CN116490192A - 寡糖组合物及其使用方法 - Google Patents

寡糖组合物及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116490192A
CN116490192A CN202180065168.9A CN202180065168A CN116490192A CN 116490192 A CN116490192 A CN 116490192A CN 202180065168 A CN202180065168 A CN 202180065168A CN 116490192 A CN116490192 A CN 116490192A
Authority
CN
China
Prior art keywords
oligosaccharide composition
subject
composition
oligosaccharides
oligosaccharide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180065168.9A
Other languages
English (en)
Inventor
J·梅斯纳
C·M·刘
M·罗西尼
M·赫克特
E·亨弗里斯
A·乔斯
J·范希尔卡马弗利格
M·道林
M·文格特扎恩
J·李
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dsm Nutritional Products Co ltd
Original Assignee
Dsm Nutritional Products Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dsm Nutritional Products Co ltd filed Critical Dsm Nutritional Products Co ltd
Publication of CN116490192A publication Critical patent/CN116490192A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/20—Reducing nutritive value; Dietetic products with reduced nutritive value
    • A23L33/21—Addition of substantially indigestible substances, e.g. dietary fibres
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/702—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/30—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols, e.g. xylitol; containing starch hydrolysates, e.g. dextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/125—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols; containing starch hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A61K31/52—Purines, e.g. adenine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/60—Salicylic acid; Derivatives thereof
    • A61K31/606—Salicylic acid; Derivatives thereof having amino groups
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
    • C07H3/04—Disaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
    • C07H3/06—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/163—Sugars; Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/32—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on the health of the digestive tract
    • A23V2200/3202—Prebiotics, ingredients fermented in the gastrointestinal tract by beneficial microflora
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本公开内容的各个方面涉及寡糖组合物及其制备方法。还提供了使用寡糖组合物作为微生物群系代谢疗法以减少炎症以治疗炎症和免疫障碍和疾病的方法。

Description

寡糖组合物及其使用方法
发明领域
本公开涉及寡糖组合物及其用途。
背景技术
维持或恢复人类健康面临大量挑战，其中许多挑战是由于缺乏有效的治疗选项。具体而言，炎症性肠病(IBD)包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩氏病(CD)，在美国影响约300万人，是一种慢性复发性免疫介导的肠道疾病，目前尚无有效治疗选项。IBD的发病机制知之甚少，但被认为是由遗传、环境、肠道屏障和免疫因素相互作用引起的，这些因素改变肠道稳态并引发易感个体的炎症。持续需要用于疾病和障碍例如IBD的新疗法和治疗方案。
发明概述
根据一些方面，本文提供了利用寡糖组合物的微生物群系代谢疗法，其可用于驱动肠道微生物群系器官的功能输出以，例如，治疗疾病。本公开内容的一些方面涉及以下认识：寡糖组合物可用于增加受试者体内的短链脂肪酸(SCFA)例如丁酸、乙酸和/或丙酸的水平，以及促进共生细菌相对于致病菌的生长和丰度，这两种功能性结果可用于治疗多种炎症和免疫疾病，包括自身免疫和过敏性障碍(例如，慢性炎症性障碍，例如炎症性肠病，例如溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩氏病(CD)。因此，在本文所述的一些方面，本公开内容的寡糖组合物可有效治疗炎症性和免疫障碍，包括溃疡性结肠炎。
在一些方面，本文提供了寡糖组合物，其包含多种寡糖，所述多种寡糖的特征在于多重编辑梯度增强的1H-13C异核单量子相干(HSQC)NMR谱，其包含下表的信号2、3和11中的一个或多个，
其中信号1-11中的每一个的曲线下面积(AUC)是通过获得使用椭圆形对由1H中心位置和13C中心位置限定的积分区域的积分确定的，并且其中所述谱图是使用具有少于2％单体的寡糖组合物样品产生的：
在一些实施方案中，寡糖组合物包含信号2、3和11中的2个或3个，其中信号2的AUC(占信号1-11总面积的百分比)在0.34-2.01范围内，信号3的AUC(占信号1-11总面积的百分比)在7.28-25.71范围内，信号11的AUC(占信号1-11总面积的百分比)在7.93-12.69范围内。
在一些实施方案中，寡糖组合物包含信号2、3和11中的2个或3个，其中信号2的AUC(占信号1-11总面积的百分比)在0.68-1.68范围内，信号3的AUC(占信号1-11总面积的百分比)在10.97-22.02范围内，信号11的AUC(占信号1-11总面积的百分比)在8.88-11.74的范围内。
在一些实施方案中，寡糖组合物进一步包含信号5，其中信号5的AUC(占信号1-11总面积的百分比)在0.23-3.87范围内。在一些实施方案中，寡糖组合物进一步包含信号5，其中信号5的AUC(占信号1-11总面积的百分比)在0.96-3.14范围内。
在一些实施方案中，寡糖组合物进一步包含信号1、4、6、7、8、9和10中的一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)，其中至少信号1、4、6、7、8、9和10定义如下：
在一些实施方案中，信号1-11中的至少一个定义如下：
在一些方面，本文提供了寡糖组合物，其包含多种寡糖，所述多种寡糖的特征在于多重编辑梯度增强的1H-13C异核单量子相干(HSQC)NMR谱，其包含下表的信号2、3和11中的一个或多个，其中信号1-11中的每一个的曲线下面积(AUC)是通过获得使用椭圆形对由1H中心位置和13C中心位置限定的积分区域的积分确定的，并且其中所述谱图是使用具有少于2％单体的寡糖组合物样品产生的：
在一些实施方案中，寡糖组合物包含信号2、3和11中的2个或3个，其中信号2的AUC(占信号1-11总面积的百分比)在0.77-1.70范围内，信号3的AUC(占信号1-11总面积的百分比)在10.52-22.14范围内，信号11的AUC(占信号1-11总面积的百分比)在9.14-11.59范围内。
在一些实施方案中，寡糖组合物包含信号2、3和11中的2个或3个，其中信号2的AUC(占信号1-11总面积的百分比)在1.05-1.45的范围内，信号3的AUC(占信号1-11总面积的百分比)在12.94-18.90范围内，信号11的AUC(占信号1-11总面积的百分比)在9.73-10.99范围内。
在一些实施方案中，寡糖组合物进一步包含信号5，其中信号5的AUC(占信号1-11总面积的百分比)在0.77-3.24范围内。
在一些实施方案中，寡糖组合物进一步包含信号5，其中信号5的AUC(占信号1-11总面积的百分比)在1.26-2.42范围内。
在一些实施方案中，寡糖组合物进一步包含信号1、4、6、7、8、9和10中的一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)，其中至少信号1、4、6、7、8、9和10定义如下：
在一些实施方案中，寡糖组合物包含寡糖组合物的信号1-11中的至少一者，定义如下：
在一些实施方案中，信号1-11的1H中心位置和13C中心位置限定的积分区域进一步定义如下：
在一些实施方案中，NMR谱图是通过对组合物样品进行多重编辑梯度增强的1H-13C异核单量子相干(HSQC)实验(例如，在500MHz工作的NMR仪器中)而得到的，所述实验使用回波-反回波方案使用以下脉冲序列图、采集参数和处理参数进行相干选择：
脉冲序列图(图5)
采集参数
1H载波频率＝4ppm
13C载波频率＝65ppm
采集维度中的点数＝596
采集维度中的频谱范围＝6.23ppm至1.83ppm
间接维度中的点数＝300个复杂点
间接维度中的频谱范围＝120ppm至10ppm
循环延迟＝1秒
单键1H-13C耦合常数＝JCH＝146Hz
扫描次数＝8
温度＝298-299K
溶剂＝D2O
处理参数
直接维度的窗函数＝高斯展宽，7.66Hz
间接维度的窗函数＝高斯展宽26.48Hz
处理＝直接维度中的512个复杂点，间接维度中的1024个复杂点
在一些实施方案中，NMR谱是通过对组合物的样品进行多重编辑梯度增强的1H-13C异核单量子相干(HSQC)实验(例如，在以600MHz操作的NMR仪器中)得到的，所述实验使用回波-反回波方案使用以下脉冲序列图、采集参数和处理参数进行相干性选择：
脉冲序列图
采集参数
1H载波频率＝600.13MHz
13C载波频率＝150.91MHz
脉冲序列＝hsqcedetgpsisp2.3
采集维度中的点数＝2048
采集维度中的频谱范围＝6.75ppm至0.25ppm
间接维度中的点数＝512
间接维度中的频谱范围＝120ppm至0ppm
循环延迟＝1.5秒
单键1H-13C耦合常数＝JCH＝145Hz
扫描次数＝8
温度＝298-299K
溶剂＝D2O
处理参数
直接维度的窗函数＝Qsine 2
间接维度的窗函数＝Qsine 2
处理＝直接维度中的2048个复杂点，间接维度中的2048个复杂点
前向线性预测＝32个系数，512个预测点
在一些实施方案中，NMR谱是通过对寡糖组合物的样品进行HSQC NMR得到的，其中样品溶解在D2O中。在一些实施方案中，寡糖组合物已经过脱单体化程序。
在一些实施方案中，寡糖组合物包含少于10％的单体。在一些实施方案中，寡糖组合物包含少于5％的单体。在一些实施方案中，寡糖组合物包含少于2％的单体。
在一些实施方案中，寡糖组合物包含多种基本上由式(I)组成的寡糖：
其中式(I)中的R独立地选自氢、以及式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id):
其中式(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)中的R独立地如以上式(I)中所定义。
在一些方面，本文提供包含多种寡糖的寡糖组合物，每种寡糖包含多种单体基团；
该多种寡糖包含以下单体基团中的一个或多个：
(4)3-吡喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中5.31-7.15mol％的单体基团；
(10)6-吡喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中13.81-19.02mol％的单体基团；
(16)3,6-吡喃半乳糖和/或2,6-呋喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中4.14-5.93mol％的单体基团；和/或
(17)2,6-吡喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中1.98-2.99mol％的单体基团。
在一些实施方案中，多种寡糖包含选自基团(4)、(10)、(16)和(17)的至少2、3或4种单体基团。
在一些实施方案中，寡糖组合物进一步包含一种或多种以下单体基团：
(1)t-呋喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中6.29-12.84mol％的单体基团；
(2)t-吡喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中20.45-28.28mol％的单体基团；
(3)2-呋喃半乳糖和/或2-呋喃葡萄糖单基，其代表所述多种寡糖中2.73-3.46％mol％的单体基团；
(5)3-呋喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中3.36-4.28mol％的单体基团；
(6)2-吡喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中4.12-4.45mol％的单体基团；
(7)4-吡喃半乳糖和/或5-呋喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中4.65-5.87mol％的单体基团；
(8)2,3-呋喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中0.43-0.82mol％的单体基团；
(9)6-呋喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中2.92-9.58mol％的单体基团；
(11)3,4-吡喃半乳糖和/或3,5-呋喃半乳糖和/或2,3-吡喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中1.41-1.99mol％的单体基团；
(12)2,4-吡喃葡萄糖和/或2,5-呋喃葡萄糖和/或2,4-吡喃半乳糖和/或2,5-呋喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中0.88-1.21mol％的单体基团；
(13)2,3,4-吡喃半乳糖和/或2,3,5-呋喃半乳糖三基，其代表所述多种寡糖中0.14-0.28mol％的单体基团；
(14)3,6-呋喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中1.69-2.27mol％的单体基团；
(15)4,6-吡喃半乳糖和/或5,6-呋喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中3.93-5.26mol％的单体基团；
(18)3,4,6-吡喃半乳糖和/或3,5,6-呋喃半乳糖和/或2,3,6-呋喃半乳糖三基，其代表所述多种寡糖中0.91-1.68mol％的单体基团；
(19)2,3,6-吡喃半乳糖和/或2,4,6-吡喃半乳糖和/或2,5,6-呋喃半乳糖三基，其代表所述多种寡糖中0.01-3.10mol％的单体基团；和/或
(20)2,3,4,6-吡喃半乳糖和/或2,3,5,6-呋喃半乳糖四基，其代表所述多种寡糖中0.01-0.28mol％的单体基团。
在一些实施方案中，寡糖组合物包含多种寡糖，每种寡糖包含多种单体基团；
所述多种寡糖包含以下单体基团的一种或多种：
(4)3-吡喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中4.79-7.75mol％的单体基团；
(10)6-吡喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中11.64-22.24mol％的单体基团；
(16)3,6-吡喃半乳糖和/或2,6-呋喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中2.20-7.06mol％的单体基团；和/或
(17)2,6-吡喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中0.89-3.63mol％的单体基团。
在一些实施方案中，多种寡糖包含选自基团(4)、(10)、(16)和(17)的至少2、3或4种单体基团。
在一些实施方案中，寡糖组合物进一步包含一种或多种以下单体基团：
(1)t-呋喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中2.52-15.21mol％的单体基团；
(2)t-吡喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中13.49-40.02mol％的单体基团；
(3)2-呋喃半乳糖和/或2-呋喃葡萄糖单基，其代表所述多种寡糖中0.64％-4.82mol％的单体基团；
(5)3-呋喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中2.22-5.03mol％的单体基团；
(6)2-吡喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中3.10-5.13mol％的单体基团；
(7)4-吡喃半乳糖和/或5-呋喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中3.99-6.87mol％的单体基团；
(8)2,3-呋喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中0.00-1.93％mol％的单体基团；
(9)6-呋喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中1.52-10.39mol％的单体基团；
(11)3,4-吡喃半乳糖和/或3,5-呋喃半乳糖和/或2,3-吡喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中0.68-3.15mol％的单体基团；
(12)2,4-吡喃葡萄糖和/或2,5-呋喃葡萄糖和/或2,4-吡喃半乳糖和/或2,5-呋喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中0.49-1.45mol％的单体基团；
(13)2,3,4-吡喃半乳糖和/或2,3,5-呋喃半乳糖三基，其代表所述多种寡糖中0.00-0.67mol％的单体基团；
(14)3,6-呋喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中0.41-3.10mol％的单体基团；
(15)4,6-吡喃半乳糖和/或5,6-呋喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中3.60-5.65mol％的单体基团；
(18)3,4,6-吡喃半乳糖和/或3,5,6-呋喃半乳糖和/或2,3,6-呋喃半乳糖三基，其代表所述多种寡糖中0.68-1.85mol％的单体基团；
(19)2,3,6-吡喃半乳糖和/或2,4,6-吡喃半乳糖和/或2,5,6-呋喃半乳糖三基，其代表所述多种寡糖中0.00-3.51mol％的单体基团；和/或
(20)2,3,4,6-吡喃半乳糖和/或2,3,5,6-呋喃半乳糖四基，其代表所述多种寡糖中0.00-0.35mol％的单体基团。
在一些实施方案中，所述多种寡糖包含选自基团(1)-(3)、(5)-(9)、(11)-(15)和(18)-(20)的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16种单体基团。
在一些实施方案中，多种寡糖包含选自基团(1)-(20)的单体基团的每一个。
在一些实施方案中，单体基团的摩尔百分比使用全甲基化测定来确定，其中全甲基化测定包括气相色谱质谱(GC-MS)分析。
在一些实施方案中，寡糖组合物包含多种基本上由式(I)组成的寡糖：
其中式(I)中的R独立地选自氢、以及式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id):
其中式(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)中的R独立地如以上式(I)中所定义。
在一些实施方案中，寡糖组合物的平均聚合度(DP)为约DP11至约DP19。在一些实施方案中，寡糖组合物的平均聚合度(DP)为约DP13至约DP17。在一些实施方案中，组合物包含大于85％的DP2+。在一些实施方案中，组合物包含87-95％的DP2+。在一些实施方案中，组合物包含89-93％的DP2+。在一些实施方案中，组合物包含58-94％的总膳食纤维(干基)。在一些实施方案中，组合物包含65-87％的总膳食纤维(干基)。
在一些实施方案中，寡糖组合物包含多种寡糖，所述多种寡糖包含式(I)：
其中式(I)中的R独立地选自氢、以及式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id):
其中式(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)中的R独立地如上式(I)中所定义；
其中所述寡糖组合物通过包括以下的方法生成：
(a)用包含带正电荷的氢离子的酸催化剂形成包含半乳糖单体的反应混合物；和
(b)通过向反应混合物传递足够的热量以将反应混合物保持在其沸点，从而促进反应混合物中酸催化寡糖的形成。
在一些实施方案中，步骤(b)包括将该反应混合物装载包含带正电荷氢离子的酸催化剂，其量使得带正电荷的氢离子与总半乳糖单体含量的摩尔比在合适的范围内。在一些实施方案中，步骤(a)和(b)同时发生。在一些实施方案中，步骤(a)包括在搅拌条件下将反应混合物加热至100℃至160℃范围内的温度。在一些实施方案中，步骤(a)包括在搅拌条件下将反应混合物加热至130℃至140℃范围内的温度。在一些实施方案中，步骤(a)包括在合适的条件下逐渐升高温度(例如，从室温)至约136℃以实现同质性和均匀的热传递。
在一些实施方案中，步骤(b)包括将反应混合物保持在大气压或真空下，在128℃至140℃(任选地130℃至140℃)范围内的温度，在促进酸催化寡糖组合物形成的条件下，直至寡糖组合物中半乳糖单体的重量百分比在5-14％的范围内。在一些实施方案中，步骤(b)包括将反应混合物保持在大气压或真空下，在128℃至140℃(任选地130℃至140℃)范围内的温度，在促进酸催化寡糖组合物形成的条件下，直至寡糖组合物中半乳糖单体的重量百分比在5-13％的范围内。在一些实施方案中，步骤(b)包括将反应混合物保持在大气压或真空下，在128℃至140℃(任选地130℃至140℃)范围内的温度，在促进酸催化寡糖组合物形成的条件下，直至寡糖组合物中半乳糖单体的重量百分比在7-11％的范围内。在一些实施方案中，步骤(b)包括将反应混合物保持在大气压或真空下，在约136℃的温度，在促进酸催化寡糖组合物形成的条件下，直至寡糖组合物中半乳糖单体的重量百分比在5-13％的范围内。在一些实施方案中，步骤(b)包括将反应混合物保持在大气压或真空下，在约136℃的温度，在促进酸催化寡糖组合物形成的条件下，直至寡糖组合物中半乳糖单体的重量百分比在7-11％的范围内。
在一些实施方案中，酸催化剂是强酸阳离子交换树脂，其具有根据表1的一种或多种物理和化学性质和/或其中催化剂包含>3.0mmol/g磺酸部分和<1.0mmol/g阳离子部分。在一些实施方案中，催化剂具有45-50重量百分比的标称水分含量。在一些实施方案中，酸催化剂是可溶性催化剂。在一些实施方案中，可溶性催化剂是有机酸。在一些实施方案中，可溶性催化剂是弱有机酸。在一些实施方案中，可溶性催化剂是柠檬酸。
在一些实施方案中，该方法进一步包括：(c)淬灭反应混合物，例如用水，同时使反应混合物的温度达到55℃至95℃范围内的温度(例如，85℃、90℃)。在一些实施方案中，该方法(例如，大规模方法，例如，50L、2000L或大于50L的方法)进一步包括(c)例如用水淬灭反应混合物，同时使将反应混合物的温度调节至20℃至40℃范围内的温度(例如，20℃、25℃)。
在一些实施方案中，该方法还包括：(d)将寡糖组合物与酸催化剂分离。在一些实施方案中，所述分离包括通过过滤除去催化剂。在一些实施方案中，(d)包括在过滤之前将反应混合物冷却至低于约100℃。
在一些实施方案中，该方法还包括：(e)用水将(d)的寡糖组合物稀释至约40-55重量百分比(任选地，45-55重量百分比)的浓度；(f)将稀释的组合物通过阳离子交换树脂；(g)使稀释的组合物通过脱色聚合物树脂；和/或(h)使稀释的组合物通过阴离子交换树脂；其中(f)、(g)和(h)中的每一个可以以任何顺序进行一次或多次。
在一些方面，本文提供了减轻受试者炎症的方法。在一些实施方案中，减轻受试者炎症的方法包括向受试者的胃肠道施用有效量的本文所述的寡糖组合物。
在一些方面，本文提供了治疗患有或疑似患有炎症性和免疫障碍的受试者的方法。在一些实施方案中，治疗患有或疑似患有炎症性和免疫障碍的受试者的方法包括向受试者的胃肠道施用有效量的本文所述的寡糖组合物，从而治疗受试者。
在一些方面，本文提供治疗患有或疑似患有炎症性和免疫障碍的受试者的方法，该方法包括向受试者的胃肠道施用有效量的寡糖组合物，其中寡糖组合物的平均聚合度为5-20且包含多种寡糖，其选自式(I)：
其中式(I)中的R独立地选自氢、以及式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id):
其中式(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)中的R独立地如以上式(I)中所定义，从而治疗受试者。
在一些方面，本文提供了治疗患有或疑似患有炎症性肠病的受试者的方法。在一些实施方案中，治疗患有或疑似患有炎症性肠病的受试者的方法包括向受试者的胃肠道施用有效量的本文所述的寡糖组合物，从而治疗受试者。
在一些方面，本文提供了治疗患有或疑似患有炎症性肠病的受试者的方法，包括向受试者的胃肠道施用有效量的寡糖组合物，其中寡糖组合物的平均聚合度为5-20且包含多种寡糖，其选自式(I)：
其中式(I)中的R独立地选自氢、以及式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id):
其中式(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)中的R独立地如以上式(I)中所定义，从而治疗受试者。
在一些实施方案中，炎症性和免疫障碍是慢性炎症性障碍。在一些实施方案中，慢性炎症性障碍是炎症性肠病。
