发明的一些可选实施方式，MDA5结合蛋白还包括恒定区。其中MDA5结合蛋白中的重链恒定区可选地来源于人，来源于人的重链恒定区的氨基酸序列例如SEQ ID NO：37所示；MDA5结合蛋白中的轻链恒定区可选地来源于鼠，来源于鼠的轻链恒定区的氨基酸序列例如SEQ ID NO：38所示。
作为本发明的一些可选实施方式，所述MDA5结合蛋白为人鼠嵌合抗体，其重链包括氨基酸序列如SEQ ID NO：37所示来源于人的重链恒定区，其轻链包括氨基酸序列如SEQID NO：38所示的鼠的轻链恒定区。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种生物材料，包括多核苷酸、载体、细胞；其中，多核苷酸编码上述MDA5结合蛋白；载体携带所述多核苷酸；细胞携带所述多核苷酸、含有所述载体或能够表达所述MDA5结合蛋白。利用编码MDA5结合蛋白的多核苷酸与载体连接后，可以将上述载体导入到真核细胞、尤其是哺乳动物细胞中，构建获得能够表达MDA5结合蛋白的细胞系，在细胞表达能够获得相应蛋白。在一些可选的实施方式中，所述宿主细胞为293细胞(人肾上皮细胞系)或CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了与上述MDA5结合蛋白的制备方法，包括：将编码含有所述MDA5结合蛋白的多核苷酸转化至宿主细胞并表达，通过纯化获得MDA5结合蛋白。
作为本发明的一些可选实施方式，根据需要合成含有所述MDA5结合蛋白编码基因的多核苷酸，和/或，根据需要制备合适的表达载体，将表达载体转化至所需的宿主细胞中并表达，通过纯化可得到所述MDA5结合蛋白。
作为本发明的一些可选实施方式，所述的MDA5结合蛋白的多核苷酸包括重链基因表达质粒和轻链基因表达质粒，将所述重链基因表达质粒和轻链基因表达质粒按照1：(1～2)的摩尔比转化至宿主细胞，细胞表达后纯化获取所述MDA5结合蛋白，其中宿主细胞优选为真核细胞，更优选为哺乳动物细胞，进一步优选为293细胞或CHO细胞。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述MDA5结合蛋白、上述生物材料在如下(a)～(e)中任意一种的应用；
(a)制备检测MDA5的试剂或试剂盒；
(b)制备诊断皮肌炎的试剂或试剂盒；皮肌炎优选包括抗MDA5抗体阳性皮肌炎；
(c)非诊断和治疗目的的检测MDA5；
(d)用于制备MDA5抗体检测质控品；
(e)制备用于示踪的组合物。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种试剂或试剂盒，该试剂或试剂盒包含上述MDA5结合蛋白；和/或，上述生物材料。作为本发明的优选实施方式，所述试剂为质控品或用于示踪的组合物。
所述用于示踪的组合物包含所述MDA5结合蛋白和标记物；所述标记物包括酶、发光标记、荧光微球、彩色微球、乳胶微球、胶体金、量子点、生物素或链霉亲和素、放射性核素、放射性造影剂、顺磁离子、金属和光敏剂中的一种或多种。试剂或试剂盒中用于示踪的组合物中MDA5结合蛋白和标记物可以连接也可以不连接；当不连接时，若需要连接则待使用时再进行连接。所述连接可以但不限于化学连接或物理吸附。
酶的实例例如可以为但不限于为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶，发光标记例如可以为但不限于为荧光蛋白、合成类小分子或聚合物染料等，具体的实例包括但不限于Alexa350、Alexa 405、Alexa 430、Alexa 488、Alexa 555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green514、Pacific Blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红中的一种或多种。荧光微球、彩色微球和乳胶微球分别独立的选自本领域可接受的产品，例如来源于市售的产品。放射性核素包括但不限于110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb和83Sr中的一种或多种。顺磁离子包括但不限于铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)中的一种或多种。
