CN116496398A - 一种特异性结合CD44的v5外显子的抗体及其用途 - Google Patents
一种特异性结合CD44的v5外显子的抗体及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种特异性结合人CD44中v5外显子的抗体或其片段。还涉及含所述抗体或其片段的嵌合抗原受体分子，编码所述抗体或其片段以及所述嵌合抗原受体分子的核酸分子、重组载体、细胞，或包含所述抗体的抗体药物偶联物。还涉及所述抗体、嵌合抗原受体分子或所述药物偶联物的用途。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及抗体领域。本发明提供了一种新的单克隆抗体，其能够特异性结合人CD44v，具体而言结合人CD44v中的v5外显子。
背景技术
恶性肿瘤细胞表面表达着一些异于普通健康细胞的抗原，这些抗原可以作为单克隆抗体的良好靶点。肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen；TAA)、肿瘤特异性抗原(tumor-specific antigen，TSA)的发现与鉴定对于肿瘤治疗，尤其是抗体介导的靶向治疗至关重要。
CD44是一种非激酶跨膜糖蛋白，在多种组织细胞表面广泛分布，并在包括肿瘤干细胞在内的几种细胞类型中过表达，并且经常以被认为在癌症发展和进程中起作用的其他剪接变体的形式表达。透明质酸是CD44的主要配体，与CD44结合并激活CD44，从而激活细胞信号传导途径，进而诱导细胞增殖、增加细胞存活率、调节细胞骨架变化并增强细胞迁移性。
CD44具有多种同种型，其通过不同的剪切形成。在小鼠CD44的20个外显子中，前5个外显子和后5个外显子是较为恒定的外显子，而位于中部的10个外显子，即外显子6至外显子15，构成了可变区或v区。这10个外显子编码的氨基酸序列分别对应于v1至v10区，也可称为v1至v10结构域。人CD44共有19个外显子，缺少一个对应于小鼠外显子6(v1结构域)的外显子，因此人CD44的可变区为位于中部的9个外显子，即人的外显子6至外显子14。与这9个外显子对应的氨基酸序列在本文上下文中分别称为v2至v10区结构域，其中v2对应于人外显子6，v3对应于人外显子7，以此类推。不含v2-v10区域的同种型为CD44标准型(CD44standard；CD44s)。其他剪切变体可统称为CD44v(CD44 variant)，其主要区别在于可变区部分所包含的外显子不同。但是，对于CD44剪切事件的研究还大多停留在检测阶段。主要原因是CD44可变剪切的方式很多，并且缺乏有效的外显子特异性检测抗体，主要的评估手段还是以RT-PCR为主。
CD44的剪接变体是非常具有临床应用潜力的肿瘤相关抗原。然而，CD44s和CD44v同种型的不同功能角色尚不完全清楚。CD44v包含额外的肽基序，可以通过在细胞表面结合/隔离生长因子，从而起共受体的作用，促进细胞信号传导。此外，CD44v在转移的肿瘤中表达，而CD44v和CD44s之间的切换可能在调节上皮向间质转化(EMT)以及癌细胞的适应性可塑性中发挥作用。CD44v已被证实在多种肿瘤中高表达，而在正常组织中低表达。CD44v的异常表达常与肿瘤的发生和转移密切相关，有研究表明CD44v的异常表达与乳腺癌等多种肿瘤远端转移的不良预后密切相关。随着研究的深入，越来越多的变体被陆续发现。因此，以CD44v为靶点进行肿瘤诊断和治疗有潜在的意义。
因此，寻求能够更为有效地用于诊断和/或治疗用途的CD44v抗体及其相关药物，以克服现有抗体靶向性不足、特异性低等问题，显得尤为重要。
发明内容
本发明的发明人在尝试开发更有效、肿瘤特异性的CD44v抗体的过程中，发现了靶向人CD44v5(靶向人CD44第9外显子)的新抗体，并基于此进行了进一步的人源化改造，开发了抗体相关抗肿瘤药物。本发明的单克隆抗体对CD44v5具有高特异性和高亲和力，并且能够识别抗原的内源性天然构象，而非仅在(体外)筛选过程中识别线性表位。另外，通过研究CD44v5在多种正常组织和肿瘤组织中的表达情况，以及本发明的抗体在这些组织中的结合情况，发现靶向CD44v5的本发明的抗体具有良好的肿瘤特异性。基于该抗体制备的抗体药物偶联物(ADC)在细胞、动物模型中也都显示出了理想的抗肿瘤效应。
因此，第一方面，本发明涉及一种特异性结合人CD44v的单克隆抗体或其片段，所述CD44v包含v5外显子，并且所述抗体包含：
(a)重链可变区，其包含重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，所述重链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述重链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；和
(b)轻链可变区，其包含轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3，所述轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述重链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
在具体的实施方案中，所述人CD55v的v5外显子的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
在优选的实施方案中，所述单克隆抗体是鼠抗体、人鼠嵌合抗体或人源化抗体。
在优选的实施方案中，所述单克隆抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO:21或23所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:21或23所示的氨基酸序列具有至少85％同源性的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；所述单克隆抗体的轻链可变区包含如SEQ ID NO:22或24所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:22或24所示的氨基酸序列具有至少85％同源性的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成。
在优选的实施方案中，所述单克隆抗体包含重链和轻链，所述重链包含如SEQ IDNO:7或9所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7或9所示的氨基酸序列具有至少85％同源性的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；所述轻链包含如SEQ ID NO:8或10所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8或10所示的氨基酸序列具有至少85％同源性的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成。
第二方面，本发明涉及包含第一方面的单克隆抗体或其片段的嵌合抗原受体(CAR)分子。
第三方面，本发明涉及核酸分子，其包含编码第一方面的单克隆抗体或其片段，或第二方面的CAR分子的核酸分子。
第四方面，本发明涉及包含第三方面的核酸分子的重组载体。
第五方面，本发明涉及包含第三方面的核酸分子或第四方面的重组载体的宿主细胞。
第六方面，本发明涉及包含第一方面的单克隆抗体或其片段的抗体药物偶联物(ADC)。
第七方面，本发明涉及第一方面的单克隆抗体、第二方面的CAR分子或第六方面的抗体药物偶联物在制备药物中的用途。在优选的实施方案中，所述药物用于治疗肿瘤，特别是CD44v5阳性肿瘤。例如，所述肿瘤是黑色素瘤、肺癌、胆管癌、肝癌如肝细胞癌、乳腺癌如三阴乳腺癌、胃癌、结肠癌或胰腺癌。
本发明至少具有如下优势：
-本发明的抗体对CD44v5具有高亲和力；
-本发明的免疫偶联物对于表达CD44v5的肿瘤展现出肿瘤抑制活性；
-本发明的抗体可以特异性识别CD44v5阳性肿瘤细胞，与正常细胞/组织无显著结合；与商品化的抗CD44v6抗体Bivatuzumab相比，不具有与正常皮肤组织、细胞结合的能力，因而潜在的能够规避“在靶/脱肿瘤”(on-target off-tumor)所造成的副作用。
附图说明
通过附图来示例性说明本发明的实施例方案和效果，但不应将附图中的内容理解为对本发明范围的限制。
图1显示了本发明的抗体H1D8与包含不同V区外显子组合的CD44v截短变体的结合实验结果。(A)是测试的CD44v截短变体的结构示意图；(B)为Western Blot(WB)结果。
图2显示了CD44v和CD44s在肝内胆管癌细胞株RBE、HCCC9810以及HuCCT1中的表达情况，(A)PCR结果，和(B)使用本发明的抗体H1D8的流式细胞检测分析结果，显示H1D8特异性结合CD44v。
图3显示了H1D8在小鼠模型中的实验结果。(A)过表达CD44v的RBE细胞株中的蛋白质表达水平；(B)Cy5染料标记的H1D8特异性结合CD44v过表达RBE细胞后的活体成像结果；(C)基于图3B的观察结果的定量结果。
图4是免疫组化的结果，显示了在H1D8在正常组织和CD44v阳性肿瘤组织中与细胞的结合情况。
图5显示了抗体药物偶联物的结构和性质。(A)示例性抗体药物偶联物的结构；(B)验证抗体药物偶联情况的PAGE结果，结果显示出H1D8具有良好的纯度，并且二硫键成功部分还原；(C)对纯化后的ADC进行表征的反相色谱(reversed phase chromatography)。
图6显示了抗体内化检测实验的结果。(A)高内涵活细胞工作站的成像结果；(B)对抗体和溶酶体进行共定位的细胞免疫荧光结果；(C)分析内化效率的流式细胞术结果。
图7显示了本发明的抗体药物偶联物H1D8-DC在体外实验中对CD44v5阳性肿瘤和CD44v5阴性肿瘤的肿瘤抑制效果。(A)Calcein-AM/PI双染后的荧光照片；(B)不同浓度H1D8-DC的肿瘤抑制效果；(C)通过转基因手段在CD44v5阴性肿瘤细胞株中稳定表达CD44v5抗原，H1D8-DC显现出良好的靶向杀伤能力，并且具有剂量依赖特性；(D)PI对(C)中肿瘤细胞进行染色，死亡细胞会被标记上红色荧光。
图8显示了使用本发明的H1D8-DC治疗CD44v阳性肿瘤的模型小鼠的方案和结果。(A)给药计划；(B)各处理组肿瘤组织拍照；(C)肿瘤体积变化情况；(D)各处理组小鼠体重变化；(E)各处理组肿瘤质量与体重质量的比值。
图9显示了使用本发明的H1D8-DC治疗CD44v阳性肿瘤的模型小鼠后，小鼠的体重变化(A)和主要器官重量变化(B)。
图10是免疫组化结果，显示了本发明的H1D8抗体和结合CD44v6的抗体Bivatuzumab与正常皮肤组织的结合并在其中富集的能力。
图11显示了实施例4中在临床样本中验证单克隆抗体H1D8对不同组织，包括正常组织和CD44v5阳性肿瘤组织的结合能力的Histo-score得分结果。
图12显示了不同组织中的Cathepsin B表达。
图13显示了实施例1和2中抗-CD44v5高亲和力、高特异性单克隆抗体的筛选流程。(A)筛选流程。通过对杂交瘤细胞进行单克隆筛选，获得217株单克隆抗体；通过ELISA初筛获得38株可以识别CD44v，无法识别CD44s的单克隆抗体；通过WB、FCM对抗体特异性、结合能力进行进一步验证，最终获得3株候选抗体；通过SPR亲和力测定，筛选出亲和力最高、特异性最好的单克隆抗体。(B)WB验证结合能力与特异性；(C)流式测定结合能力与特异性；(D)SPR进行亲和力测定。
图14显示了在PDX模型中验证H1D8-DC抗肿瘤效应的实验结果。(A)肝内胆管癌PDX模型构建与治疗策略示意图。(B)PDX模型中IHC检测的CD44v5抗原和增殖指标Ki-67的表达情况。(C)各处理组小鼠肿瘤体积的变化情况。治疗结束后，断颈处死小鼠，剥离肿瘤组织，记录肿瘤数据。其中供体1中治疗组有一只小鼠肿瘤已检测不到。(D)各处理组小鼠体的重变化情况。(E-F)在治疗前后通过IHC检测的CD44v5抗原、凋亡指标(Caspase 3，γH2AX)以及干细胞指标(CD133)的表达情况。
图15显示了由本公开的抗-CD44v5抗体制备的CAR分子对靶细胞的杀伤效果。(A)CAR分子结构示意图；(B)不同效靶比下，UTD(非转染巨噬细胞)/CAR-M对靶细胞的杀伤能力；(C)流式检测UTD/CAR-M对靶细胞的吞噬能力变化。
具体实施方式
定义
除非在本文件的其他位置有具体定义，否则本文使用的所有其他技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的含义。
如用于本文，包括所附的权利要求时，单数形式的词语例如“一个”、“一种”和“所述/该”包括其对应的复数所指物，除非上下文另有明确规定。
除非上下文另有明确规定，否则术语“或”用于表示术语“和/或”并且可以与术语“和/或”互换使用。