在一些实施方案中，炎症性肠病是溃疡性结肠炎。在一些实施方案中，炎症性肠病是克罗恩氏病。在一些实施方案中，炎症性肠病是肉芽肿性结肠炎。在一些实施方案中，炎症性肠病是未定型结肠炎。在一些实施方案中，炎症性肠病是转向性结肠炎。在一些实施方案中，炎症性肠病是结肠袋炎。在一些实施方案中，炎症性肠病是白塞氏病。在一些实施方案中，炎症性肠病是显微镜下结肠炎。在一些实施方案中，炎症性肠病是憩室病相关结肠炎。在一些实施方案中，炎症性肠病是胶原性结肠炎。在一些实施方案中，炎症性肠病是淋巴细胞性结肠炎。在一些实施方案中，炎症性肠病是小儿发病的炎症性肠病。
在一些方面，本文提供了增加受试者中短链脂肪酸的相对或绝对丰度的方法。在一些实施方案中，增加受试者中短链脂肪酸的相对或绝对丰度的方法包括向受试者的胃肠道施用有效量的本文所述的寡糖组合物。
在一些实施方案中，与基线测量值相比(例如，其中基线测量值在治疗前确定)，短链脂肪酸的相对或绝对丰度增加至少5％、10％、20％或30％。
在一些实施方案中，短链脂肪酸是丁酸、乙酸和/或丙酸。
在一些方面，本文提供了降低受试者中促炎和/或致病细菌的相对或绝对丰度的方法。在一些实施方案中，降低受试者中促炎和/或致病细菌的相对或绝对丰度的方法包括向受试者的胃肠道施用有效量的本文所述的寡糖组合物。在一些实施方案中，促炎和/或致病细菌是肠杆菌科和/或瘤胃球菌科。
在一些方面，本文提供了增加受试者中共生细菌的相对或绝对丰度的方法。在一些实施方案中，增加受试者中共生细菌的相对或绝对丰度的方法包括向受试者的胃肠道施用有效量的本文所述的寡糖组合物。在一些实施方案中，共生细菌是副拟杆菌属和/或拟杆菌属。
在一些实施方案中，受试者是人类受试者。在一些实施方案中，受试者是新生儿(早产新生儿、足月新生儿)、一岁以下的婴儿、幼儿(例如，1岁至12岁)、青少年(例如，13-19岁)、成年人(例如，20-64岁)或老年人(例如，65岁及以上)。
在一些实施方案中，该方法包括将寡糖组合物施用至肠(例如，大肠)。在一些实施方案中，寡糖组合物是自我施用至受试者的。在一些实施方案中，寡糖组合物被配制为用于口服递送的药物组合物。在一些实施方案中，寡糖组合物被口服施用至受试者。在一些实施方案中，寡糖组合物每天一次或每天两次施用于受试者。
在一些实施方案中，该方法增加受试者(例如，受试者的胃肠道)中总短链脂肪酸的丰度或浓度。
在一些实施方案中，该方法增加受试者(例如，受试者的胃肠道)中丁酸的丰度或浓度。在一些实施方案中，该方法增加受试者(例如，受试者的胃肠道)中丙酸的丰度或浓度。在一些实施方案中，该方法增加受试者(例如，受试者的胃肠道)中乙酸的丰度或浓度。
在一些实施方案中，总SCFA的丰度相对于基线测量值(例如，其中基线测量值是在治疗之前确定的)增加至少5％、10％、20％或30％。在一些实施方案中，丁酸、丙酸和乙酸中至少一种的丰度相对于基线测量值(例如，其中基线测量值是在治疗之前确定的)增加至少5％、10％、20％或30％。
在一些实施方案中，该方法促进受试者胃肠道微生物群系内共生细菌的生长(例如，增加它们的相对丰度)。在一些实施方案中，该方法促进受试者胃肠道微生物群系内副拟杆菌属和拟杆菌属的生长(例如，增加它们的相对丰度)。
在一些实施方案中，该方法导致受试者胃肠道微生物群系内促炎和/或致病细菌的丰度降低。在一些实施方案中，该方法导致受试者胃肠道微生物群系内促炎症性肠杆菌科的丰度降低。
在一些实施方案中，该方法导致属于受试者的大便/粪便样品中的粪便钙卫蛋白、粪便脂质运载蛋白和/或粪便乳铁蛋白的水平相对于基线测量值降低。在一些实施方案中，粪便钙卫蛋白的水平相对于基线测量值降低至少50％。在一些实施方案中，粪便钙卫蛋白的水平相对于基线测量值降低至少65％。在一些实施方案中，粪便乳铁蛋白的水平相对于基线测量值降低至少50％。
在一些实施方案中，该方法引起受试者胃肠道微生物群系内与粘附侵入性大肠杆菌相关的基因的消耗。在一些实施方案中，与粘附侵入性大肠杆菌相关的基因是fimH、ompA和ompC。
在一些实施方案中，施用寡糖组合物至少20、30、40或50天。在一些实施方案中，施用寡糖组合物56天或10周。在一些实施方案中，施用寡糖组合物20-100天，任选地50-75天。
在一些实施方案中，受试者患有溃疡性结肠炎，并且其中寡糖组合物的施用导致溃疡性结肠炎疾病活动相对于基线测量值降低。在一些实施方案中，溃疡性结肠炎疾病活动的降低使用简单临床结肠炎活动指数(Simple Clinical Colitis Activity Index，SCCAI)综合评分来测量。
在一些实施方案中，该方法进一步包括施用标准护理治疗。在一些实施方案中，标准护理治疗是5-ASA(美沙拉嗪)、硫唑嘌呤、维多珠单抗、英夫利昔单抗或阿达木单抗。
一些方面提供了降低受试者(任选地表现出炎症性疾病的受试者)中与炎症相关的一种或多种生物标志物(例如，粪便钙卫蛋白、粪便脂质运载蛋白和/或粪便乳铁蛋白)的水平的方法，包括以有效量向受试者施用权利要求1-57中任一项的寡糖组合物以相对于基线测量值降低一种或多种生物标志物的水平。
一些方面提供了降低受试者(任选地表现出炎症性疾病的受试者)中一种或多种致病有机体(例如，促炎细菌分类群，例如肠杆菌科)的丰度的方法，包括以有效量向受试者施用权利要求1-57中任一项的寡糖组合物以降低一种或多种致病有机体的丰度。
一些方面提供了增加受试者(任选地表现出炎症性疾病的受试者)中一种或多种共生分类群(例如，副拟杆菌属和拟杆菌属)的丰度的方法，包括以有效量向受试者施用权利要求1-57中任一项的寡糖组合物以增加一种或多种共生分类群的丰度。
在一些实施方案中，在来自受试者的大便/粪便样品中测量一种或多种生物标志物的水平、一种或多种致病有机体的丰度和/或一种或多种共生分类群的丰度。
附图说明
图1提供了显示相对于阴性对照(水)，所选的寡糖组合物使来自八名健康人类受试者的粪便样品中的丁酸浓度增加的能力的图。
图2A-2B提供的图表显示了相对于阴性对照(水)，所选的寡糖组合物使八名健康人类受试者的粪便样品中的短链脂肪酸(丁酸、丙酸和乙酸)浓度增加的能力。图2A显示了在测试的粪便样品中产生的短链脂肪酸的中位数量(以mM为单位)。图2B显示了在每个测试的粪便样品中产生的丁酸、丙酸和乙酸的相对比例。
图3A-3B提供的图表显示了相对于阴性对照(水)，所选的寡糖组合物调节来自八名健康人类受试者的粪便样品中致病菌和共生菌丰度的能力。图3A显示所选的寡糖组合物导致致病菌属(肠杆菌科)的相对丰度降低。图3B显示所选的寡糖组合物导致共生菌属(副拟杆菌属和拟杆菌属)的相对丰度增加。
图4提供了临床食品研究试验的示意图设计，以评估所选的寡糖组合物在患有溃疡性结肠炎(UC)的受试者中的安全性和耐受性，以及微生物群系变化和由所选的寡糖组合物调节的炎症生物标志物的变化。
图5提供示例HSQC NMR脉冲序列图。
图6A-6C提供了与所选的寡糖组合物相关的HSQC NMR数据。图6A显示了使用实施例8中描述的方法获得的所选寡糖的HSQC NMR谱图(F2维度＝1H；F1维度＝13C)。图6B显示了使用椭圆形(F2维度＝1H；F1维度＝13C)限定所选的寡糖组合物的HSQC NMR峰/信号1-11的坐标的积分区域。图6C示出了由长轴坐标(F2维度；1H)和短轴坐标(F1维度；13C)限定的椭圆形的示例。
图7A-7B提供了使用实施例8中描述的方法获得的所选寡糖的HSQC NMR谱图图像(F2维度＝1H；F1维度＝13C)。图7A显示非异头区域的放大图。注释表明所选寡糖中存在的离散键类型的指定位置；和所选的寡糖组合物的峰/信号7-11。图7B显示异头区域的放大图。注释表明所选寡糖中存在的离散键类型的指定位置；和所选的寡糖组合物的峰/信号1-6。
图8提供的图表明了在水的存在下将所选的寡糖组合物在不同温度保持六小时的时间段的效果。
图9提供了示例机制，据认为所选的寡糖组合物通过该机制减少肠道炎症。
图10提供的图显示与阴性对照(水)相比，所选的寡糖组合物增加十名健康人类受试者的粪便样品中总短链脂肪酸(SCFA)和单个SCFA(乙酸、丙酸和丁酸)浓度的能力。
图11提供了Bray-Curtis非度量多维标度(NMDS)排序图，其显示与阴性对照(水)相比，所选的寡糖组合物改变了来自10名健康人类受试者的粪便样品中微生物群系的组成。图中的每个数据点代表来自单个粪便样品的微生物群系组成。圆圈的数据点代表与所选的寡糖组合物一起孵育的样品。
图12提供了热图，其显示与阴性对照(水)相比，在与所选的寡糖组合物孵育后来自健康受试者的十个粪便样品(行)中细菌分类群(列)的相对丰度的log2倍变化。在热图的左侧指明了样品中耗尽的分类群(包括致病有机体)；在热图的中央和右侧指明了富集的分类群(包括共生群)。
图13A-13B提供的图表显示了相对于阴性对照(水)，所选的寡糖组合物在来自八名健康人类受试者的粪便样品中调节致病菌和共生菌丰度的能力。图13A显示了所选的寡糖组合物对共生属(副拟杆菌属)的相对丰度的影响。图13B显示了所选的寡糖组合物对致病有机体属(肠杆菌科)相对丰度的影响。
图14A-14B提供的图显示了所选的寡糖组合物在单菌株测定中对共生细菌分类群(图14A)(粪副拟杆菌、狄氏副拟杆菌、单形拟杆菌、多形拟杆菌和粪便拟杆菌)和致病有机体分类群(图14B)(大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、暗沟肠杆菌和肠道沙门氏菌)生长的影响，其使用阴性对照(水，以评估不添加碳源的情况下的最小生长)和阳性对照(葡萄糖，作为通用碳源以评估测定的最大生长能力)。
图15A-15B提供的图显示了所选的寡糖组合物在参与实施例11中描述的临床试验后降低患有溃疡性结肠炎(UC)的人类患者的粪便生物标志物水平的能力。图15A显示了筛查时和摄入结束时(参见图4)患者粪便样品中的粪便钙卫蛋白水平，绘制为数据集(左)和每个个体(右)。图15B显示了摄入之前和结束时(参见图4)患者粪便样品中的粪便乳铁蛋白水平，绘制为数据集(左)和每个个体(右)。
图16提供了溃疡性结肠炎(UC)患者在施用实施例11中描述的临床试验中所选的寡糖组合物后，摄入之前和结束时(参见图4)的简单临床结肠炎活动指数(SCCAI)综合评分，其绘制为数据集(左)和每个个体(右)。
图17A-17B提供的图显示了来自参与实施例11中描述的临床试验的五名溃疡性结肠炎(UC)患者在摄入前和结束时(参见图4)的粪便样品中所选的致病细菌和共生细菌分类群的丰度，绘制为数据集(左)和每个个体(右)。图17A显示了副拟杆菌属分类群的相对丰度。图17B显示了肠杆菌科分类群的相对丰度。
图18提供的图显示了溃疡性结肠炎(UC)患者在参与实施例11中描述的临床试验之后，摄入之前和结束时(参见图4)的粪便样品中与粘附侵入性大肠杆菌相关的三种基因(fimH、ompA和ompC)的变化，绘制为数据集(左)和每个个体(右)。
图19提供的图显示了为鉴定所选的寡糖组合物而进行的筛查工作，表明了所筛查的431种合成寡糖和所选的寡糖的平均丁酸产量。
图20提供了临床研究以评估所选的寡糖组合物治疗患有轻度至中度活动性溃疡性结肠炎的患者的能力的示意图设计。
发明详述
本文所述的组合物和方法基于寡糖组合物可用于减轻受试者炎症的发现。在一些实施方案中，本文所述的寡糖组合物可用于在受试者中产生增加水平的短链脂肪酸(SCFA)，例如丁酸、丙酸和乙酸。在一些实施方案中，本文所述的寡糖组合物可用于降低相对于受试者(例如，受试者的胃肠道)中的共生微生物(例如，副拟杆菌属和拟杆菌属)促炎微生物分类群(例如，来自肠杆菌科的分类群)的丰度。在一些实施方案中，由于受试者中SCFA水平增加和/或受试者(例如，受试者的胃肠道)中促炎微生物的相对丰度降低，炎症在受试者中减少。在一些实施方案中，本文所述的寡糖组合物可用于治疗炎症性和免疫障碍，包括自身免疫和过敏性障碍。在一些实施方案中，本文所述的寡糖组合物可用于治疗慢性炎症性障碍，例如炎症性肠病。在一些实施方案中，本文所述的寡糖组合物可用于治疗炎症性肠病，例如溃疡性结肠炎(UC)、克罗恩氏病(CD)、肉芽肿性结肠炎、未定型结肠炎、转向性结肠炎、结肠袋炎、白塞氏病、显微镜下结肠炎、憩室病相关结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎和小儿发病的炎症性肠病。在一些实施方案中，本文所述的寡糖组合物可用于治疗炎症性肠病例如溃疡性结肠炎(UC)。
本公开内容的某些方面基于广泛筛查工作的结果，该筛查工作被执行以鉴定能够调节(例如，增加)受试者中不同类型的短链脂肪酸(例如丁酸、丙酸和乙酸)的浓度。测定了数百种独特的寡糖组合物在离体环境中对人体胃肠道微生物群系的影响。在筛查中检查的寡糖组合物是使用不同的糖单体(例如右旋糖单体、木糖单体等)以及在不同反应温度、不同时间段和/或存在不同催化剂条件的条件下生成的。从这一筛查工作中，所选的寡糖组合物被鉴定为SCFA，例如丁酸、丙酸和乙酸的高效调节剂。
SCFA，如丁酸、丙酸和乙酸，在维持受试者健康的上皮功能、免疫稳态和胃肠道炎症方面起着重要作用。此外，SCFA刺激肠道上皮对致病菌产生定植抵抗，促进胃肠道调节性T细胞的分化和功能。丁酸用作胃肠道上皮细胞的能量来源并促进上皮完整性的维持。维持上皮完整性对于防止先天性和适应性免疫细胞的不当激活很重要。丁酸激活上皮细胞和免疫细胞表面的G蛋白偶联受体(GPCR)，并抑制这些细胞类型细胞核中的组蛋白脱乙酰酶。这些宿主细胞靶标的参与促进了胃肠道中免疫功能和免疫稳态的适当平衡。丙酸还可以通过激活这些相同的GPCR来促进肠道免疫稳态。受试者胃肠道中这些SCFA水平的增加对应于胃肠道中炎症的减少和/或炎症可能性的降低。因此，将本文所述的所选的寡糖组合物施用于受试者导致所述受试者中SCFA水平增加，最终导致炎症减轻和/或胃肠道炎症的可能性降低。
除了产生增加水平的SCFA之外，所选的寡糖组合物的发酵会导致共生细菌(例如，副拟杆菌属和拟杆菌属)的生长，并在胃肠道中创造营养竞争的生态系统。这种竞争环境有助于防止、减缓或限制会破坏肠道稳态并刺激有害的炎症免疫反应的促炎症性致病菌(例如，来自肠杆菌科的分类群)的定植。由于施用所选的寡糖组合物，胃肠道微生物生态系统的变化减少了促炎微生物的相对丰度，导致炎症的减少和/或胃肠道炎症的可能性降低。
因此，在一些实施方案中，该寡糖组合物特别可用于治疗患有生态失调、致病菌相对于共生菌的相对丰度高和/或短链脂肪酸水平低的受试者。在一些实施方案中，所选的寡糖组合物可用于治疗炎症性和免疫障碍。在一些实施方案中，所选的寡糖组合物可用于治疗自身免疫性和过敏性障碍。在一些实施方案中，所选的寡糖组合物可用于治疗慢性炎症性障碍。在一些实施方案中，所选的寡糖组合物可用于治疗炎症性肠病(例如，溃疡性结肠炎(UC)、克罗恩氏病(CD)、肉芽肿性结肠炎、未定型结肠炎、转向性结肠炎、结肠袋炎、白塞氏病、显微镜下结肠炎、憩室病相关结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎和小儿发病的炎症性肠病)。炎症性和免疫障碍，特别是影响胃肠道的慢性炎症性障碍(例如炎症性肠病)的一个标志是肠道微生物群组成的深刻改变，即生态失调，多项临床研究的可重复发现表明促炎分类群(例如，来自肠杆菌科的分类群)存在的增加和与正常免疫活动相关的共生多样性减少。因此，受试者胃肠道中短链脂肪酸的产生增加和/或共生细菌相对于促炎细菌的丰度增加(例如，由将本文所述的所选的寡糖组合物施用至受试者的胃肠道引起)可以导致治疗炎症性和免疫障碍，例如慢性炎症障碍(例如，炎症性肠病，例如溃疡性结肠炎或克罗恩氏病)。
在一些实施方案中，所选的寡糖组合物通过以下起作用来减少炎症，例如慢性消化道和/或全身性炎症，例如与溃疡性结肠炎相关的炎症：(a)刺激有益细菌的生长、代谢和/或营养利用，从而通过营养竞争间接限制病原体生长；和/或促进SCFA和其他微生物代谢物的产生，其支持减少炎症的肠上皮功能。在一些实施方案中，所选的寡糖组合物被认为使用图9所描述的一种或多种或所有机制来减少炎症，其中，例如，寡糖组合物优先支持产生SCFA和其他有用代谢物的有益分类群(例如，共生分类群)的生长，而不支持(细菌)致病有机体或病原体的生长。SCFA和其他代谢物支持肠上皮细胞并调节肠道炎症，这又可以改善屏障功能。宿主上皮细胞和肠道微生物群的这些变化可以直接降低UC受试者的胃肠道炎症；并进一步限制全身炎症。
在一些实施方案中，所选的寡糖组合物可用于治疗炎症性肠病例如溃疡性结肠炎(UC)。溃疡性结肠炎导致大肠和直肠粘膜反复发炎和溃疡。尽管UC的确切病理生理学尚不清楚，但多项证据表明该疾病是由改变肠道稳态的遗传和环境因素共同引起的，从而引发免疫介导的炎症。UC包括三组疾病活动和进展-轻度活动(2-4的改良Mayo评分)、中度活动(5-7的中度Mayo评分)和重度活动(8-9的改良Mayo评分)。具有轻度UC活动的受试者通常少于或等于4次大便/天，有或没有血液，浅表粘膜有有限的红斑，并且通常未使用生物制剂，具有长期5-ASA促进缓解和通常由短疗程类固醇管理发作。具有中度UC活动的受试者通常有5次或更多次大便/天和轻度但增加的贫血，这是由于内窥镜检查中的腹泻和中度结肠溃疡引起的。具有中度UC活动的典型受试者在5-ASA治疗后从轻度进展到中度，并且通常用IS/类固醇和早期生物制剂(例如，抗TNF、维多珠单抗)治疗。具有严重UC活动的受试者通常有8次或更多次大便/天的大量血性腹泻，内窥镜检查显示粘膜血管标记消失。从中度进展到重度的患者主要接受生物制剂和小分子治疗，结肠切除术被认为是最后的选择。
大多数UC患者被诊断为30至40岁，男性患病率略有升高(男性占UC患者的～60％)，并在30至50岁之间出现最严重的症状。随着患者年龄的增长，他们的UC疾病活动趋于衰退。遗传易感性被认为是发生UC的关键风险因素，但有人提出，环境触发因素可能是炎症发作所必需的。UC患者通常会出现自身免疫性肠外表现形式的合并症(例如，类风湿性关节炎、原发性硬化性胆管炎)，因此除了UC治疗外，可能还需要针对其他自身免疫性病症进行额外的医疗或药物干预。
UC可以使用微生物粪便检测、内窥镜检查、生物标志物分析和血常规来诊断。最初的微生物粪便测试可用于通过PCR确定结肠炎症的感染原因(例如沙门氏菌、艰难梭菌、弯曲杆菌感染)，同时也可对常见的肠道寄生虫进行显微镜粪便分析。UC诊断可以通过内窥镜检查来确认，例如，以识别结肠粘膜的连续溃疡(而病变组织的“跳跃区域”支持克罗恩氏病的诊断)。在一些实施方案中，用于UC诊断的生物标志物分析包括每年测试C反应蛋白(CRP)水平以监测缓解。
在一些实施方案中，所选的寡糖组合物可用于治疗炎症性肠病例如克罗恩氏病(CD)。克罗恩氏病会引起胃肠道炎症(尤其是小肠末段和结肠)，导致腹痛、严重腹泻、疲劳、体重减轻和营养不良。
在一些实施方案中，所选的寡糖组合物可用于治疗炎症性肠病例如肉芽肿性结肠炎。肉芽肿性结肠炎引起胃肠道炎症、壁增厚和壁分层丧失。在一些实施方案中，肉芽肿性结肠炎在末端回肠中最为普遍。
在一些实施方案中，所选的寡糖组合物可用于治疗炎症性肠病例如未定型结肠炎。未定型结肠炎的特点是胃肠道炎症和炎症性肠病的典型症状。在一些实施方案中，受试者被诊断患有未定型结肠炎，因为组织学结果对于任何其他炎症性肠病(例如，UC或CD)是不确定的。
在一些实施方案中，所选的寡糖组合物可用于治疗炎症性肠病例如转向性结肠炎。转向性结肠炎是一种由外科手术(例如，回肠造口术或结肠造口术)并发症引起的结肠炎症，通常在手术后一年内发生。
在一些实施方案中，所选的寡糖组合物可用于治疗炎症性肠病例如结肠袋炎。结肠袋炎是在治疗其他炎症性肠病(如溃疡性结肠炎或其他胃肠道疾病、某些其他疾病)的外科手术(例如J储袋手术)期间产生的储袋内层炎症。大约25-50％的J储袋手术患者会出现结肠袋炎。
在一些实施方案中，所选的寡糖组合物可用于治疗炎症性肠病例如白塞氏病。白塞氏病是一种罕见的障碍，会导致全身血管发炎。在一些实施方案中，胃肠道经历中度至重度炎症、腹痛、腹泻和出血。
在一些实施方案中，所选的寡糖组合物可用于治疗炎症性肠病例如显微镜下结肠炎。显微镜下结肠炎引起大肠炎症，导致持续性水样腹泻。在一些实施方案中，显微镜下结肠炎进一步分类为胶原性结肠炎(特征在于结肠组织中的厚胶原层)、淋巴细胞性结肠炎(特征在于结肠组织中淋巴细胞增加)或不完全性显微镜下结肠炎(特征在于胶原性和淋巴细胞性结肠炎的特征的组合)。
在一些实施方案中，所选的寡糖组合物可用于治疗炎症性肠病例如憩室病相关结肠炎。憩室病相关结肠炎的特征是受憩室病影响的乙状结肠发生慢性炎症。炎症可能位于管腔粘膜中。
在一些实施方案中，所选的寡糖组合物可用于治疗炎症性肠病例如小儿发病的炎症性肠病。小儿发病的炎症性肠病通常会导致结肠发炎并且可能对标准护理药物产生耐药性，影响17岁以下的人群。在一些实施方案中，小儿发病的炎症性肠病进一步分类为早发性炎症性肠病(特征为10岁以下发病)、极早发性炎症性肠病(特征为6岁以下发病)、幼稚炎症性肠病(特征为2岁以下发病)，或新生儿炎症性肠病(特征为28日龄以下发病)。
下面提供本公开的进一步的方面，包括定义术语的描述。
I.定义
搅拌条件：如本文所用，术语“搅拌条件”是指促进或维持混合物(例如，包含半乳糖单体的反应混合物)关于固体(例如固体催化剂)分散的基本均匀或均质状态、热传递均匀性或其他类似参数的条件。搅拌条件通常包括搅拌、摇动和/或混合反应混合物。在一些实施方案中，搅拌条件可以包括向溶液中添加气体或其他液体。在一些实施方案中，搅拌条件用于维持催化剂，例如酸催化剂的基本均匀或均质的分布。在一些实施方案中，在酸催化剂的存在和以实现均质性和均匀的热传递合适的条件下加热单糖制剂，从而合成寡糖组合物。
约：如本文所用，术语“近似地”或“约”，应用于一个或多个感兴趣的值，是指类似于陈述的参考值的值。在某些实施方案中，术语“近似地”或“约”是指以任何方向(大于或小于)与所陈述的参考值相差不超过15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少中的一系列值，除非另有说明或从上下文中可以明显看出(除非该数字超过可能值的100％)。
有效量：如本文所用，术语“有效量”是指寡糖组合物的施用量或浓度，其是引发生物反应所必需且足以的，例如，在受试者或患者中。在一些实施方案中，有效量的寡糖组合物能够增加受试者中(例如，受试者的胃肠道中)的短链脂肪酸(例如，丁酸、丙酸和/或乙酸)的浓度。在一些实施方案中，有效量的寡糖组合物能够调节，例如，增加或减少至少一种微生物物种的浓度或数量。在一些实施方案中，有效量的寡糖组合物能够使受试者中促炎微生物和/或病原体(例如，药物或抗生素抗性病原体，或MDR病原体)的定植的获得减少或储库减少。在一些实施方案中，有效量的寡糖组合物能够降低促炎微生物和/或致病微生物相对于共生微生物的丰度。在一些实施方案中，有效量的寡糖组合物能够治疗患有自身免疫性和过敏性障碍(例如，慢性炎症性障碍例如炎症性肠病)的受试者。在一些实施方案中，有效量的寡糖组合物能够治疗溃疡性结肠炎(UC)、克罗恩氏病(CD)、肉芽肿性结肠炎、未定型结肠炎、转向性结肠炎、结肠袋炎、白塞氏病、显微镜下结肠炎、憩室病相关结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎和/或小儿发病的炎症性肠病。在一些实施方案中，有效量的寡糖组合物能够调节，例如，减轻受试者的自身免疫性和过敏性障碍(例如，慢性炎症性障碍，例如炎症性肠病)的症状(例如，症状的严重程度或数量)。在一些实施方案中，有效量的寡糖组合物能够调节，例如，增加或减少受试者体内酶的活性或水平。在一些实施方案中，有效量的寡糖组合物能够调节，例如，增加或减少代谢物的加工。
半乳糖单体：如本文所用，术语“半乳糖单体”通常是指半乳糖单体的D-异构体，称为D-半乳糖。
单糖制剂：如本文所用，术语“单糖制剂”是指包含半乳糖单体的制剂。在一些实施方案中，单糖制剂包含半乳糖单体。
寡糖：如本文所用，术语“寡糖”(在某些情况下可以与术语“低聚糖”互换使用)是指包含经由糖苷键(聚合度(DP)至少为2(例如，DP2+))连接在一起的半乳糖单体的糖分子。在一些实施方案中，寡糖包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个通过糖苷键连接的单糖亚基。在一些实施方案中，3-20、4-16、5-15、8-12、5-25、10-25、20-50、40-80或75-100个单糖范围内的寡糖通过糖苷键连接。在一些实施方案中，寡糖包含至少一个1,2；1,3；1,4；和/或1,6糖苷键。寡糖可以是直链或支链的。寡糖可具有一个或多个呈α-构型的糖苷键和/或一个或多个呈β-构型的糖苷键。
药物组合物：如本文所用，“药物组合物”是指在减轻、治疗或预防疾病中具有药理活性或其他直接作用的组合物，和/或其最终剂型或制剂，并且用于人类。药物组合物或药物制剂通常是在良好生成规范(GMP)条件下生成的。药物组合物或制剂可以是无菌的或非无菌的。如果是非无菌的，则此类药物组合物或制剂通常符合美国药典(USP)或欧洲药典(EP)中所述的非无菌药物产品的微生物学指标和标准。本文所述的任何寡糖组合物都可以配制成药物组合物。
受试者：如本文所用，术语“受试者”是指人类受试者或患者。受试者可以包括新生儿(早产新生儿、足月新生儿)、一岁以下的婴儿、幼儿(例如，1岁至12岁)、青少年(例如，13-19岁)、成年人(例如，20-64岁)和老年人(65岁及以上)。在一些实施方案中，受试者为儿童人群或其子人群，其包括新生儿(出生至1个月)、婴儿(1个月至2岁)、发育中的儿童(2至12岁)和青少年(12至16岁)。在一些实施方案中，受试者是健康受试者。在一些实施方案中，受试者是相对于健康受试者具有降低水平的SCFA，例如丁酸、丙酸和/或乙酸的患者。在一些实施方案中，受试者患有自身免疫性和/或过敏性障碍(例如，慢性炎症性障碍)。在一些实施方案中，受试者患有炎症性肠病。在一些实施方案中，受试者患有溃疡性结肠炎(UC)、克罗恩氏病(CD)、肉芽肿性结肠炎、未定型结肠炎、转向性结肠炎、结肠袋炎、白塞氏病、显微镜下结肠炎、憩室病相关结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎或小儿发病的炎症性肠病。在一些实施方案中，相对于健康受试者，受试者具有降低水平的共生细菌(例如，副拟杆菌属和拟杆菌属)。在一些实施方案中，相对于健康受试者，受试者具有增加水平的致病菌(例如，肠杆菌科)。在一些实施方案中，与健康人相比，受试者具有相对于共生菌升高的致病菌比率。在一些实施方案中，受试者的年龄在20至70岁之间、20至60岁之间、25至60岁之间或25至55岁之间。在一些实施方案中，受试者具有至少一种合并症，例如，除了炎症性肠病(例如，UC、CD)，例如自身免疫病症，例如类风湿性关节炎。在一个实施方案中，受试者表现出轻度疾病(例如，轻度UC)。例如，受试者表现出溃疡性结肠炎Mayo评分/疾病活动指数(DAI)为2-4，例如，每天排便少于4次，有或没有血液，浅表粘膜有有限的红斑。在一个实施方案中，受试者表现出中度疾病(例如，中度UC)。例如，受试者表现出溃疡性结肠炎的Mayo评分/疾病活动指数(DAI)为5-7，例如，每天大便5次或更多，并且由于腹泻和内窥镜检查中的结肠中度溃疡引起的加重，但增加的贫血。在一个实施方案中，受试者表现出严重的疾病(例如，严重的UC)。例如，受试者表现出的溃疡性结肠炎Mayo评分/疾病活动指数(DAI)为8-9，例如，每天8次或更多次大便的大量血性腹泻，内窥镜检查显示粘膜血管标记缺失。在一个实施方案中，受试者表现出轻度至中度疾病(例如，轻度至中度UC)。在一个实施方案中，受试者表现出中度至重度疾病(例如，中度至重度UC)。