可以理解的是，本发明提供的试剂或试剂盒中除去上述抗体组合物，以及可选的固相载体，还任选地包括本领域用于检测反应的，本领域技术人员熟知的试剂和/或耗材，例如可以为但不限于为缓冲试剂、盐、二抗、显色底物、封闭液、洗涤液、溶剂、洗脱液、偶联剂、阴性对照、阳性对照、标准品、质控品和标记物中的一种或多种。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过噬菌体展示技术筛选出对MDA5蛋白结合活性高的结合蛋白，然后在宿主细胞中表达，经过对筛选得到的MDA5结合蛋白序列进行分析，得到相应的蛋白序列特征。根据提供的相应蛋白序列特征，本领域人员可制备相应的含有相关序列的MDA5结合蛋白，操作简单，耗时短，且生产工艺可控，可尽量减少产品批间差。
本发明公开了一种特异性识别结合MDA5的结合蛋白，与MDA5抗原具有Kd≤9.3×10-6mol/L的亲和力，在一些优选的CDR组合中，结合蛋白与MDA5的Kd低于10-9mol/L，最小为1.9×10-9mol/L。
将本发明公开的MDA5结合蛋白用于检测试剂盒中的质控品，可缓解偶联效率低的问题，降低生产成本，稳定产品质量，并能够显著提高反应值；另一方面相较于直接使用人血清，也能够避免样本来源和高成本问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中用于构建文库的重链(Fd)与轻链(κ、λ)的核酸电泳图；
图2为本发明实施例1中用于构建文库的Fab基因片段的核酸电泳图；
图3为本发明实施例3中抗MDA5重组单抗的SDS-PAGE蛋白电泳图；
图4为本发明实施例4中ELISA测定重组单抗与MDA5蛋白的结合情况分析，Ab-MDA5为重组单抗对MDA5抗原的结合活性，Ab-BSA为重组单抗对对照蛋白BSA的非特异性结合活性。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。
实施例1：Fab型噬菌体文库的构建
(1)MDA5抗原免疫后的小鼠取脾，使用小鼠淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。
(2)抽提RNA：取1×106细胞，提取淋巴细胞的总RNA。
(3)反转录：对提取的总RNA进行反转录，合成cDNA。
(4)抗体基因片段扩增：以cDNA为模板，通过特异性扩增引物，扩增抗体的κ、λ轻链及重链的VH-CH1(Fd)区。轻链各扩增6管，重链扩增21管。
20μL反应体系：1μL cDNA，0.8μLPrime F，0.8μLPrime R，10μL 2×phanta maxmaster mix，7.4μl Nuclease-Free Water；
反应程序：解链95(30s，退火55 30sec，延伸72 45s，30个循环。
反应结束后，体系中加入loading buffer，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳图如图1所示，目的条带约750bp。
切下目的条带，分别回收抗体重链(Fd)基因片段和轻链基因片段(κ、λ)。
(5)抗体轻链及重链基因片段通过ovrlapping PCR组成完整Fab基因片段。
25μl反应体系：轻链30ng，linker 4.3ng，30ng重链，0.5μl sfiⅠF(上游引物)，0.5μl sfiⅠR(下游引物)，12.5μl 2×phanta max master mix，Nuclease-Free Water补至总体系25μl。
反应程序：解链95℃30s，退火55℃30sec，延伸72℃90s，30个循环。反应结束后，体系中加入loading buffer，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳图如图2所示，目的条带约1500bp。切下目的条带，回收抗体Fab片段。
上游引物sfiⅠF：5’>GAGCAGGAGCATAGGAGGATCGGGCGGCGGCC<3’(SEQ ID NO：39)；
下游引物sfiⅠR：5’>CCATGGCAATGGTGATTCTGCTGCGCGGCCTGGCC<3’(SEQ ID NO：40)。
(6)质粒构建：将抗体Fab片段及pComb3xSS质粒分别用sfiⅠ酶酶切，按照酶切片段与质粒摩尔比3:1的比例混匀，加入T4 DNA ligase，16℃连接过夜。