在本公开的上下文中，除非另有说明，否则词语“包含”及其变型例如“包括”和“含有”应被理解为暗示包括所陈述的要素，例如氨基酸序列、核苷酸序列、性质、步骤或它们的组，但不排除任何其他元素，例如氨基酸序列、核苷酸序列、性质和步骤。当在本文中使用时，术语“包含”或其任何变型可以被术语“含有”、“包括”或有时被“具有”或其等同的变型替代。在某些实施方案中，词语“包含”还包括“由……组成”的情形。
如用于本文，术语“CD44v”在没有特别指明的情况下，指人CD44v，即人CD44变体。CD44v是一系列CD44同种型的统称。在实施例部分中，CD44v指包含所有可变区的CD44，其氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。
术语“CD44v5”在没有特别说明的情况下，在本发明中指包含人CD44的v5外显子的剪切变体。在本发明的上下文中，人CD44的v5外显子对应于人CD44外显子1至外显子19中的外显子9，其氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。进一步地，所述人CD44的外显子9对应于小鼠CD44的外显子10。
术语“CD44s”指不含v2-v10区域的CD44标准型，其氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19所示。
除非另有说明，否则本文所用的术语“抗体”涵盖最广义的抗体以及抗体片段，只要它识别并结合本发明的抗原，即包含v5外显子的人CD44v即可。具体而言，本申请的抗体结合人CD44v5。本申请的抗体一般指单特异性抗体。但是本申请还考虑了具有异源特异性(异特异性(heterospecific))或多特异性抗体的抗体。抗体通过特异性结合位点与特异性抗原决定簇或表位结合。
“抗体片段”指全长抗体的一部分，通常包含抗原的结合区或可变区。抗体片段的实例可包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体最常见的基本结构是四聚体。每个四聚体包括两对相同的多肽链，每对具有一条称为“轻链”(约25kDa)的较小的链和一条称为“重链”(约50-70kDa)的较大的链。在每条链的氨基末端，其包括一个主要负责抗原识别的大约100至110个或更多个氨基酸的可变结构域。重链的羧基末端部分可以定义主要负责效应子功能的恒定区。通常，人抗体的轻链分为κ和λ轻链。此外，人抗体的重链通常分类为α、δ、ε、γ或μ，并将抗体的同种型分别定义为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM及其亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。每个轻链/重链(VL/VH)对的可变区/结构域形成抗体结合位点。因此，完整抗体通常具有两个结合位点。
术语“高变域”指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变域包含来自“互补决定区(CDR)”(即轻链可变域中的LCDR1、LCDR2和LCDR3以及重链可变域中的HCDR1、HCDR2和HCDR3)的氨基酸残基。通常，重链和轻链二者的可变域都包含三个高变域，即CDR，它们位于相对保守的“框架区”或“FR”之间。CDR通常通过框架区排列对齐，从而能够与特定表位结合。一般而言，从N末端到C末端，轻链和重链可变域均包含FR-1(或FR1)、CDR-1(或CDR1)、FR-2(或FR2)、CDR-2(或CDR2)、FR-3(或FR3)、CDR-3(或CDR3)和FR-4(或FR4)。本领域技术人员能够理解，CDR区的确定可以使用Kabat、IMGT、Chothia抗体编号系统中的任何一种编号方式来确定。在使用不同的编号方式时，针对同一可变区的氨基酸序列可能会划定不同的CDR区。无论使用哪一种编号方式确定的CDR区，都落入本发明的保护范围。除非另行声明，否则本申请中记载的具体CDR区的氨基酸序列是按照IMGT抗体编号系统确定的，例如通过使用V-QUEST工具来确定。
除非另有说明，否则“抗体片段”、“靶结合片段”和“抗原结合片段”在本申请的上下文中可以互换，并且意指保留了特异性结合由全长抗体结合的抗原的能力的抗体片段，例如保留了一个或多个CDR区的片段。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如单链Fv(ScFv)；由抗体片段形成的纳米抗体和多特异性抗体。
“特异性结合”或“与……特异性结合”意指与其他蛋白质相比，抗体表现出对特定靶标的优先结合，但这种特异性不需要是绝对的结合特异性。如果抗体的结合可测定样品中靶蛋白的存在，例如不会产生不希望的结果，例如假阳性，则认为抗体对其预期靶标具有“特异性”。相较于与非靶蛋白的亲和力，本发明的抗体或其抗原结合片段将以至少2倍高，优选至少10倍高，更优选至少20倍高，且最优选至少100倍高的亲和力结合靶蛋白。作为替代或在此基础上，本发明的抗体或其抗原结合片段将具有对其靶蛋白的结合亲和力，如由低于1 x 10-8 M、低于1 x 10-9 M(1nM)，低于1 x 10-10 M，低于1 x 10-11 M，或甚至低于1 x10-12 M(1pM)的KD值所代表。如果本申请的抗体与包含给定氨基酸序列的多肽结合但不与缺乏该序列的蛋白质结合，则称其为特异性结合包含所述给定氨基酸序列的多肽。
如本文所用，术语“人抗体”意指仅包含人免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。如果在小鼠、小鼠细胞或源自小鼠细胞的杂交瘤中产生，人抗体可能含有鼠的糖链。类似地，“小鼠抗体”或“大鼠抗体”分别意指仅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白序列的抗体。
术语“嵌合抗体”是指由来自不同物种的可变区和恒定区构成的抗体，其通常通过基因工程将不同部分的编码序列连接在一起而获得。例如，常见的人鼠嵌合抗体可以包含来自小鼠单克隆抗体的可变区，以及来自人的恒定区。
术语“人源化抗体”指将非人抗体(如鼠抗体)中的序列用人序列取代而获得的抗体。例如，人源化抗体通常含有非人的CDR区域，但其余区域均为人源序列。
本发明的抗体可以是动物源抗体如鼠源抗体。本发明的抗体可以是嵌合抗体如人鼠嵌合抗体。本发明的抗体可以是人抗体或人源化抗体。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“mAb”或“Mab”是指基本上同质的抗体群体，这意味着群体中包含的抗体分子在氨基酸序列上是相同的，除了可能以少量存在的有可能天然发生的突变外。“单克隆”表示抗体从基本上同质的抗体群体中获得的特征，而不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。单克隆抗体(mAb)可以通过本领域已知的常规方法获得。
可以对本申请的抗体实施纯化工艺以去除不需要的物质，从而产生纯化的抗体。纯化抗体的常规方法包括但不限于本领域公知的柱层析法。
本发明的抗体或抗原结合片段可以是分离的抗体。术语“分离的”是指所述抗体或抗原结合片段至少部分不含来自产生它们的细胞、细胞培养物、生长培养基、表达系统的其他生物材料或非生物材料。所述材料可以包括核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物、缓冲液、盐或其他材料，例如细胞碎片和生长培养基。
本申请还涵盖包含一个或多个保守取代的抗体或其抗原结合片段，只要该抗体或抗原结合片段结合CD44v并具有本文所述的抗体的至少一种特性。氨基酸的“保守取代”是本领域众所周知的，并且通常指将一个氨基酸残基改变为具有结构或功能上相似的侧链的另一个氨基酸残基。例如，下表中提供了示例性的保守取代列表。
本申请还提供包含编码本申请的抗体或其片段的核苷酸序列的分离的核酸序列。“分离的核酸”或“分离的多核苷酸”指从在自然界中该分离的多核苷酸存在于其中的多核苷酸的全部或部分移出的DNA或RNA，或连接到它在自然界中不与之相连的多核苷酸的DNA或RNA。“包含”特定核苷酸序列的分离的核酸分子除特定序列外，还可包括可操作地连接的调控序列，其控制所述核酸序列的编码区的表达。由于密码子简并性，本领域技术人员可以理解特定的氨基酸序列可以由不同的核苷酸序列编码。
“百分比同源性”或“％同源性”在本发明的上下文中用于描述两条核苷酸序列或两条氨基酸序列之间的相似性程度，与“百分比同一性”的含义相同。两条序列的百分比同源性可以如下计算，在将两条序列对齐(alignment)之后，用残基相同的位置数除以对齐后的序列总长度再乘以100％。比对两条氨基酸序列或核苷酸序列的方法和工具是本领域公知的，例如NCBI网站上提供的BLAST套件(Altschul,S.F.et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410)。
“核苷酸”在本发明的上下文中包括DNA和RNA。
在术语“分离的核酸分子”中，“分离的”意指已经进行了去除想要的成分之外的因子的操作，并且所述分离的核酸分子不再以其天然存在的状态存在，如不再存在于染色体基因组中。
“表达构建体”或“表达盒”指包含目的基因和基因表达调控序列的一段核苷酸序列。所述表达调控序列包括但不限于启动子、增强子、终止子、多聚腺苷酸化序列等。
“载体”指能够将外源基因携带至细胞内的运载体DNA分子。载体的实例包括但不限于质粒、病毒载体、粘粒、人工染色体。用于将外源转基因引入细胞中并促成该转基因表达的载体称为“表达载体”。
“宿主细胞”在本文中指包含外源重组DNA如表达载体的细胞，也指包含由重组DNA表达所获得的多肽或蛋白的细胞。可将这样的宿主细胞用于进行本发明的抗CD44v5抗体的生产。在一个实施方式中，作为宿主细胞，只要是能够用于多肽序列例如本发明的抗CD44v5抗体的表达的宿主细胞即可，没有特别的限制。
“ADC”是指抗体药物偶联物，即通过化学连接将单克隆抗体与小分子药物连接形成的偶联物。
如本文所用的术语“施用”、“给予”、“治疗”和“处理”，当应用于受试者，例如动物，包括人，或细胞、组织、器官或生物流体时，意指使外源药物、治疗剂、诊断剂或组合物与该受试者、细胞、组织、器官或生物流体接触。细胞的处理包括使试剂与细胞接触，以及使试剂与流体接触，其中所述流体与细胞接触。术语“施用”和“治疗”还包括体外和离体治疗例如细胞，例如通过试剂、诊断剂、结合化合物或通过另一种细胞进行。在一些情况中，治疗包括预防性治疗。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指当向受试者施用以治疗疾病，或疾病或病症的至少一种临床症状时，足以实现对所述疾病、病症或症状的该种治疗的抗体的量。“治疗有效量”可随抗体、疾病、病症和/或疾病或病症的症状，疾病、病症和/或疾病或病症的症状的严重程度，待治疗的受试者的年龄，和/或待治疗的受试者的体重而变化。在任何给定情况下的合适量对于本领域技术人员来说是显而易见的或者可以通过常规实验确定。在联合疗法的情况下，“治疗有效量”是指用于有效治疗疾病、病症或状况的联合对象的总量。
在本申请的上下文中，“受试者”指动物，优选哺乳动物，例如灵长类动物，优选高等灵长类动物，例如人类。
术语“癌症”或“肿瘤”在本文中意指或描述哺乳动物中的生理状况，其通常以不受调节的细胞生长为特征。
抗体及其抗原结合片段
本发明提供特异性结合包含v5外显子的人CD44v的抗体，并且所述抗体不结合CD44s或不包含v5外显子的CD44v。为了方便描述，也将本发明的抗体描述为特异性结合人CD44中v5外显子的抗体、特异性结合CD44v5的抗体，或简称为抗CD44v5抗体。需要理解的是这并不意味着本发明的抗体仅能结合CD44v5，而是可以结合所有包含v5外显子的CD44剪接变体。例如，本发明的抗体能够特异性结合包含人CD44的可变区外显子中的一个或多个的抗原性多肽或表达所述抗原性多肽的细胞，所述人CD44的可变区外显子中的至少一个为v5外显子。具体地，本发明的抗体能够特异性结合包含如SEQ ID NO:13所示的人CD44的v5外显子(外显子9)的抗原。
本发明的抗体与其抗原的特异性结合可以发生在体内或体外。例如，本发明的抗体能够结合处于类似于体内的天然构象的内源性抗原，而不仅限于结合线性结构的抗原序列(缺乏立体构象)，这保证了其在体内与抗原特异性结合的能力。
在具体的实施方案中，本发明的抗CD44v5抗体能够特异性结合人CD44中的v5外显子，并且所述抗CD44v5抗体包含：
(a)重链可变区，其包含重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，所述重链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述重链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；和/或
(b)轻链可变区，其包含轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3，所述轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述重链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