治疗方法和治疗：如本文所用，术语“治疗”和“治疗方法”是指将组合物施用于受试者(例如，患有不良病症、障碍或疾病的有症状受试者)以影响症状严重程度和/或频率的降低、消除症状和/或其根本原因，和/或促进损害的改善或补救，和/或在易患特定的不良病症、障碍或疾病，或怀疑患有该病症、障碍或疾病或有发展这种病症、障碍或疾病的风险的无症状受试者中预防所述不良病症、障碍或疾病。在一些实施方案中，用寡糖组合物治疗受试者调节，例如，增加受试者中短链脂肪酸(SCFA)例如丁酸、丙酸和/或乙酸的相对或绝对水平。在一些实施方案中，用寡糖组合物治疗受试者降低自身免疫性和/或过敏性障碍(例如，慢性炎症性障碍)的严重性。在一些实施方案中，用寡糖组合物治疗受试者降低炎症性肠病(例如，溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、肉芽肿性结肠炎、未定型结肠炎、转向性结肠炎、结肠袋炎、白塞氏病、显微镜下结肠炎、憩室病相关结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎和/或小儿发病的炎症性肠病)的严重性。在一些实施方案中，用寡糖组合物治疗受试者提高患有或疑似患有自身免疫性和/或过敏性障碍(例如，慢性炎症性障碍，例如炎症性肠病，例如溃疡性结肠炎或克罗恩氏病)的人的生活质量。在一些实施方案中，用寡糖组合物治疗受试者减少患有或疑似患有自身免疫性和/或过敏性障碍(例如，慢性炎症性障碍，例如炎症性肠病，例如溃疡性结肠炎或克罗恩氏病)的症状(例如腹泻、发热、疲劳、腹痛、血便、炎症、体重减轻)的数量和严重性。在一些实施方案中，用寡糖组合物治疗受试者防止自身免疫性和/或过敏性障碍(例如，慢性炎症性障碍，例如炎症性肠病，例如溃疡性结肠炎或克罗恩氏病)的恶化、进展或发作。在一些实施方案中，用寡糖组合物治疗受试者减少慢性炎症性障碍(例如炎症性肠病，例如溃疡性结肠炎或克罗恩氏病)的症状复发的次数和/或复发率。在一些实施方案中，用寡糖组合物治疗受试者群体提高患有或疑似患有自身免疫性和/或过敏性障碍(例如，慢性炎症性障碍，例如炎症性肠病，例如溃疡性结肠炎或克罗恩氏病)的接受治疗的人的平均生活质量。在一些实施方案中，用寡糖组合物治疗受试者群体降低患有或怀疑患有自身免疫性和/或过敏性障碍(例如，慢性炎症性疾病，例如炎症性肠病，例如溃疡性结肠炎或克罗恩氏病)的接受治疗的人的症状(例如腹泻、发热、疲劳、腹痛、血便、炎症、体重减轻)的平均数量和严重性。在一些实施方案中，用寡糖组合物治疗受试者导致以下一项或多项中至少5％的改善，例如至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％的改善)：相对于对照或护理标准治疗的症状数量、症状严重程度、疾病严重程度和正在治疗的疾病的进展。例如，症状的临床缓解，例如，在10周、26周或52周后(例如，在治疗开始后)。可以通过测量一种或多种疾病相关生物标志物来评估治疗，包括与炎症相关的生物标志物，例如粪便钙卫蛋白、粪便乳铁蛋白和粪便脂质运载蛋白。或者或另外，治疗可以是通过评估粘膜愈合(例如，肠道内壁)来评估。或者或此外，可以通过评估生活质量(QoL)来评估治疗，例如使用32项炎症性肠病问卷(IBDQ-32)，该问卷评估例如受试者的肠道症状、情绪健康、系统性系统和社会功能。在一个实施方案中，QoL分数可以是自我报告的。治疗也可以使用简单临床结肠炎活动指数(SCCAI)综合评分进行评估(例如，如Walmsley,R S；Walmsley,R S；Ayres,R C S；Pounder,R E；Allan,R N(1998)."A simple clinicalcolitis activity index".Gut.43(1):29–32所报道)。
II.寡糖组合物
本文提供寡糖组合物及其用于降低人类受试者炎症的使用方法。
一方面，本文提供的寡糖组合物包含多种寡糖，其选自式(I)
其中式(I)中的R独立地选自氢、以及式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id):
其中式(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)中的R独立地如以上式(I)中所定义。
在一些实施方案中，寡糖组合物通过最初涉及将包含半乳糖单体的制剂加热至100℃至160℃、100℃至120℃、110℃至110℃至130℃、120℃至140℃、130℃至150℃，或约135℃范围内的温度。加热可以在搅拌条件下进行。加热可包括在合适的条件下逐渐升高温度(例如，从室温)至约130℃、约135℃、约140℃、约145℃或约150℃以实现同质性和均匀的传热。
将包含带正电荷的氢离子的酸催化剂加入到制剂中(例如，在加热之前)。在一些实施方案中，酸催化剂是固体催化剂。在一些实施方案中，催化剂是具有一种或多种根据表1的物理和化学性质的强酸阳离子交换树脂。在一些实施方案中，催化剂包含>3.0mmol/g的磺酸部分和<1.0mmol/g的阳离子部分。在某些实施方案中，催化剂具有45-50重量百分比的标称水分含量。在一些实施方案中，催化剂是可溶性催化剂，例如有机酸催化剂。在一些实施方案中，催化剂是柠檬酸、乙酸、丁酸或丙酸。在某些实施方案中，催化剂与半乳糖单体同时添加。
表1：强酸性阳离子交换树脂特性的非限制性示例
在一些实施方案中，在用催化剂装载制剂之后，在促进酸催化寡糖形成的条件下，将所得反应混合物保持在大气压和100℃至160℃、100℃至120℃、110℃至130℃、120℃至140℃、130℃至150℃或约135℃的范围内的温度。在一些实施方案中，一旦寡糖组合物中总半乳糖单体内容物的重量百分比在2-14％(任选地2-5％、4-8％、5-13％、7-10％、7-11％、9-14％或8-12％)的范围内，将反应混合物淬灭。淬灭通常涉及使用水(例如，去离子水)稀释反应混合物，并逐渐将反应混合物的温度降低至55℃至95℃。在一些实施方案中，用于淬灭的水为约95℃。可以在足以避免使混合物固化的条件下将水加入到反应混合物中。在某些实施方案中，可以通过蒸发从反应混合物中除去水。在一些实施方案中，反应混合物可包含50-55重量百分比的溶解固体。在一些实施方案中，应根据图8和实施例19的公开，其证明了所选的寡糖组合物在各种升高的温度的稳定性，以及时的方式进行淬灭。
最后，为了获得纯化的寡糖组合物，该组合物通常通过用水将淬灭的反应混合物稀释至约35-60重量百分比(任选地，35-50重量百分比)的浓度和低于约85℃的温度，然后混合物通过过滤器或一系列色谱树脂。在一些实施方案中，最终的纯化寡糖组合物是通过用水将淬灭的反应混合物稀释至约35-60重量百分比(任选地35-50重量百分比)的浓度和低于约85℃的温度(例如，室温)，无需使用任何色谱树脂而获得的。在一些实施方案中，组合物与酸催化剂分离。在某些实施方案中，所使用的过滤器是0.45μm过滤器。或者，可以使用一系列色谱树脂并且通常包括阳离子交换树脂、阴离子交换树脂和/或脱色聚合物树脂。在一些实施方案中，任何或所有类型的树脂可以以任何顺序使用一次或多次。在一些实施方案中，寡糖组合物包含低于在室温下储存时微生物生长所必需的水平的水。
在一些实施方案中，寡糖组合物通过大规模方法生产(例如，大于50L规模、500-5000L、1000-5000L、1000-4000L、1000-3000L、1500-3000L，例如，反应器的大小)。在一些实施方案中，用于生产寡糖组合物的大规模方法是50L方法(例如，50L反应器)，例如，如实施例12所述。在一些实施方案中，用于生产寡糖组合物的大规模方法是2000L工艺(例如，2000L反应器)，例如，如实施例13所述。本领域技术人员将理解如何基于可用的反应器和他们可用的仪器(例如，尺寸、形状、材料等的选择用于反应器、搅拌器、叶轮、电机等)修改本文所述的大规模方法(例如，如实施例12和13所述)。例如，对实施例13(2000L规模)描述的大规模方法的修改可能涉及改变从沸点(例如，约112℃)到反应维持温度(例如，约130℃)的增加(例如，加快或减慢温度增加)；和/或以逐步方式改变搅拌速率(例如，以减少反应器及其电机的功率使用)，例如，以允许增加反应材料的粘度。
在某些实施方案中，所有寡糖的平均聚合度在11-19，任选地13-17范围内。在一些实施方案中，寡糖组合物包含45-55重量百分比范围内的水。在一些实施方案中，寡糖组合物包含MWw(重均分子量)(g/mol)在1900-2800、任选地2214-2715范围内的寡糖。在一些实施方案中，寡糖组合物包含MWw(重均分子量)(g/mol)在2070-3090范围内的寡糖。在一些实施方案中，寡糖组合物包含MWn(数均分子量)(g/mol)在1050-1250，任选地1095-1201范围内的寡糖。在一些实施方案中，寡糖组合物包含MWn(数均分子量)(g/mol)在1110-1350范围内的寡糖。在一些实施方案中，包含寡糖组合物的溶液具有在2.50-3.50范围内的pH。在一些实施方案中，包含寡糖组合物的溶液具有在2.00-5.00，任选地2.00-4.80范围内的pH。在一些实施方案中，寡糖组合物包含在89-94重量百分比范围内聚合度为至少二(DP2+)的低聚物。在一些实施方案中，寡糖组合物包含在85-95重量百分比、任选地88-90重量百分比范围内的聚合度至少为2(DP2+)的低聚物。在一些实施方案中，寡糖组合物包含在80-98重量百分比范围内的聚合度为至少二(DP2+)的低聚物。
此外，在一些实施方案中，寡糖组合物可以脱单体化。在一些实施方案中，脱单体化包括去除残留的糖单体。在一些实施方案中，使用色谱树脂进行脱单体化。因此，在一些实施方案中，可以根据存在的单体百分比制备不同的组合物。在一些实施方案中，寡糖组合物被脱单体化至单体含量为约1％、约3％、约5％、约10％或约15％。在一些实施方案中，寡糖组合物被脱单体化至单体含量为约1-3％、约3-6％、约5-8％、约7-10％或约10-15％。在一个实施方案中，将寡糖组合物脱单体化至单体含量小于1％。在一个实施方案中，寡糖组合物被脱单体化至单体含量在约7％和10％之间。在一个实施方案中，寡糖组合物被脱单体化至单体含量在约0.1％和低于2％之间。在一个实施方案中，将寡糖组合物脱单体化至单体含量为约1％至3％之间。在一个实施方案中，通过渗透分离实现脱单体化。在第二个实施方案中，通过切向流过滤(TFF)实现脱单体化。在第三个实施方案中，通过乙醇沉淀实现脱单体化。
在一些实施方案中，具有不同单体含量的寡糖组合物还可具有总膳食纤维、水分、总膳食纤维(以干基计)或右旋糖当量百分比(DE)的不同测量值。在一些实施方案中，根据AOAC 2011.25的方法测量总膳食纤维。在一些实施方案中，水分是通过使用真空烘箱在60℃测量的。在一些实施方案中，计算总膳食纤维(以干基计)。在一些实施方案中，DE百分比根据食品化学品典籍(FCC)测量。
在一些实施方案中，寡糖组合物的总膳食纤维含量为58-94％(以干基计)。在一些实施方案中，寡糖组合物的总膳食纤维含量为65-87％(以干基计)。在一些实施方案中，寡糖组合物的总膳食纤维含量为73-81％(以干基计)。在一些实施方案中，寡糖组合物的总膳食纤维含量为50-80、55-80、60-80、50-70、55-70、60-70、50-65、55-65或60-65％(以干基计)。在一些实施方案中，寡糖组合物的总膳食纤维含量为约50％、约55％、约58％、约60％、约62％或约65％(以干基计)。
在一些实施方案中，寡糖组合物的可溶性膳食纤维总含量为58-94％(以干基计)。在一些实施方案中，寡糖组合物的可溶性膳食纤维总含量为65-87％(以干基计)。在一些实施方案中，寡糖组合物的可溶性膳食纤维总含量为73-81％(以干基计)。在一些实施方案中，寡糖组合物的可溶性膳食纤维总含量为50-80、55-80、60-80、50-70、55-70、60-70、50-65、55-65或60-65％(以干基计)。在一些实施方案中，寡糖组合物的总可溶性膳食纤维含量为约50％、约55％、约58％、约60％、约62％或约65％(以干基计)。
在一些实施方案中，寡糖组合物具有5-50％的总还原糖含量(右旋糖当量(DE)(干固体))。
在一些实施方案中，根据本文提供的方法的寡糖组合物的生成可以分批过程或连续过程进行。例如，在一个实施方案中，以分批过程生成寡糖组合物，其中将反应器的内容物置于搅拌条件(例如，连续混合或共混)，并且移出(例如，分离和/或回收)全部或大量的反应产物。
在某些实施方案中，使用催化剂的方法在水性环境中进行。一种合适的水性溶剂是水，其可以从各种来源获得。通常，在一些实施方案中，可以使用离子物种(例如，钠、磷、铵或镁的盐)浓度较低的水源，因为这类离子物种可能会降低催化剂的效力。在所述水性溶剂是水的一些实施方案中，所述水具有小于10％的离子物种(例如，钠、磷、铵、镁的盐)。在所述水性溶剂是水的一些实施方案中，所述水的电阻率为至少0.1兆欧-厘米、至少1兆欧-厘米、至少2兆欧-厘米、至少5兆欧-厘米或至少10兆欧-厘米。
在一些实施方案中，随着本文提供的方法的反应的进行，一个或更多个糖单体的各自糖苷偶联产生水(例如，释放的水)。在某些实施方案中，本文所述的方法可还包括在一段时间内监测所述反应混合物中存在的水的量和/或水与单体或催化剂的比率。因此，在一些实施方案中，所述反应混合物中的水含量可以在反应过程中改变，例如除去产生的释放的水。可以使用适当的方法去除反应混合物中的水(例如，释放的水)，包括例如通过蒸发，例如通过蒸馏。在一些实施方案中，所述方法包括在反应混合物中包括水。在某些实施方案中，所述方法包括通过蒸发从反应混合物中除去水。
在某些实施方案中，制剂负载有包含带正电荷的氢离子的酸催化剂。在一些实施方案中，酸催化剂是固体催化剂(例如，Dowex Marathon C)。在一些实施方案中，酸催化剂是可溶性催化剂(例如，柠檬酸)。
在一些实施方案中，带正电荷氢离子与总半乳糖单体含量的摩尔比在合适的范围内。在一些实施方案中，带正电荷的氢离子与总半乳糖单体含量的摩尔比在0.01至0.1、0.02至0.08、0.03至0.06或0.05至0.06的范围内。在一些实施方案中，带正电荷的氢离子与半乳糖单体含量的摩尔比在0.003至0.01、0.005至0.02、0.01至0.02、0.01至0.03、0.03至0.02、0.02至0.04、0.03至0.05、0.03至0.08、0.04至0.07、0.05至0.1、0.05至0.2、0.1至0.2、0.1至0.3或0.2至0.3的范围内。
在一些实施方案中，可溶性酸催化剂(例如，柠檬酸催化剂)与总半乳糖单体含量的摩尔比在合适的范围内。在一些实施方案中，可溶性酸催化剂(例如，柠檬酸催化剂)与总半乳糖单体含量的摩尔比在0.01至0.1、0.02至0.08、0.03至0.06或0.05至0.06的范围内。在一些实施方案中，可溶性酸催化剂(例如，柠檬酸催化剂)与总半乳糖单体含量的摩尔比在0.003至0.01、0.005至0.02、0.01至0.02、0.01至0.03、0.02至0.03、0.02至0.04、0.03至0.05、0.03至0.08、0.04至0.07、0.05至0.1、0.05至0.2、0.1至0.2、0.1至0.3或0.2至0.3的范围内。
在一些实施方案中，将水加入反应混合物以通过使反应混合物的温度达到100℃或更低来淬灭反应。在一些实施方案中，用于淬火的水是去离子水。在一些实施方案中，用于淬火的水是USP水。在一些实施方案中，所述水具有约60℃至约100℃的温度。在某些实施方案中，用于淬火的水为约95℃。在一些实施方案中，在足以避免使混合物固化的条件下将水加入反应混合物中。
可以在反应过程中测量和/或改变反应混合物的粘度。通常，粘度是指流体的内部流动阻力(例如“稠度”)的度量，以厘泊(cP)或帕斯卡-秒表示。在一些实施方案中，所述反应混合物的粘度为约100cP至约95,000cP、约5,000cP至约75,000cP、约5,000至约50,000cP或约10,000至约50,000cP之间。在某些实施方案中，所述反应混合物的粘度在约50cP至约200cP之间。
在一些实施方案中，本文提供的寡糖组合物可以进行一个或多个另外的处理步骤。另外的处理步骤可包括例如纯化步骤。纯化步骤可包括例如分离、脱单体、稀释、浓缩、过滤、脱盐或离子交换、色谱分离或脱色或其任何组合。
在某些实施方案中，本文所述的方法还包括稀释步骤。在一些实施方案中，去离子水用于稀释。在某些实施方案中，USP水用于稀释。在某些实施方案中，稀释后，寡糖组合物包含约5-75、25-65、35-65、45-55或47-53重量百分比范围内的水。在某些实施方案中，稀释后，寡糖组合物包含约35-65重量百分比范围的水。在某些实施方案中，稀释后，寡糖组合物包含约40-50重量百分比范围的水。
在一些实施方案中，本文所述的方法还包括脱色步骤。所产生的一种或多种寡糖组合物可使用适当的方法进行脱色步骤，所述方法包括例如用吸附剂、活性炭、色谱法(例如，使用离子交换树脂)和/或过滤(例如，微滤)处理
在一些实施方案中，使产生的一种或多种寡糖组合物与材料接触以除去盐、矿物质和/或其他离子物质。例如，在某些实施方案中，使产生的一种或多种寡糖组合物流过阴离子交换柱。在其他实施方案中，使产生的寡糖组合物流过阴离子/阳离子交换柱对。
在一些实施方案中，本文所述的方法可还包括浓缩步骤。例如，在一些实施方案中，可将寡糖组合物进行蒸发(例如，真空蒸发)以产生浓缩的寡糖组合物。在其他实施方案中，可将寡糖组合物进行喷雾干燥步骤以产生寡糖粉末。在某些实施方案中，所述寡糖组合物可同时进行蒸发步骤和喷雾干燥步骤。在一些实施方案中，将所述寡糖组合物进行冻干(例如，冷冻干燥)步骤以除去水并产生粉状产物。
在一些实施方案中，本文所述的方法还包括分级步骤。制备和纯化的寡糖组合物可以随后使用本领域已知的任何方法通过分子量分离，所述方法包括例如高效液相色谱法、吸附/解吸(例如低压活性炭色谱法)或过滤(例如，超滤或渗滤)。在某些实施方案中，寡糖组合物被分成代表60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或大于98％的短(约DP1-2)、中(约DP3-10)、长(约DP11-18)或非常长(约DP>18)的物种的集合。
在某些实施方案中，制备的寡糖组合物通过吸附在碳质材料上进行分级，随后通过用在水中的浓度为1％、5％、10％、20％、50％或100％的有机溶剂的混合物洗涤所述材料，将级分解吸。在一个实施方案中，所述吸附材料是活性炭。在另一个实施方案中，所述吸附材料是活性炭和如硅藻土或Celite545的填充剂(按体积或重量计5％、10％、20％、30％、40％或50％的比率)的混合物。
在进一步的实施方案中，制备的寡糖组合物通过高效液相色谱系统分离。在某些变体中，通过离子亲和色谱、亲水相互作用色谱或包括凝胶渗透和凝胶过滤的尺寸排阻色谱分离所制备的寡糖组合物。
在一些实施方案中，过滤除去催化剂。在某些实施方案中，0.45μm过滤器用于在过滤过程中去除催化剂。在其他实施方案中，通过过滤方法除去低分子量材料。在某些变体中，可以通过透析、超滤、渗滤或切向流过滤除去低分子量材料。在某些实施方案中，所述过滤是在静态透析管装置中进行的。在其他实施方案中，所述过滤在动态流过滤系统中进行的。在其他实施方案中，所述过滤是在离心力驱动的滤筒中进行的。在某些实施方案中，将所述反应混合物冷却至低于约85℃，然后过滤。
在某些实施方案中，所有寡糖的平均聚合度在11-19的范围内。在某些实施方案中，所有寡糖的平均聚合度在10-16的范围内。在某些实施方案中，所有寡糖的平均聚合度在13-17的范围内。在某些实施方案中，所有寡糖的平均聚合度为约15。在一些实施方案中，所有寡糖的平均聚合度在5-20、6-19、11-16、12-18、10-17、7-15、7-12、7-10、7-8、9-10、10-11、11-11、11-15、12-13、12-14、13-14、14-15、15-16、17-18、15-20、3-8、4-7，或5-6的范围内。在一些实施方案中，所有寡糖的平均聚合度(DP)为约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20，或约21。
在某些实施方案中，寡糖组合物中半乳糖单体的重量百分比在6-12的范围内。在某些实施方案中，寡糖组合物中半乳糖单体的重量百分比在8-10的范围内。在某些实施方案中，寡糖组合物中半乳糖单体的重量百分比在5-13的范围内。在某些实施方案中，寡糖组合物中半乳糖单体的重量百分比在6-7的范围内。
在一些实施方案中，寡糖组合物是包含分子式为H-[C6H9-11O5]n-OH的聚合物的混合物，其中混合物的单个聚合物中的单体单元总数范围为2到约60(n＝2-60)，混合物的平均值约为15.1个单体单元。每个单体单元可以为未被取代、被另一半乳糖单元以任何糖苷异构体单、双或三取代。
在一些实施方案中，寡糖组合物包含5-75重量百分比范围的水。在一些实施方案中，寡糖组合物包含25-65重量百分比范围的水。在一些实施方案中，寡糖组合物包含35-65重量百分比范围的水。在一些实施方案中，寡糖组合物包含45-55重量百分比范围的水。
在一些实施方案中，寡糖组合物包含MWw(g/mol)在2214-2715范围内的寡糖。在一些实施方案中，寡糖组合物包含MWw(g/mol)在1816-3070范围内的寡糖。在一些实施方案中，寡糖组合物包含MWw(g/mol)在1400-3500、1800-3100、1500-2000、1700-2200、1900-2400、2100-2600、2300-2800、2500-3000或2700-3200范围内的寡糖。
在一些实施方案中，寡糖组合物包含MWn(g/mol)在1095-1201范围内的寡糖。在一些实施方案中，寡糖组合物包含MWn(g/mol)在1011-1299范围内的寡糖。在一些实施方案中，寡糖组合物包含MWn(g/mol)在900-1100、1000-1200、1100-1400、1200-1500、1300-1600或1400-1700范围内的寡糖。
在一些实施方案中，包含寡糖组合物的溶液的pH在1.50-6.00的范围内。在一些实施方案中，包含寡糖组合物的溶液的pH在1.50-5.00的范围内。在一些实施方案中，包含寡糖组合物的溶液的pH在2.00-4.00的范围内。在一些实施方案中，包含寡糖组合物的溶液的pH在2.50-3.50的范围内。
在一些实施方案中，寡糖组合物包含支化度在约13％至约30％范围内的寡糖。在一些实施方案中，寡糖组合物包含支化度在约15％至约26％范围内的寡糖。在一些实施方案中，寡糖组合物包含支化度在约20％至约21％范围内的寡糖。在一些实施方案中，寡糖组合物包含支化度在5-50％、5-40％、5-30％、5-20％、5-15％、10-50％、10-40％、10-30％、10-25％、15-30％或15-20％范围内的寡糖。
在一些实施方案中，寡糖组合物包含80-100重量百分比范围内的具有两个或更多个重复单元(DP2+)的低聚物。在一些实施方案中，寡糖组合物包含87-96重量百分比范围内的具有两个或更多个重复单元(DP2+)的低聚物。在一些实施方案中，寡糖组合物包含88-94重量百分比范围内的具有两个或更多个重复单元(DP2+)的低聚物。在一些实施方案中，寡糖组合物包含90-92重量百分比范围内的具有两个或更多个重复单元(DP2+)的低聚物。在一些实施方案中，寡糖组合物包含80-85、85-87、86-88、87-90、88-91、89-92、90-93、91-94、92-95、93-96或95-98重量百分比范围内的具有两个或更多个重复单元(DP2+)的低聚物。
在一些实施方案中，寡糖组合物具有1.8-2.4的多分散指数(PDI)。在一些实施方案中，寡糖组合物具有2.0-2.3的多分散指数(PDI)。在一些实施方案中，寡糖组合物具有1.0-1.2、1.2-1.3、1.3-1.4、1.4-1.5、1.5-1.6、1.7-1.8、1.8-2.0、2.0-2.2、2.2-2.4-或2.4-2.6的PDI。在一些实施方案中，寡糖组合物具有约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.1、约2.2、约2.3或约2.4的PDI。
在一些实施方案中，寡糖组合物中寡糖的MWw、MWn、PDI、单体含量(DP1)和/或DP2+值使用实施例6中描述的尺寸排阻色谱法确定。
在一些实施方案中，寡糖组合物包含具有至少三个连接的单体单元(DP3+)的低聚物，其在80-85、85-87、86-88、87-90、88-91、89-92、90-93、91-94或92-95重量百分比的范围内。
在一些实施方案中，寡糖组合物包含6.4％至11.4％的单体(DP1)。在一些实施方案中，寡糖组合物包含5％至10％、7％至12％、11％至18％、10％至15％或12％至17％的单体(DP1)。在一些实施方案中，寡糖组合物包含88.6％至94.6％的具有至少两个连接的单体单元(DP2+)的低聚物。在一些实施方案中，寡糖组合物包含80％至81％、81％至82％、82％至83％、84％至85％、85％至86％、86％至87％、87％至88％、88％至90％，或89％至95％的具有至少两个连接的单体单元(DP2+)的低聚物。在一些实施方案中，寡糖组合物包含84％至85％、85％至86％、86％至87％、87％至88％或88％至90％的具有至少三个连接的单体单元(DP3+)的寡聚物。
在一些实施方案中，寡糖组合物包含小于0.10％的总杂质(不包括单体)。在一些实施方案中，寡糖组合物包含小于0.05％的总杂质(不包括单体)。在一些实施方案中，寡糖组合物包含小于0.20％、0.15％、0.10％或0.05％的总杂质(不包括单体)。在一些实施方案中，寡糖组合物包含小于0.10％w/w的葡糖醛酸、小于0.10％w/w的乳酸、小于0.10％w/w的甲酸、小于0.10％w/w乙酸，以及少于0.10％w/w的羟甲基糠醛(HMF)。在一些实施方案中，寡糖组合物包含不可检测水平的乳酸、甲酸、乙酰丙酸和HMF。在一些实施方案中，寡糖组合物包含0.19％w/w柠檬酸。在一些实施方案中，寡糖组合物包含0.15-0.22％w/w、0.10-1.00％w/w、0.50-1.50％w/w、1.00-2.00％w/w、2.00-3.00％w/w、2.00-2.50％w/w或2.50-3.00％w/w的柠檬酸。
在一些实施方案中，寡糖组合物包含2214-2715的MWw、1095-1201的MWn和/或2.0-2.3的PDI。
在某些实施方案中，通过NMR分析的寡糖组合物含有单糖单体(DP1)，即，在NMR分析之前不从组合物中除去DP1组分。例如，在一些实施方案中，通过NMR分析的寡糖组合物含有10％-25％的DP1单体。在某些实施方案中，通过NMR分析的组合物是脱单体化的，即，在NMR分析之前去除组合物的一些或所有DP1组分，例如，通过实施例8中描述的方法。例如，在一些实施方案中，通过NMR分析的寡糖组合物包含0.05％至10％之间的DP1单体。
本文所述的寡糖组合物，以及根据本文所述的方法制备的寡糖组合物，可以使用全甲基化分析来表征和区别于现有技术的组合物。参见，例如，Zhao,Y.,等人‘Rapid,sensitive structure analysis of oligosaccharides,’PNAS March 4,1997 94(5)1629-1633；Kailemia,M.J.,等人‘Oligosaccharide analysis by mass spectrometry:Areview of recent developments,’Anal Chem.2014Jan 7；86(1):196–212。因此，在另一方面，本文提供了寡糖组合物，其包含(例如，人类最低限度可消化的)多种寡糖，所述多种寡糖包含单体基团。所述多种寡糖中不同类型单体基团的摩尔百分比可以使用如实施例9所述的全甲基化测定法定量。对所述组合物的脱单体化样品进行了全甲基化测定。
在一些实施方案中，所述多种寡糖包含选自基团(1)-(20)的两种或更多种单体基团：
(1)t-呋喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中4.11-15.02mol％(任选地6.29-12.84mol％)的单体基团；
(2)t-吡喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中17.74-31.28mol％(任选地20.45-28.28mol％)的单体基团；
(3)2-呋喃半乳糖和/或2-呋喃葡萄糖单基，其代表所述多种寡糖中2.48-3.70mol％(任选地2.73-3.46％mol％)的单体基团；
(4)3-吡喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中4.70-7.76mol％(任选地5.31-7.15mol％)的单体基团；
(5)3-呋喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中3.05-4.58mol％(任选地3.36-4.28mol％)的单体基团；
(6)2-吡喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中4.01-4.56mol％(任选地4.12-4.45mol％)的单体基团；
(7)4-吡喃半乳糖和/或5-呋喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中4.24-6.28mol％(任选地4.65-5.87mol％)的单体基团；
(8)2,3-呋喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中0.30-0.95mol％(任选地0.43-0.82mol％)的单体基团；
(9)6-呋喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中0.70-11.80mol％(任选地2.92-9.58mol％)的单体基团；
(10)6-吡喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中12.07-20.76mol％(任选地13.81-19.02mol％)的单体基团；
(11)3,4-吡喃半乳糖和/或3,5-呋喃半乳糖和/或2,3-吡喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中1.22-2.19mol％(任选地1.41-1.99mol％)的单体基团；
(12)2,4-吡喃葡萄糖和/或2,5-呋喃葡萄糖和/或2,4-吡喃半乳糖和/或2,5-呋喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中0.77-1.32mol％(任选地0.88-1.21mol％)的单体基团；