(7)文库构建：回收上步中连接产物，去离子水洗脱。取1.5μl回收产物，加入TG1感受态，混匀后转移至电转杯中电转，参数选择：Bac-Ec1。电转结束37℃活化培养1h，转移活化后的菌液至200ml 2×YT培养基中，加入1/1000氨苄抗生素及终浓度为2％的葡萄糖溶液，37℃、220rpm培养至OD600＝0.6。加入20倍菌数的辅助噬菌体M13K07。混匀后，置于37℃摇床中静止感染45min。离心15min收菌，用200mL新的2×YT+Amp+Kana培养基重悬沉淀，30℃，220rpm摇菌14h进行phage扩增。第二天离心收上清，加入1/4体积20％PEG6000沉降噬菌体，并用PBS重悬，得到噬菌体展示文库。
实施例2利用噬菌体展示库淘选抗MDA5抗体
(1)偶联生物素的MDA5蛋白为靶标抗原，与SA磁珠一起孵育1h后，反应体系中加入1×1012个实施例1中获得的噬菌体，孵育1h，特异性的噬菌体被抗原捕获。用PBS+0.05％Tween-20清洗10次，去掉未结合以及结合弱的噬菌体。
(2)结合抗原的磁珠加入TG1菌液中，37℃静置感染45min，之后37℃，220rpm活化培养1h。再加入葡萄糖(终浓度为2％)和1/1000氨苄抗生素，37℃，220rpm摇菌3h。
(3)向菌液中加入10μL M13K07，37℃静置感染45min。
(4)6000×g，离心10min，用10mL 2×YT+Amp+kana培养基重悬，30℃，220rpm，摇菌14h扩增噬菌体。第二天离心收上清，加入1/4体积20％PEG6000沉降噬菌体，并用PBS重悬，得到第一轮筛选的噬菌体。
(5)用第一轮筛选得到的噬菌体，重复步骤1～4，进行第2轮筛选，另外需取适量静置感染后的菌液涂布氨苄平板。
(6)单克隆鉴定：第二轮筛选涂布平板中挑选单克隆于96孔深孔板中，过夜摇菌扩增噬菌体。
包板：MDA5抗原包被ELISA板，同时以BSA作为对照蛋白包板，4℃过夜。封闭：第二天弃去包被液，PBST(PBS+0.05％ Tween 20)洗板3次，拍干，加入3％milk，37℃封闭2h。
一抗准备：96孔深孔板离心，取上清稀释于终浓度为1％milk中，混匀后作为一抗备用。
一抗孵育：弃去封闭液，PBST洗板3次，拍干，加入一抗，37℃孵育2h。
二抗孵育：弃去一抗，PBST洗板5次，拍干，加入1:4000稀释的Anti-M13 Antibody(HRP)二抗，37℃孵育1h。弃去二抗，PBST洗板5次，拍干，加入显色底物显色，15min后加入终止液停止反应，进行OD值读数。
(7)挑选读值高(MDA5抗原孔OD值>1)且非特异性结合低(BSA对照蛋白孔OD值<0.5)的克隆送测序。
轻链测序引物：Bomp：5’>GTGTGGAATTGTGAGCGG<3’(SEQ ID NO：41)；
重链测序引物：PELB：5’>ACCTATTGCCTACGGCAGCCG<3’(SEQ ID NO：42)。
测序结果显示：所述抗体重链可变区包含氨基酸如SEQ ID NO：33所述的序列，所述抗体轻链可变区包含氨基酸如SEQ ID NO：34所述的序列(即各互补决定区的突变位点为突变组合1)。
实施例3抗MDA5重组单抗的表达纯化
将实施例2测序获得候选抗体Fab区序列后进行基因合成：载体选择PTT5质粒，以EcoRI+BamHI作为克隆位点，插入轻链基因片段。重链的CH1替换为人IgG1的CH1，并在C端融合人IgG1的Fc(序列如SEQ ID NO：37所示，为人源序列，)，构建完整的重链片段插入PTT5质粒。轻链恒定区序列如SEQ ID NO：38所示，为鼠源序列。
采用哺乳动物细胞293F表达体系表达。
(1)质粒抽提：基因合成的质粒转化TOP10感受态，37℃过夜培养，第二天使用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒。
(2)转染前1天接种120mL 293F细胞于500mL悬浮细胞培养瓶，控制细胞密度为1×106个/ml。
(3)第二天将40μg重链质粒及80μg轻链质粒稀释于3mL转染buffer中轻轻混匀，再将480μL PEI稀释于3mL转染buffer，轻轻混匀。将稀释好的PEI缓缓加入稀释好的质粒中，轻轻混匀，室温孵育20分钟，逐滴加入细胞中。将细胞放入悬浮培养箱中，98转/分钟，37℃，5％ CO2悬浮培养。
(4)6天后收集培养基上清，用rProtein A填料纯化IgG，0.1M Glycine(pH3.0)洗脱，加入1M Tris(PH8.0)进行中和。洗脱完成后用的超滤离心管置换为PBS缓冲液并浓缩，测定蛋白浓度，经SDS-PAGE验证，结果如图3所示。