在优选的实施方案中，所述抗CD44v5抗体能够人CD44中的v5外显子并且包含：
(a)重链可变区，其包含如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列具有至少85％同源性，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；和/或
(b)轻链可变区，其包含如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列具有至少85％同源性，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成。
在更优选的实施方案中，所述抗CD44v5抗体能够人CD44中的v5外显子并且包含：
(a)重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；和/或
(b)轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示。
在更进一步优选的实施方案中，所述抗CD44v5抗体能够人CD44中的v5外显子并且包含：
(a)重链，其包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少85％同源性，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；和/或
(b)轻链，其包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少85％同源性，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成。
在更进一步优选的实施方案中，所述抗CD44v5抗体能够人CD44中的v5外显子并且包含：
(a)重链，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；和/或
(b)轻链，其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
在另一个优选的实施方案中，所述抗CD44v5抗体能够人CD44中的v5外显子并且包含：
(a)重链可变区，其包含如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列具有至少85％同源性，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；和/或
(b)轻链可变区，其包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少85％同源性，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成。
在更优选的实施方案中，所述抗CD44v5抗体能够人CD44中的v5外显子并且包含：
(a)重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示；和/或
(b)轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示。
在更进一步优选的实施方案中，所述抗CD44v5抗体能够人CD44中的v5外显子并且包含：
(a)重链，其包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少85％同源性，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；和/或
(b)轻链，其包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少85％同源性，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成。
在更进一步优选的实施方案中，所述抗CD44v5抗体能够人CD44中的v5外显子并且包含：
(a)重链，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；和/或
(b)轻链，其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
优选地，上述通过序列同源性百分比限定的抗体与参照抗体的氨基酸差异均在非CDR区中，甚至均在恒定区中。优选地，所述氨基酸差异是氨基酸的保守取代。
在具体的实施方案中，所述人CD44的v5外显子的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。本发明的抗CD44v5抗体能够特异性结合包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的抗原性多肽或表达所述抗原性多肽的细胞。例如，所述抗原性多肽是包含v5外显子的人CD44剪接变体。
本发明的抗体可以是鼠抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
本发明的抗体的片段或特异性结合人CD44的v5外显子的片段可以是抗体片段或类似物，例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。
本发明的抗体可以是多特异性抗体，如双特异性抗体或三特异性抗体。
特别地，本发明的抗体不结合不含v5外显子的CD44剪接变体，例如不含v5外显子的CD44v和CD44s。“不结合”在本发明的上下文中意味着对该抗原多肽具有极低甚至以常规方法不可检测的结合亲和力，例如KD值高于1x 10-6M或不可检出。
制备方法
本发明还涉及制备所述抗CD44v5抗体的方法。所述方法可以是分子生物学方法。例如，所述方法包括制备编码所述抗CD44v5抗体的一条或多条链的一条或多条核苷酸序列，将所述一条或多条编码核苷酸序列构建到一个或多个表达载体中，并在适当的细胞中表达所述表达载体来制备。
本领域技术人员可以理解，在抗CD44v5抗体的氨基酸序列确定的前提下，由于存在密码子简并性，可以使用不同的编码核苷酸序列，也可以对编码核苷酸序列进行优化。进行编码序列密码子优化的方法是本领域技术人员已知的，包括针对宿主的类型将密码子调整为宿主的偏好密码子，降低GC含量和/或减少富含GC的区域，提高mRNA稳定性，从而提高目标核苷酸在特定宿主中的表达效率。
在具体的实施方案中，所述编码核苷酸序列包含编码如本发明所述的特异性结合人CD44中v5外显子的抗CD44v5抗体的核苷酸序列。
在具体的实施方案中，所述抗CD44v5抗体的编码核苷酸序列可以包含：
(1)编码重链的核苷酸序列，其包含编码如SEQ ID NO:21所示的重链可变区(VH)的核苷酸序列；和/或
(2)编码轻链的核苷酸序列，其包含编码如SEQ ID NO:22所示的轻链可变区(VL)的核苷酸序列。
在进一步的实施方案中，所述抗CD44v5抗体的编码核苷酸序列可以包含：
(1)编码重链的核苷酸序列，其包含编码如SEQ ID NO:21所示的重链可变区(VH)的核苷酸序列，并且包含如SEQ ID NO:25所示的编码VH的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性的核苷酸序列；和/或
(2)编码轻链的核苷酸序列，其包含编码如SEQ ID NO:22所示的轻链可变区(VL)的核苷酸序列，并且包含如SEQ ID NO:26所示的编码VL的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性的核苷酸序列。
在进一步的实施方案中，所述抗CD44v5抗体的编码核苷酸序列可以包含：
(1)编码如SEQ ID NO:7所示的重链的核苷酸序列；和/或
(2)编码如SEQ ID NO:8所示的轻链的核苷酸序列。
在进一步的实施方案中，所述抗CD44v5抗体的编码核苷酸序列可以包含：
(1)编码如SEQ ID NO:7所示的重链的核苷酸序列，其包含如SEQ ID NO:29所示的编码重链的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性的核苷酸序列；和/或
(2)编码如SEQ ID NO:8所示的轻链的核苷酸序列，其包含如SEQ ID NO:30所示的编码轻链的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性的核苷酸序列。
在具体的实施方案中，所述抗CD44v5抗体的编码核苷酸序列可以包含：
(1)编码重链的核苷酸序列，其包含编码如SEQ ID NO:23所示的重链可变区(VH)的核苷酸序列；和/或
(2)编码轻链的核苷酸序列，其包含编码如SEQ ID NO:24所示的轻链可变区(VH)的核苷酸序列。
在进一步的实施方案中，所述抗CD44v5抗体的编码核苷酸序列可以包含：
(1)编码重链的核苷酸序列，其包含编码如SEQ ID NO:23所示的重链可变区(VH)的核苷酸序列，并且包含如SEQ ID NO:27所示的编码VH的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性的核苷酸序列；和/或
(2)编码轻链的核苷酸序列，其包含编码如SEQ ID NO:24所示的轻链可变区(VL)的核苷酸序列，并且包含如SEQ ID NO:28所示的编码VL的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性的核苷酸序列。
在进一步的实施方案中，所述抗CD44v5抗体的编码核苷酸序列可以包含：
(1)编码如SEQ ID NO:9所示的重链的核苷酸序列；和/或
(2)编码如SEQ ID NO:10所示的轻链的核苷酸序列。
在进一步的实施方案中，所述抗CD44v5抗体的编码核苷酸序列可以包含：
(1)编码如SEQ ID NO:9所示的重链的核苷酸序列，其包含如SEQ ID NO:11所示的编码重链的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性的核苷酸序列；和/或
(2)编码如SEQ ID NO:10所示的轻链的核苷酸序列，其包含如SEQ ID NO:12所示的编码轻链的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性的核苷酸序列。
合适的生产细胞是本领域技术人员已知的。在一些实施方案中，使用哺乳动物细胞，例如293T、CHO或其衍生细胞系作为生产细胞。在一些实施方案中，使用微生物细胞例如细菌细胞或真菌细胞作为生产细胞，例如大肠杆菌或酵母。在一些实施方案中，使用昆虫细胞作为生产细胞，例如Sf9。可以针对具体的生产细胞系对编码本发明的抗CD44v5抗体的核苷酸序列进行密码子优化。
优选对产生的抗CD44v5抗体进行纯化。抗CD44v5抗体的纯化可以通过抗体生产领域的常规方法进行，所述方法可以包括过滤、层析等步骤。所述过滤步骤可以选自深层过滤、超滤、渗滤、纳米过滤中的一种或多种。所述层析步骤可以选自亲和层析、阳离子层析、阴离子层析、大小排阻层析、疏水层析、羟基磷灰石层析中的一种或多种。
本发明的抗体可以被制备成液体或固体的制剂，例如注射剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂。例如，可以通过常规方法例如冷冻干燥制备成冻干粉针剂，然后在施用之前通过复溶临场配制为注射剂用于施用。
抗体药物偶联物(ADC)
本发明的抗CD44v5抗体特别适合于抗体药物偶联物的制备。
抗体药物偶联物中的药物部分也被称为载荷(payload)，其可以使用本领域已知的或未来开发的合适的细胞毒性剂。适用于本发明的细胞毒性剂包括但不限于：微管蛋白抑制剂(也称为微管蛋白破坏剂)、拓扑异构酶1抑制剂、DNA结合剂、糖皮质激素受体调节剂(Glucocorticoid Receptor Modulators；GRMs)或它们的衍生物。在一些实施方案中，也可以使用如siRNA等小分子药物之外的抑制剂。
在具体的实施方案中，本发明的ADC中的载荷药物是微管蛋白抑制剂。所述微管蛋白抑制剂的实例包括但不限于：奥瑞他汀类(auristatins)、美登素类、微管溶素、秋水仙碱、长春花生物碱、紫杉烷。奥瑞他汀类的实例包括一甲基奥瑞他汀(MMAE)、一甲基奥瑞他汀F(MMAF)、奥瑞他汀F、奥瑞他汀苯丙氨酸苯二胺(AFP)。在具体的实施方案中，本发明的ADC中的载荷药物是MMAE。
在本发明的ADC中，可以包含用于连接抗体和载荷药物的接头。例如，所述接头可以是化学键如二硫键。例如，所述接头可以是可被切割或降解的接头，特别优选的是在体内、胞内或溶酶体内能够被切割或降解的接头，例如被体内、胞内或溶酶体内的内源酶切割或降解的接头。这种接头的使用能够使ADC进入到体内、细胞内或溶酶体内之后，通过接头的断裂而释放载荷药物并发挥药物的作用。在更优选的实施方案中，所述接头的断裂在靶细胞中的切割效率高于在非靶细胞中的切割效率。例如，在靶细胞中能够切割所述接头的酶的表达量更高。所述靶细胞可以是患病细胞如肿瘤细胞或病原体细胞。