(13)2,3,4-吡喃半乳糖和/或2,3,5-呋喃半乳糖三基，其代表所述多种寡糖中0.09-0.32mol％(任选地0.14-0.28mol％)的单体基团；
(14)3,6-呋喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中1.49-2.46mol％(任选地1.69-2.27mol％)的单体基团；
(15)4,6-吡喃半乳糖和/或5,6-呋喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中3.49-5.70mol％(任选地3.93-5.26mol％)的单体基团；
(16)3,6-吡喃半乳糖和/或2,6-呋喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中3.54-6.52mol％(任选地4.14-5.93mol％)的单体基团；
(17)2,6-吡喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中1.65-3.32mol％(任选地1.98-2.99mol％)的单体基团。
(18)3,4,6-吡喃半乳糖和/或3,5,6-呋喃半乳糖和/或2,3,6-呋喃半乳糖三基，其代表所述多种寡糖中0.65-1.94mol％(任选地0.91-1.68mol％)的单体基团；
(19)2,3,6-吡喃半乳糖和/或2,4,6-吡喃半乳糖和/或2,5,6-呋喃半乳糖三基，其代表所述多种寡糖中0.01-4.14mol％(任选地0.01-3.10mol％)的单体基团；和/或
(20)2,3,4,6-吡喃半乳糖和/或2,3,5,6-呋喃半乳糖四基，其代表所述多种寡糖中0.01-0.44mol％(任选地0.01-0.28mol％)的单体基团。
在一些实施方案中，寡糖组合物中总糖苷键的14-30％是1,2糖苷键。在一些实施方案中，寡糖组合物中总糖苷键的16.7-26.2％是1,2糖苷键。在一些实施方案中，寡糖组合物中总糖苷键的约20％或约21％是1,2糖苷键。在一些实施方案中，寡糖组合物中总糖苷键的约8.7-33.6％(任选地约12.4-28.0％)是1,2糖苷键。在一些实施方案中，寡糖组合物中总糖苷键的15-50％、15-40％、15-30％、15-20％、20-40％、20-30％、25-50％、25-30％或30-45％是1,2糖苷键。
在一些实施方案中，寡糖组合物中总糖苷键的约15-32％是1,3糖苷键。在一些实施方案中，寡糖组合物中总糖苷键的约21％或约22％是1,3糖苷键。在一些实施方案中，寡糖组合物中总糖苷键的17.4-27.8％是1,3糖苷键。在一些实施方案中，寡糖组合物中总糖苷键的约11.0-34.4％(任选地14.4-29.2％)是1,3糖苷键。在一些实施方案中，寡糖组合物中总糖苷键的10-50％、15-40％、15-30％、15-25％、10-40％、10-30％、10-25％、15-30％或15-20％是1,3糖苷键。
在一些实施方案中，寡糖组合物中总糖苷键的约10-22％是1,4糖苷键。在一些实施方案中，寡糖组合物中总糖苷键的约16％是1,4糖苷键。在一些实施方案中，寡糖组合物中总糖苷键的11.9-19.7％是1,4糖苷键。在一些实施方案中，寡糖组合物中总糖苷键的9.5-23.5％(任选地11.4-20.4％)是1,4糖苷键。在一些实施方案中，寡糖组合物中总糖苷键的5-35％、10-30％、10-25％、10-20％、5-20％、5-15％或20-30％是1,4糖苷键。
在一些实施方案中，寡糖组合物中总糖苷键的约24-57％是1,6糖苷键。在一些实施方案中，寡糖组合物中总糖苷键的约39％或约40％是1,6糖苷键。在一些实施方案中，寡糖组合物中总糖苷键的29.4-50.1％是1,6糖苷键。在一些实施方案中，寡糖组合物中总糖苷键的20.9-57.8％(任选地27.6-50.2％)是1,6糖苷键。在一些实施方案中，寡糖组合物中总糖苷键的25-60％、25-50％、25-40％、30-60％、30-50％、30-40％或35-45％是1,6糖苷键。
在一些实施方案中，寡糖组合物包含26-49％的总呋喃糖。在一些实施方案中，寡糖组合物包含约38％或约44％的总呋喃糖。在一些实施方案中，寡糖组合物包含19-71(任选地28-61％)的总呋喃糖。在一些实施方案中，寡糖组合物包含15-75％、15-65％、15-50％、15-40％、20-40％、25-35％或25-40％的总呋喃糖。
在一些实施方案中，寡糖组合物包含至少一种呋喃半乳糖或吡喃半乳糖基团。
在一些实施方案中，提供了寡糖组合物，其包含多种寡糖，所述寡糖包含表2中所示的摩尔百分比的单体基团(1)-(20)。
表2.全甲基化数据
实施例9和16中描述了表征所选的寡糖组合物的各个批次的全甲基化数据。下面提供了实施例9和16中描述的这些数据的复合，以显示所有测试批次和重复的平均数据和标准偏差(std.dev.)，其描述了所选的寡糖组合物中存在的单体基团，如表3所示。
表3.全甲基化数据(复合数据)
/>
在某些实施方案中，寡糖组合物不含单体(例如，脱单体化)。在其他实施方案中，寡糖组合物包含单体。
在一些实施方案中，提供了寡糖组合物，其包含多种寡糖，所述寡糖包含单体基团(1)-(20)或基本上由单体基团(1)-(20)组成，如本文所述。在一些实施方案中，提供了寡糖组合物，其包含多种寡糖，所述寡糖包含至少一种(例如，至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种，或至少十种)选自基团(l)-(20)的单体基团与至少一个(例如，至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个，在至少七个、至少八个、至少九个或至少十个)如表2所示对应的摩尔百分比。在一些实施方案中，提供了寡糖组合物，其包含多种寡糖，所述寡糖包含单体基团(1)-(20)或由单体基团(1)-(20)组成，其摩尔百分比如表2所示。
本文所述的和根据本文所述的方法制备的寡糖组合物可以使用二维异核NMR表征并区别于现有技术的组合物。因此，另一方面，提供了包含多种(例如，在人体中最低限度可消化的)寡糖的寡糖组合物，多种寡糖的特征在于多重编辑梯度增强的1H-13C异核单量子相干(HSQC)NMR谱包含表4的信号1-11中的一个或多个，其中使用具有少于2％单体的寡糖组合物样品生成谱图。
表4.HSQC NMR数据
因此，在另一个方面，提供了包含多种寡糖(例如，其在人类中最低限度地可消化)的寡糖组合物，所述多种寡糖的特征在于多重编辑梯度增强的1H-13C异核单量子相干(HSQC)NMR谱图包含表5的信号1-11中的一个或多个，其中该谱图是使用具有小于2％单体的寡糖组合物的样品产生的。
表5.HSQC NMR数据
在一些实施方案中，寡糖组合物包含寡糖组合物的信号1-11中的至少一者，如下表6中所限定：
表6.HSQC NMR数据
/>
表征所选的寡糖组合物的各个批次的HSQC NMR谱图描述于实施例8和15中。实施例8和15中描述的数据的复合提供了如下表7中限定的平均HSQC NMR谱图：
表7.HSQC NMR数据(复合数据)
如本文所用，术语“异核单量子相关(HSQC)NMR”可与术语“异核单量子相干(HSQC)NMR”互换使用。
如本文所用，术语“曲线下面积”或“AUC”是指NMR谱中峰/信号的相对大小(即，相对强度、相对体积)(例如，所选的寡糖组合物的HSQC NMR谱图的信号1-11的相对大小)。本文定义的AUC或峰/信号的相对大小表示使用椭圆形的积分区域。椭圆形状可以由长轴坐标和短轴坐标限定。由长轴坐标(F2维度；1H)和短轴坐标(F1维度；13C)限定的椭圆形状的示例在图6C中示出。因此，然后可以通过在该椭圆形的范围内积分以获得椭圆上方或下方的体积来确定AUC。
在一些实施方案中，具有多种寡糖的寡糖组合物的特征在于多重编辑梯度增强的1H-13C异核单量子相关(HSQC)NMR谱包含如下表8定义的具有1H积分区和13C积分区的信号1-11中的一个或多个：
表8.HSQC NMR积分区域的坐标
在一些实施方案中，NMR谱图是通过对寡糖组合物样品进行多重编辑梯度增强的1H-13C异核单量子相干(HSQC)实验而得到的，所述实验使用回波-反回波方案使用以下脉冲序列图、采集参数和处理参数进行相干选择：
脉冲序列图(图5)
采集参数
1H载波频率＝4ppm
13C载波频率＝65ppm
采集维度中的点数＝596
采集维度中的频谱范围＝6.23ppm至1.83ppm
间接维度中的点数＝300个复杂点
间接维度中的频谱范围＝120ppm至10ppm
循环延迟＝1秒
单键1H-13C耦合常数＝JCH＝146Hz
扫描次数＝8
温度＝298-299K
溶剂＝D2O
处理参数
直接维度的窗函数＝高斯展宽，7.66Hz
间接维度的窗函数＝高斯展宽26.48Hz
处理＝直接维度中的512个复杂点，间接维度中的1024个复杂点
在某些实施方案中，NMR谱图是通过对组合物的样品进行HSQC NMR获得的，其中样品是在氘代溶剂中的溶液。合适的氘代溶剂包括氘代乙腈、氘代丙酮、氘代甲醇、D2O及其混合物。在特定实施方案中，氘代溶剂是D2O。此外，在一些实施方案中，已对通过HSQC NMR表征的寡糖组合物进行脱单体化程序，使得寡糖组合物包含少于10％的单体(例如，少于8％、6％、5％、4％、2％或1％单体)。
在某些实施方案中，使用实施例8中描述的条件获得NMR谱图。
示例性寡糖组合物可根据本文所述的程序制备。
III.使用方法
本文提供减少有此需要的受试者的炎症的方法。在一些实施方案中，方法包括将本文所述的选定寡糖组合物施用于受试者(例如施用于受试者的胃肠道)以减少受试者的炎症。在一些实施方案中，本文所述的寡糖组合物可用于减轻患有或疑似患有炎症性和免疫障碍(例如，自身免疫性和过敏性障碍)的受试者的炎症。在一些实施方案中，本文所述的寡糖组合物可用于减轻患有或疑似患有慢性炎症障碍(例如，炎症性肠病，例如UC或CD)的受试者的炎症。在一些实施方案中，本文所述的寡糖组合物可用于减少受试者(例如患有或怀疑患有慢性炎症障碍例如溃疡性结肠炎(UC)的受试者)的局部炎症(例如肠道炎症)。在一些实施方案中，本文所述的寡糖组合物可用于减轻受试者的局部炎症(例如肠道炎症)，例如局部炎症的严重程度和/或发炎局部区域(例如肠道炎症区域)的大小。在一些实施方案中，本文所述的寡糖组合物可用于减少患有或疑似患有溃疡性结肠炎(UC)、克罗恩氏病(CD)、肉芽肿性结肠炎、未定型结肠炎、转向性结肠炎、结肠袋炎、白塞氏病、显微镜下结肠炎、憩室病相关结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎和小儿发病的炎症性肠病的受试者的炎症。
可以通过确定粪便和/或血液中炎症生物标志物的水平来评估炎症性障碍如溃疡性结肠炎(UC)的治疗。在一些实施方案中，炎症是局部评估的(例如，局部肠道炎症)。在一些实施方案中，炎症是全身地评估的(例如，全身炎症)。在一些实施方案中，将本文所述的所选的寡糖组合物施用于人类受试者导致调节一种或多种炎症生物标志物(例如，在大便/粪便样品)。由所选的寡糖组合物调节的炎症生物标志物的实例包括钙卫蛋白(例如，粪便钙卫蛋白)、乳铁蛋白(例如，粪便乳铁蛋白)和脂质运载蛋白(例如，粪便脂质运载蛋白)。可由所选的寡糖组合物调节的炎症生物标志物的其他实例包括高灵敏度C反应蛋白(hsCRP)、LPS结合蛋白(LBP)、肠脂肪酸结合蛋白(I-FABP)、TNFα、IL-lβ、IL-6、IL-12、IFNγ、IL-2、IL-4、IL-13、IL-8和IL-10。
钙卫蛋白是一种蛋白质生物标志物，存在于参与对病原体的免疫反应的细胞中，例如嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞(Gaya等人，2002，QJM：An InternationalJournal of Medicine，第95卷，第9期，2002年9月，第557-558页；Roseth等人，2004年，Scandinavian Journal of Gastroenterology，39:10，1017-1020)。它可占嗜中性粒细胞胞质蛋白的60％之多。在肠道炎症期间，嗜中性粒细胞通过肠上皮迁移到肠腔，导致粪便中钙卫蛋白的数量增加(Masoodi等人，2011年，Ger Med Sci)。粪便钙卫蛋白的水平与肠腔中嗜中性粒细胞的数量相关，并且在炎症性肠病(IBD)，例如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎(Konikoff M.R.，Inflamm Bowel Dis.2006六月；12(6):524-34.)中升高。
在一些实施方案中，相对于参考测量值(例如，在施用组合物之前获得的测量值)，向受试者施用寡糖组合物，例如有效剂量的寡糖组合物导致属于受试者的大便/粪便样品中的粪便钙卫蛋白水平降低至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％,或100％。在一些实施方案中,相对于参考测量值(例如，在施用组合物之前获得的测量值)，向受试者施用寡糖组合物导致属于受试者的大便/粪便样品中的粪便钙卫蛋白水平降低1-10％、5-20％、10-25％、20-40％、30-50％、40-60％、50-70％、60-80％、70-90％、80-100％或90-100％。在一些实施方案中，在约1周、2周、4周、6周、8周、10周、12周、26周、52周的治疗(例如，在第一次向受试者施用例如有效剂量的所选的寡糖之后)，向受试者施用寡糖组合物导致属于受试者的大便/粪便样品中粪便钙卫蛋白水平的降低。
在一些实施方案中，在向受试者施用寡糖组合物后，属于受试者的大便/粪便样品中的粪便钙卫蛋白水平低于200μg/g、150μg/g、100μg/g、75μg/g或50μg/g。
在一些实施方案中，相对于参考测量值(例如，在施用组合物之前获得的测量值)，向受试者施用寡糖组合物，例如有效剂量的寡糖组合物，导致属于受试者的大便/粪便样品中的粪便乳铁蛋白水平降低至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％,或100％。在一些实施方案中，相对于参考测量值(例如，在施用组合物之前获得的测量值)，向受试者施用寡糖组合物导致属于受试者的大便/粪便样品中的粪便乳铁蛋白水平降低1-10％、5-20％、10-25％、20-40％、30-50％、40-60％、50-70％、60-80％、70-90％、80-100％或90-100％。在一些实施方案中，在约1周、2周、4周、6周、8周、10周、12周、26周、52周的治疗(例如，在第一次向受试者施用例如有效剂量的所选的寡糖之后)，向受试者施用寡糖组合物导致属于受试者的大便/粪便样品中粪便乳铁蛋白水平降低。
在一些实施方案中，在向受试者施用寡糖组合物后，属于受试者的大便/粪便样品中的粪便乳铁蛋白水平低于20μg/g、15μg/g、10μg/g、5μg/g或3μg/g。
在一些实施方案中，相对于参考测量值(例如，在施用组合物之前获得的测量值)，向受试者施用寡糖组合物，例如有效剂量的寡糖组合物，导致属于受试者的大便/粪便样品中的粪便脂质运载蛋白水平降低至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施方案中，相对于参考测量值(例如，在施用组合物之前获得的测量值)，向受试者施用寡糖组合物导致属于受试者的大便/粪便样品中的粪便脂质运载蛋白水平降低1-10％、5-20％、10-25％、20-40％、30-50％、40-60％、50-70％、60-80％、70-90％、80-100％或90-100％。在一些实施方案中，在约1周、2周、4周、6周、8周、10周、12周、26周、52周的治疗(例如，在第一次向受试者施用例如有效剂量的所选的寡糖之后)，向受试者施用寡糖组合物导致属于受试者的大便/粪便样品中粪便脂质运载蛋白水平的降低。
在一些实施方案中，在向受试者施用寡糖组合物后，属于受试者的大便/粪便样品中的粪便脂质运载蛋白水平低于2000μg/g、1500μg/g、1000μg/g、500μg/g或250μg/g。
在一些实施方案中，向受试者施用寡糖组合物导致属于受试者的大便/粪便样品中的粪便钙卫蛋白、粪便乳铁蛋白和/或粪便脂质运载蛋白水平的降低，同时不引起钙卫蛋白、乳铁蛋白和/或脂质运载蛋白的血浆水平的类似降低。这表明，在一些实施方案中，所选的寡糖组合物可以局部作用，例如对局部肠道炎症。
本文所述的寡糖组合物可用于调节(例如，增加)短链脂肪酸(SCFA)例如丁酸、乙酸和丙酸的水平。在实施方案中，本文所述的寡糖组合物可用于调节(例如，增加)短链脂肪酸(SCFA)，例如丁酸、乙酸和丙酸的水平，例如在表现出炎症性病症或疾病，例如，慢性炎症性病症，例如炎症性肠病，例如UC和CD的受试者中。在一些实施方案中，本文所述的寡糖组合物可用于增加受试者中短链脂肪酸(SCFA)例如丁酸、乙酸和丙酸的水平。在一些实施方案中，本文所述的寡糖组合物可用于增加受试者胃肠道中的短链脂肪酸(SCFA)例如丁酸、乙酸和丙酸的水平。在一些实施方案中，本文提供通过向受试者施用本文所述的寡糖组合物来增加受试者的丁酸浓度的方法。在一些实施方案中，本文提供通过向受试者施用本文所述的寡糖组合物来增加受试者体内受试者的丙酸浓度的方法。在一些实施方案中，本文提供通过向受试者施用本文所述的寡糖组合物来增加受试者的乙酸浓度的方法。
本文所述的寡糖组合物可用于调节(例如，减少)致病微生物和/或促炎微生物相对于共生微生物的丰度。在实施方案中，本文所述的寡糖组合物可用于调节(例如，减少)致病微生物和/或促炎微生物相对于共生微生物的丰度，例如，在表现出炎症性病症或疾病，例如慢性炎症性病症，例如炎症性肠病，例如UC和CD的受试者中。在一些实施方案中，本文所述的寡糖组合物可用于促进共生微生物(例如，副拟杆菌属和拟杆菌属)的生长和/或丰度(例如，相对丰度)。在一些实施方案中，本文所述的寡糖组合物可用于减少致病有机体和/或促炎微生物分类群(例如，来自肠杆菌科的分类群)的生长和/或丰度(例如，相对丰度)。在一些实施方案中，本文所述的寡糖组合物可用于增加共生菌相对于致病菌和/或促炎菌的比率。在一些实施方案中，本文提供通过向受试者施用本文所述的寡糖组合物来降低受试者(例如，受试者的胃肠道)中致病微生物和/或促炎微生物相对于共生微生物的丰度的方法。在一些实施方案中，本文提供通过向受试者施用本文所述的寡糖组合物来增加受试者(例如，受试者的胃肠道)中共生微生物相对于致病和/或促炎微生物的丰度的方法。
在一些实施方案中，本文提供通过增加受试者中SCFA(例如，丁酸、丙酸和/或乙酸)的总浓度或量(例如，通过施用本文所述的寡糖组合物)来减少有此需要的受试者的炎症的方法。在一些实施方案中，本文提供通过减少受试者(例如受试者的胃肠道)中致病微生物和/或促炎微生物相对于共生微生物的丰度，通过向受试者，例如表现出炎症性病症或疾病，例如慢性炎症性病症，例如炎症性肠病，例如UC和CD的受试者施用本文所述的寡糖组合物，来减少有此需要的受试者的炎症的方法。
在一些实施方案中，本文所述的寡糖组合物可用于增加患有或疑似患有自身免疫性和/或过敏性障碍(例如，慢性炎症性障碍，例如炎症性肠病，例如溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、肉芽肿性结肠炎、未定型结肠炎、转向性结肠炎、结肠袋炎、白塞氏病、显微镜下结肠炎、憩室病相关结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎和/或小儿发病的炎症性肠病)的受试者的短链脂肪酸(SCFA)例如丁酸、乙酸和丙酸的水平。在一些实施方案中，将所选的寡糖组合物以有效增加有需要的受试者中的短链脂肪酸(SCFA)例如丁酸、乙酸和丙酸(例如，在胃肠道中)的水平的量施用于受试者。
在一些实施方案中，本文所述的寡糖组合物可用于降低患有或疑似患有自身免疫性和/或过敏性障碍(例如慢性炎症性障碍，例如炎症性肠病，例如溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、肉芽肿性结肠炎、未定型结肠炎、转向性结肠炎、结肠袋炎、白塞氏病、显微镜下结肠炎、憩室病相关结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎和/或小儿发病的炎症性肠病)受试者中(例如，受试者的胃肠道中)致病和/或促炎微生物相对于共生微生物的丰度。在一些实施方案中，将所选的寡糖组合物以有效降低有需要的受试者(例如，在受试者的胃肠道中)中的致病和/或促炎微生物相对于共生微生物的丰度的量施用于受试者。
在一些实施方案中，向受试者施用寡糖组合物可有效治疗与致病菌相对于共生菌的高相对丰度和/或低水平的SCFA相关的生态失调和疾病或障碍。在一些实施方案中，向受试者施用寡糖组合物可有效治疗自身免疫性和/或过敏性障碍(例如慢性炎症性障碍，例如炎症性肠病，例如溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、肉芽肿性结肠炎、未定型结肠炎、转向性结肠炎、结肠袋炎、白塞氏病、显微镜下结肠炎、憩室病相关结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎和/或小儿发病的炎症性肠病)。在一些实施方案中，向受试者施用寡糖组合物可有效治疗溃疡性结肠炎。在一些实施方案中，向受试者施用寡糖组合物可有效治疗克罗恩氏病.
在一些实施方案中，将寡糖组合物施用于患有自身免疫性和/或过敏性障碍(例如，慢性炎症性障碍)的受试者增加短链脂肪酸(SCFA)，例如丁酸、乙酸和丙酸的水平(例如，在受试者的胃肠道)。在一些实施方案中，将寡糖组合物施用于患有炎症性肠病(例如，溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、肉芽肿性结肠炎、未定型结肠炎、转向性结肠炎、结肠袋炎、白塞氏病、显微镜下结肠炎、憩室病相关结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎和/或小儿发病的炎症性肠病)增加短链脂肪酸(SCFA)，例如丁酸、乙酸和丙酸的水平(例如，在受试者的胃肠道中)。
在一些实施方案中，提供了调节受试者中微生物群落组成和/或微生物群落代谢输出，例如，调节环境，例如调节(例如，增加)短链脂肪酸(例如，丁酸、乙酸和/或丙酸)的水平的方法。在一些实施方案中，本文所述的寡糖组合物促进产丙酸细菌(例如，属于副拟杆菌门)的生长和/或丰度(例如，相对丰度)。在一些实施方案中，本文所述的寡糖组合物促进产丁酸细菌(例如，毛螺菌科和优杆菌科)的生长和/或丰度(例如，相对丰度)。在一些实施方案中，寡糖组合物以有效量施用以调节微生物群落和改变胃肠道环境(例如，改变pH、改变乳酸、改变微生物密度等)。
在一些实施方案中，相对于参考测量值(例如，在施用组合物之前获得的测量值)，向受试者施用寡糖组合物导致受试者中(例如，受试者的胃肠道中)总短链脂肪酸的水平增加至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％或200％。在一些实施方案中，相对于参考测量值(例如，在施用组合物之前获得的测量值)，向受试者施用寡糖组合物导致受试者中(例如，受试者胃肠道中)总短链脂肪酸水平增加1-10％、5-20％、10-25％、20-40％、30-50％、40-60％、50-70％、60-80％、70-90％、80-100％、90-110％、100-125％、110-150％、125-175％或150-200％。
在一些实施方案中，受试者中短链脂肪酸的基线测量参考如Venegas,D.P.等人，Short Chain Fatty Acids(SCFAs)-Mediated Gut Epithelial and Immune Regulationand Its Relevance for Inflammatory Bowel Diseases.,Front.Immunol.,第10卷，第277条，2019年3月11日中所述。在一些实施方案中，受试者中短链脂肪酸的基线测量参考如Cummings,J.H.等人，Short chain fatty acids in human large intestine,portal,hepatic and venous blood.,Gut,1987,28,1221-1227中所述。
在一些实施方案中，相对于参考测量值(例如，在施用组合物之前获得的测量值)，向受试者施用寡糖组合物导致受试者中(例如，受试者的胃肠道中)的丁酸水平增加至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％或200％。在一些实施方案中，相对于参考测量，向受试者施用寡糖组合物导致受试者中(例如，受试者的胃肠道中)的丁酸水平增加1-10％、5-20％、10-25％、20-40％、30-50％、40-60％、50-70％、60-80％、70-90％、80-100％、90-110％、100-125％、110-150％、125-175％或150-200％。
在一些实施方案中，相对于参考测量值(例如，在施用组合物之前获得的测量值)，向受试者施用寡糖组合物导致受试者中(例如，受试者的胃肠道中)的乙酸水平增加至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％或200％。在一些实施方案中，相对于参考测量，向受试者施用寡糖组合物导致受试者中(例如，受试者的胃肠道中)的乙酸水平增加1-10％、5-20％、10-25％、20-40％、30-50％、40-60％、50-70％、60-80％、70-90％、80-100％、90-110％、100-125％、110-150％、125-175％或150-200％。
在一些实施方案中，相对于参考测量值(例如，在施用组合物之前获得的测量值)，向受试者施用寡糖组合物导致受试者中(例如，受试者的胃肠道中)的丙酸水平增加至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％或200％。在一些实施方案中，相对于参考测量，向受试者施用寡糖组合物导致受试者中(例如，受试者的胃肠道中)的丙酸水平增加1-10％、5-20％、10-25％、20-40％、30-50％、40-60％、50-70％、60-80％、70-90％、80-100％、90-110％、100-125％、110-150％、125-175％或150-200％。
在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法可用于治疗自身免疫性和/或过敏性障碍(例如，慢性炎症性障碍)的至少一种症状(例如，一种、两种、三种或四种或更多种)。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法可用于治疗炎症性肠病(例如溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、肉芽肿性结肠炎、未定型结肠炎、转向性结肠炎、结肠袋炎、白塞氏病、显微镜下结肠炎、憩室病相关结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎和/或小儿发病的炎症性肠病)的至少一种症状(例如，一种、两种、三种或四种或更多种)。炎症性肠病的症状包括腹泻频率、腹泻严重程度、腹痛和痉挛、稀便、血便、直肠疼痛、直肠出血、排便急迫、尽管急迫但排便困难、体重减轻、食欲不振、疲劳、和发烧。
在一些实施方案中，治疗患有自身免疫性和/或过敏性障碍(例如慢性炎症性障碍，例如炎症性肠病，例如溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、肉芽肿性结肠炎、未定型结肠炎、转向性结肠炎、结肠袋炎、白塞氏病、显微镜下结肠炎、憩室病相关结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎和/或小儿发病的炎症性肠病)的受试者包括组合施用寡糖组合物和标准护理治疗。标准护理治疗包括类固醇、皮质类固醇(例如，泼尼松和/或布地奈德)、免疫调节剂药物(例如，硫唑嘌呤、巯基嘌呤、环孢菌素和/或托法替尼)、氨基水杨酸盐(例如，5-氨基水杨酸及其衍生物，柳氮磺胺吡啶(Azulfidine)、美沙拉嗪(AsacolHD、Delzicol等)、巴柳氮(Colazal)和奥沙拉嗪(Dipentum))和生物制品(例如，抗TNF分子，如阿达木单抗、英利昔单抗、戈利木单抗、赛妥珠单抗聚乙二醇、抗整合素分子如那他珠单抗、维多珠单抗和/或IL-12和/或IL-23激动剂如优特克单抗)。在一些实施方案中，治疗患有溃疡性结肠炎的受试者包括与标准护理治疗(例如，用皮质类固醇、类固醇、氨基水杨酸盐、免疫调节药物、生物制剂等治疗)同时施用寡糖组合物。在一些实施方案中，治疗患有克罗恩氏病的受试者包括与标准护理治疗(例如，用皮质类固醇、类固醇、氨基水杨酸盐、免疫调节药物、生物制剂等治疗)同时施用寡糖组合物。