实施例4ELISA测定重组单抗与MDA5抗原的结合活性
进一步测定实施例3重组单抗与MDA5抗原的结合活性，方法如下：
(1)将MDA5蛋白(2μg/mL)包被在ELISA板上，同时包被BSA作为非特异性结合对照，4℃孵育过夜。
(2)弃去包被液，PBST洗3次，拍干，加入3％milk，37℃封闭2h。
(3)弃去封闭液，PBST洗3次，拍干，加入500nM起始3倍梯度稀释的抗体，37℃孵育1.5h。
(4)弃去一抗，PBST洗5次，拍干，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗人IgG二抗，37℃孵育1h。
(5)弃去二抗，PBST洗5次，拍干，加入显色底物显色，15min后加入终止液停止反应，OD值读数。
(6)以OD值为纵坐标，抗体摩尔浓度取对数作为横坐标，进行非线性拟合作图。如图4所示，抗体的EC50约为0.07nM。
实施例5竞争ELISA测定不同突变重组单抗亲和力
进一步分析、设计得到所述抗体重链互补决定区可进行如下突变：
VH-CDR1为G-Y-X1-I-K-X2-Y-L，其中X1为A或T，X2为N或S，如SEQ ID NO：1～4所示；
VH-CDR2为I-X3-T-Y-X4-G-N-T，其中X3为N或S，X4为S或G，如SEQ ID NO：5～8所示；
VH-CDR3为A-R-R-X5-P-E-X6-A-Y，其中X5为G或L，X6为F或G，如SEQ ID NO：9～12所示。
其中，X1～X6分别为待突变位点。
重链可变区的骨架区如下：
VH-FR1：QVQLQQSGVELVRPGTSVKVSCKAS(SEQ ID NO：21)；
VH-FR2：IEWLKQRPGQGLEWIGV(SEQ ID NO：22)；
VH-FR3：KYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFC(SEQ ID NO：23)；
VH-FR4；WGQGTLVTVSA(SEQ ID NO：24)。
进一步分析、设计得到所述抗体轻链互补决定区可进行如下突变：
VL-CDR1为Q-S-I-V-X7-S-N-G-N-T-Y，其中X7为A或I，如SEQ ID NO：13或SEQ IDNO：14所示；
VL-CDR2为K-X8-S，其中X8为A或V，如SEQ ID NO：15(KAS)或SEQ ID NO：16(KVS)所示；
VL-CDR3为Q-Q-S-X9-H-F-P-X10-T，其中X9为S或T，X10为P或Q，如SEQ ID NO：17～20所示。
其中，X7～X10分别为待突变位点。
轻链可变区的骨架区如下：
VL-FR1：DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSS(SEQ ID NO：25)；
VL-FR2：LEWYLQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO：26)；
VL-FR3：NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC(SEQ ID NO：27)；
VL-FR4；FGGGTKLEIK(SEQ ID NO：28)。
合成含有不同突变可变区的重链或轻链核酸序列；其中，重链可变区和骨架按如下排列：[FR1-(VH-CDR1)-FR2-(VH-CDR2)-FR3-(VH-CDR3)-FR4]，重链的CH1替换为人IgG1的CH1，并在C端融合人IgG1的Fc，如SEQ ID NO：37所示；轻链可变区和骨架按如下排列：[FR1-(VL-CDR1)-FR2-(VL-CDR2)-FR3-(VL-CDR3)-FR4]，轻链恒定区序列如SEQ ID NO：38所示。按照实施例3的方法将重链或轻链核酸序列分别插入相应的载体，并转染细胞进行重组单抗的表达纯化，制备含有如下表1突变组合的不同重组单抗。
表1不同重组单抗互补决定区的突变组合情况
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抗体与抗原的结合是一个可逆过程：当反应达到平衡时，解离常数Kd＝[Ab][Ag]/[Ab·Ag]，[Ab·Ag]表示反应平衡时抗原抗体结合物的浓度，[Ab]表示反应平衡时游离抗体的浓度，[Ag]表示反应平衡时游离抗原的浓度。设抗原初始浓度为a0，抗体初始浓度为i0，反应达到平衡时，游离抗原浓度为a，游离抗体浓度为i，抗体结合率B＝(A0-Ai)/A0(A为吸光度值)，a0-i0B＝Kd×B/(1-B)。