一个具体的可切割接头的实例是肽接头，例如能够被组织蛋白酶B降解的缬氨酸-瓜氨酸二肽接头。本发明人出乎预料的发现组织蛋白酶B在肿瘤细胞如黑色素瘤细胞和胆管癌细胞中的表达高于正常细胞如皮肤细胞，因此使用能够被组织蛋白酶B降解的接头连接的ADC能够在肿瘤细胞中发挥比正常细胞中更强的效力，进一步提高了对肿瘤细胞的特异性。
嵌合抗原受体(CAR)分子
本发明的抗CD44v5抗体或其片段可制备CAR分子。
本发明的CAR分子至少包括胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞质信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述胞外抗原结合结构域包括本发明的抗CD44v5抗体或其片段。在一些实施方案中，所述胞外抗原结合结构域包括本发明的抗CD44v5抗体的特异性结合CD44v5的片段。在本发明的CAR分子中包括抗CD44v5抗体或其片段的部分可以以各种形式存在，包括例如，单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)和人源化抗体。在一些实施方案中，抗原结合结构域可以作为连续的多肽链的一部分表达。
在一些实施方案中，所述跨膜结构域包括，但不限于：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154中的一种或多种的组合。
在一些实施方案中，所述胞外抗原结合结构域通过铰链区与所述跨膜结构域连接。在具体的实施方案中，所述铰链区可以例如为CD8α铰链。
在一些实施方案中，所述胞质信号传导结构域包含4-1BB的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域。在一些实施方案中，所述胞质信号传导结构域还包含共刺激结构域。在一些实施方案中，所述共刺激结构域包含，例如CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CDS、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160或B7-H3蛋白质的功能性信号传导结构域，或其任何组合。
在一些实施方案中，本发明的CAR分子的抗原结合结构域的N末端还包括前导序列。前导序列任选地在细胞加工和CAR定位至细胞膜期间从抗原结合结构域切下。
表达本发明的CAR分子的淋巴细胞能够特异性识别肿瘤细胞上的CD44v5，产生治疗肿瘤的作用，包括但不限于例如肿瘤体积减少、癌细胞数量减少、转移瘤数量减少、预期寿命延长、癌细胞增殖减少、癌细胞存活降低、或与癌性病症相关的各种生理症状改善。
治疗用途
本发明的抗CD44v5抗体或包含所述抗体的ADC可以用于治疗或诊断应用，例如癌症的治疗。
在一个优选的实施方案中，通过本发明的抗体或ADC治疗的肿瘤表面表达CD44v，特别是表达包含v5外显子的CD44剪接变体。本申请的抗CD44v5抗体或ADC可用于治疗肿瘤，特别是恶性肿瘤，例如黑色素瘤、肺癌、胆管癌、肝癌如肝细胞癌、乳腺癌如三阴乳腺癌、胃癌、结肠癌或胰腺癌。
“胆管癌(bile duct cancer)”或“胆管细胞癌(cholangiocarcinoma)”是一种因胆管上皮细胞的不受控增殖形成的肿瘤。根据原发肿瘤的部位不同可以分为肝内胆管癌、肝门部胆管癌和肝外胆管癌。肝内胆管癌也称为肝内胆管细胞癌(intrahepaticcholangiocarcinoma；ICC)，其有时也被认为是肝癌的一种因为其发病部位在肝脏内部。胆管癌主要通过切除部分肝脏的手术来进行治疗，对化疗不敏感。
在本发明的具体实施方案中，本申请的抗CD44v5抗体或ADC可用于治疗胆管癌，包括肝内胆管癌、肝门部胆管癌和肝外胆管癌，特别是肝内胆管癌。
本发明的抗体由于结合位点存在于CD44的v5外显子上，因此不结合CD44s或其他不包含v5外显子的剪接变体，因此具有更好的肿瘤特异性和更低的脱肿瘤副作用。发明人也证明了正常细胞中包含v5外显子的人CD44剪接变体的表达量显著低于肿瘤组织，而在肿瘤组织中无论是否含有IDH1突变(肝内胆管癌的驱动基因)，均显示出v5外显子的高表达(如图11)。这样的结果说明，本发明的抗体或ADC结合到正常组织上的能力大大降低，这提供了更高的安全性和更广的应用范围。该结果还说明，对于胆管癌样本而言，无论是否表达通常作为治疗靶点的驱动基因IDH，都显示出了CD44v5的表达，这意味着本发明的抗体或ADC能够结合这些胆管癌细胞，无论其是否表达IDH。因此，对于一些无法适用于IDH相关靶向药的患者，如胆管癌患者，本发明的抗体或ADC为其提供了一种新的治疗选择。
因此，在一个实施方案中，本发明的抗体或ADC用于治疗IDH1阳性肿瘤，如IDH1阳性胆管癌，优选IDH1阳性肝内胆管癌。在一个特别的实施方案中，本发明的抗体或ADC用于治疗IDH1阴性肿瘤，如IDH1阴性胆管癌，优选IDH1阴性肝内胆管癌。
给药方法
本发明的抗CD44v5抗体或ADC可以通过常规方法进行递送。本发明的抗CD44v5抗体或ADC可以系统性施用或局部施用。例如，本发明的抗CD44v5抗体或ADC可以通过静脉内、腹膜内、动脉内途径进行施用。例如，本发明的抗CD44v5抗体或ADC可以局部施用，例如通过瘤内、瘤周注射施用。
本发明的抗CD44v5抗体或ADC可以以治疗有效量施用。“治疗有效量”是指当向受试者施用以治疗疾病，或疾病或病症的至少一种临床症状时，足以使对所述疾病、病症或症状的此类治疗生效的抗体的量。“治疗有效量”可以随抗体，所述疾病、病症和/或疾病或病症的症状，所述疾病、病症和/或疾病或病症的症状的严重程度，待治疗的受试者的年龄，和/或待治疗的受试者的体重而变化。
在本申请的一个优选实施方案中，抗体的给药量(mg/kg)基于受试者的体重。例如，本发明的抗CD44v5抗体的单次给药剂量可以在约1ng/kg体重至约20mg/kg体重的范围，优选5ng/kg体重至约15mg/kg体重的范围，更优选0.1mg/kg体重至约10mg/kg体重的范围。例如，可以按照约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg体重的剂量进行给药。
例如，本发明的ADC的单次给药剂量可以在约0.01mg/kg体重至约100mg/kg体重的范围，优选0.05mg/kg体重至约50mg/kg体重的范围，更优选0.1mg/kg体重至约10mg/kg体重的范围。例如，可以按照约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg体重的剂量进行给药。
在优选的实施方案中，在通过静脉输注进行施用时，本发明的抗CD44v5抗体可以进行一次或多次给药。在进行多次给药时，两次给药之间的间隔可以不少于1天、不少于3天，不少于5天，或者至少相隔一周。
药物联用
本发明的抗CD44v5抗体或药物偶联物可以和其他治疗或药物进行联用，例如其他抗肿瘤治疗或药物。
在一些实施方案中，本发明的抗CD44v5抗体或药物偶联物可以与另外的抗体类药物联用。
在一些实施方案中，本发明的抗CD44v5抗体或药物偶联物可以与放射性治疗联用。
在一些实施方案中，本发明的抗CD44v5抗体或药物偶联物可以与细胞治疗联用。所述细胞治疗的实例包括但不限于NK细胞疗法、新抗原识别性T细胞、CAR-T疗法、TCR-T疗法、CAR-NK疗法、CAR-M疗法(CAR-巨噬细胞疗法)。
本发明还涉及如下各个实施方案。
1.一种特异性结合人CD44的v5外显子的单克隆抗体或其片段，并且所述抗体或其片段包含：
(a)重链可变区，其包含重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，所述重链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述重链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；和
(b)轻链可变区，其包含轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3，所述轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述重链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
2.项1所述的抗体或其片段，其包含：
(a)重链可变区，其包含如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列具有至少85％同源性，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；和/或
(b)轻链可变区，其包含如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列具有至少85％同源性，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成。
3.项2所述的抗体或其片段，其包含：
(a)重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；和/或
(b)轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示。
4.项3所述的抗体或其片段，其包含：
(a)重链，其包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少85％同源性，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；和/或
(b)轻链，其包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少85％同源性，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成。
5.项4所述的抗体或其片段，其包含：
(a)重链，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；和/或
(b)轻链，其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
6.项1所述的抗体或其片段，其包含：
(a)重链可变区，其包含如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列具有至少85％同源性，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；和/或
(b)轻链可变区，其包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少85％同源性，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成。
7.项6所述的抗体或其片段，其包含：
(a)重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示；和/或
(b)轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示。
8.项7所述的抗体或其片段，其包含：
(a)重链，其包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少85％同源性，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；和/或
(b)轻链，其包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少85％同源性，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成。
9.项8所述的抗体或其片段，其包含：
(a)重链，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；和/或
(b)轻链，其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
10.项1-9中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体特异性结合包含人CD44的v5外显子的抗原性多肽，例如人CD44包含v5外显子的剪接变体或其衍生物。
11.项1-10中任一项所述的抗体或其片段，所述人CD44的v5外显子的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
12.项1-11中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体不结合人CD44s或不包含v5外显子的人CD44剪接变体。