在一些实施方案中，需要本文所述的寡糖组合物的患有自身免疫性和/或过敏性障碍(例如慢性炎症性障碍，例如炎症性肠病，例如溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、肉芽肿性结肠炎、未定型结肠炎、转向性结肠炎、结肠袋炎、白塞氏病、显微镜下结肠炎、憩室病相关结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎和/或小儿发病的炎症性肠病)的受试者是先前接受过手术(例如去除胃肠道受损部分)或针对所述障碍的标准护理治疗干预(例如，用皮质类固醇、类固醇、氨基水杨酸盐、免疫调节剂药物、生物制剂等治疗)的受试者。
本文提供的化合物和组合物可用于调节受试者微生物群中存在的细菌分类群(例如1、2、3、4、5或更多类群)的方法。在一些实施方案中，调节包括减少促炎和/或致病微生物分类群(例如，来自肠杆菌科的分类群)的丰度(例如，相对丰度)。在一些实施方案中，调节包括相对于共生微生物分类群(例如，副拟杆菌属和拟杆菌属)减少促炎和/或致病微生物分类群(例如，来自肠杆菌科的分类群)的丰度。在一些实施方案中，调节包括降低肠杆菌科和/或瘤胃球菌科的丰度(例如，相对丰度)。在一些实施方案中，调节包括降低肠杆菌科埃希氏菌属和/或瘤胃球菌科粪杆菌属的丰度(例如，相对丰度)。在一些实施方案中，调节包括增加共生微生物分类群(例如，来自副拟杆菌属和拟杆菌属的分类群)的丰度(例如，相对丰度)。在一些实施方案中，调节包括增加副拟杆菌属和Eisenbergiella的丰度(例如，相对丰度)。在一些实施方案中，调节包括相对于促炎和/或致病微生物分类群(例如，来自肠杆菌科的分类群)增加共生微生物分类群(例如，来自副拟杆菌属和拟杆菌属的分类群)的丰度。在一些实施方案中，调节包括增加拟杆菌科和/或坦纳菌科的丰度(例如，相对丰度)。在一些实施方案中，调节包括降低拟杆菌科拟杆菌属、坦纳菌科副拟杆菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、志贺氏菌属和/或柠檬酸杆菌属的丰度(例如，相对丰度)。在一些实施方案中，调节包括微生物群系结构的变化，例如分类群的相对组成的变化或分类群的相对丰度的变化，例如，相对于另一个分类群或相对于在没有调节的情况下将观察到的。在其他实施方案中，调节包括微生物群系功能的变化，例如基因表达的变化、基因拷贝数的变化、DNA的总体丰度、基因产物(例如，RNA或蛋白质)的水平，或微生物群系的代谢输出，或宿主功能途径的变化(例如，基因表达、基因产物水平或宿主细胞或宿主过程的代谢输出的变化)。WO 2016/122889和WO 2016/172657中公开的调节微生物分类群的方法适用于本文所述的方法，其通过引用并入本文。在一些实施方案中，本文所述的寡糖组合物促进产丙酸细菌(例如，属于副拟杆菌门)的生长和/或丰度(例如，相对丰度)。在一些实施方案中，本文所述的寡糖组合物促进产丁酸细菌(例如，毛螺菌科和优杆菌科)的生长和/或丰度(例如，相对丰度)。
本文描述的方法包括以有效调节分类群的量向受试者施用本文描述的组合物，例如，包括本文所述的寡糖组合物。在一些实施方案中，当施用组合物，细菌分类群的丰度可能相对于其他分类群增加(或相对于从一个时间点到另一个时间点)，并且增加可以是至少5％、10％、25％、50％、75％、100％、250％、500％、750％增加或至少1000％增加。当施用组合物时，细菌分类群的丰度也可能相对于其他分类群减少(或相对于从一个时间点到另一个时间点)，并且减少可以是至少5％、10％、25％、50％、75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％减少，或至少减少99.9％。施用组合物可以调节受试者胃肠道微生物群系中所需和/或非所需细菌分类群的丰度。
在一些实施方案中，本文所述的组合物(例如，包括本文所述的寡糖组合物)调节(例如，显著增加或显著减少)一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)细菌分类群的总(胃肠道)群落的生长(和总数)(或显著增加或显著减少相对表现/丰度)。
在一些实施方案中，本文所述的组合物(例如，包括本文所述的寡糖组合物)显著增加生长，例如，一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)共生细菌分类群的总(胃肠道)群落的总数或相对表现/丰度。在一些实施方案中，本文描述的组合物，例如包含本文描述的寡糖组合物，显著增加生长，例如副拟杆菌属和拟杆菌属的总(胃肠道)群落的总数或相对表现/丰度。在一些实施方案中，本文描述的组合物，例如包含本文描述的寡糖组合物，显著增加生长，例如拟杆菌科和/或坦纳菌科的总(胃肠道)群落的总数或相对表现/丰度。
在一些实施方案中，本文所述的组合物(例如，包括本文所述的寡糖组合物)显著减少生长，例如，一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)细菌分类群的总(胃肠道)群落的总数或相对表现/丰度。在一些实施方案中，本文描述的组合物，例如包含本文描述的寡糖组合物，显著降低生长，例如肠杆菌科和/或瘤胃球菌科总(胃肠道)群落的总数或相对表现/丰度。在一些实施方案中，本文描述的组合物，例如包含本文描述的寡糖组合物，显著降低生长，例如肠杆菌科埃希氏菌属和/或瘤胃球菌科粪杆菌属的总(胃肠道)群落的总数或相对表现/丰度。
在一些实施方案中，将所选的寡糖组合物施用于受试者(例如，施用于受试者的肠道)导致受试者中(例如，在受试者的粪便样品中测量)与胃肠道微生物群系内的粘附侵入性大肠杆菌相关的基因的消耗(即，水平降低)。水平评估(例如，宏基因组评估)代表评估粘附侵入性大肠杆菌浓度和丰度的机制。在一些实施方案中，使用基于泛基因组的系统基因组分析(PanPhlAn)(例如，宏基因组数据的)来评估与粘附侵入性大肠杆菌相关的基因水平，上述系统基因组分析用于量化大肠杆菌基因的泛基因组(例如，使用此类基因的90％氨基酸同一性基因簇的泛基因组参考)。这些细菌分类群与炎症性肠病如溃疡性结肠炎的发病机制有关。参见，例如，Palmela C.等“Adherent-invasive Escherichia coli ininflammatory bowel disease,”Gut 2018；67:574–587。与侵入性大肠杆菌相关的基因可能包括fimH、ompA、ompC、fim operon/fimH、chiA、nlpI、yfgL、ibeA、afaC、vat-AIEC、fliC、vgrG、hcp、vasD、vasG、impL、impK，以及本领域技术人员已知的其他内容。在一些实施方案中，相对于参考测量值(例如，在施用组合物之前获得的测量值，例如，在受试者的粪便样品中测量的)，向受试者施用寡糖组合物导致受试者胃肠道微生物群系内与粘附侵入性大肠杆菌相关的基因(例如，fimH、ompA、ompC)消耗(例如，水平降低)至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施方案中，相对于参考测量值(例如，在施用组合物之前获得的测量值，例如，在受试者的粪便样品中测量的)，向受试者施用寡糖组合物导致受试者胃肠道微生物群系内与粘附侵入性大肠杆菌相关的基因(例如，fimH、ompA、ompC)消耗(例如，水平降低)至少1-10％、5-20％、10-25％、20-40％、30-50％、40-60％、50-70％、60-80％、70-90％、80-100％、90-100％。
在一些实施方案中，本文所述的寡糖组合物调节生长，例如，消耗胆固醇的细菌分类群和物种的总(胃肠道)群落的总数或相对表现/丰度，例如，比参考细菌分类群或物种的比率更高。
在一些实施方案中，寡糖组合物被配制成粉末，例如用于重构(例如，在水中)用于口服施用。在一些实施方案中，寡糖组合物被配制为用于口服施用的固体形式(例如，咀嚼片或软糖)。在一些实施方案中，寡糖组合物被配制成用于通过饲管递送的药物组合物。在一些实施方案中，寡糖组合物被配制成用于通过全胃肠外营养(TPN)递送的药物组合物。
可以每天、每周、每两周或每月向受试者施用寡糖组合物。在一些实施方案中，每天向受试者施用组合物多于一次(例如，每天2、3或4次)。在一些实施方案中，组合物每天施用于受试者。在一些实施方案中，组合物每周多于一次(例如，每周2、3或4次)施用于受试者。在一些实施方案中，组合物连续一、二、三、四、五、六、七、八、九或十个星期每天一次或两次施用于受试者。在一些实施方案中，组合物长期施用于受试者。在一些实施方案中，组合物连续2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个月施用于受试者。在一些实施方案中，最初施用较高剂量，例如持续1-2周、1-4周、1-6周、1-8周、1-10周、1-12周，然后降低剂量(例如，降低20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)，例如，用于对受试者的慢性或长期施用。
在一些实施方案中，寡糖组合物可以每天或每周施用于患有慢性障碍(例如，炎症性肠病)的受试者。在一些实施方案中，寡糖组合物可以每天两次以有效治疗障碍的量施用于患有慢性障碍(例如，炎症性肠病)的受试者。在一些实施方案中，寡糖组合物可以每天两次以最大耐受剂量施用于患有慢性障碍(例如，炎症性肠病)的受试者。
在一些实施方案中，寡糖组合物的有效量为每天施用总共5-200克、5-150克、5-100克、5-75克、5-50克、5-25克、10-50克、25-50克、30-60克、50-75克、50-100克或40-80克。
本公开的寡糖组合物对受试者具有良好的耐受性(例如，寡糖组合物不会在受试者中引起或引起最小的不适，例如产生气体或胃肠不适)。在一些实施方案中，5-200克、5-150克、5-100克、5-75克、5-50克、5-25克、10-50克、25-50克、30-60克、50-75克、50-100克或40-80克的总日剂量被受试者很好地耐受。在一些实施方案中，寡糖组合物的最大耐受剂量为每天施用5-200克、5-150克、5-100克、5-75克、5-50克、5-25克、10-50克、25-50克、30-60克、50-75克、50-100克、40-80克或更多克。一次性或以单次剂量施用受试者的如本文所述的寡糖组合物的任何剂量可被受试者很好地耐受。
在一些实施方案中，与类似量的商业低消化性糖例如低聚果糖(FOS)相比，在单次或以单剂量向受试者施用的寡糖组合物的量更能被受试者耐受。本领域已知市售低消化性糖在受试者中耐受性差(参见，例如Grabitske,H.A.,Critical Reviews in Food Scienceand Nutrition,49:327-360(2009))，例如以高剂量。例如，FOS的耐受性研究表明，每天20克FOS会导致轻微的胃肠道症状，每天30克FOS会导致严重的不适和胃肠道症状。
在一些实施方案中，本文描述的寡糖组合物与共生的或益生的菌类群以及通常被认为安全的细菌(GRAS)或已知的共生的或益生菌微生物共同施用。在一些实施方案中，共生的或益生的菌类群(或其制剂)可以在向受试者施用寡糖组合物之前或之后向受试者施用。在一些实施方案中，益生菌或共生菌分类群(或其制剂)可以与向受试者施用寡糖组合物同时向受试者施用。
共生的或益生的细菌也称为益生菌。益生菌可以包括益生菌细菌在发酵过程中产生的代谢物。这些代谢物可以释放到发酵培养基中，例如释放到宿主生物体(例如，受试者)中，或它们可以储存在细菌内。“益生细菌(Probiotic bacteria)”包括细菌、细菌匀浆、细菌蛋白、细菌提取物、细菌发酵上清液及其组合，它们例如当以治疗剂量施用时对宿主动物发挥有益作用。
有用的益生菌包括至少一种产生乳酸和/或乙酸和/或丙酸的细菌，例如通过分解碳水化合物诸如葡萄糖和乳糖产生乳酸和/或乙酸和/或丙酸的微生物。优选地，益生细菌是乳酸菌。在实施方案中，乳酸菌包括乳杆菌属、明串珠菌属、片球菌属、链球菌属和双歧杆菌属。合适的益生细菌还可以包括通过改善宿主肠道细菌平衡而有益地影响宿主的其它细菌，诸如但不限于酵母诸如酵母属(Saccharomyces)、德巴利氏酵母属(Debaromyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)和球拟酵母属(Torulopsis)，霉菌诸如曲霉属(Aspergillus)、根霉属(Rhizopus)、毛霉属(Mucor)以及青霉属(Penicillium)和球拟酵母属，以及其他细菌诸如但不限于拟杆菌属、梭菌属(Clostridium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、蜜蜂球菌属(Melissococcus)、丙酸菌属、肠球菌属、乳球菌属、葡萄球菌属、消化链球菌属、芽孢杆菌属、片球菌属、微球菌属、明串珠菌属、魏斯氏菌属(Weissella)、气球菌属(Aerococcus)和酒球菌属(Oenococcus)，以及它们的组合。
可用于本公开的乳酸菌的非限制性实例包括乳酸链球菌、乳脂链球菌、二乙酰乳酸链球菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、双叉乳酸杆菌、干酪乳杆菌、乳酸杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、德氏乳杆菌、嗜热乳杆菌、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentii)、唾液乳杆菌、副干酪乳杆菌、短乳杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、两岐双歧杆菌、动物双歧杆菌、乳酸双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌和啤酒片球菌及其组合，特别是乳杆菌、双歧杆菌及其组合。
具体可用于本公开的共生的和益生的细菌包括来源于人(或来源于正在被施用益生细菌的哺乳动物)(用于人施用)，对宿主不致病、对技术过程具有抗性(即在加工期间和在递送媒介物中可以保持活力和活性)，对胃酸和胆汁毒性具有抗性，粘附于肠道上皮组织，具有定殖在胃肠道中、产生抗菌物质、调节宿主的免疫应答并影响代谢活动(例如胆固醇同化、乳糖酶活性、维生素产生)的能力的那些。
共生的和益生的细菌可以作为单一菌株或多种菌株的组合使用，其中一个剂量的益生细菌中的细菌总数为每剂从约1x 103至约1x 1014、或从约1x 10至约1x 1012、或从约1x107至约1x 1011CFU。
可以将共生的或益生的细菌与寡糖组合物配制，同时益生细菌是活的但处于“休眠”或嗜睡状态。一旦冷冻干燥，对益生细菌的一种或多种活的培养物进行处理，以使对水分的暴露(这将使培养物恢复活力)最小化，因为一旦恢复活力，培养物即可经历高发病率，除非很快在高水分环境或培养基中培养。另外，处理培养物以减少对高温的可能暴露(尤其是在水分存在下)以降低发病率。
益生细菌可以粉末状的干燥形式使用。益生细菌也可以在寡糖组合物中或在单独的寡糖组合物中施用，与寡糖组合物同时或在不同时间施用。
其他合适的益生菌包括乳酸双歧杆菌、动物双歧杆菌、两岐双歧杆菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌和婴儿双歧杆菌。
在实施方案中，可以在本文描述的寡糖组合物中使用和/或与其组合使用的共生菌分类群包括阿克曼氏菌属、厌氧球菌属(Anaerococcus)、拟杆菌属、双歧杆菌属(包括乳酸双歧杆菌、动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌、短双歧杆菌、和婴儿双歧杆菌)、布劳特氏菌属(Blautia)、梭菌属、棒状杆菌属(Corynebacterium)、小类杆菌属(Dialister)、真杆菌属(Eubacterium)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、芬戈尔德菌属(Finegoldia)、梭杆菌属、乳杆菌属(包括嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、双歧乳杆菌、乳酸乳杆菌、发酵乳杆菌、唾液乳杆菌、副干酪乳杆菌、短乳杆菌、德氏乳杆菌、嗜热乳杆菌、卷曲乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、生孢乳杆菌和保加利亚乳杆菌)、消化球菌属、消化链球菌属、嗜蛋白胨菌属(Peptoniphilus)、普雷沃菌属(Prevotella)、罗斯氏菌属(Roseburia)、瘤胃球菌属、葡萄球菌属、和/或链球菌属(包括乳酸链球菌、乳脂链球菌、二乙酰乳酸链球菌、嗜热链球菌)。
在实施方案中，可以在本文描述的寡糖组合物中使用和/或与其组合使用的共生菌分类群，例如GRAS菌株，包括凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)GBI-30，6086；动物双歧杆菌乳酸亚种BB-12；短双歧杆菌养乐多(Yakult)；婴儿双歧杆菌35624；动物双歧杆菌乳酸亚种UNO 19(DR10)；长双歧杆菌BB536；大肠杆菌M-17；尼氏大肠杆菌(埃希氏菌属coliNissle)1917；嗜酸乳杆菌DDS-1；嗜酸乳杆菌LA-5；嗜酸乳杆菌NCFM；干酪乳杆菌DN 114-001(免疫/防御干酪乳杆菌)；干酪乳杆菌CRL431；干酪乳杆菌F19；副干酪乳杆菌Stl l(或NCC2461)；约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)Lai(乳杆菌属LCI、约氏乳杆菌NCC533)；乳酸乳球菌L1A；植物乳杆菌299V；罗伊氏乳杆菌ATTC 55730(罗伊氏乳杆菌SD2112)；鼠李糖乳杆菌ATCC 53013；鼠李糖乳杆菌LB21；酿酒酵母(布拉氏(boulardii))lyo；鼠李糖乳杆菌GR-1和罗伊氏乳杆菌RC-14的混合物；嗜酸乳杆菌NCFM和乳酸双歧杆菌BB-12或BL-04的混合物；嗜酸乳杆菌CL1285和干酪乳杆菌的混合物；以及瑞士乳杆菌R0052、鼠李糖乳杆菌R0011和/或鼠李糖乳杆菌GG(LGG)的混合物。
IV.试剂盒
还考虑了试剂盒。例如，试剂盒可包含寡糖组合物的单位剂型，以及包含使用该组合物治疗，例如，与高氨血症有关的疾病，例如，尿素循环障碍或肝性脑病的说明书的包装插页。在一些实施方案中，所述组合物以干粉形式提供。在一些实施方案中，所述组合物以溶液、粉末或片剂形式提供。所述试剂盒在合适的包装中包括寡糖组合物以供有需要的受试者使用。本文所述的任何组合物都可以以试剂盒的形式包装。试剂盒可包含足以用于整个治疗过程或部分治疗过程的量的寡糖组合物。所述寡糖组合物的剂量可以单独包装，或者所述寡糖组合物可以散装提供，或其组合。因此，在一个实施方案中，试剂盒在合适的包装中提供了与治疗方案中的给药点相对应的寡糖组合物的单独剂量，其中该剂量被包装在一个或多个小包中。
试剂盒可还包括书面材料，例如说明书、预期结果、鉴定书(testimonials)、解释、警告、临床数据、供保健专业人员使用的信息等。在一个实施方案中，所述试剂盒包含标签或其他指示该试剂盒仅在保健专业人员的指导下使用的信息。容器可还包括勺、注射器、瓶子、杯子、涂抹器或其他测量或服务装置。
实施例
实施例1.在寡糖组合物存在下健康粪便样品中短链脂肪酸(SCFA)的产生
测试了数百种不同的合成寡糖组合物(总共431种组合物)调节(例如，降低)健康粪便样品中代谢物(例如，短链脂肪酸，例如乙酸、丙酸和丁酸)水平的能力。
从捐赠者处收集粪便样品，冷冻并储存在-80℃直至使用。将冷冻的粪便样品转移到厌氧室中，使其解冻并在补充有15％甘油的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中均质化至最终浓度为20％的固体。然后过滤20％的粪便浆液以去除大块碎片，等分，从厌氧室中取出并立即冷冻在干冰上，然后在-80℃储存。在实验当天，在厌氧室中将每种20％粪便浆液的一个1mL等分试样解冻并稀释到细菌生长培养基(补充有0.1％w/v胰蛋白酶蛋白胨和0.75mM尿素的梭菌基本培养基)中，最终浓度为1％。然后将1％的粪便浆液溶液分配到含有无菌水(阴性对照)或寡糖制剂(终浓度为0.5％)的96深孔板的孔中。每个样品制备三个重复。粪便微生物培养物在37℃厌氧培养45小时。对来自健康受试者的三种不同粪便微生物群落进行了初步离体筛查。
45小时培养期后，将含有粪便微生物培养物的96孔深孔板从厌氧室中取出并置于冰上。通过在4℃离心(3,000x g)10分钟使板沉降。收集粪便微生物群培养物上清液和沉淀物并储存在-80℃。将上清液样品解冻并通过具有火焰离子化检测器(GC-FID)的气相色谱进行分析，以量化粪便样品中产生的短链脂肪酸(乙酸、丙酸和丁酸)的浓度。
通过从具有寡糖组合物的值中减去具有阴性对照的每个SCFA的值来计算归一化的SCFA浓度。进行该计算以确定所选的寡糖组合物在这些测定条件下增加丁酸产量的程度。
数百种测试的寡糖组合物之一，如本文中所述的所选的寡糖组合物(例如，如通过实施例2-4、12和13中的方法生产的)，被确定显著增加丁酸产生(相对于阴性对照，三个测试粪便群落中的丁酸中值增加为4.2mM)(图19)。
实施例2.使用可溶性酸催化剂从半乳糖生产100g规模的寡糖组合物
开发了用于以100克规模合成如实施例1中所述的所选的寡糖组合物的程序。将100g半乳糖和足以达到85％溶解固体起始浓度的水量添加到反应容器(1L三颈圆底烧瓶)中。反应容器装备有配置有顶部搅拌器的加热套。探针热电偶通过隔膜布置在容器中，使得探针尖端位于搅拌叶片上方并且不与反应容器壁接触。在加入催化剂之前，反应容器在回流位置装有冷凝器。
该程序使用柠檬酸(1.5-3％w/w)作为催化剂，并使用去离子水进行淬灭。添加催化剂后，将反应容器装配在蒸馏位置以在整个反应进程中除去过量的水。
温度控制器设置为目标温度(130至140℃)，随着糖浆温度达到在环境(大气)压力的目标温度，开始搅拌容器内的物质以促进糖固体的均匀传热和熔化。
添加催化剂后，将反应在连续混合下保持在目标温度约2.5-5小时，通过HPLC跟踪反应确定。接下来，在保持恒定搅拌的同时关闭加热。
然后通过缓慢添加约60mL去离子(DI)水(室温)稀释和冷却产物混合物来淬灭反应，以达到50-60wt％溶解固体的目标最终浓度。在该实施例的一些实施方案中，通过缓慢添加60-100mL去离子(DI)水(室温)稀释和冷却产物混合物来淬灭反应，以达到45–65wt％溶解固体的目标最终浓度。通常，当寡糖组合物被冷却和稀释时，执行加水速率以控制混合物粘度。
实施例3.使用可溶性酸催化剂从半乳糖生产10kg规模的所选的寡糖组合物
开发了用于以10千克的规模合成如实施例1中所述的所选的寡糖组合物的程序。将9.1kg无水半乳糖、0.27kg柠檬酸无水酸催化剂和1.45kg水添加到反应容器(22LLittleford-Day卧式犁式混合器)中。蒸馏冷凝器单元连接到反应器。以约30RPM搅拌内容物，容器温度在3.5-4.0小时内逐渐升高至大气压力的约136℃。将混合物在该温度保持1-1.5小时，之后停止加热并以60mL/min的速率将预热水逐渐添加到反应混合物中，直到反应器内容物的温度降至120℃，然后以150mL/min直到反应器内容物的温度降低到110℃，然后以480mL/min直到总共添加了7.5kg的水，并且反应器内容物的温度降低到100℃以下。向反应器中加入另外的1.6kg水用于进一步稀释。将反应混合物从容器中排出，得到作为水溶液的17.0-17.6kg的粗寡糖(约49-52wt％)。
寡糖组合物通过使其流过阳离子交换树脂(Monosphere 88H)柱、两根脱色聚合物树脂(/>OptiPore SD-2)柱和阴离子交换树脂(/>Monosphere77WBA)进行纯化。所得具有约43wt％的浓度的纯化的物质然后通过真空旋转蒸发浓缩至约70wt％固体的最终浓度以获得纯化的寡糖组合物。
实施例4.使用固体酸催化剂从半乳糖生产100g规模的寡糖组合物
开发了用于以100克规模合成如实施例1中所述的所选的寡糖组合物的程序。将100g半乳糖和足以达到85％溶解固体起始浓度的量的水添加到反应容器(1L三颈圆底烧瓶)中。反应容器配备有配置有顶置式搅拌器的加热套。探针热电偶通过隔膜设置在容器中，使得探针尖端位于搅拌叶片上方并且不与反应容器的壁接触。在加入催化剂之前，反应容器配备有处于回流位置的冷凝器。
该程序使用润湿(45-55％水分含量)Dowex Marathon-C，H+形式(1-5％w/w，干基)作为催化剂和去离子水进行淬灭。加入催化剂后，将反应容器装在蒸馏位置以在整个反应过程中除去过量的水。
将温度控制器设置为目标温度(130至145℃)，并开始搅拌容器中的内容物以促进糖固体的均匀传热和熔化，同时在环境(大气)压下将糖浆的温度达到目标温度。
加入催化剂后，反应在目标温度在连续混合下保持约2-4小时，通过HPLC跟踪反应确定。接着，在保持恒定搅拌的同时关闭加热。然后通过缓慢添加约60mL去离子(DI)水(室温)以稀释和冷却产物混合物来淬灭反应，以达到50-60wt％溶解固体的目标最终浓度。在该实例的一些实施方案中，产物混合物被带到50-65wt％溶解固体的最终浓度。通常，随着寡糖组合物冷却和稀释，进行加水速率以控制混合物粘度。淬灭后，使用烧结玻璃漏斗过滤固体催化剂。
实施例5.脱单体化程序
将实施例2-4、12和13中产生的所选的寡糖组合物的各个批次使用下述两个程序之一进行脱单体。
色谱方法
所选的寡糖组合物的各个批次在旋转蒸发仪上浓缩至约50Brix(通过白利度折光仪(Brix refractometer)测量)。使用粗头注射器将所得糖浆(最多4g干基)负载到Teledyne ISCO RediSep Rf Gold Amine柱(55克固定相)上。也可以使用其他类似的色谱柱，例如Biotage SNAP KP-NH Cartridges。将样品在配备ELSD检测器的Biotage Isolera上纯化(使用超过55倍柱体积的20/80至50/50(v/v)去离子水/ACN流动相梯度洗脱)。也可以使用其他快速色谱系统，例如Teledyne ISCO Rf。流速是根据制造商针对色谱柱和系统的规格设置的。在～16柱体积单体级分完全洗脱后，将流动相设置为100％水，直到寡糖组合物的其余部分洗脱并收集。含游离单体的级分通过旋转蒸发浓缩以得到脱单体产物。
乙醇沉淀
在用离子交换树脂(例如，如本文所述)处理后，将如实施例2-4、12和13中生产的各批次所选的寡糖组合物在旋转蒸发器上浓缩至约25Brix，如通过Brix折射计测量的。将100mL浓缩寡糖组合物以不高于10mL/分钟的速率倒入含有900mL纯USP级乙醇的剧烈搅拌的烧杯中。一旦添加完成，沉淀的固体在室温或略低于室温再搅拌15分钟。将悬浮液在5℃以4000rpm离心4小时。倒出上清液，将沉淀的固体(颗粒)溶解在水中至最终浓度为25Brix，然后再浓缩至＞65Brix。然后将该糖浆稀释回25Brix并再次浓缩以确保去除残留的乙醇。将所得糖浆稀释回25Brix，冷却至-78℃，并冻干以产生脱单体化产物。
实施例6.尺寸排阻色谱
如实施例1中所述并根据如实施例2-4、12和13中所述的方法生产的所选的寡糖组合物的批次的重均分子量(MWw)、数均分子量(MWn)和多分散指数(PDI)，由SEC HPLC测定。
方法
这些方法涉及使用具有折射率(RI)检测器的Agilent 1100，该检测器配备以下两个串联色谱柱：Shodex OHpak SB-802HQ,8.0x 300mm,8μm,P/NF6429100和Shodex OHpakSB-803HQ,8.0x 300mm,6μm,P/N F6429102。也可以使用本领域已知的等效柱。
通过称重34g的NaNO3(ACS级试剂)并溶解在2000mL去离子(DI)水(来自MiliQ滤水器)中来制备流动相(0.1M NaNO3)。通过0.2μm过滤器过滤该溶液。
聚合物标准溶液(10.0mg/mL)的制备方法是称取20mg标准品到单独的20mL闪烁瓶中，然后向每个瓶中加入2.0mL的DI水。
样品A一式两份制备。将约300mg的寡糖组合物样品称入20mL闪烁瓶中，并添加10mL DI水。将溶液混合并通过具有0.2μm聚醚砜膜的Acrodisc25mm注射器过滤器过滤。样品B一式两份制备。将约210mg的寡糖样品称入20mL闪烁瓶中，并加入10mL DI水。将溶液混合并用具有0.2μm聚醚砜膜的Acrodisc 25mm注射器过滤器过滤。
运行样品前至少2小时将流速设置为0.7-0.9mL/min，柱温和RI检测器均设置为40℃，并打开RI检测器吹扫。