进一步通过竞争ELISA测定抗体亲和力的实验测定含有各突变组合的重组单抗的亲和力，步骤如下：
(1)将0.1μg/ml的MDA5蛋白包被酶标板，每孔100μL，4℃过夜；
(2)用5％的脱脂奶粉室温封闭2h，PBST洗涤；
(3)MDA5蛋白从20μg/ml倍比10个梯度，抗MDA5抗体浓度为50ng/ml，两者混合使体积为100μL，37℃下反应1.5h；
(4)将上述反应的混合液加入到上述包被的酶标板中，37℃反应0.5h，PBST洗板；
(5)加入酶标二抗，孵育1h，PBST洗涤；
(6)加入显色底物显色，显色15min后加入终止液停止反应，进行OD值读数。以B/(1-B)为横坐标，a0-i0B为纵坐标作图，斜率为解离常数Kd。结果如表2所示。
表2各种突变组合亲和力分析数据
位点 Kd(M) 位点 Kd(M)
突变组合1 6.2E-8 突变组合17 4.4E-7
突变组合2 7.3E-8 突变组合18 9.3E-6
突变组合3 5.3E-8 突变组合19 7.9E-9
突变组合4 1.5E-8 突变组合20 7.8E-7
突变组合5 1.8E-7 突变组合21 4.6E-6
突变组合6 6.4E-6 突变组合22 6.4E-8
突变组合7 9.8E-8 突变组合23 6.4E-9
突变组合8 5.6E-7 突变组合24 5.6E-6
突变组合9 4.5E-6 突变组合25 5.8E-8
突变组合10 2.7E-8 突变组合26 3.8E-7
突变组合11 8.6E-8 突变组合27 5.5E-6
突变组合12 6.3E-8 突变组合28 2.9E-6
突变组合13 2.3E-8 突变组合29 2.5E-7
突变组合14 6.4E-9 突变组合30 6.4E-9
突变组合15 8.2E-8 突变组合31 7.3E-8
突变组合16 1.9E-9 突变组合32 2.2E-6
由表2可得，突变组合16、14、23、30和突变组合19的Kd可达E-9，其中突变组合16的重组突变抗体Kd最小(为1.9E-9)，亲和力最高；突变组合18的Kd最大(9.3E-6)，亲和力最低。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.MDA5结合蛋白，其特征在于，具有重链可变区和/或轻链可变区；
所述重链可变区包括互补决定区VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3；所述轻链可变区包括互补决定区VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3；
所述VH-CDR1的氨基酸序列为G-Y-X1-I-K-X2-Y-L，其中X1为A或T，X2为N或S，如SEQ IDNO：1～4所示；
所述VH-CDR2的氨基酸序列为I-X3-T-Y-X4-G-N-T，其中X3为N或S，X4为S或G，如SEQ IDNO：5～8所示；
所述VH-CDR3的氨基酸序列为A-R-R-X5-P-E-X6-A-Y，其中X5为G或L，X6为F或G，如SEQID NO：9～12所示；
所述VL-CDR1的氨基酸序列为Q-S-I-V-X7-S-N-G-N-T-Y，其中X7为A或I，如SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14所示；
所述VL-CDR2的氨基酸序列为K-X8-S，其中X8为A，氨基酸序列为KAS；或X8为V，氨基酸序列为KVS；
所述VL-CDR3的氨基酸序列为Q-Q-S-X9-H-F-P-X10-T，其中X9为S或T，X10为P或Q，如SEQ ID NO：17～20所示。
2.根据权利要求1所述的MDA5结合蛋白，其特征在于，所述MDA5结合蛋白与MDA5具有Kd≤2.2×10-6mol/L的亲和力。
3.根据权利要求1所述的MDA5结合蛋白，其特征在于，所述MDA5结合蛋白中各互补决定区的突变位点选自下述突变组合1～32中的任意一种：
优选地，各互补决定区的突变位点选自突变组合1～5，7～8，10～17，19～20，22～23，25～26或29～32中的任意一组；
优选地，各互补决定区的突变位点选自突变组合14、16、19、23、30中的任意一组。
4.根据权利要求1所述的MDA5结合蛋白，其特征在于，所述MDA5结合蛋白还包括骨架区；