13.项1-12中任一项所述的抗体或其片段，所述片段为抗体的抗原结合片段或抗体衍生物，如scFv。
14.一种嵌合抗原受体分子，其包括胞外抗原结合结构域，所述胞外抗原结合结构域包括项1-13中任一项的抗体或其片段。
15.项14所述的嵌合抗原受体分子，所述嵌合抗原受体分子还包括跨膜结构域，优选地，所述跨膜接结构域包括T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154中的一种或多种的组合。
16.项14所述的嵌合抗原受体分子，所述嵌合抗原受体分子还包括铰链区，所述铰链区优选包括CD8α铰链。
17.项14所述的嵌合抗原受体分子，所述嵌合抗原受体分子还包括胞质信号传导结构域，所述胞质信号传导结构域优选包含4-1BB的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域。
18.项17所述的嵌合抗原受体分子，所述胞质信号传导结构域还包含共刺激结构域，所述共刺激结构域优选包含CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CDS、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160或B7-H3蛋白质的功能性信号传导结构域，或其任何组合。
19.项14所述的嵌合抗原受体分子，所述胞外抗原结合结构域的N末端还包括前导序列
20.一种分离的核酸分子，其包含编码项1-13中任一项的抗体或其片段，或项14-19中任一项的嵌合抗原受体分子的核苷酸序列。
21.项20的核酸分子，其包含：
(1)编码重链的核苷酸序列，其包含编码如SEQ ID NO:21所示的重链可变区(VH)的核苷酸序列；和/或
(2)编码轻链的核苷酸序列，其包含编码如SEQ ID NO:22所示的轻链可变区(VL)的核苷酸序列。
22.项21的核酸分子，其包含：
(1)编码重链的核苷酸序列，其包含编码如SEQ ID NO:21所示的重链可变区(VH)的核苷酸序列，并且包含如SEQ ID NO:25所示的编码VH的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性的核苷酸序列；和/或
(2)编码轻链的核苷酸序列，其包含编码如SEQ ID NO:22所示的轻链可变区(VL)的核苷酸序列，并且包含如SEQ ID NO:26所示的编码VL的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性的核苷酸序列。
23.项22的核酸分子，其包含：
(1)编码如SEQ ID NO:7所示的重链的核苷酸序列；和/或
(2)编码如SEQ ID NO:8所示的轻链的核苷酸序列。
24.项23的核酸分子，其包含：
(1)编码如SEQ ID NO:7所示的重链的核苷酸序列，其包含如SEQ ID NO:29所示的编码重链的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性的核苷酸序列；和/或
(2)编码如SEQ ID NO:8所示的轻链的核苷酸序列，其包含如SEQ ID NO:30所示的编码轻链的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性的核苷酸序列。
25.项20的核酸分子，其包含：
(1)编码重链的核苷酸序列，其包含编码如SEQ ID NO:23所示的重链可变区(VH)的核苷酸序列；和/或
(2)编码轻链的核苷酸序列，其包含编码如SEQ ID NO:24所示的轻链可变区(VH)的核苷酸序列。
26.项25的核酸分子，其包含：
(1)编码重链的核苷酸序列，其包含编码如SEQ ID NO:23所示的重链可变区(VH)的核苷酸序列，并且包含如SEQ ID NO:27所示的编码VH的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性的核苷酸序列；和/或
(2)编码轻链的核苷酸序列，其包含编码如SEQ ID NO:24所示的轻链可变区(VL)的核苷酸序列，并且包含如SEQ ID NO:28所示的编码VL的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性的核苷酸序列。
27.项26的核酸分子，其包含：
(1)编码如SEQ ID NO:9所示的重链的核苷酸序列；和/或
(2)编码如SEQ ID NO:10所示的轻链的核苷酸序列。
28.项27的核酸分子，其包含：
(1)编码如SEQ ID NO:9所示的重链的核苷酸序列，其包含如SEQ ID NO:11所示的编码重链的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性的核苷酸序列；和/或
(2)编码如SEQ ID NO:10所示的轻链的核苷酸序列，其包含如SEQ ID NO:12所示的编码轻链的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性的核苷酸序列。
29.一种重组载体，其包含项20-28中任一项所述的核酸分子。
30.一种宿主细胞，其包含项20-28中任一项所述的核酸分子，或项29所述的重组载体。
31.一种抗体药物偶联物(ADC)，其包含项1-13中任一项所述的抗体和细胞毒性药物。
32.项31所述的抗体药物偶联物，其中所述细胞毒性药物为微管蛋白抑制剂。
33.项32所述的抗体药物偶联物，其中所述细胞毒性药物为奥瑞他汀类药物。
34.项33所述的抗体药物偶联物，其中所述细胞毒性药物为一甲基奥瑞他汀(MMAE)。
35.项31-34中任一项所述的抗体药物偶联物，其进一步包含连接所述抗体和细胞毒性药物的接头。
36.项35的抗体药物偶联物，其中所述接头为可切割接头。
37.项36的抗体药物偶联物，其中所述接头为可切割的二肽接头，例如缬氨酸-瓜氨酸二肽接头。
38.项31-37中任一项的抗体药物偶联物，其为抗CD44v5抗体-Val-Cit-MMAE。
39.一种药物组合物，其包含项1-13中任一项的抗体或其片段、项14-19中任一项的嵌合抗原受体分子或项31-38中任一项的抗体药物偶联物，和药学上可接受的载体。
40.项1-13中任一项的抗体或其片段、项14-19中任一项的嵌合抗原受体分子或项31-38中任一项的抗体药物偶联物在制备药物中的用途。
41.一种治疗有需要的受试者中的疾病的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的项1-13中任一项的抗体或其片段、项14-19中任一项的嵌合抗原受体分子或项31-38中任一项的抗体药物偶联物。
42.项40的用途或项41的方法，所述疾病是癌症。
43.项40的用途或项41的方法，所述癌症表达包含人CD44的v5结构域的抗原性多肽，如包含人CD44的v5结构域的人CD44剪接变体。
44.项40的用途或项41的方法，所述癌症为黑色素瘤、肺癌、胆管癌、肝癌如肝细胞癌、乳腺癌如三阴乳腺癌、胃癌、结肠癌或胰腺癌。
45.项40的用途或项41的方法，所述癌症为胆管癌。
实施例
为了更全面地理解和应用本发明，下文将参考实施例和附图详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。
实施例1.单克隆抗体制备
本实施例描述了本发明的单克隆抗体的制备过程。
1.抗原的表达与纯化：
1.1 pcDNA3.4:CD44v2-v10重组质粒的构建
(1)细胞总RNA提取及反转录为cDNA
利用Trizol法提取HCC 1937细胞(ATCC，CRL-2336)总RNA，具体方法如下：
收取6 cm培养皿中的HCC 1937肿瘤细胞，1000 rpm离心5 min。用1×PBS清洗细胞2次，离心弃净上清，收集细胞团。加入0.5 mL的TRIzol试剂，充分混匀后室温静置5 min。加入0.2 mL氯仿并混匀后室温静置5 min后，在4℃条件下12000 g离心10 min，小心将无色上清转移至新的除酶EP管中。向上清中加入0.25 mL的异丙醇并混匀。室温静置10 min后，4℃条件下12000 g离心10 min，弃净上清。加入75％乙醇轻轻重悬沉淀后再次离心并弃净上清，室温放置15-20 min。晾干后，通过加入0.05 mL DEPC H2O于65℃溶解10 min。使用NanoDrop 2000检测RNA浓度，并立即用于反转录。
cDNA的合成使用5X All-In-One RT MasterMix试剂盒(Abm，G492)，按说明书操作：
测好浓度的RNA用于反转录，反转录体系如下：
将配制好的反转录体系混匀，25℃孵育10 min后，42℃反应50 min。将温度调整至85℃孵育5 min终止反应。反转录得到的cDNA立即用于PCR扩增或20℃储存。
(2)CD44v2-v10(人外显子6至外显子14)抗原肽段扩增
为了扩增CD44v2-v10的序列(SEQ ID NO:14)，设计并合成了用于扩增CD44v2-v10的PCR引物(SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17)，并添加BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点及相应保护碱基，使用2×Hieff Gold PCR Master Mix试剂盒(翊圣)进行PCR扩增，体系如下：
配制好的PCR体系混匀后按如下程序进行PCR扩增：
20μL的PCR体系加入2μL的10×上样缓冲液(loading buffer)充分混匀，样品经1％琼脂糖凝胶电泳后，切下1200 bp左右的目的条带并用Omega胶回收试剂盒根据说明书对目的基因进行回收。
(3)双酶切法构建pcDNA3.4 CD44v2-v10重组质粒
首先对pcDNA3.4真核表达载体(GenScrip公司提供)和PCR产物(CD44v2-v10目的基因)分别进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切反应，反应体系如下：
将配制好的反应体系充分混匀，并离心至管底，置于37℃水浴酶切反应约2 h。反应结束后各自加入2μL的10×上样缓冲液混匀后，用1％琼脂糖凝胶对酶切产物进行胶回收，并用Nanodrop 2000测定浓度。回收的载体酶切产物和目的基因的酶切产物按摩尔比1：4配制T4 DNA酶连反应体系：
配制好的反应体系充分混匀后离心至管底，16℃连接18 h。大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态于冰上解冻。将连接产物全部加入感受态中，混匀后于冰上静置30 min，之后42℃热激90s，立即转移至冰上冷却3-5 min。加入200μL无抗生素LB培养基，37℃摇床120 rpm振荡1h。将菌悬液均匀涂布于含卡那霉素的LB琼脂糖平板上，37℃培养箱中倒置培养16 h左右。从平板上挑取3个单克隆转移至含卡那霉素的LB培养基中，37℃摇床120 rpm摇菌至对数生长期。取适量菌液测序。经序列比对后，选取测序正确的菌种扩增并提取质粒。
(4)pcDNA3.4 CD44v2-v10重组质粒的提取
质粒的提取使用质粒小提试剂盒(Omega)，按照说明书进行操作，简要方法如下：
取5-10 mL菌液室温10000 g离心1 min。尽量弃净上清，收集细菌。加入250μLSolutionI/RNaseA混和溶液并将细菌完全悬浮。加入250μL Solution II，轻轻颠倒混匀6-8次，室温静置2-3 min。加入350μL Solution III，立即上下颠倒6-8次至出现白色絮状物。室温13000 g离心10 min。将上清转移至收集柱中，室温13000 g离心1 min。弃去收集管中废液并将柱子重新装回收集管中。加入500μL提前加入异丙醇的HBC Buffer，并在室温13000 g离心1 min。弃去收集管中废液并将柱子重新装回收集管中，加入700μL提前加入无水乙醇的DNA WashBuffer，室温下13000 g离心1 min。弃去收集管中废液并将柱子重新装回收集管中，室温下13000 g空甩2 min，室温下静置15 min晾干。将收集柱转移至新1.5 mLEP管上，分两次向柱子中心加入40μL预热Elution Buffer。室温静置1 min后，13000 g离心1 min收集质粒。收集的质粒用Nanodrop测定浓度后可以立即使用或存储于-20℃。
1.2 CD44v2-v10抗原肽段真核表达与纯化
将pcDNA3.4 CD44v2-v10重组质粒、阳离子转染试剂PEI(1 mg/ml)以及无血清培养基Opti-MEM(Gibico)恢复至室温。按照质粒(ug)：PEI(ul)＝1：2的比例，分别加入500 ulOpti-MEM培养基中，混匀，室温静置5 min；再将质粒和PEI溶液混合，混匀室温静置20 min；缓慢滴加到293F细胞中，37℃，5％CO2，培养4-6天。
收集细胞培养上清并用0.45μm滤器过滤。利用Ni-NTA亲和力层析对过滤后上清进行纯化，包括柱平衡、上样、二次柱平衡，之后分别用20 mM、50 mM、100 mM、200 mM、300 mM和500 mM进行洗脱，对每步洗脱液收集，进行后续分析。