运行由DI水组成的空白样品。运行每个标准的样品。样品A运行。运行样品B。
在一些实验中，运行样品之前，所有样品的注射体积为10μL且运行时间为28分钟，关闭检测器吹扫并以0.7-0.9mL/min的速度运行泵，直到获得可接受的基线。对15至22分钟之间的峰进行积分。
在其他实验中，运行样品之前，所有样品的注射体积为10μL且运行时间为40分钟，关闭检测器吹扫并以0.7-0.9mL/min的速度运行泵，直到获得可接受的基线。
Empower 3软件中的校准曲线拟合类型设置为第3阶。分子量使用Empower 3软件计算宽峰的分布和多分散性。报告了产物峰(DP2+)的Mw、Mn和多分散性。
结果
使用上述SEC方法分析了使用实施例3中描述的方法以10kg规模生产的六批所选的寡糖组合物。将通过实施例2中描述的方法生产的小批量的所选的寡糖组合物脱单体化。
根据实施例3生产的寡糖组合物的测定批次包含平均MWw为2443g/mol(范围为2214-2715g/mol)，平均MWn为1155g/mol(范围为1095-1201g/mol)，平均PDI为2.1(范围为2.0-2.3)的寡糖。测定的批次还包含91.1％(范围为90.0-91.9)的平均DP2+和15.1(范围为13.6-16.7)的平均聚合度(DP)。
使用上述SEC方法分析使用实施例13中描述的方法以500kg(2000L)规模生产的四批所选的寡糖组合物。根据实施例13生产的寡糖组合物的测定批次包含平均MWw为2056g/mol(范围为1968-2109g/mol)和平均MWn为1107g/mol(范围为1071-1138g/mol)的寡糖。测定批次还包含89.1％(范围为88.1-90.2％)的平均DP2+和12.7(范围为12.1-13.0)的平均聚合度(DP)。
实施例7.用于确定杂质的SEC HPLC方法
通过SEC HPLC确定如通过实施例3中的方法生产的选择的寡糖组合物的批次和样品的残留有机酸杂质和相关物质的存在。
方法
这些方法涉及使用配备有保护柱(Bio-Rad MicroGuard Cation H+Cartridge，PIN 125-0129或等同物)和Bio-Rad Aminex HPX-87H,300x 7.8mm,9μm,PIN 125-0140柱，或等同物的带有折射率(RI)检测器的Agilent 1100。
流动相(水中25mM的H2SO4)是通过在瓶中填充2000mL的去离子水并缓慢添加2.7mL的H2SO4制备的。将该溶液通过0.2μm的过滤器过滤。
通过在100-mL容量瓶中测量50±2mg参考标准品，将流动相加入至100-mL刻度并充分混合来制备标准溶液。
一式两份制备选择的寡糖组合物的样品(样品A)。将约1000mg的寡糖样品称入10mL容量瓶中，将流动相加至刻度。混合该溶液并通过带有0.2μm聚醚砜膜的PES注射器式过滤器过滤。
一式两份制备选择的寡糖组合物的样品(样品B)。将约700mg的寡糖样品称入10mL容量瓶中，将流动相加至刻度。混合该溶液并通过带有0.2μm聚醚砜膜的PES注射器式过滤器过滤。
在运行样品(柱温设置为50℃和RI检测器温度设置为50℃，并打开RI检测器净化)之前至少2小时将流速设置为0.65mL/min。
在运行样品之前，所有样品的进样体积为50μL，并且运行时间为40分钟，关闭检测器吹扫，泵以0.65mL/min运行，直到获得可接受的基线。
运行由去离子水组成的空白样品。将标准品、样品A和样品B各自独立运行。
7.5分钟(葡萄糖醛酸)、9.4分钟(马来酸)、11.3分钟(左旋葡聚糖)、11.9分钟(乳酸)、13.1分钟(甲酸)、14.2分钟(乙酸)、15.5分钟(乙酰丙酸)、31.8分钟(羟甲基糠醛，HMF)和8.3分钟(葡萄糖)的峰被积分。Empower 3软件中的校准曲线拟合类型设置为三阶。
结果
使用上述方法测试通过实施例3中的方法生产的六批所选的寡糖。所选的寡糖组合物的样品包含0.19％w/w柠檬酸(范围为0.18-0.19％w/w)和不可检测水平的乳酸、甲酸、乙酰丙酸和HMF。
实施例8.使用Bruker NMR机器的HSQC NMR分析程序
根据下述方案，使用Bruker NMR机器对实施例1中描述，并按照实施例2和3所述生产的所选的寡糖组合物样品的HSQC NMR谱图进行测定。
方法
样品制备：
将30mg先前冻干的寡糖组合物固体样品溶解在300μL D2O(含0.1％丙酮作为内标)中。然后将溶液放入3mm NMR管中。
NMR实验：
每个样品在于499.83MHz(125.69MHz 13C)工作，配备XDB宽带探针，Z轴梯度，调谐至13C，且在25℃运行的Bruker NMR中进行分析。使用用于相干选择的回波-反回波方案，对每个样品进行多重编辑梯度增强的1H-13C异核单量子相干(HSQC)实验。以下脉冲序列图以及采集和处理参数用于获取每个样品的NMR谱：
脉冲序列图(图5)
采集参数
1H载波频率＝4ppm
13C载波频率＝65ppm
采集维度中的点数＝596
采集维度中的频谱范围＝6.23ppm至1.83ppm
间接维度中的点数＝300个复杂点
间接维度中的频谱范围＝120ppm至10ppm
循环延迟＝1秒
单键1H-13C耦合常数＝JCH＝146Hz
扫描次数＝8
温度＝298-299K
溶剂＝D2O
处理参数
直接维度的窗函数＝高斯展宽，7.66Hz
间接维度的窗函数＝高斯展宽26.48Hz
处理＝直接维度中的512个复杂点，间接维度中的1024个复杂点
谱图分析
使用来自Mestrelab Research(Santiago de Compostela,Spain)的MNova软件包分析所得谱图。谱图参考内部丙酮信号(1H–2.22ppm；13C–30.8ppm)，并在F2和F1维度上使用Regions2D方法定相。在F2和F1维度中都应用了使用90度偏移正弦的变迹(Apodization)。对于每个谱图，单个信号(C-H相关性)通过使用具有椭圆形积分形状的“预定义积分区域”对各自的峰进行积分来量化。图6B显示了限定所选的寡糖组合物的HSQCNMR峰/信号1-11坐标的积分区域。图6C示出了由长轴坐标(F2维度；1H)和短轴坐标(F1维度；13C)限定的椭圆形状的示例。来自谱图的积分区域和值的所得表被归一化为总和100，以便该值代表总数的百分比。选择峰积分区域以避免与单体相关的峰，并专注于光谱的区别特征。
结果
使用如上所述的NMR方法分析了根据实施例3中描述的方法生产的六批所选的寡糖组合物(平均DP为15.1(±1.3))和根据实施例2中描述的方法生产的两批所选的寡糖组合物。
根据实施例5中所述的乙醇沉淀程序脱单体后，通过HSQC NMR分析所选的寡糖组合物的批次样品。还通过HSQC NMR分析了所选的寡糖组合物的未进行脱单体的批次样品。值得注意的是，对脱单体前后样品的HSQC NMR谱图的分析提供了基本相似的峰(例如，信号1-11处的相似相对AUC值)。表9提供了预限定的积分区域，或约束(即限定)椭圆形状的坐标。
表9.所选的寡糖组合物的HSQC NMR积分区域坐标
进一步确定了根据实施例2和3中描述的方法生产的(未脱单体的)总共八批所选的寡糖组合物的NMR谱图收集的每个峰的相对大小(曲线下面积(AUC))，如下表10所示：
表10.HSQC NMR数据(使用实施例2和3中描述的方法生产的批次；未脱单体化)
进一步确定了根据实施例2和3中所述的方法生产并根据实施例5所述的乙醇沉淀程序脱单体的总共八批的所选的寡糖组合物的NMR谱收集的每个峰的相对大小(曲线下面积(AUC))，如下表11所示：
表11.HSQC NMR数据(使用实施例2和3中描述的方法生产的批次；脱单体化)
进一步确定了根据实施例3中描述的方法生产的(未脱单体的)的总共六个批次的所选的寡糖组合物的NMR谱图收集的每个峰的相对大小(曲线下面积(AUC))，如下表12所示：
表12.HSQC NMR数据(使用实施例3中描述的方法生产的批次)
如上所述，通过HSQC NMR分析市售寡糖(低聚半乳糖、乳糖、蜜二糖、人乳寡糖2-a-L-吡喃岩藻糖基-D-乳糖和人乳寡糖乳-N-新四糖)样品。每种市售寡糖的NMR谱图与所选寡糖的指定峰积分区域(即，表9中的峰信号1-11)重叠，并确定这些积分区域中每一个的相对AUC，如下所示。这些实验表明所选寡糖组合物的HSQC NMR谱图与测试的市售寡糖显著不同(表13)。
表13.使用所选的寡糖组合物的积分区域的市售寡糖的HSQC NMR数据
*NS＝未检测到峰信号
实施例9.使用全甲基化分析确定糖苷键分布
根据以下描述的方案，使用全甲基化分析进行如通过实施例2中的方法生产的选择的寡糖组合物样品的糖苷键分布的测定。在全甲基化分析之前将样品脱单体。
使用的试剂为甲醇、乙酸、硼氘化钠、碳酸钠、二氯甲烷、异丙醇、三氟乙酸(TFA)和乙酸酐。装置包括加热模块、干燥设备、为毛细管柱配备并配有RID/MSD检测器的气相色谱仪和30米的(RESTEK)。所有推导过程均在通风橱中完成。
醛糖醇乙酸酯(alditol acetate)的制备
A.标准制备
制备以下标准分析物的1mg/mL溶液：阿拉伯糖、鼠李糖、岩藻糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖和肌醇。通过将50μL阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖的每一者与20μL肌醇在小瓶中混合来制备标准品。随后将该标准品冻干。
B.样品制备
通过将100-500μg选择的寡糖组合物(以分析天平称重)与20μg(20μL)肌醇在小瓶中混合来制备每个样品。
C.水解
将200μL 2M三氟乙酸(TFA)加入样品中。将装有样品的小瓶盖紧并在加热模块上于121℃孵育2小时。2小时后，将样品从加热模块取出并冷却至室温。然后将该样品用N2/空气干燥。加入200μL的IPA(异丙醇)并再次用N2/空气干燥。将此水解步骤(在121℃添加TFA持续2小时；用异丙醇洗涤)重复两次。
如样品所述，类似地使用TFA对标准品进行水解。
D.还原和乙酰化
在1M氢氧化铵中制备10mg/mL硼氘化钠溶液。将200μL的此溶液添加到样品中。然后将样品在室温下孵育至少一小时或过夜。与硼氘化钠溶液一起孵育后，将5滴冰醋酸添加到样品中，然后添加5滴甲醇。然后将样品干燥。将500μL的9：1MeOH：HOAc添加到样品中，然后干燥(重复两次)。然后将500μL MeOH添加到样品中，然后干燥(重复一次)。这在样品瓶侧面产生了硬皮白色残留物。
然后将250μL乙酸酐添加到样品瓶中，并将样品涡旋至溶解。向样品中加入230μL的浓TFA，并将样品在50℃孵育20分钟。将样品从热源移开并冷却至室温。加入约1mL异丙醇，并将样品干燥。然后，加入约200μL异丙醇，并再次干燥样品。然后将约1mL的0.2M碳酸钠添加到样品中，并轻轻混合。最后将约2mL二氯甲烷添加到样品中，然后将其涡旋并短暂离心。丢弃水性顶层。加入1mL水并将样品涡旋并短暂离心。重复此步骤，然后除去有机层(底部)并转移到另一个小瓶中。使用N2/空气将样品浓缩至约100μL的最终体积。然后将1μL最终样品注入GC-MS。
GC温度程序SP2330用于GC-MS分析。初始温度为80℃，初始时间为2.0分钟。第一次升温速率为30℃/min，最终温度为170℃且最终时间为0.0分钟。第二次升温速率为4℃/min，最终温度为240℃且最终时间为20.0分钟。
箱守法(Hakomori)甲基化分析多糖和寡糖的糖基连接
A.NaOH碱的制备
在玻璃螺旋顶管中，将100μL的50/50NaOH溶液和200μL的无水MeOH合并。塑料移液管用于NaOH，玻璃移液管用于MeOH。将该溶液短暂涡旋，加入约4mL无水的DMSO，然后再次涡旋该溶液。离心该管以浓缩溶液，然后从沉淀物中吸出DMSO和盐。重复前两个步骤约四次，以除去沉淀中的所有水。从管的侧面除去所有白色残留物。除去所有残留物并澄清沉淀后，加入约1mL无水DMSO并将溶液涡旋。然后所述碱就可以使用了。每次需要时，都要重新制备所述碱。
B.全甲基化
通过将600-1000μg所选的寡糖组合物(以分析天平称重)与200μLDMSO混合来制备每个样品。将样品搅拌过夜直至寡糖组合物溶解。
向样品中加入等量的NaOH碱(400μL)，然后将该样品放回搅拌器中并充分混合10分钟。将100μL碘甲烷(CH3I)添加到样品中。将该样品在搅拌器上混合20分钟，然后重复前面的步骤(添加NaOH碱和碘甲烷)。
将约2mL超纯水添加到样品中并将该样品充分混合，以致浑浊。将移液器的尖端放在试管底部的样品溶液中并用极少量的空气鼓泡CH3I。随着CH3I的鼓泡，样品变得清澈。将移液器移至溶液周围以确保所有CH3I均已消失。然后加入约2mL的二氯甲烷，并将该溶液通过涡旋充分混合30秒。然后将样品离心并除去顶部的水层。加入约2mL水并将样品混合，然后短暂离心，然后除去顶部的水层。重复添加二氯甲烷和水。除去有机底层并转移到另一管中，使用N2干燥。使用醛糖醇乙酸酯(Alditol Acetate)继续进行分析。
C.水解
将200μL 2M三氟乙酸(TFA)加入样品中。将装有样品的小瓶盖紧并在加热模块上于121℃孵育2小时。2小时后，将样品从加热模块取出并冷却至室温。然后将该样品用N2/空气干燥。加入200μL的IPA(异丙醇)并再次用N2/空气干燥。将此水解步骤(在121℃添加TFA持续2小时；用异丙醇洗涤)重复两次。
D.还原和乙酰化
在1M氢氧化铵中制备10mg/mL硼氘化钠溶液。将200μL的此溶液添加到样品中。然后将样品在室温下孵育至少一小时或过夜。与硼氘化钠溶液一起孵育后，将5滴冰醋酸添加到样品中，然后添加5滴甲醇。然后将样品干燥。将500μL的9：1MeOH：HOAc添加到样品中，然后干燥(重复两次)。然后将500μL MeOH添加到样品中，然后干燥(重复一次)。这在样品瓶侧面产生了硬皮白色残留物。
然后将250μL乙酸酐添加到样品瓶中，并将样品涡旋至溶解。向样品中加入230μL的浓TFA，并将样品在50℃孵育20分钟。将样品从热源移开并冷却至室温。加入约1mL异丙醇，并将样品干燥。然后，加入约200μL异丙醇，并再次干燥样品。然后将约1mL的0.2M碳酸钠添加到样品中并轻轻混合。最后将约2mL二氯甲烷添加到样品中，然后将其涡旋并短暂离心。丢弃水性顶层。加入1mL水并将样品涡旋并短暂离心。重复此步骤，然后除去有机层(底部)并转移到另一个小瓶中。使用N2/空气将样品浓缩至约100μL的最终体积。然后将1μL最终样品注入GC-MS。
GC温度程序SP2330用于GC-MS分析。初始温度为80℃，初始时间为2.0分钟。第一次升温速率为30℃/min，最终温度为170℃且最终时间为0.0分钟。第二次升温速率为4℃/min，最终温度为240℃且最终时间为20.0分钟。
结果
使用上述方法对通过实施例3中描述的方法生产的六批脱单体化寡糖组合物收集全甲基化数据。每批一式两份分析。下面表14中提供了与这六批脱单体化寡糖组合物中存在的基团相关的数据：
表14.全甲基化数据(通过实施例3中描述的方法生产的脱单体化寡糖组合物)
/>
实施例10.所选的寡糖组合物增加了离体粪便样品中SCFA的产生
评估了通过实施例3中描述的方法生产的包含多种选自式(I)的寡糖的所选的寡糖组合物增加健康受试者粪便悬浮液中短链脂肪酸(SCFA)产生的能力。
收集来自健康受试者的8个粪便样品，冷冻并储存在-80℃直至使用。将冷冻的粪便样品转移到厌氧室中，使其解冻并在补充有15％甘油的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中均质化至最终浓度为20％的固体。然后过滤20％的粪便浆液以去除大块碎片，等分，从厌氧室中取出并立即在干冰上冷冻，然后在-80℃储存。在实验当天，在厌氧室中将每种20％粪便浆液的一个1mL等分试样解冻并稀释到细菌生长培养基(补充有0.1％w/v胰蛋白酶蛋白胨和0.75mM尿素的梭菌基本培养基)中，最终浓度为1％。然后将1％的粪便浆液溶液分配到含有无菌水(阴性对照)或寡糖制剂(终浓度为0.5％)的96深孔板的孔中。每个样品制备三个重复。粪便微生物培养物在37℃厌氧培养45小时。
45小时培养期后，将含有粪便微生物培养物的96孔深孔板从厌氧室中取出并置于冰上。通过在4℃离心(3,000x g)10分钟使板沉降。收集粪便微生物群培养物上清液和沉淀物并储存在-80℃。将上清液样品解冻并通过具有火焰离子化检测器(GC-FID)的气相色谱进行分析，以量化粪便样品中产生的短链脂肪酸(乙酸、丙酸和丁酸)的浓度。
将粪便群落与所选的寡糖组合物一起孵育，导致受试粪便群落中总SCFA的中值产量约为5.1mM(与阴性对照相比增加4.6mM)(图1)。值得注意的是，所选的寡糖组合物增加了八个粪便群落中每个群落中的丁酸产生。
除丁酸外，所选的寡糖组合物还增加了这些粪便群落中乙酸和丙酸的产生。将粪便群落与所选的寡糖组合物孵育导致产生27.4mM总SCFA(即，乙酸、丙酸和丁酸的总和)(图2A)。相反，阴性对照导致仅产生5.6mM总SCFA。由所选的寡糖组合物引起的总SCFA产量的增加表明丁酸和丙酸的相对比例发生了变化。在与所选的寡糖组合物孵育的八个粪便群落中的四个中，产生的总SCFA的20％至40％是丁酸，而丙酸占总量的较小比例(图2B)。在其他四个粪便群落中，丙酸占产生的总SCFA的比例大于丁酸。
为了确定所选的寡糖组合物如何改变粪便群落的分类组成，对粪便微生物培养物颗粒进行16S rRNA扩增子测序。将培养物颗粒解冻并根据制造商的说明使用MagAttractPowerMicrobiome DNA/RNA试剂盒(Qiagen)进行基因组DNA(gDNA)提取。使用Quant-iTPicogreen dsDNA测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific)对gDNA进行定量，并归一化为1ng/μL。聚合酶链式反应(PCR)和测序是使用先前描述的修改方案进行的(Caporaso等人，2011年)。简而言之，使用靶向16S rRNA基因V4区的条形码引物扩增PCR产物。随后使用AMPure XP PCR纯化系统(Beckman Coulter)纯化PCR产物。纯化PCR产物，在1％琼脂糖凝胶上运行，用溴化乙锭染色，并成像以确保存在正确的扩增子。对纯化的PCR浓度进行定量(如上文针对gDNA所述)，归一化为4nM的浓度，并汇集以创建由5μL的每个扩增子组成的最终文库。如Caporaso等人，2011所述，使用MiSeq试剂盒v2(500个循环)在Illumina Miseq上进行16S rRNA测序。
在所测试的八个群落中的每一个群落中，与阴性对照相比，所选的寡糖组合物显著降低了致病有机体科肠杆菌科的相对丰度(图3A)。所选的寡糖组合物也显著增加了共生属副拟杆菌属和拟杆菌属的相对丰度(图3B)。
这些数据共同表明，所选的寡糖组合物稳健且一致地增加了总SCFA；并增加共生细菌(即副拟杆菌属和拟杆菌属)的量，同时减少致病有机体(即肠杆菌科)的量。
实施例11.评估所选的寡糖组合物在溃疡性结肠炎患者中的安全性和耐受性的人体试验
在溃疡性结肠炎(UC)患者中评估了通过实施例3-4、12和13中描述的方法生产的所选的寡糖组合物的安全性和耐受性。其他观察包括患者微生物群系的变化以及所选的生物标志物和健康评估。符合条件的患者(18-75岁)在接受口服美沙拉嗪和/或嘌呤类似物治疗时出现轻度至中度UC症状。
具有轻度至中度UC症状的10名患者被纳入研究。该研究由筛查期(14+2天)、治疗期(56+3天)和随访期(28+3天)组成，如图4中详述。
符合纳入和排除标准的患者有资格进入14天+2筛查期，其中收集血液和粪便样品，并完成3天的饮食日记。
纳入标准包括以下：
男性或女性,≥18岁且≤75岁
体重指数≥18.5且<45kg/m2
通过内窥镜检查确诊为UC(>1年)
筛查1周内出现轻度至中度UC症状，每天排便次数≥3次和<8次
根据主要研究者(PI)的判断，在筛查访视之前至少进行4周的UC症状学检查
如果患者正在服用治疗溃疡性结肠炎的药物，则在随机分组前2周内，他们保持稳定的药物治疗方案
排除标准包括：
克罗恩氏病或不确定疾病的可能或确诊诊断
由于IBD或其他病因，例如性传播感染、肛门外伤、沙门氏菌和/或志贺氏菌感染，局限于直肠的孤立性远端直肠炎的既往病史。
筛查前经过28天内的抗生素治疗
排除任何非UC相关的免疫抑制或自身免疫病症，或任何非UC相关的免疫抑制或自身免疫病症的治疗；全身性皮质类固醇>泼尼松10mg QD被排除
任何免疫抑制病症或使用除嘌呤类似物以外的免疫抑制药物治疗且未使用全身性皮质类固醇，如所定义
初始粪便钙卫蛋白<250μg/g的患者
安排患者进行基线(第1天)亲自访视以完成安全性评估。返回3天的饮食日记，并为患者抽血和收集粪便样品，以评估生化标志物和微生物群系组成。进行了简单临床结肠炎活动指数(SCCAI)综合评分和平均疲劳严重程度量表(FSS)。完成这些评估后，指导患者在监督下服用第一剂所选的寡糖组合物。然后患者出院并继续在家中每天两次口服所选的寡糖组合物，如下所述进行剂量递增。
患者在每次研究访视前一周完成了为期3天的饮食日记，并参加了筛查(第-14天+2天)、基线(第1天)、治疗结束(第56天)和随访(第84±2天)。记录任何不良反应的日志由患者每天在家中完成，并由现场工作人员在每次面对面、电话和虚拟访视时进行审查。
在第30天(±2天)，与患者面谈以确认研究依从性并评估健康状况或治疗中出现的不良反应(TEAE)的任何变化，并进行了SCCAI。
在治疗的最后一天(第56天；摄入期结束)，患者返回3天的饮食日记并审查TEAE日志；收集了粪便样品和血液；进行SCCAI和FSS，然后患者进入28天的随访期。在随访期间，患者完成了3天的饮食日记和TEAE日志。粪便样品是在随访期结束时收集，以评估生化标志物和微生物群系组成的变化。
第84天后，受试者完成了主要研究。8周后联系完成至第84天的患者，以完成UC扩展问卷、SCCAI并提供粪便和血液样品(如果可行，收集血液样品)以评估研究产品摄入后3个月停用所选的寡糖组合物对炎症的生物标志物和微生物群系结构和功能的影响。
在第14天和第44天(±3天)，患者接到电话以审查研究依从性并评估健康状况或TEAE的任何变化。
根据以下给药方案，在至少120mL水中重构后，患者口服所选的寡糖组合物以进行每次给药，每天两次：
阶段1(第1-7天) 消耗20g(即，10g，每日每次)
阶段2(第8-14天) 消耗40g(即，20g，每日每次)
阶段3(第15-55天) 消耗80g(即，40g，每日每次)
阶段3(第56天) 消耗40g(仅早晨剂量)
根据以下确定安全性和耐受性：
经历任何治疗中出现的不良事件(TEAE)，包括因果关系、严重程度和严重性评估的患者人数
耐受性：与治疗相关的不良事件(AE)和因AE导致的停药
在以下中与基线相比的变化：
ο生命体征
ο安全性实验室分析
身体检查
探索性终点参数包括：
通过核酸测序测量到研究治疗结束时，α多样性、分类学和细菌丰度(包括肠杆菌科相对于总数和每克粪便)相对于基线的变化
粪便和血液中炎症的生化和其他生物标志物从基线到摄入期结束的变化
与在受试者中磨合(run-in)和摄入结束之间观察到的相比较，在使用离体培养系统将临床导入样品与所选的寡糖组合物孵育后，细菌分类群相对丰度的测量(即，肠道微生物群系组成)。
简单临床结肠炎活动指数(SCCAI)综合评分从基线到摄入期结束的变化
平均疲劳严重程度量表(FSS)评分从基线到摄入期结束的变化
疲劳患者(定义为平均FSS评分≥4)到摄入期结束时在平均FSS评分中的比例
疲劳患者(定义为平均FSS评分≥4)到随访期结束时在平均FSS评分中的比例
医疗保健利用，例如住院治疗、针对UC对医疗保健专业人员的非常规访视结果
结果
使用EliA Calprotectin 2测试(Phadia Laboratory Systems)测量在筛查时和摄入期结束时从患者收集的粪便样品中的钙卫蛋白。在研究中检查的10名参与者中，粪便钙卫蛋白的浓度从筛查到摄入结束下降了68.7％的中值(图15A)。十名参与者中有七名的粪便钙卫蛋白减少了至少50％。表18提供了每个参与者在初始筛查时(在施用所选的寡糖组合物之前)、摄入结束时(在施用所选的寡糖组合物之后)的粪便钙卫蛋白水平(μg/g粪便)，并且包括百分比变化。
表18.每个参与者的粪便钙卫蛋白(μg/g粪便)
钙卫蛋白是一种蛋白质，存在于参与对病原体的免疫反应的细胞，例如嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞(Gaya等人，2002，Q J Med；Roseth等人，2004，Scand JGastroenterol)中。它可占嗜中性粒细胞胞质蛋白的60％之多。在肠道炎症期间，嗜中性粒细胞通过肠上皮迁移到肠腔，导致粪便中钙卫蛋白的量增加(Masoodi等人，Ger MedSci.2011年2月16日；9：Doc03.)。粪便钙卫蛋白的水平与肠腔中嗜中性粒细胞的数量相关，并且在炎症性肠病(IBD)，例如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎中升高(Konikoff M.R.，Inflamm Bowel Dis.2006年六月；12(6):524-34)。
还在筛查(摄入前)和摄入期结束时从患者收集的粪便样品中测量了另外两种肠道炎症的蛋白质生物标志物。使用ELISA测定法(BioVendor)测量粪便乳铁蛋白和脂质运载蛋白。从筛查到摄入结束，粪便乳铁蛋白浓度在六个测试的参与者中降低了69.2％的中值(图15B)。六名参与者中有五名的粪便乳铁蛋白浓度降低了至少50％。粪便乳铁蛋白已被证明是IBD疾病活动的特异性和选择性生物标志物(Dai等人，Scand J Gastroenterol.，第42卷，2007年-第12期，第1440-1444页，2007年)。
粪便脂质运载蛋白浓度呈水平下降趋势，六名参与者中的三名下降。
炎症的粪便生物标志物的这些减少表明由于向患有溃疡性结肠炎的患者施用所选的寡糖组合物而引起局部肠道炎症减少，表明本文所述的所选的寡糖组合物可用于治疗患有炎症性疾病例如炎症性肠病，包括UC的患者。
在摄入期之前和结束时，还使用简单临床结肠炎活动指数(SCCAI)对研究参与者的疾病活动进行了评估。使用该测量评估的八名参与者中有五名SCCAI下降(图16)。
还在五名研究参与者的血浆样品中测量了炎症的另外的蛋白质生物标志物。这些生物标志物包括高敏C反应蛋白(hsCRP)、钙卫蛋白、脂质运载蛋白和LPS结合蛋白(LBP)。肠道上皮完整性的生物标志物，肠道脂肪酸结合蛋白(I-FABP)也在血浆样品中进行了测量。在摄入期后观察到这些血浆生物标志物的微小变化。然而，摄入前每种生物标志物的水平通常较低，并且在健康受试者的预期范围内。
在血浆样品中测量了一组作为全身炎症的生物标志物的细胞因子。该组包括TNFα、IL-1β、IL-6、IL-12、IFNγ、IL-2、IL-4、IL-13、IL-8和IL-10。仅观察到这些细胞因子的微小变化。这些细胞因子的水平在摄入时通常很低，并且在健康受试者的预期范围内。
在筛查和摄入期结束时，对五名患者进行了副拟杆菌属(共生分类群成员)和肠杆菌科(致病有机体分类群成员)的宏基因组相对丰度检查。在用所选的寡糖组合物治疗后，五名患者中有四名患者的副拟杆菌属相对丰度增加(图17A)，肠杆菌科的相对丰度在所有五名参与者中均降低(图17B)，其在收集自受试者的粪便样品中评估。这些数据证明所选的寡糖组合物能够改变患有溃疡性结肠炎的人类患者的肠道微生物群系。具体而言，这些数据表明，在患有溃疡性结肠炎的人类患者中，所选的寡糖组合物增加了共生分类群(例如，副拟杆菌属)相对于致病有机体(例如，肠杆菌科)的丰度。
宏基因组学也被用来证明施用所选的寡糖会导致粘附侵入性大肠杆菌致病有机体减少。为了鉴定与粘附侵入性大肠杆菌相关的毒力特征，基于泛基因组的系统基因组分析(PanPhlAn)用于量化大肠杆菌基因的泛基因组，其使用90％氨基酸同一性基因簇的泛基因组参考。基因参考的丰度被聚合到KEGG KO基因家族分类水平。该分析表明，与粘附侵入性大肠杆菌分离株(fimH、ompA和ompC)相关的三个基因注释在摄取所选的寡糖组合物后减少。这些数据表明，所选的寡糖组合物能够减少患有溃疡性结肠炎的人类患者肠道微生物群系中粘附侵入性大肠杆菌的丰度。这很重要，因为粘附侵入性大肠杆菌与溃疡性结肠炎的发病机制有关。
数据表明所选的寡糖能够影响炎症性疾病如炎症性肠病，例如UC和CD中涉及的几种途径/机制(参见例如图9)。数据表明，所选的寡糖(a)增加了SCFA(例如，丁酸)(图1、2、10和19)，(b)增加了共生菌(例如，副拟杆菌属)的丰度并降低了致病菌(例如，肠杆菌科)(图3、12、13、14和17)和大肠杆菌(图18)的丰度，(c)减少肠道炎症(例如，粪便钙卫蛋白和乳铁蛋白)(图15)，和(d)提高生活质量(QoL，例如SCCAI评分)(图16)。总的来说，数据表明本文所述的所选的寡糖组合物可用于治疗表现出炎症性疾病例如炎症性肠病例如UC和CD的患者。
实施例12.使用可溶性酸催化剂从半乳糖生产25kg规模的所选的寡糖组合物