优选地，所述重链可变区还包括骨架区WH-FR1、WH-FR2、WH-FR3和WH-FR4；所述轻链可变区还包括骨架区VL-FR1、VL-FR2、VL-FR3和VL-FR4；
WH-FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示；WH-FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示；WH-FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示；WH-FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示；
VL-FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示；VL-FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示；VL-FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示；VL-FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示；
优选地，所述重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：35；
优选地，所述轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：36。
5.根据权利要求1～4任一项所述的MDA5结合蛋白，其特征在于，还包括恒定区；
优选地，所述MDA5结合蛋白中的重链恒定区来源于人；
优选地，来源于人的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：37所示；
优选地，所述MDA5结合蛋白中的轻链恒定区来源于鼠；
优选地，来源于鼠的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：38所示。
6.根据权利要求5所述的MDA5结合蛋白，其特征在于，所述MDA5结合蛋白为人鼠嵌合抗体，其重链包括氨基酸序列如SEQ ID NO：37所示来源于人的重链恒定区，其轻链包括氨基酸序列如SEQ ID NO：38所示的鼠的轻链恒定区。
7.生物材料，其特征在于，包括多核苷酸、载体或细胞；
所述多核苷酸编码权利要求1～6任一项所述的MDA5结合蛋白；
所述载体携带所述多核苷酸；
所述细胞携带所述多核苷酸，或含有所述载体，或能够表达权利要求1～6任一项权利要求所述的MDA5结合蛋白；
优选地，所述细胞为哺乳动物细胞；
优选地，所述哺乳动物细胞包括293细胞或CHO细胞。
8.MDA5结合蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将编码包括如权利要求1～6任一项所述的MDA5结合蛋白的多核苷酸转化至宿主细胞并表达，通过纯化获得所述MDA5结合蛋白；
优选地，所述的MDA5结合蛋白的多核苷酸包括重链基因表达质粒和轻链基因表达质粒，所述重链基因表达质粒和轻链基因表达质粒按照1：(1～2)的摩尔比转化至宿主细胞，通过纯化获取所述MDA5结合蛋白；
优选地，所述宿主细胞为真核细胞，优选为哺乳动物细胞；
优选地，所述哺乳动物细胞包括293细胞或CHO细胞。
9.权利要求1～6任一项所述的MDA5结合蛋白、或权利要求7所述的生物材料在如下(a)～(e)中任意一种的应用；
(a)制备检测MDA5的试剂或试剂盒；
(b)制备诊断皮肌炎的试剂或试剂盒；
(c)非诊断和治疗目的的检测MDA5；
(d)用于制备MDA5抗体检测质控品；
(e)制备用于示踪的组合物；
优选地，所述皮肌炎包括抗MDA5抗体阳性皮肌炎。
10.试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包含权利要求1～6任一项所述的MDA5结合蛋白；和/或，权利要求7所述的生物材料；
优选地，所述试剂为质控品或用于示踪的组合物；
所述用于示踪的组合物包含权利要求1～6任一项所述的MDA5结合蛋白和标记物；
所述标记物包括酶、发光标记、荧光微球、彩色微球、乳胶微球、胶体金、量子点、生物素或链霉亲和素、放射性核素、放射性造影剂、顺磁离子、金属和光敏剂中的一种或多种。
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