2.小鼠免疫
动物免疫的方法采取多次皮下多点免疫，免疫剂量为100μg只，共免疫4次。免疫方案如下：
前两次免疫需要将抗原和佐剂利用注射器推法充分乳化以增强免疫效果。
第三次免疫后一周尾静脉取血，利用ELISA的方法对免疫动物血清效价进行检测。收集静脉血8000 rpm离心5-10 min，收集上清备用，并以未免疫小鼠血清作为阴性对照。首先，使用包被缓冲液按照每孔100μL 5μg/mL的蛋白量预包被ELISA板4℃过夜。用含1‰Tween-20的PBST，350μL/孔洗两次。每孔加入200μL含2％BSA的PBS对包被板进行封闭，37℃恒温2 h，PBST洗三次；以1：500稀释血清，即取2μL血清于1 mL PBS中，充分混匀；随后以PBS为溶剂倍比稀释，设1：500-1：56000共10个梯度(每个梯度设置一个复孔)；每孔100μL加样，37℃孵育1 h。洗板三次后加入1：3000稀释的HRP标记山羊抗小鼠，100μL/孔，37℃孵育1 h。PBST洗涤五次后，每孔加入100μL TMB显色液(A液：B液＝1：1，现配现用)，37℃显色15 min，最终按照50μL/孔加入2 M H2SO4溶液终止反应，用于酶标仪波长450 nm/570 nm下的吸光度，并进行分析，以效价较高的免疫小鼠作为后续杂交瘤细胞制备脾细胞的来源。
3.杂交瘤细胞制备
(1)饲养层细胞的准备
在融合前一天准备饲养层细胞。对8周龄的雌性小鼠实施安乐死，于75％乙醇浸泡2-3min。于超净工作台将小鼠腹腔真皮打开，暴露腹膜。用5 mL注射器向腹腔注入5 mLRPMI1640培养基，反复抽吸3-4次至培养基呈淡黄色为止。将细胞悬液用完全培养基将细胞密度稀释至约2×105个/mL，作为将饲养层细胞，100μL/孔以均匀铺至96孔板，转移至细胞培养箱中待用。
(2)细胞融合
对免疫后小鼠实施安乐死。于无菌操作下，打开腹膜取脾脏剪碎置于200目铜网上，研磨；收集脾细胞悬液，RPMI 1640洗涤细胞两次后用20 mL重悬，计数。同时对提前准备好的处于对数生长期且生长状态良好的骨髓瘤细胞Sp2/0进行收集并计数。将脾细胞：Sp2/0细胞按照5:1混合均匀，离心得到细胞团，轻轻震荡使细胞团分散，37℃水浴条件下准备进行细胞融合。提前在37℃条件下预热灭菌后的PEG 1500(RPMI 1640：PEG为3 mL：3 g)。用移液管吸取0.9 mL PEG溶液匀速加入混合细胞中，60 s边加边混匀，静置30 s，等待细胞融合。依次在规定时间内匀速加入1mL RPMI 1640(1min)、5mL RPMI 1640(2min)、10mL RPMI1640(2min)和10mL RPMI 1640(2min)，从而终止融合反应，1000rpm离心5min，用HAT的完全培养基重悬后，100μL/孔铺入含饲养层细胞的96孔板。4d后观察是否有单克隆形成，并对单克隆细胞孔进行半量换液，一周后进行全换液，并将HAT培养基替换为HA培养基。
(3)阳性克隆筛选
对分泌特异性识别CD44v抗体的杂交瘤细胞的筛选采用ELISA初筛、WB复筛以及FACS进一步筛选的方法。
为筛选分泌靶向天然结构CD44v的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，首先构建了过表达CD44s和CD44v的MDA-MB-231细胞(分别为231-CD44s和231-CD44v)。人CD44s的氨基酸序列和编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19所示；人CD44v的氨基酸序列和编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:33所示。
质粒构建测方法参照pcDNA3.4 CD44v2-v10的构建，其中质粒为PLVX-puro-flag为本实验室保存，含有嘌呤霉素(puromycin)抗性基因及flag标签(flag tag)检测基因。细胞转染使用LipofectamineTM 2000 Transfection Reagent试剂，并按其说明书进行转染操作。第二天加入嘌呤霉素选择培养基进行筛选，一周后提取细胞全蛋白，采用WB对细胞稳定过表达CD44s或CD44v进行验证。
待单克隆孔细胞长满1/4时即可进行初筛，提前一天更换新鲜培养基，第二天采用ELISA的方法对杂交瘤上清是否含有目标抗体进行检测。
收集ELISA初筛得到的阳性克隆细胞培养上清，利用CD44s及CD44v过表达细胞株全蛋白进行WB实验，以杂交瘤培养上清为一抗，对杂交瘤细胞进行复筛。
最终利用流式细胞技术进行进一步验证。首先收集CD44s及CD44v过表达细胞，PBS洗涤细胞2次，然后加入杂交瘤细胞上清作为一抗，冰上孵育30min。PBS洗涤细胞一次，加入FITC或APC标记的荧光二抗，避光冰上孵育45min，PBS洗涤细胞一次，最后用适量PBS重悬通过流式细胞仪进行分析。
4.腹水型单克隆抗体的制备与纯化
对筛选得到的稳定分泌阳性抗体的杂交瘤细胞进行扩增，利用腹水法制备抗体。取8-10周龄的健康BALB/c雌鼠，腹腔注射液体石蜡0.5mL/只，3d后收集对数生长期杂交瘤细胞并用PBS洗涤2次，用生理盐水重悬细胞，调整细胞密度为2×106个/mL，按0.5mL/只注射至小鼠体内。待小鼠腹部明显胀大后，用注射器收集腹水，4℃条件下12000rpm离心15min，吸取上清用于抗体纯化。
腹水型单克隆抗体的纯化采用Protein A/G亲和层析的方法。首先将离心后腹水用4倍体积的20mM PBS进行稀释，经0.45μm滤器过滤后即可用于纯化。取适量Protein A/GAgarose装填纯化柱，用5-10倍柱体积的20mM PBS平衡纯化柱。加入预处理后的腹水进行上样后，用10-20倍柱体积的20mM PBS再次平衡纯化柱，并洗去未结合及非特异性的杂蛋白。洗涤结束后，用50mM Glycine-HCl溶液(pH2.7-3.0)对抗体进行洗脱，并收集于装有1MTris-HCl溶液(pH 8.75)进行中和。利用超滤管对洗脱蛋白进行浓缩及缓冲液的置换，最后用BCA法测定抗体浓度并进行分装，-20℃保存备用。
在获得的217株单克隆抗体中，通过ELISA进行初步筛选，确定了其中38株单克隆抗体能够特异性结合CD44v且不结合CD44s。将这38株单克隆抗体作为候选抗体用于进一步的实验。
实施例2.单克隆抗体特异性、亲和力筛选
上述实施例获得的一系列单克隆抗体，通过WB、流式、组化等方式进行特异性和亲和力评估，筛选获得具有高特异性、高亲和力的亚克隆(图13A)。
(1)Western blot(WB)：收集CD44v阳性/阴性细胞，200g离心2min，PBS清洗一遍，加入50ml细胞裂解液，振荡10s，冰上放置10min。12,000g离心5min，收集上清。BCA试剂盒测定蛋白浓度，吸取40-60μg蛋白，加入5×上样缓冲液。根据待检测蛋白分子量的大小制备相应浓度的胶。80V电泳约20min，到蛋白进入分离胶后改用110V电泳约80min。电泳完毕后，半干法转膜(24V，120min)，使蛋白转移到PVDF膜上。用含5％脱脂奶粉的TBST室温封闭1h或4℃过夜。纯化获得的单克隆抗体用含2％ BSA的TBST稀释，稀释至浓度为1ug/ml，4℃孵育过夜。TBST洗膜，2min/次，5次。将二抗按比例稀释，室温包被2h。TBST洗膜，2min/次，5次。显影，拍照，结果示于图13B。
(2)流式检测：收集CD44v阳性/阴性细胞，200g离心2min，PBS清洗一遍，用含有BSA(5％)的PBS重悬，冰上放置10min，进行封闭。封闭结束后，用PBS清洗一遍。用含有BSA(5％)的PBS稀释单克隆抗体至浓度为1ug/ml，重悬细胞，冰上静置15min。孵育结束后用遇冷的PBS清晰2遍。加入荧光二抗，冰上孵育15min。孵育结束后用PBS洗2遍，PBS重悬细胞，通过流式细胞仪进行检测，结果示于图13C。
(3)免疫组化分析：将正常组织/肿瘤组织切片浸入二甲苯、梯度稀释乙醇中进行切片脱蜡、水化，最终用PBS洗3次，每次5min。制备适量的柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)，将切片置于修复液中，继续加热，等液体沸腾及时5min，冷却至室温，进行抗原修复。PBS洗2次，每次2min。加入含％H2O2的甲醇溶液(V：V＝1:9)去内源性过氧化物酶，室温孵育10min。PBS洗2次，每次2min。10％山羊血清室温封闭1h。按照终浓度为1ug/ml加入制备的单克隆抗体，4℃孵育过夜。将切片恢复室温，PBS洗2次，每次2min。HRP标记的二抗，室温孵育30min。PBS洗2次，每次2min。DAB显色。苏木素复染30s，自来水冲洗。0.5％盐酸酒精分化5sec，自来水冲洗返蓝。脱水透明：将水化过程颠倒。封片显微镜下观察并拍照。
在前一实施例初筛获得的38株抗体(能够特异性识别CD44v抗原而不识别CD44s)中，通过WB进一步筛选出了3株特异性优越的单克隆抗体。对这3株抗体进一步运用SPR进行亲和力测定，结果示于图13D，并由此选定了特异性高、亲和力强的一株单克隆抗体，即1D8，并将其用于后续人源化改造。
实施例3.单克隆抗体人源化改造
(1)利用IMGT数据比对分析
通过对表达抗体的杂交瘤细胞进行测序获得了1D8的抗体序列。利用IMGT数据库的V-QUEST工具对已知抗体序列的可变区进行分析及注释。“种属”选择为Mus musculus，“Receptor type or locus”选择为IG，分别输入测序得到的抗体重链、轻链可变区核苷酸的FASTA格式文件，点击Start，数据库即可通过自动比对和分析，匹配得到与待分析抗体同源性最高的已知抗体，并对抗体的V(D)J、CDRs即FRs等进行详细的注释。确定的鼠源1D8抗体序列如下表1和表2所示。
表1.鼠源抗体1D8的CDR序列
表2.鼠源抗体1D8的重链、轻链的可变区序列和全长序列(CDR以粗体表示)
(2)对抗体序列进行人源化改造
采用Discovery studio对序列进行了人源化改造后，为抗体重链、轻链添加信号肽，为重链添加恒定区即可合成序列，并将序列构建与pCDNA3.4上用于人源化抗体的表达。获得的人源化抗体称为“H1D8”或“h1D8”，其具有与鼠源抗体相同的CDR序列以及如下表3所示的重链和轻链序列。
表3.人源化抗体H1D8的重链、轻链的可变区序列和全长序列
(3)人源化抗体的表达纯化
利用Expi 293F真核表达体系制备治疗性抗体已被认可。将重链和轻链的重组质粒共同转染至293F细胞，重链和轻链在细胞内可自动配对形成“Y”型抗体。将3.5×108个细胞接种于175mL无血清表达培养基中使得细胞密度达2×106个/mL，于二氧化碳恒温震旦培养箱中37℃条件下，125rpm，5％ CO2培养过夜。第二天待细胞密度达到4-5×106个/mL，按体积1：1加入新鲜培养基。将17.5mL的Opti-MEM与234μg的轻链重组质粒及117μg的重链重组质粒混合均匀；将17.5mL的Opti-MEM与1.05mg的PEI混合均匀，分别静置5min后，缓慢将两者混合，静置20min。然后将混合物加入细胞培养瓶中，于二氧化碳恒温震荡培养箱中37℃条件下，125rpm，5％CO2进行细胞培养及抗体的表达，每天观察细胞状态，3-4天后及时收取细胞培养上清，利用Protein A/G亲和层析对重组抗体进行纯化。纯化后人源化抗体的纯度、结合能力分析方法参考单克隆抗体性质鉴定，其中非还原性型SDS-PAGE即在制样过程中上样缓冲液不含β-巯基乙醇，其他操作与还原型SDS-PAGE相同。
实施例4.H1D8抗体的结合特异性
本实施例描述了对H1D8抗体的结合特异性进行测试的多项实验。
(1)与不同CD44截短突变体的结合能力
利用分子生物学方法构建了一系列CD44截短突变体的真核表达质粒。所述截短突变体为V2-10、V3-10、V4-10、V5-10、V6-10、V7-10、V8-10，且各个截短突变体的结构示意图示于图1A。将这些质粒转染至293T细胞中。运用WB方法检测单克隆抗体与这些截短突变体的结合情况，结果示于图1B。
如图1中的WB结果所示，人源化抗体H1D8与所有包含v5外显子的截短突变体V2-10、V3-10、V4-10、V5-10结合，并且不与不包含v5外显子的截短突变体V6-10、V7-10、V8-10结合。该结果充分说明了本发明的抗体的结合表位应该在CD44对应于外显子9的V5区(v5外显子)上。
(2)细胞模型验证人源化抗体H1D8对CD44v阳性肿瘤细胞的识别特异性
运用PCR方法验证了不同的CD44剪接变体在肝内胆管癌细胞株RBE、HCCC9810以及HuCCT1中的表达情况。使用的CD44v引物针对CD44s会扩增出94nt的条带，而针对不同的CD44剪接变体会扩增出长度在94-1394nt不等的多条条带。所述引物序列如下：
CD44v-F：5’-ATCCCAGACGAAGACAGTCCC-3’(SEQ ID NO:31)；和
CD44v-R：5’-TGTTTGCTCCACCTTCTTGAC-3’(SEQ ID NO:32)。