开发了用于以25千克规模合成如实施例1中所述的所选的寡糖组合物的程序。将25kg的无水半乳糖、0.38kg的柠檬酸无水酸催化剂和6.5kg的水添加到配备有蒸馏冷凝器单元的反应容器(油夹套的50L连续搅拌釜反应器(CSTR))中。内容物以大约120rpm搅拌，容器温度在2-4.0小时内升高至大气压力下的大约130℃。将混合物在该温度再保持3-5小时，之后停止加热并开始急速冷却程序。冷却30分钟后，将6L预热水(淬灭水)以500mL/min的速率快速添加到反应混合物中。一旦加入所有淬灭水，就允许反应器内容物混合直至完全溶解并冷却至等于或低于55℃的内部温度。将反应混合物从容器排出，产生大约45-50kg的粗寡糖水溶液(大约47-55wt％)。
通过流过0.45微米过滤器纯化寡糖组合物以获得大约45-50kg的过滤组合物。
实施例13.使用可溶性酸催化剂从半乳糖生产500kg规模的所选的寡糖组合物
开发了用于以500千克(2000L)规模合成如实施例1中所述的所选的寡糖组合物的程序。首先将125kg水加入干净的玻璃衬里的2000L连续搅拌釜反应器中。以大约60rpm的速度搅拌水，并将反应器的夹套加热至85℃。然后将500kg无水半乳糖和7.5kg柠檬酸无水酸催化剂加入到反应器中。
内容物以约60rpm的速度搅拌，容器温度在2-4.0小时内增加至大气压力下的约130℃。将混合物在该温度再保持至少5小时，之后停止加热并开始冷却程序以在数小时内将内容物的温度降低至25℃或更低。降低反应器夹套的温度，并在大约十分钟内将大约190kg热水(65℃)添加到反应器的内容物中。然后进一步降低反应器夹套的温度，向反应器内容物中加入额外的约310kg室温水，并使内容物冷却至室温。
随后通过流过0.45微米过滤器纯化寡糖组合物。
实施例14.喷雾干燥程序
将如实施例13中生产的各批次所选的寡糖组合物喷雾干燥。配备旋转雾化器的SPX Anhydro MicraSpray 400仪器的腔室被惰性化，使腔室内的氧气浓度至<1％。开始干燥气流并将其设置为440kg/hr。一旦干燥气流稳定，将喷雾干燥仪器设置为以下设定值：(i)喷雾干燥器压力设定值＝1050mbar；(ii)喷雾干燥室表面加热器＝60℃；(iii)再循环风扇预热器＝20℃；(iv)蒸汽加热器入口＝90℃；(v)旋转雾化器速度＝25000RPM；(vi)旋风表层加热器(Cyclone skin heater)＝90℃；和(vii)袋式除尘器表面加热器＝40℃。一旦上述喷雾干燥器工艺参数稳定，打开空白溶液(纯化水)并将其设置为7.5kg/hr，并将蒸汽加热器入口温度升高至145℃。
在喷雾干燥器出口温度稳定到90℃左右后，将溶剂进料从空白溶液(纯化水)更改为进料溶液(所选的寡糖组合物)，并将进料速率调整为15.0kg/hr。喷雾干燥的寡糖组合物在通过仪器干燥时收集在800L锥形容器中。
实施例15.使用Bruker NMR机器对大规模批次的所选的寡糖组合物进行HSQC NMR分析
根据实施例8中描述的HSQC NMR方法，使用Bruker NMR机器获得并使用来自Mestrelab Research的MNova软件包分析实施例1中描述的，并如实施例12和13中所述生产的所选的寡糖组合物的样品的HSQC NMR谱测定。
结果
对根据实施例12中描述的方法生产的单批次所选的寡糖组合物(25kg半乳糖；50L规模)和根据实施例13中描述的方法生产的四批次所选的寡糖组合物(500kg半乳糖；2000L规模)(具有12.7(±0.4)的平均DP)使用实施例8中描述的HSQC NMR方法进行分析。在HSQCNMR分析之前，使用实施例5中描述的乙醇沉淀程序对样品进行脱单体化。
确定了所选的寡糖组合物的分析批次的NMR谱图收集的每个峰的相对大小(即，使用具有椭圆形状的表9的预限定积分区域的峰/信号1-11的积分；本文中称为曲线下面积(AUC))，如下表15所示：
表15.HSQC NMR数据(使用实施例12和13中描述的过程生产的批次)
所选的寡糖组合物(使用实施例12和13中描述的过程生产)的大规模批次的这些HSQC NMR数据使用预限定的积分区域提供了如对于使用实施例2-4中描述的方法生产的所选的寡糖组合物批次所表明的基本相似的峰/信号1-11的相对积分。因此，这些数据表明，大规模(例如，500kg半乳糖；2000L规模)生产所选的寡糖组合物不会显著改变所选的寡糖组合物的化学性质。
上面分析的2000L批次之一(2000L批次#1)进一步进行实施例14中描述的喷雾干燥程序。在喷雾干燥程序之后，通过将30mg喷雾干燥组合物(在使用实施例5中描述的乙醇沉淀程序脱单体化后)溶解在300μL的D2O中，其中含有0.1％丙酮作为内标，制备喷雾干燥组合物样品用于HSQC NMR分析。然后将溶液放入3mm NMR管中并使用实施例8中描述的HSQCNMR方法。确定了所选的寡糖组合物的分析批次的NMR谱图收集的每个峰的相对大小(即,使用具有椭圆形状的表9的预限定积分区域的峰/信号1-11的积分；在本文称为曲线下面积(AUC))，并与喷雾干燥前2000L批次#1的NMR谱图进行比较，如下表16所示:
表16.HSQC NMR数据(喷雾干燥前和后)
喷雾干燥前后2000L批次#1的HSQC NMR谱图彼此基本相似，每个峰的相对大小只有微小变化(即,使用具有椭圆形状的表9的预限定积分区域的峰/信号1-11的积分；在本文称为曲线下面积(AUC))。因此，这些HSQC NMR数据表明，喷雾干燥对HSQC NMR谱图和所选寡糖组合物的化学性质几乎没有影响。
实施例16.使用全甲基化分析测定大规模批次的所选的寡糖组合物的糖苷键分布
根据实施例9中描述的方法，使用全甲基化分析对实施例1中描述的并如实施例12和13中所述生产的所选的寡糖组合物的样品的糖苷键分布进行测定。在全甲基化分析之前将样品脱单体化。根据实施例12中描述的方法生产的单批次所选的寡糖组合物(25kg半乳糖；50L规模)和根据实施例13中描述的方法生产的四批次所选的寡糖组合物(500kg半乳糖；2000L规模)(具有12.7(±0.4)的平均DP)在本实施例中进行了测试。
结果
收集全甲基化数据，并用三个技术重复(technical replicates)分析每批次。下表17中提供了与这些批次的脱单体化寡糖组合物中存在的基团相关的三个技术重复中的平均数据以及标准偏差(std.dev.)：
表17.全甲基化数据(通过实施例12和13中描述的方法生产的脱单体化寡糖组合物)
/>
/>
实施例17.所选的寡糖组合物谱图中HSQC NMR峰/信号的分配
实施例1中描述的和如实施例12和13中所述生产的所选的寡糖组合物的HSQC NMR谱图的测定根据下面描述的方案，使用Bruker NMR机器进行，以便将特定峰/信号分配为注释为属于所选的寡糖组合物中存在的离散键类型。
方法
样品制备：
将30mg先前冻干的寡糖组合物固体样品溶解在300μL D2O中，其中含有0.1％丙酮作为内标。然后将溶液放入3mm NMR管中。
NMR实验：
每个样品都在以600MHz运行，配备了具有1H/19F、13C、15N、31P的CP QCI探头的Bruker NMR中进行了分析。
使用以下脉冲序列图，使用PEP和反演、重新聚焦和匹配的扫掠绝热脉冲(sweepadiabatic pulses)，对每个样品进行相位敏感、多重编辑梯度增强的1H-13C异核单量子相干(HSQC)实验，其中梯度以back-inept：
脉冲序列图
采集参数
1H载波频率＝600.13MHz
13C载波频率＝150.91MHz
脉冲序列＝hsqcedetgpsisp2.3
采集维度中的点数＝2048
采集维度中的频谱范围＝6.75ppm至0.25ppm
间接维度中的点数＝512
间接维度中的频谱范围＝120ppm至0ppm
循环延迟＝1.5秒
单键1H-13C耦合常数＝JCH＝145Hz
扫描次数＝8
温度＝298-299K
溶剂＝D2O
处理参数
直接维度的窗函数＝Qsine 2
间接维度的窗函数＝Qsine 2
处理＝直接维度中的2048个复杂点，间接维度中的2048个复杂点
前向线性预测＝32个系数，512个预测点
谱图分析和结果
使用来自Mestrelab Research(Santiago de Compostela,Spain)的MNova软件包分析所得谱图。谱图参照内部丙酮信号(1H-2.22ppm；13C-30.8ppm)并在F2和F1维度上使用Regions2D方法定相。在F2和F1维度中都应用了使用90度偏移正弦的变迹。属于所选的寡糖中存在的离散键类型的峰/信号的分配基于诸如“1H NMR结构-报告基团概念”(Leeuwen等人，Carbohydrate Research 343(2008),1114-1119)、文献化学位移、H2BC和HMBC相关性的策略。分析中使用的二聚体包括(Carbosynth,Inc)：Galp-b(1-2)-Galp、Galp-a(1-2)-Galp、Galp-a(1-3)-Galp、Galp-b(1-3)-Galp、Galp-b(1-4)-Galp、Galp-a(1-4)-Galp、Galp-b(1-6)-Galp和Galp-a(1-6)-Galp。将连接键丰度与全甲基化数据进行比较，并与文献值和其他寡糖组合物进行交叉参考。赋值(Assignments)在图7A-7B中提供。
实施例18.所选的寡糖组合物的稳定性
所选的寡糖组合物的稳定性通过将所选的寡糖组合物在升高的温度孵育一段时间来评估。在带油套的250mL反应器中将150mL等分试样的所选的寡糖组合物(50％w:v)置于目标温度(70℃、80℃、90℃或100℃)，然后在6小时内定期采样(t0＝达到目标温度的点)。使用实施例6中描述的方法在SEC上运行样品以确定不同时间点的Mw、Mn和DP2+百分比。图8显示了所选的寡糖组合物样品在孵育终点(即时间＝6小时)的Mw、Mn和DP2+百分比。所选的寡糖组合物的结构完整性在有水存在的情况下长时间(即6小时)暴露于70℃和80℃的温度受到的影响极小。然而，在存在水的情况下暴露于较高温度可导致水解并缩短包含在所选的寡糖组合物中的寡糖的平均长度，如通过Mw、Mn和％DP2+测量的。
这表明所选的寡糖组合物的化学结构受70℃和80℃高温长时间保持(即6小时)的影响极小。此外，这些数据表明，在生产所选的寡糖组合物(例如，大规模生产，例如，使用实施例12和13)后，考虑到这些数据，应及时进行后处理步骤(例如，淬灭)，以便保持所选的寡糖组合物的结构完整性。例如，根据该实施例，为了冷却所选的寡糖组合物，在产生所选的寡糖组合物之后反应混合物的淬灭应该及时进行。
实施例19.所选的寡糖组合物增加离体培养系统中健康受试者粪便样品中SCFA的产生。
来自10名健康受试者的粪便样品在梭菌基本培养基(Theriot等人，2014年，Nature Communications)中，补充有0.75mM尿素和0.1％(w/v)胰蛋白酶蛋白胨，不含(阴性对照)或含有最终浓度为0.5％(w/v)的所选的寡糖组合物，在37℃进行厌氧培养45小时。每个粪便样品孵育都用三个生物学重复进行。孵育后，通过离心沉淀样品并收集培养物上清液。使用具有火焰离子化检测的气相色谱(GC-FID)对培养上清液中的SCFA浓度进行量化。
跨样品重复的平均SCFA值包括在箱须图(box-whisker plots)中，并且使用双尾配对t检验确定p值(图10)。与阴性对照的15.2mM相比，所选的寡糖组合物将10个粪便样品中SCFA的产生增加到47.0mM的中值浓度。此外，在测试的10个粪便样品中的每一个中所选的寡糖组合物增加了三种SCFA(即，乙酸、丙酸和丁酸)的每一种。用所选的寡糖组合物孵育产生的中值为27.8mM的乙酸、15.0mM的丙酸和6.1mM的丁酸，而阴性对照(水)的中值为10.0mM的乙酸、3.1mM的丙酸和2.1mM的丁酸。
还使用Quant-iT pricoGeen dsDNA测定试剂盒(Invitrogen)测定基因组DNA浓度。使用靶向细菌16S rRNA基因的寡核苷酸引物对基因组DNA进行定量PCR。提取的基因组DNA浓度和每单位体积培养物中16S rRNA基因的拷贝数是每种培养物中细菌丰度的测量值。与所选的寡糖组合物孵育的粪便样品的中位基因组DNA浓度为30.2ng/μL，而阴性对照为2.7ng/μL。类似地，与所选的寡糖组合物孵育的粪便样品的中位16S rRNA基因拷贝数为1.1x 108拷贝/μL，而阴性对照为2.2x 107拷贝/μL。所选的寡糖组合物与阴性对照之间的基因组DNA浓度和16S rRNA基因拷贝的差异具有统计学显著性，其通过双尾配对t检验确定(p值<0.0001)。
这些结果表明，所选的寡糖组合物被来自不同健康受试者的粪便微生物群持续发酵(消耗)。这种发酵产生了平衡的SCFA生产概况，表明所选的寡糖组合物支持多种产生SCFA，例如乙酸、丙酸和丁酸的共生肠道细菌的稳健生长和代谢。
实施例20.在离体培养系统中所选的寡糖组合物调节健康受试者粪便样品中的粪便微生物群系
为了了解与所选的寡糖组合物孵育所产生的分类组成的变化，粪便微生物群系通过鸟枪法宏基因组测序(shotgun metagenomic sequencing)(Diversigen，美国明尼苏达州)进行了表征。在Illumina NextSeq平台上测序之前，使用NexteraXT套件制备鸟枪法宏基因组测序文库，每个文库至少有1000万个读数。来自鸟枪法宏基因组测序数据的分类计数表由SHOGUN管道使用数据库生成，该数据库包括RefSeq v87中每个物种的前20个菌株。Bray-Curtis差异是在所有样品之间的属级分类表上计算的。在非度量多维尺度(NMDS)排序图中，与所选的寡糖组合物一起孵育的粪便样品形成一个簇，代表与对照样品不同的微生物群系组成(图11)。这被量化为0.53的平均Bray-Curtis位移(标准偏差为0.06)，相对对照中(平均值为0.35，标准偏差为0.075)和用所选的寡糖组合物孵育的样品中(平均值为0.299，标准偏差为0.123)更连贯的簇(coherent cluster)，95％置信区间。这些数据表明，即使在具有不一致的输入微生物群系组成概况(例如，在施用所选的寡糖组合物之前)的受试者或样品中孵育，所选的寡糖组合物也可能产生一致的微生物群系组成概况。
实施例21.在与所选的寡糖组合物孵育后所选的寡糖组合物在个体粪便样品中产生分类变化。
为了识别通过与所选的寡糖组合物孵育而被调节(例如，相对或绝对丰度增加或减少)的属和种，对微生物群系属和物种分类群表进行过滤，以获得所选择的寡糖组合物相对于对照的平均0.1％和log2倍的孵育率。这产生了一组在健康受试者中持续富集的共生分类群(例如副拟杆菌属、Eisenbergiella)，和一组持续消耗的致病有机体(例如埃希氏菌属、克雷伯菌属、志贺氏菌属、柠檬酸杆菌属)(图12)。尽管微生物群系组成存在天然差异，但所选的寡糖组合物能够选择性且持续地富集一组共生细菌并持续消耗致病有机体。具体而言，所选的寡糖组合物富集了属于副拟杆菌属的分类群。副拟杆菌属在10个健康受试者的粪便样品中的中值相对丰度从阴性对照(水)的0.2％增加到所选的寡糖组合物的40.4％(图13A)。副拟杆菌属属于拟杆菌门，其由编码广泛的聚糖利用系统的细菌组成，通常产生丙酸作为聚糖发酵的副产物(Reichardt等人，The ISME Journal，第8卷，第1323-1335页(2014))。副拟杆菌属也显示与粪便微生物群移植后UC患者的缓解相关(Paramsothy等人，Lancet.2017年3月25日；389(10075)：1218-1228.)。除了副拟杆菌属的成员外，所选的寡糖组合物还富集厚壁菌门的特定分类群。所选的寡糖组合物增加了Eisenbergiella和Fusicatenibacter属的相对丰度，这两个属都属于毛螺菌科。该科包含许多产生丁酸作为聚糖发酵副产物的物种，包括Eisenbergiella tayi(其通过所选的寡糖组合物富集)。所选的寡糖组合物还富集了毛螺菌科中的两个未分类物种，以及优杆菌属中的一个未分类物种。
这些富集是值得注意的，因为与健康的非IBD对照相比，拟杆菌门和毛螺菌科的成员在IBD患者的粪便样品中被消耗(Frank等人，PNAS 2007年8月21日104(34)13780-13785)。此外，这些细菌群产生的丁酸和丙酸为结肠上皮细胞提供能量来源，支持上皮完整性和功能，并调节肠道免疫反应以减少结肠炎(Pryde等人，FEMS Microbiol Lett.2002年12月17日；217(2)：133-9；Smith等人，SCIENCE，2013年2月1日，第339卷，第6119期，第548-554页)、Arpaia等人，Nature.2013年12月19日；504(7480)：451-5.doi:10.1038/naturel2726.电子版2013年11月13日)。具体而言，所选的寡糖组合物消耗了属于肠杆菌科的分类群，已知该分类群含有多种病原有机体分类群。十个粪便样品中肠杆菌科的中值相对丰度从阴性对照(水)的38.2％下降到所选的寡糖组合物的10.8％(图13B)。所选的寡糖组合物还降低了肠杆菌科中几个属，例如埃希氏菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属和柠檬酸杆菌属的相对丰度。这些数据表明，所选的寡糖组合物可以消耗属于肠杆菌科的许多不同的致病有机体分类群，肠杆菌科是在患者中与溃疡性结肠炎患者疾病相关的分类群(Caruso等人，Nat Rev Immunol.2020年7月；20(7)：411-426.doi:10.1038/s41577-019-0268-7.)。
实施例22.所选的寡糖组合物选择性地支持单一培养中共生细菌的生长和丰度，而不支持致病有机体的生长。
在粪便样品离体孵育后观察到的分类群富集和消耗表明，某些共生细菌具有利用所选的寡糖组合物作为生长底物的能力，而致病有机体则缺乏这种能力。所选的共生和致病有机体物种在不含(阴性对照)或含0.5％w/v所选的寡糖组合物或含葡萄糖(阳性对照)的培养基中厌氧培养。使用BioTek Powerwave分光光度计每15分钟测量一次每种培养物的光密度，持续24-48小时。每种培养物都用三个生物学重复进行。平均最大光密度值在培养重复中确定并包含在条形图中。发现相对于阴性对照，所选的寡糖组合物支持两种不同副拟杆菌属物种(粪副拟杆菌和狄氏副拟杆菌)的强劲生长，表明这些物种能够利用所选的寡糖组合物进行发酵(图14A)。相对于阴性对照，所选的寡糖组合物还支持三种不同拟杆菌属物种(单形拟杆菌、多形拟杆菌和粪便拟杆菌)的生长水平，表明这些物种也能够使用所选的寡糖组合物作为生长底物。相反，相对于阴性对照，致病有机体物种大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、暗沟肠杆菌和肠道沙门氏菌未观察到生长(图14B)。
测试了大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的五种不同菌株，以及暗沟肠杆菌的三种不同菌株。测试了每个其他物种的一个菌株。致病有机体条形图中显示的各个点代表测试物种的各个菌株的平均值。
这些数据表明，副拟杆菌属和拟杆菌属中的共生细菌能够利用所选的寡糖组合物作为生长底物，但肠杆菌科中的致病有机体物种缺乏这种能力。与离体宏基因组测序数据一起，这些单一培养数据表明所选的寡糖组合物可以选择性地支持共生肠道细菌的生长，并赋予它们优于定植于溃疡性结肠炎患者肠道的致病有机体的生态优势。
实施例23.美沙拉嗪不影响所选的寡糖组合物的离体发酵。
5-氨基水杨酸(5-ASA)，例如美沙拉嗪，是治疗轻度至中度溃疡性结肠炎患者的标准护理化合物。确定了所选的寡糖组合物在美沙拉嗪存在下支持微生物分类群生长的能力。来自10名健康受试者的粪便样品在不含(阴性对照)或含有所选的寡糖组合物的补充梭菌基本培养基中进行厌氧培养。具有所选的寡糖组合物的样品也与0.0、0.5、2、8、32、125或500μM美沙拉嗪一起孵育。每个粪便样品孵育都用三个生物学重复进行。孵育后，通过离心沉淀样品并收集培养物上清液用于通过GC-FID进行SCFA定量。
如前所述，与阴性对照(水)相比，与所选的寡糖组合物一起孵育会增加总SCFA以及乙酸、丁酸和丙酸中每一种的浓度。重要的是，与美沙拉嗪一起孵育的样品均未显示在所选的寡糖组合物的SCFA产生方面有任何显著差异。
为了解美沙拉嗪是否影响理解与所选的寡糖组合物孵育所产生的分类学组成的变化，粪便样品通过16S rRNA扩增子测序进行表征。使用DNeasy PowerSoil提取板(Qiagen)从粪便样品中提取基因组DNA，并使用Quant-iT PicoGreen dsDNA测定(Invitrogen)进行定量。使用515F/806R引物组通过PCR扩增制备16S rRNA文库，然后在Illumina NextSeq平台上测序至至少25,000个读数。16S rRNA基因的序列通过原始序列的UNOISE聚类和去噪分析，然后进行DADA2/RDP分类调用。使用与所选的寡糖组合物和没有美沙拉嗪一起孵育的样品的Bray-Curtis差异对来自十个粪便样品的样品的16S rRNA测序进行了比较。测试的所有5-ASA浓度均具有类似于重复测序差异性(0.06(S.D.0.03))的平均Bray-Curtis差异(0.06(S.D.0.02))，表明美沙拉嗪的存在对所选的寡糖组合物对粪便微生物群系成分的影响非常低。作为比较，与所选的寡糖组合物一起孵育但没有美沙拉嗪的样品内的变异为0.31(S.D.0.05)，与阴性对照的差异为0.46(S.D.0.03))。总之，这些结果表明美沙拉嗪不干扰来自健康受试者的粪便样品中所选的寡糖组合物的离体发酵。
实施例24.评估所选的寡糖组合物治疗溃疡性结肠炎疾病患者能力的临床试验
在2A期、随机化、双盲、对照、多中心研究中评价了由实施例3-4、12和13中所述的方法产生的所选的寡糖组合物治疗溃疡性结肠炎(UC)患者的能力，以评估所选的寡糖组合物在患有轻度至中度活动性溃疡性结肠炎的参与者中的安全性和有效性。UC活动由3至7的改良Mayo评分(MMS)(包括MMS为3至4为轻度和5至7为中度)确定。除非EMS为2，否则MMS 3至4(轻度)的参与者的招募限制在总研究群体的大约30％。随机化前需要大于或等于170μg/g的粪便钙卫蛋白(FC)水平。最多可招募90名参与者。
该研究分两个阶段进行。筛查期完成后，随机分配到阶段1的参与者在前2周内以剂量递增的方式接受高剂量的所选的寡糖组合物或对照，以在剩余的8周内达到最大剂量。计划在～45名参与者完成第1阶段的治疗后进行中期分析(IA)。第1阶段招募完成后，第2阶段招募立即开始。IA的结果决定是否继续招募全部90名参与者，或者研究是否停止。在第2阶段随机分配的参与者在前2周内以剂量递增的方式接受低剂量的所选的寡糖组合物或对照，以在剩余的8周内达到最大剂量。
筛查期：图20提供了研究设计的概述。参与者在第-28天到第0天签署知情同意书并完成筛查评估。要求参与者提供第一个早晨粪便样品，用于评估粪便钙卫蛋白、粪便代谢物和微生物群系。收集血样作为基线实验室评估。参与者将记录每天的大便频率和直肠出血。执行内窥镜检查以集中读取内窥镜Mayo子评分(EMS)并记录修正的和总Mayo评分(MMS/TMS)。每个MMS为3到7的合格参与者被随机分配到试验中。在符合随机化条件的参与者中也可以获得组织学的中央读数。允许参与者在不超过28天的时间内完成筛查期。
治疗期：在第1天，参与者抽血进行血清学生物标志物评估，并收集第一个早晨的FC粪便样品。参与者被指示使用电子日记完成IBDQ和2分量Mayo评分(即，大便频率子评分和直肠出血子评分)。参与者被随机分配并在监督下在现场服用第一剂研究药物，然后在家中每天两次(BID)继续自行口服研究药物，持续10周。治疗期间后续访视的研究评估将包括Mayo评分(在基线和治疗结束时进行医生的全面评估)、IBDQ、用于实验室分析的血样采集以及第一个早晨FC粪便样品采集和微生物群系粪便样品采集。在EOT访视时或EOT前1周内进行内镜检查以获取EMS和组织学的中央读数。提前退出研究的参与者不会被替换。
所选的寡糖组合物以粉末(9g小袋)的形式提供，用于在120mL水中重构，根据以下滴定时间表口服：
第1阶段：
高剂量的所选的寡糖组合物(升级至36g BID)
第1至7天：所选的寡糖组合物以9g BID给药
第8至14天：所选的寡糖组合物以18g BID给药
第15至70天：所选的寡糖组合物以36g BID给药
第2阶段：
低剂量的所选的寡糖组合物(升级至18g BID)
第1至7天：所选的寡糖组合物以9g BID给药
第8至70天：所选的寡糖组合物以18g BID给药
随访访视：EOT访视两周后，该访视前5天共采集3次早晨粪便样品；访视时采集血样用于血清学生物标志物评估。
纳入标准包括以下内容：
男性或女性，在随机时≥18岁且≤75岁，在筛查前患有UC至少3个月
愿意并能够提供知情同意。
体重指数≥17且<40kg/m2。
患有轻度至中度UC，如通过改良Mayo评分(MMS)为3至7，EMS为1或2，出血Mayo评分(BMS)>1所证明。将EMS限制在1至30％，将MMS限制在3或4至30％，除非EMS为2。
在随机分组前28天内进行内窥镜筛查。
筛查前的UC药物治疗
如果目前未接受UC药物治疗：筛查前28天未服用任何UC药物。
如果目前正在接受UC药物治疗：在筛查前28天采用稳定的UC
药物治疗方案。UC方案不能包括每天>9mg的布地奈德或每天>10
mg的泼尼松(或等效的皮质类固醇)。参见排他性药物的完整列表。
参与者必须愿意在研究期间继续服用任何现有补充剂和维生素的相同方案。
粪便钙卫蛋白>170μg/g(在筛查V1时确定)。
排除标准包括以下内容：
克罗恩氏病、不确定疾病或显微镜下结肠炎的病史。
与其他病因相关的炎症性肠病，例如性传播感染、肛门外伤、沙门氏菌和/或志贺氏菌感染。
UC的病史仅限于肛缘以上15cm。
筛查前30天内已知的粪便测试对虫卵和/或寄生虫或致病性粪便培养物呈阳性。
参与者必须对艰难梭菌具有PCR粪便检测阴性。PCR检测呈阳性的参与者可以使用粪便培养进行一次重新检测。
患有已知活动性COVID-19感染或可能干扰试验的并发症的参与者
在筛查V1之前的24周内进行过与肠道相关的重大腹腔内手术和/或研究期间计划的侵入性手术/住院/程序(包括研究期间计划的下位内窥镜检查)。
患有已知或疑似中毒性巨结肠或小肠细菌过度生长的参与者
有憩室炎、胃旁路术、结肠造口术、结肠切除术、回肠袋肛管吻合术(IPAA)或既往肠道手术史的参与者。接受过微创手术(如胆囊切除术或阑尾切除术)的参与者可由首席研究员(PI)酌情决定是否入组。
筛查前24周内使用的生物制剂或小分子(例如，英夫利昔单抗、阿达木单抗、戈利木单抗、赛妥珠单抗、维多珠单抗、优特克单抗、那他珠单抗、Janus激酶/信号转导剂和转录激活剂[Jak-Stat]抑制剂，以及鞘氨醇-1-磷酸[SIP]激动剂)。
在筛查访视之前无法停止类固醇灌肠剂或栓剂或美沙拉嗪灌肠剂或栓剂。
在筛查前的最后24周内接受了粪便微生物群移植(FMT)。
已知对含有对照成分(赤藓糖醇)或所选的寡糖组合物成分(例如半乳糖)的食品过敏或不耐受；例如，患有半乳糖血症的参与者。
筛查前7天内使用过任何止泻药。未通过此入组标准的参与者可以在最后一次使用止泻药后≥7天重新筛查
筛查前28天内进行全身抗生素治疗(口服或注射)
当前丙氨酸转氨酶(ALT)或天冬氨酸转氨酶(AST)升高>2.5倍正常值上限(ULN)和/或总胆红素>1.5倍ULN的参与者。
任何心血管、肾脏、肝脏、内分泌、传染性、血液学、肿瘤学、神经精神病学或免疫介导障碍的先前诊断，PI认为这些疾病可能影响参与者的安全性或依从性，或研究的解释结果。如果参与者的2型糖尿病已根据研究者的判断得到控制并且没有出现有症状的高血糖或低血糖事件，并且非胰岛素药物治疗在过去12周内一直稳定，则可以考虑纳入。
在筛查访视前28天内或5个半衰期(以较长者为准)内使用任何其他研究药物进行治疗。
主要终点包括：
患者粪便样品中粪便钙卫蛋白(FC)在第10周时相对于基线的变化。
次要终点包括：
经历治疗中出现的不良事件(TEAE)的参与者人数
经历治疗相关不良事件(TRAE)的参与者人数
因TRAE而中断治疗的参与者人数
生命体征、安全实验室分析、身体检查相对于基线的变化
探索性终点包括：
使用总Mayo评分的各个组成部分和组成部分组合获得缓解的参与者比例
第10周时改良Mayo评分(MMS)相对于基线的变化。MMS仅由大便频率子评分(SMS)、直肠出血子评分(BMS)和内窥镜Mayo子评分(EMS)组成。
Geboes指数在第10周时相对于基线的变化
32项炎症性肠病问卷(IBDQ-32)相对于基线的变化
等同形式和术语
可以在不存在本文未具体公开的任何一个或多个要素，一个或多个限制的情况下适当地实践本文说明性描述的公开内容。因此，例如，在本文的每种情况中，术语“包括”、“基本上由...组成”和“由...组成”中的任何一个都可以用其他两个术语中的任一个代替。已经采用的术语和表达用作描述性术语，而不是限制性的，并且不意图在使用这样的术语和表达时排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同形式，但是应当认识到，在本公开的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解，尽管已经通过优选实施方案、任选的特征具体公开了本公开，但是本领域技术人员可以借助属于本公开的概念进行修改和变型，并且可以将这样的修改和变型视为在本公开的范围内。