如图2A所示，RBE细胞株只表达CD44s，不表达任何CD44v；HCCC9810和HuCCT1均表达CD44v，并且HuCCT1表达水平更高。
运用流式细胞(FCM)检测分析H1D8与CD44v阳性肿瘤细胞株的结合能力，并将结果示于图2B。
如图所示，制备的人源化抗体H1D8不结合不表达CD44v的RBE细胞株，结合表达CD44v的HCCC9810和HuCCT1细胞株，并且对于CD44v表达水平更高的HuCCT1显示出更强的结合。这些结果说明H1D8可以特异性识别CD44v阳性肿瘤细胞株。
(3)在小鼠模型中验证人源化抗体H1D8在CD44v(CD44v2-v10)阳性肿瘤组织中的特异性富集
为了进一步验证人源化抗体H1D8的体内靶向性，采用与实施例1类似的方法分别构建了CD44s和CD44v2-v10过表达的两种RBE细胞株(图3A)。将构建好的细胞株皮下接种于裸鼠，构建胆管癌异位接种模型。在同一只小鼠的左右两侧接种分别表达CD44s或CD44v的细胞株。人源化抗体H1D8用Cy5染料进行标记，尾静脉注射进小鼠体内(100ug/只)，活体成像系统进行监测。具体操作如下。
构建双侧荷瘤小鼠模型，选取雌性5-6周龄Nude BALB/c小鼠，收取对数生长期的CD44s及CD44v细胞，用PBS洗涤2次，制备PBS细胞悬液，计数后加入20％基质胶并用PBS调整活细胞浓度为5×107个/mL，分别接种于裸鼠左、右侧腹股沟皮下接种，0.2mL/只。
Cy5偶联单克隆抗体：1.将抗体溶于0.1M碳酸钠缓冲液(pH 9)，浓度≥2mg/mL。建议现配现用。溶解Cy5于无水DMSO配制成浓度为1mg/mL的溶液。对于1mL蛋白溶液加入50μLFITC溶液，可按照每次5μL的量边加边轻轻搅拌蛋白溶液；待所需Cy5加入完毕，将反应液于4℃避光孵育8h；加入NH4Cl使其终浓度至50mM，4℃终止反应2h；加入二甲苯青至浓度0.1％，甘油至浓度5％；通过大小孔径合适的凝胶过滤层析分离排除未被结合的Cy5，分离范围在20,000至50,000(球蛋白例如抗体)。待凝胶柱平衡后，将以上反应混合液从柱顶注入，打开凝胶柱，待其全部流入柱床后，加入PBS缓冲液。此时，可以形成两条带：a，快速移动带，也就是Cy5-抗体偶联物，先被洗脱，通常于室内光下可看到；b，慢速移动带，也就是未结合蛋白的Cy5和二甲苯青。仅仅在PBS缓冲液清洗后被洗脱出来。于4℃避光储存。
活体成像：待动物模型构建1-2周后，肉眼可见肿瘤块形成，尾静脉注射偶联Cy5-抗体偶联物(50ug/只)。利用活体成像在不同注射时间对肿瘤及解剖后各组织器官的荧光值进行统计并分析。
活体成像的结果如图3B和3C所示，人源化抗体H1D8可以特异性识别CD44v5阳性肿瘤细胞，并在CD44v5阳性肿瘤组织中富集。
(4)在临床样本中验证单克隆抗体对CD44v5阳性肿瘤组织的特异性识别能力
制备了标准化临床样本，通过免疫组化的方法验证单克隆抗体H1D8对人主要组织中细胞的结合情况，进一步验证本发明的单克隆抗体的特异性。
按照实施例2中所述的方法，对H1D8特异性结合多种主要组织(包括甲状腺、舌、食管粘膜、胃粘膜、十二指肠粘膜、空肠粘膜、回肠粘膜、阑尾、结肠粘膜、直肠粘膜、肝脏、胰腺、气管、肺、心肌、动脉、骨骼肌、皮肤、精囊、前列腺、睾丸、膀胱、延脑、端脑、小脑、脑干、脾)以及胆管癌组织中细胞的能力进行了分析，并将结果示于图4A～4C。如图4所示，人源化抗体H1D8特异性识别CD44v5阳性胆管癌肿瘤组织，而不识别正常组织。鉴于CD44的不同剪接形式在正常组织中的广泛分布，本发明的抗CD44v5抗体对肿瘤组织的特异性识别出乎预料且具有重大意义，这说明本发明的抗体在被用于肿瘤治疗时，基本不会结合主要的正常组织，提高了抗体或抗体相关药物的安全性。
(5)与抗-CD44v6抗体Bivatuzumab的比较
运用正常皮肤组织对本发明的抗体以及抗-CD44v6的Bivatuzumab进行了免疫组化(IHC)测定，免疫组化实验方法与实施例2中所述的相同，并将结果示于图10。
如图所示，Bivatuzumab可以在正常皮肤组织中富集，而本发明的抗体则不会结合并富集在正常皮肤组织细胞中。这可能是由于本发明的抗体特异性识别CD44v5外显子，而正常皮肤组织中有可能不表达该结构域。
综上所述，在基于细胞、动物以及临床样本进行的系统分析与鉴定实验中，人源化抗体H1D8均可以特异性识别CD44v5阳性肿瘤组织，并且不结合正常组织，这在临床应用中具有重要意义。
实施例5.抗体内化检测
单克隆抗体的内化性质主要通过共聚焦高内涵活细胞成像、细胞免疫荧光及流式细胞术进行鉴定分析。
使用高内涵活细胞工作站对活细胞进行长时间成像与观察。通过观察不同时间点单克隆抗体在细胞的位置从而对抗体是否被内化以及内化的过程。提前一天按2000，4000，8000的密度将细胞接种于专用96孔板中。第二天弃去上清，用活细胞染料Hoechst 33342对细胞核进行染色，孵育10min后，吸除含染料的培养液，用培养液或PBS洗涤2-3次后，加入含有Cy5.5标记单克隆抗体培养基，立即转移至活细胞工作站，采集不同时间的荧光结果，对抗体的内化情况及过程进行监测。将结果示于图6A。
利用细胞免疫荧光对抗体和溶酶体进行共定位，从而检测抗体是否可以被内化。首先将细胞玻璃爬片进行无菌处理后放置于6孔板中，按104个/孔的细胞密度进行接种，培养48h。待细胞完全贴壁后，弃去培养基并用PBS洗涤细胞，置于冰上。每孔加入250μL的溶解有10ug抗体的PBS溶液，冰上孵育1h。弃去上清，加入正常完全培养基并将细胞置于37℃培养箱培养。分别在0h、0.5h、1h、4h及24h观察抗体内化情况，即在相应时间点弃去培养基加入3.7％固定细胞，以及0.5％ Triton X-100对细胞进行透化处理。加入待分析抗体种属荧光二抗，再加入溶酶体标志蛋白LAMP1抗体以及相应种属荧光二抗进行处理。最终加入DAPI染色及固定，利用荧光共聚焦显微镜对待检测抗体及溶媒体的共定位情况进行检测。将结果示于图6B。
利用流式细胞技术可以对细胞的内化效率进行分析。收集细胞用PBS洗涤一遍，PBS重悬细胞并调整细胞密度为2×107个/mL。每个EP管中加入50μL细胞悬液，即106个细胞，每个样品设置3个重复。向每支细胞中加入50μL浓度为10μg/mL的待检测抗体，混匀后冰上孵育60min。用2mL的PBS洗涤细胞并于4℃条件下300g离心5min。用200μL的PBS对细胞进行重悬，37℃孵育15min-2h，在不同时间点检测抗体的内化情况，其中每个时间点需设置4℃孵育的细胞作为非内化的阴性对照。将细胞转移至预先经过冰浴处理的新的EP管中并加入2mL 4℃的PBS终止内化，4℃条件下300g离心5min。用荧光二抗对在细胞膜表面的抗体进行检测，4℃避光孵育30min，用PBS洗涤细胞2次。内化程度的检测通过平均荧光强度(MFI)下降百分比表征。抗体的内化百分比以及细胞表面结合百分比(％of MFI)由以下公式计算：
％of MFI tx＝37℃孵育的MFI/4℃孵育的MFI×100
内化百分比(％tx)＝100-％of MFI tx。将结果示于图6C。
如图6A-C中的结果所示，H1D8能够通过内在化进入溶酶体。这意味着可以将H1D8与小分子药物偶联制成ADC，借助H1D8的内在化使ADC进入溶酶体，通过溶酶体降解之后，使小分子药物得以释放并发挥其预期的作用。
实施例6.基于人源化抗体制备抗体-药物偶联物H1D8-DC
本实施例描述了抗体药物偶联物的制备。
首先用3.2倍(质量摩尔比)的TCEP对人源化抗体H1D8进行还原，置于25℃水浴锅中恒温孵育2小时，然后加入N,N-二甲基乙酰胺(DMA)溶剂、7.0倍(质量摩尔比)的mc-vc-PAB-MMAE(HY-15575，MCE)(DMA为溶剂，10mg/mL)，使得最终共溶剂DMA含量为10％，然后偶联反应在25℃恒温孵育2小时，将mc-vc-PAB-MMAE(VcMMAE)偶联在H1D8上，获得靶向CD44v5的抗体药物偶联物H1D8-DC(图5A)。偶联反应结束用Zeba spin desalting column(用PBS预平衡)进行脱盐换液，将ADC样品置换到PBS的溶液中。将纯化后的ADC样品用SDS-PAGE、RP方法进行表征，检测药物抗体比值(DAR)为3.7(图5B和图5C)。
上述ADC中使用了药物-接头分子VcMMAE，其中的接头为缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)二肽接头，需要被溶酶体中的组织蛋白酶B(Cathepsin B；CTSB)水解才能释放药物分子，从而发挥作用。出乎预料的是，发明人发现通过正常皮肤组织中CTSB表达较低，而黑色素瘤组织中CTSB表达显著升高，在胆管癌中CTSB表达(供体1和供体2)也显著增高(图12)。这意味着在使用上述ADC时，在正常皮肤组织细胞中可能会由于CTSB的不足而不利于接头的切割和药物分子的释放，在黑色素瘤和胆管癌细胞中会更有利于药物分子的释放，这进一步提高了本发明的ADC的特异性和安全性。类似地，在两份作为肝内胆管癌组织供体的样本中，CTSB也有显著增高，说明了本发明的ADC也适合于治疗肝内胆管癌。
实施例7.ADC体外药效评价
在本实施例中，在体外测试了H1D8-DC特异性杀伤CD44v阳性肿瘤细胞的能力。
将细胞以5×104个/mL的细胞密度接种于96孔培养板中，每孔100μL，于37℃二氧化碳恒温培养箱中培养过夜。待细胞贴壁后，分别加入ADC使其终浓度达0、0.1、1、5、10、25、100、125、250、500、1000和10000nM，每组设置4个复孔，培养48h后，运用CCK-8、Calcein-AM/PI染色等方法进行细胞活力检测。计算IC50。具体方法如下。
用制备好的H1D8-DC(1ug/ml)分别处理CD44v5阴性细胞株RBE、CD44v5阳性细胞株HuCCT1。使用Calcein-AM/PI双染试剂盒对细胞进行染色，运用荧光显微镜进行监测(图7A)。结果显示H1D8-DC对CD44v5+HuCCT1具有杀伤作用。
进一步用上述不同浓度的H1D8-DC处理RBE、HuCCT1细胞，并通过CCK-8监测细胞活力。结果显示H1D8-DC在HuCCT1中的IC50约为100ng/ml，远低于RBE的IC50(约为2000ng/ml)(图7B)。
此外，还运用了上述实施例4中获得的CD44s/CD44v过表达的RBE细胞株，进一步评价了H1D8-DC对CD44v5阳性肿瘤细胞的特异性杀伤。如图7C-D所示，H1D8-DC对CD44s过表达的RBE没有细胞毒性，但是对CD44v过表达的RBE具有细胞毒性，并且呈现剂量依赖性。
实施例8.ADC体内药效评价
本实施例在小鼠模型中验证了H1D8-DC通过靶向CD44v5发挥的抗肿瘤作用。
肿瘤模型采用双侧荷瘤裸鼠模型，将过表达CD44s/CD44v的RBE细胞株，分别接种于裸鼠两侧腹股沟，2周左右成瘤，具体方法参考实施例4。待肿瘤体积约为100mm3时，将造模成功小鼠按肿瘤体积分为2组(n≥6)，分别于细胞株接种后第16、20、24天尾静脉给予ADC药物(实验组)，100ug/只，并以非靶向性的人免疫球蛋白G偶联MMAE的偶联物IgG-MMAE作为对照(isotype对照组)。每天观察小鼠状态，统计体重及肿瘤体积。给药3次后处死小鼠，对小鼠的体重、主要脏器(脑、心脏、肾脏、肝脏、肺和脾脏)的质量、肿瘤体积和质量进行统计。按照公式V＝1/2×长×宽×宽，计算肿瘤体积。将结果示于图8和图9。
如图所示，H1D8-DC可以特异性杀伤CD44v5阳性肿瘤细胞，抑制CD44v-RBE肿瘤的进展(图8B-C和E)。在此基础上，H1D8-DC的施用并不影响小鼠体重(图8D，图9A)，也不影响脑、心脏、肾脏、肝脏、肺、脾脏等主要脏器(图9B)。
实施例9.在PDX模型中评价ADC体内药效
使用来自两名肝内胆管细胞癌(ICC)患者(供体1和供体2)的CD44v5阳性的活检肿瘤组织，构建了人源性组织异种移植(patient-derived xenografts；PDX)小鼠模型。
通过免疫组化进一步确认了PDX小鼠模型中CD44v5抗原和增殖指标Ki-67的表达情况。如图14B所示，供体1的PDX小鼠模型中CD44v5的表达较低，肿瘤增殖标志物Ki-67的表达也较低，说明肿瘤增殖较慢；供体2的PDX小鼠中CD44v4表达高，Ki-67表达较高，说明肿瘤增殖快。
对PDX小鼠采用的给药和评价策略与实施例8中同细胞系异位接种小鼠模型实验中的策略一致(图14A)。肿瘤体积、小鼠体重的测量结果示于图14C和D，免疫组化结果示于图14E和F。
如图14C所示，在两组带有不同供体肿瘤的小鼠中，接受isotype对照IgG-MMAE的小鼠的肿瘤体积均持续增加；而接受本申请的H1D8-MMAE的小鼠的肿瘤在首次给药(第16天)后不久，肿瘤的增长均得到了相对于对照组而言非常显著的抑制。H1D8-MMAE使肿瘤生长基本上呈停滞状态，甚至出现了肿瘤体积的减小。在H1D8-MMAE组中，一只供体1的PDX小鼠的肿瘤体积下降为零，即完全消失。
如图14D所示，H1D8-MMAE和IgG-MMAE的使用都没有显著影响小鼠体重。
如图14E所示，H1D8-DC的使用并没有降低抗原CD44v5的表达，说明H1D8-DC可以引起长久的抗肿瘤反应。
图14F中的结果说明，H1D8-DC的使用使肿瘤细胞发生了显著的凋亡，降低了CD133阳性肿瘤干细胞的比例。
综合以上结果可以说明，H1D8-DC在体内对肝内胆管癌肿瘤细胞展现出显著的抗肿瘤活性，并且不会影响受试动物的体重。
实施例10.CAR分子的设计与CAR-M的构建
按照本公开的靶向CD44v5抗体，获得含该抗体的重链可变区和轻链可变区的单链抗体片段。然后，根据CAR分子的设计原理，构建CAR分子，简单来讲将信号肽(CD8a)、含本公开的靶向CD44v5抗体的重链可变区和轻链可变区的单链抗体、铰链区(CD8a)、跨膜区(CD8a)以及膜内结构域(FcgR1A)组装在一起构建特异性靶向CD44v5抗原、特异性激活巨噬细胞吞噬能力的CAR分子(图15A)。并将该部分序列通过同源重组的方法整合到慢病毒载体PLVX中。其中，构建CAR分子的信号肽、铰链区、跨膜区和膜内结构域为本领域常规使用的。
慢病毒质粒系统pLenti6/v5、psPAX2(#12260)、pMD2.G(#12259)购自Addgene。
1、慢病毒包装
在直径6cm的细胞培养皿中铺入293T细胞，当汇合度达到60～70％后，进行转染。慢病毒质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G的转染比例为5：3：1。DNA的总量为9μg，按照Lip2000：DNA＝2：1的比例将DNA-Opti-MEM与Lip2000-Opti-MEM进行混合，静置20min后加入到培养皿中。转染6～8h后给293T细胞更换培养液，48～72h后，收集细胞上清，以2500rpm/10min离心除去细胞碎片，再用0.45μm滤器过滤上清，接着加入5×慢病毒沉淀剂，上下颠倒混匀后，于4℃静置24～48h，待病毒沉淀聚集后，4℃/2500rpm离心30min，用500μL无血清培养基重悬病毒，将慢病毒置于-80℃保存备用；
2、THP1转染
在6孔板中铺1×106个THP1细胞，加入8μg/mL的Polybrene，37℃孵育30min后，向细胞中加入500μL上述包装好的慢病毒，混匀后于37℃/1900rpm离心1h进行转染，于培养箱中静置1h后，继续37℃/1900rpm离心1h，离心转染结束后置于培养箱中培养。
3、CAR-THP1的筛选
由于慢病毒对THP1细胞系的转染效率较低，通常不超过50％，因此利用pLenti6/v5载体的抗性基因Blasticidin对转染后的CAR-THP1进行筛选，得到稳定表达CAR分子的THP1稳转株，用于后续的实验。通过预实验得到THP1在Blasticidn作用下的最佳筛选浓度是5μg/mL，筛选时间为5～7天，因此按照此条件对上述CAR-THP1进行筛选，直至得到阳性率大于90％的CAR-THP1稳转株。
实施例11.CAR-M杀伤能力检测
运用荧光素酶杀伤实验检测CAR-THP1的肿瘤杀伤功能。
(1)巨噬细胞铺板：设置5个效靶比梯度，分别为10:1、3:1、1:1、1:3、1:10，由于需要保持肿瘤靶细胞在每个效靶比组中数量一致，为6000个/孔，因此按照效靶比梯度，收集THP1与CAR(F)-THP1细胞，制成细胞悬液并计数，分别以60000个/孔、18000个/孔、6000个/孔、2000个/孔、600个/孔铺入96孔板中，每个效靶比梯度设置3个复孔，加入终浓度为100nM的PMA刺激24h；
(2)肿瘤细胞铺板：收集MKN45-Luc细胞，制成细胞悬液并计数，将MKN45-Luc以6000个/孔铺入96孔板相对应的孔中，设置对照组，置于培养箱中；
(3)荧光素酶检测：分别在共培养24h与48h后，弃尽培养基，用PBS按照1:100的比例稀释荧光素酶底物(20mg/mL)，配成200μg/mL的工作液，每孔加入100μL荧光素酶底物，设置仪器检测参数，快速置于化学发光仪进行检测；根据公式：细胞抑制率＝1-(实验组平均值/对照组平均值)，计算CAR-THP1的肿瘤杀伤百分比。
结果如图15B显示，CAR-M对靶细胞具有显著的杀伤能力，并且随着效靶比的升高而升高。
实施例12.CAR-M对靶细胞吞噬能力的检测
流式检测CAR-M的肿瘤靶向吞噬功能。
(1)巨噬细胞铺板：用PBS以1:1000的比例将CFSE染料稀释为终浓度为5μM的工作液；收集UTD THP1、CAR-M细胞，PBS清洗1次，弃尽上清，加入1mL CFSE工作液，混匀细胞悬液，于37℃避光染色30min，用含血清的RPMI 1640培养液终止染色，PBS清洗3次，弃尽上清后重悬细胞并计数，将THP1、CAR(F)-THP1与CAR(C)-THP1以4×105个/孔铺入12孔板，加入终浓度为100nM PMA，将THP1诱导为巨噬细胞，置于培养箱中诱导24h；
(2)肿瘤细胞铺板：用PBS以1:1000的比例稀释DIR细胞染液，使其工作浓度为5μM；收集肿瘤靶细胞MDA-MB-231-CD44s与MDA-MB-231-CD44v，PBS清洗1次，弃尽上清，加入1mLDIR工作液，混匀细胞悬液，于37℃避光染色30min，用含血清DMEM培养液终止染色反应，PBS清洗3次，弃尽上清后重悬细胞并计数，吸出12孔板中的培养液，将MDA-MB-231-CD44s与MDA-MB-231-CD44v以4×105个/孔铺入12孔板中对应的孔，使巨噬细胞与肿瘤细胞的比例(即效靶比)为1:1，置于培养箱中；
(3)流式检测：分别在共培养12h和24h后，收集上述共培养的细胞于离心管中，PBS清洗1次，弃尽上清，用200μL PBS重悬细胞，通过流式细胞仪检测巨噬细胞的吞噬百分比。
结果如图15C所示，CAR-M对靶细胞特异性吞噬能力显著增强。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (14)
1.一种特异性结合人CD44的v5外显子的单克隆抗体或其片段，并且所述抗体或其片段包含：
重链可变区，其包含重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，所述重链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述重链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；和
轻链可变区，其包含轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3，所述轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述重链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
2.权利要求1所述的抗体或其片段，其包含：
(a)重链可变区，其包含如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列具有至少85％同源性，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；和/或
轻链可变区，其包含如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列具有至少85％同源性，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；或者
(b)重链可变区，其包含如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列具有至少85％同源性，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；和/或
轻链可变区，其包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少85％同源性，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成。
3.权利要求2所述的抗体或其片段，其包含：
(a)重链，其包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少85％同源性，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；和/或
轻链，其包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少85％同源性，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；或者
(b)重链，其包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少85％同源性，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；和/或
轻链，其包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少85％同源性，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成。
4.权利要求1-3中任一项所述的抗体或其片段，所述抗体特异性结合包含人CD44的v5外显子的抗原性多肽，例如包含v5外显子的人CD44剪接变体或其衍生物，且不结合人CD44s或不包含v5外显子的人CD44剪接变体，和/或
所述片段为抗体的抗原结合片段或抗体衍生物，优选为Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。
5.一种嵌合抗原受体分子，其包括胞外抗原结合结构域，所述胞外抗原结合结构域包括权利要求1-4中任一项所述的抗体或其片段。
6.权利要求5所述的嵌合抗原受体分子，所述嵌合抗原受体分子还包括：
跨膜结构域，优选地，所述跨膜接结构域包括T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154中的一种或多种组合；
铰链区，所述铰链区优选包括CD8α铰链；和/或
胞质信号传导结构域，所述胞质信号传导结构域优选包括共刺激结构域。
7.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-4中任一项的抗体或其片段，或权利要求5或6所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。
8.权利要求7的核酸分子，其包含：
(1)编码重链的核苷酸序列，其包含编码如SEQ ID NO:21所示的重链可变区(VH)的核苷酸序列，并且包含如SEQ ID NO:25所示的编码VH的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性的核苷酸序列；和/或
编码轻链的核苷酸序列，其包含编码如SEQ ID NO:22所示的轻链可变区(VL)的核苷酸序列，并且包含如SEQ ID NO:26所示的编码VL的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性的核苷酸序列；或者
(2)编码重链的核苷酸序列，其包含编码如SEQ ID NO:23所示的重链可变区(VH)的核苷酸序列，并且包含如SEQ ID NO:27所示的编码VH的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性的核苷酸序列；和/或
编码轻链的核苷酸序列，其包含编码如SEQ ID NO:24所示的轻链可变区(VL)的核苷酸序列，并且包含如SEQ ID NO:28所示的编码VL的核苷酸序列，或与其具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性的核苷酸序列。
9.一种重组载体，其包含权利要求7或8所述的核酸分子。
10.一种宿主细胞，其包含权利要求7或8所述的核酸分子，或权利要求9所述的重组载体。
11.一种抗体药物偶联物(ADC)，其包含权利要求1-4中任一项所述的抗体或其片段，以及细胞毒性药物。
12.权利要求11所述的抗体药物偶联物，其中所述细胞毒性药物为微管蛋白抑制剂，优选奥瑞他汀类药物，更优选一甲基奥瑞他汀(MMAE)，和/或
所述抗体药物偶联物进一步包含连接所述抗体和细胞毒性药物的接头，优选可切割接头，更优选可切割的二肽接头，例如缬氨酸-瓜氨酸二肽接头，和/或
所述抗体药物偶联物为抗CD44v5抗体-Val-Cit-MMAE。
13.一种药物组合物，其包含权利要求1-4中任一项的抗体、权利要求5或6所述的嵌合抗原受体分子或权利要求11或12中任一项的抗体药物偶联物，和药学上可接受的载体，所述药物组合物优选还包括其他预防或治疗性药物。
14.权利要求1-4中任一项的抗体、权利要求5或6所述的嵌合抗原受体分子或权利要求11或12中任一项的抗体药物偶联物在制备药物中的用途，所述药物优选用于治疗癌症，优选表达包含人CD44的v5结构域的抗原性多肽的癌症，例如黑色素瘤、肝细胞癌或胆管癌。
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