另外，在根据马库什组或替代的其他分组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开可因此根据马库什组或其他组的任何单个成员或成员的子组来描述。
除非另有说明或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)，术语“一个”、“一种”和“该/所述”以及类似指代的使用应被解释为涵盖单数和复数。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意思是“包括但不限于”)。除非本文另外指出，否则本文中数值范围的叙述仅旨在用作分别指代落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值都被并入说明书中，如同其在本文中被单独叙述一样。除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序执行。除非另外要求，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且不对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应解释为指示任何对于实施本发明是必不可少的未要求保护的要素。
本文所述了本发明的实施方案。在阅读前述说明之后，那些实施方案的变型对于本领域普通技术人员而言将变得明显。
发明人预期本领域技术人员适当地采用这样的变型，并且发明人希望以不同于本文具体描述的方式来实践本发明。因此，本发明包括适用法律所允许的所附权利要求中记载的主题的所有修改和等同形式。而且，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述要素在其所有可能的变化中的任何组合。仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。这样的等同方案旨在由所附权利要求书涵盖。

Claims (132)

1.寡糖组合物，其包含多种寡糖，所述多种寡糖的特征在于多重编辑梯度增强的1H-13C异核单量子相干(HSQC)NMR谱图，其包含下表的信号2、3和11中的一个或多个，
其中信号1-11中的每一个的曲线下面积(AUC)是通过获得使用椭圆形对由1H中心位置和13C中心位置限定的积分区域的积分确定的，并且其中所述谱图是使用具有少于2％单体的寡糖组合物样品产生的：
2.权利要求1所述的寡糖组合物，其包含信号2、3和11中的2个或3个，其中信号2的AUC(占信号1-11总面积的百分比)在0.34-2.01范围内，信号3的AUC(占信号1-11总面积的百分比)在7.28-25.71范围内，信号11的AUC(占信号1-11总面积的百分比)在7.93-12.69范围内。
3.前述权利要求任一项所述的寡糖组合物，其包含信号2、3和11中的2个或3个，其中信号2的AUC(占信号1-11总面积的百分比)在0.68-1.68范围内，信号3的AUC(占信号1-11总面积的百分比)在10.97-22.02范围内，信号11的AUC(占信号1-11总面积的百分比)在8.88-11.74的范围内。
4.前述权利要求任一项所述的寡糖组合物，其进一步包含信号5，其中信号5的AUC(占信号1-11总面积的百分比)在0.23-3.87范围内。
5.前述权利要求任一项所述的寡糖组合物，其进一步包含信号5，其中信号5的AUC(占信号1-11总面积的百分比)在0.96-3.14范围内。
6.前述权利要求任一项所述的寡糖组合物，其进一步包含信号1、4、6、7、8、9和10中的一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)，其中至少信号1、4、6、7、8、9和10定义如下：
7.前述权利要求任一项所述的寡糖组合物，其中信号1-11中的至少一个定义如下：
8.前述权利要求任一项所述的寡糖组合物，其中信号1-11的1H中心位置和13C中心位置限定的积分区域进一步定义如下：
9.前述权利要求任一项所述的寡糖组合物，其中NMR谱图是通过对组合物样品进行多重编辑梯度增强的1H-13C异核单量子相干(HSQC)实验而得到的，所述实验使用回波-反回波方案使用以下脉冲序列图、采集参数和处理参数进行相干选择：
脉冲序列图(图5)
采集参数
1H载波频率＝4ppm
13C载波频率＝65ppm
采集维度中的点数＝596
采集维度中的频谱范围＝6.23ppm至1.83ppm
间接维度中的点数＝300个复杂点
间接维度中的频谱范围＝120ppm至10ppm
循环延迟＝1秒
单键1H-13C耦合常数＝JCH＝146Hz
扫描次数＝8
温度＝298-299K
溶剂＝D2O
处理参数
直接维度的窗函数＝高斯展宽，7.66Hz
间接维度的窗函数＝高斯展宽26.48Hz
处理＝直接维度中的512个复杂点，间接维度中的1024个复杂点。
10.前述权利要求任一项所述的寡糖组合物，其中NMR谱图是通过对寡糖组合物的样品进行HSQC NMR得到的，其中样品溶解在D2O中。
11.前述权利要求任一项所述的寡糖组合物，其中所述寡糖组合物已经过脱单体化程序。
12.权利要求11所述的寡糖组合物，其中所述脱单体化程序是乙醇沉淀。
13.前述权利要求任一项所述的寡糖组合物，其中所述寡糖组合物包含少于10％或少于5％的单体。
14.前述权利要求任一项所述的寡糖组合物，其中所述寡糖组合物包含少于2％的单体。
15.前述权利要求任一项所述的寡糖组合物，其中所述寡糖组合物包含多种基本上由式(I)组成的寡糖：
其中式(I)中的R独立地选自氢、以及式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id):
其中式(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)中的R独立地如以上式(I)中所定义。
16.包含多种寡糖的寡糖组合物，每种寡糖包含多种单体基团；
所述多种寡糖包含以下单体基团的一种或多种：
(4)3-吡喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中5.31-7.15mol％的单体基团；
(10)6-吡喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中13.81-19.02mol％的单体基团；
(16)3,6-吡喃半乳糖和/或2,6-呋喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中4.14-5.93mol％的单体基团；和/或
(17)2,6-吡喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中1.98-2.99mol％的单体基团。
17.权利要求16所述的寡糖组合物，其中所述多种寡糖包含选自基团(4)、(10)、(16)和(17)的至少2、3或4种单体基团。
18.权利要求16或17所述的寡糖组合物，其进一步包含一种或多种以下单体基团：
(1)t-呋喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中6.29-12.84mol％的单体基团；
(2)t-吡喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中20.45-28.28mol％的单体基团；
(3)2-呋喃半乳糖和/或2-呋喃葡萄糖单基，其代表所述多种寡糖中2.73-3.46％mol％的单体基团；
(5)3-呋喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中3.36-4.28mol％的单体基团；
(6)2-吡喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中4.12-4.45mol％的单体基团；
(7)4-吡喃半乳糖和/或5-呋喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中4.65-5.87mol％的单体基团；
(8)2,3-呋喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中0.43-0.82mol％的单体基团；
(9)6-呋喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中2.92-9.58mol％的单体基团；
(11)3,4-吡喃半乳糖和/或3,5-呋喃半乳糖和/或2,3-吡喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中1.41-1.99mol％的单体基团；
(12)2,4-吡喃葡萄糖和/或2,5-呋喃葡萄糖和/或2,4-吡喃半乳糖和/或2,5-呋喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中0.88-1.21mol％的单体基团；
(13)2,3,4-吡喃半乳糖和/或2,3,5-呋喃半乳糖三基，其代表所述多种寡糖中0.14-0.28mol％的单体基团；
(14)3,6-呋喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中1.69-2.27mol％的单体基团；
(15)4,6-吡喃半乳糖和/或5,6-呋喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中3.93-5.26mol％的单体基团；
(18)3,4,6-吡喃半乳糖和/或3,5,6-呋喃半乳糖和/或2,3,6-呋喃半乳糖三基，其代表所述多种寡糖中0.91-1.68mol％的单体基团；
(19)2,3,6-吡喃半乳糖和/或2,4,6-吡喃半乳糖和/或2,5,6-呋喃半乳糖三基，其代表所述多种寡糖中0.01-3.10mol％的单体基团；和/或
(20)2,3,4,6-吡喃半乳糖和/或2,3,5,6-呋喃半乳糖四基，其代表所述多种寡糖中0.01-0.28mol％的单体基团。
19.权利要求B3所述的寡糖组合物，其中所述多种寡糖包含选自基团(1)-(3)、(5)-(9)、(11)-(15)和(18)-(20)的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16种单体基团。
20.权利要求16-19中任一项所述的寡糖组合物，其中所述多种寡糖包含选自基团(1)-(20)的每个单体基团。
21.包含多种寡糖的寡糖组合物，每种寡糖包含多种单体基团；
所述多种寡糖包含以下单体基团的一种或多种：
(4)3-吡喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中4.79-7.75mol％的单体基团；
(10)6-吡喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中11.64-22.24mol％的单体基团；
(16)3,6-吡喃半乳糖和/或2,6-呋喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中2.20-7.06mol％的单体基团；和/或
(17)2,6-吡喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中0.89-3.63mol％的单体基团。
22.权利要求21所述的寡糖组合物，其中所述多种寡糖包含选自基团(4)、(10)、(16)和(17)的至少2、3或4种单体基团。
23.权利要求21或22所述的寡糖组合物，其进一步包含一种或多种以下单体基团：
(1)t-呋喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中2.52-15.21mol％的单体基团；
(2)t-吡喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中13.49-40.02mol％的单体基团；
(3)2-呋喃半乳糖和/或2-呋喃葡萄糖单基，其代表所述多种寡糖中0.64％-4.82mol％的单体基团；
(5)3-呋喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中2.22-5.03mol％的单体基团；
(6)2-吡喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中3.10-5.13mol％的单体基团；
(7)4-吡喃半乳糖和/或5-呋喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中3.99-6.87mol％的单体基团；
(8)2,3-呋喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中0.00-1.93％mol％的单体基团；
(9)6-呋喃半乳糖单基，其代表所述多种寡糖中1.52-10.39mol％的单体基团；
(11)3,4-吡喃半乳糖和/或3,5-呋喃半乳糖和/或2,3-吡喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中0.68-3.15mol％的单体基团；
(12)2,4-吡喃葡萄糖和/或2,5-呋喃葡萄糖和/或2,4-吡喃半乳糖和/或2,5-呋喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中0.49-1.45mol％的单体基团；
(13)2,3,4-吡喃半乳糖和/或2,3,5-呋喃半乳糖三基，其代表所述多种寡糖中0.00-0.67mol％的单体基团；
(14)3,6-呋喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中0.41-3.10mol％的单体基团；
(15)4,6-吡喃半乳糖和/或5,6-呋喃半乳糖二基，其代表所述多种寡糖中3.60-5.65mol％的单体基团；
(18)3,4,6-吡喃半乳糖和/或3,5,6-呋喃半乳糖和/或2,3,6-呋喃半乳糖三基，其代表所述多种寡糖中0.68-1.85mol％的单体基团；
(19)2,3,6-吡喃半乳糖和/或2,4,6-吡喃半乳糖和/或2,5,6-呋喃半乳糖三基，其代表所述多种寡糖中0.00-3.51mol％的单体基团；和/或
(20)2,3,4,6-吡喃半乳糖和/或2,3,5,6-呋喃半乳糖四基，其代表所述多种寡糖中0.00-0.35mol％的单体基团。
24.权利要求23所述的寡糖组合物，其中所述多种寡糖包含选自基团(1)-(3)、(5)-(9)、(11)-(15)和(18)-(20)的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16种单体基团。
25.权利要求21-24中任一项所述的寡糖组合物，其中所述多种寡糖包含选自基团(1)-(20)的每个单体基团。
26.权利要求16-25中任一项所述的寡糖组合物，其中单体基团的摩尔百分比使用全甲基化测定来确定，其中全甲基化测定包括气相色谱质谱(GC-MS)分析。
27.权利要求16-26中任一项所述的寡糖组合物，其中所述寡糖组合物包含多种基本上由式(I)组成的寡糖：
其中式(I)中的R独立地选自氢、以及式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id):
其中式(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)中的R独立地如以上式(I)中所定义。
28.前述权利要求任一项所述的寡糖组合物，其中所述寡糖组合物的平均聚合度(DP)为约DP11至约DP19。
29.前述权利要求任一项所述的寡糖组合物，其中所述寡糖组合物的平均聚合度(DP)为约DP13至约DP17。
30.前述权利要求任一项所述的寡糖组合物，其中所述组合物包含87-95％的DP2+。
31.前述权利要求任一项所述的寡糖组合物，其中所述组合物包含89-93％的DP2+。
32.前述权利要求任一项所述的寡糖组合物，其中所述组合物包含58-94％的总膳食纤维(干基)。
33.前述权利要求任一项所述的寡糖组合物，其中所述组合物包含65-87％的总膳食纤维(干基)。
34.前述权利要求任一项所述的寡糖组合物，其包含多种寡糖，所述多种寡糖包含
式(I):
其中式(I)中的R独立地选自氢、以及式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id):
其中式(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)中的R独立地如以上式(I)中所定义；
其中所述寡糖组合物通过包括以下的方法生成：
(a)用包含带正电荷的氢离子的酸催化剂形成包含半乳糖单体的反应混合物；和
(b)通过向反应混合物传递足够的热量以将反应混合物保持在其沸点，从而促进反应混合物中酸催化寡糖的形成。
35.权利要求34所述的组合物，其中步骤(b)包括将该反应混合物装载包含带正电荷氢离子的酸催化剂，其量使得带正电荷的氢离子与总半乳糖单体含量的摩尔比在合适的范围内。
36.权利要求34或35所述的组合物，其中步骤(a)和(b)同时发生。
37.权利要求34-36中任一项所述的组合物，其中步骤(a)包括在搅拌条件下将反应混合物加热至100℃至160℃范围内的温度。
38.权利要求37所述的组合物，其中步骤(a)包括在搅拌条件下将反应混合物加热至128℃至140℃范围内的温度。
39.权利要求38所述的组合物，其中步骤(a)包括在搅拌条件下将反应混合物加热至130℃至140℃范围内的温度。
40.权利要求34-38中任一项所述的组合物，其中步骤(a)包括在合适的条件下逐渐升高温度(例如，从室温)至约136℃以实现同质性和均匀的热传递。
41.权利要求34-40中任一项所述的组合物，其中步骤(b)包括将反应混合物保持在大气压或真空下，在128℃至140℃范围内的温度，在促进酸催化寡糖组合物形成的条件下，直至寡糖组合物中半乳糖单体的重量百分比在5-13％的范围内。
42.权利要求34-41中任一项所述的组合物，其中步骤(b)包括将反应混合物保持在大气压或真空下，在130℃至140℃范围内的温度，在促进酸催化寡糖组合物形成的条件下，直至寡糖组合物中半乳糖单体的重量百分比在5-13％的范围内。
43.权利要求34-42中任一项所述的组合物，其中步骤(b)包括将反应混合物保持在大气压或真空下，在130℃至140℃范围内的温度，在促进酸催化寡糖组合物形成的条件下，直至寡糖组合物中半乳糖单体的重量百分比在7-11％的范围内。
44.权利要求34-40中任一项所述的组合物，其中步骤(b)包括将反应混合物保持在大气压或真空下，在约136℃的温度，在促进酸催化寡糖组合物形成的条件下，直至寡糖组合物中半乳糖单体的重量百分比在5-13％的范围内。
45.权利要求34-40中任一项所述的组合物，其中步骤(b)包括将反应混合物保持在大气压或真空下，在约136℃的温度，在促进酸催化寡糖组合物形成的条件下，直至寡糖组合物中半乳糖单体的重量百分比在7-11％的范围内。
46.权利要求34-45中任一项所述的组合物，其中所述酸催化剂是强酸阳离子交换树脂，其具有根据表1的一种或多种物理和化学性质，和/或其中催化剂包含>3.0mmol/g磺酸部分和<1.0mmol/g阳离子部分。
47.权利要求46所述的组合物，其中所述催化剂具有45-50重量百分比的标称水分含量。
48.权利要求34-45中任一项所述的组合物，其中所述酸催化剂是可溶性催化剂。
49.权利要求48所述的组合物，其中所述可溶性催化剂是有机酸。
50.权利要求48或49所述的组合物，其中所述可溶性催化剂是弱有机酸。
51.权利要求48-50中任一项所述的组合物，其中所述可溶性催化剂是柠檬酸。
52.权利要求34-51中任一项所述的组合物，其中所述方法进一步包括：
(c)淬灭反应混合物，例如用水淬灭，同时使反应混合物的温度达到55℃至95℃范围内的温度(例如，85℃、90℃)。
53.权利要求34-51中任一项所述的组合物，其中所述方法进一步包括：
(c)淬灭反应混合物，例如用水淬灭，同时使反应混合物的温度达到20℃至40℃范围内的温度(例如，20℃、25℃)。
54.权利要求52所述的组合物，其中所述方法进一步包括：
(d)将寡糖组合物与酸催化剂分离。
55.权利要求54所述的组合物，其中在(d)中所述分离包括通过过滤除去催化剂。
56.权利要求54或55所述的组合物，其中(d)包括在过滤之前将反应混合物冷却至低于约100℃。
57.权利要求54-56中任一项所述的组合物，其中所述方法进一步包括：
(e)用水将(d)的寡糖组合物稀释至约40-55重量百分比的浓度，任选地，45-55重量百分比的浓度；
(f)将稀释的组合物通过阳离子交换树脂；
(g)使稀释的组合物通过脱色聚合物树脂；和/或
(h)使稀释的组合物通过阴离子交换树脂；
其中(f)、(g)和(h)中的每一个可以以任何顺序进行一次或多次。
58.减轻受试者炎症的方法，所述方法包括向所述受试者的胃肠道施用有效量的根据权利要求1-57中任一项的寡糖组合物。
59.权利要求58所述的方法，其中所述方法减少受试者胃肠道中的炎症。
60.治疗患有或疑似患有炎症性和免疫障碍的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者的胃肠道施用有效量的根据权利要求1-57中任一项的寡糖组合物，从而治疗受试者。
61.治疗患有或疑似患有炎症性和免疫障碍的受试者的方法，所述方法包括向受试者的胃肠道施用有效量的寡糖组合物，其中寡糖组合物的平均聚合度为5-20且包含多种寡糖，其选自式(I)：
其中式(I)中的R独立地选自氢、以及式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id):
其中式(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)中的R独立地如以上式(I)中所定义，从而治疗受试者。
62.权利要求60或61所述的方法，其中所述炎症性和免疫障碍是慢性炎症性障碍。
63.权利要求62所述的方法，其中所述慢性炎症性障碍是炎症性肠病。
64.权利要求63所述的方法，其中所述炎症性肠病是溃疡性结肠炎。
65.权利要求64所述的方法，其中所述炎症性肠病是克罗恩氏病。
66.权利要求64所述的方法，其中所述炎症性肠病是肉芽肿性结肠炎。
67.权利要求63所述的方法，其中所述炎症性肠病是未定型结肠炎。
68.权利要求63所述的方法，其中所述炎症性肠病是转向性结肠炎。
69.权利要求63所述的方法，其中所述炎症性肠病是结肠袋炎。
70.权利要求63所述的方法，其中所述炎症性肠病是白塞氏病。
71.权利要求63所述的方法，其中所述炎症性肠病是显微镜下结肠炎。
72.权利要求63所述的方法，其中所述炎症性肠病是憩室病相关结肠炎。
73.权利要求63所述的方法，其中所述炎症性肠病是胶原性结肠炎。
74.权利要求63所述的方法，其中所述炎症性肠病是淋巴细胞性结肠炎。
75.权利要求63所述的方法，其中所述炎症性肠病是小儿发病的炎症性肠病。
76.治疗患有或疑似患有炎症性肠病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者的胃肠道施用有效量的根据权利要求1-57中任一项的寡糖组合物，从而治疗受试者。
77.治疗患有或疑似患有炎症性肠病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者的胃肠道施用有效量的寡糖组合物，其中寡糖组合物的平均聚合度为5-20且包含多种寡糖，其选自式(I)：
其中式(I)中的R独立地选自氢、以及式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id):
其中式(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)中的R独立地如以上式(I)中所定义，从而治疗受试者。
78.权利要求77所述的方法，其中所述炎症性肠病是溃疡性结肠炎。
79.权利要求77所述的方法，其中所述炎症性肠病是克罗恩氏病。
80.权利要求77所述的方法，其中所述炎症性肠病是肉芽肿性结肠炎。
81.权利要求77所述的方法，其中所述炎症性肠病是未定型结肠炎。
82.权利要求77所述的方法，其中所述炎症性肠病是转向性结肠炎。
83.权利要求77所述的方法，其中所述炎症性肠病是结肠袋炎。
84.权利要求77所述的方法，其中所述炎症性肠病是白塞氏病。
85.权利要求77所述的方法，其中所述炎症性肠病是显微镜下结肠炎。
86.权利要求77所述的方法，其中所述炎症性肠病是憩室病相关结肠炎。
87.权利要求77所述的方法，其中所述炎症性肠病是胶原性结肠炎。
88.权利要求77所述的方法，其中所述炎症性肠病是淋巴细胞性结肠炎。
89.权利要求77所述的方法，其中所述炎症性肠病是小儿发病的炎症性肠病。
90.增加受试者中短链脂肪酸的相对或绝对丰度的方法，所述方法包括向所述受试者的胃肠道施用有效量的根据权利要求1-57中任一项的寡糖组合物。
91.权利要求90所述的方法，其中与基线测量值相比(例如，其中基线测量值在治疗前确定)，短链脂肪酸的相对或绝对丰度增加至少5％、10％、20％或30％。
92.权利要求90或91所述的方法，其中所述短链脂肪酸是丁酸、乙酸和/或丙酸。
93.降低受试者中促炎和/或致病细菌的相对或绝对丰度的方法，所述方法包括向所述受试者的胃肠道施用有效量的根据权利要求1-57中任一项的寡糖组合物。
94.权利要求93所述的方法，其中所述促炎和/或致病细菌是肠杆菌科和/或瘤胃球菌科。
95.增加受试者中共生细菌的相对或绝对丰度的方法，所述方法包括向所述受试者的胃肠道施用有效量的根据权利要求1-57中任一项的寡糖组合物。
96.权利要求95所述的方法，其中所述共生细菌是副拟杆菌属和/或拟杆菌属。
97.权利要求58-96中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类受试者。
98.权利要求97所述的方法，其中所述受试者是新生儿(早产新生儿、足月新生儿)、一岁以下的婴儿、幼儿(例如，1岁至12岁)、青少年(例如，13-19岁)、成年人(例如，20-64岁)或老年人(例如，65岁及以上)。
99.权利要求58-98中任一项所述的方法，其中所述方法包括将寡糖组合物施用至肠(例如，大肠)。
100.权利要求58-99中任一项所述的方法，其中所述寡糖组合物是自我施用至受试者的。
101.权利要求58-100中任一项所述的方法，其中所述寡糖组合物被配制为用于口服递送的药物组合物。
102.权利要求58-101中任一项所述的方法，其中所述寡糖组合物被口服施用至受试者。
103.权利要求58-102中任一项所述的方法，其中所述寡糖组合物每天一次或每天两次施用于受试者。
104.权利要求58-103中任一项所述的方法，其中所述方法增加受试者(例如，受试者的胃肠道)中总短链脂肪酸的丰度或浓度。
105.权利要求58-104中任一项所述的方法，其中所述方法增加受试者(例如，受试者的胃肠道)中丁酸的丰度或浓度。
106.权利要求58-105中任一项所述的方法，其中所述方法增加受试者(例如，受试者的胃肠道)中丙酸的丰度或浓度。
107.权利要求58-106中任一项所述的方法，其中所述方法增加受试者(例如，受试者的胃肠道)中乙酸的丰度或浓度。
108.权利要求104-107中任一项所述的方法，其中总SCFA的丰度相对于基线测量值(例如，其中基线测量值是在治疗之前确定的)增加至少5％、10％、20％或30％。
109.权利要求104-108中任一项所述的方法，其中丁酸、丙酸和乙酸中至少一种的丰度相对于基线测量值(例如，其中基线测量值是在治疗之前确定的)增加至少5％、10％、20％或30％。
110.权利要求58-109中任一项所述的方法，其中所述方法促进受试者胃肠道微生物群系内共生细菌的生长(例如，增加它们的相对丰度)。
111.权利要求58-110中任一项所述的方法，其中所述方法促进受试者胃肠道微生物群系内副拟杆菌属和拟杆菌属的生长(例如，增加它们的相对丰度)。
112.权利要求58-111中任一项所述的方法，其中所述方法导致受试者胃肠道微生物群系内促炎和/或致病细菌的丰度降低。
113.权利要求58-112中任一项所述的方法，其中所述方法导致受试者胃肠道微生物群系内促炎症性肠杆菌科的丰度降低。
114.权利要求58-113中任一项所述的方法，其中相对于基线测量值，所述寡糖组合物的施用导致属于受试者的大便/粪便样品中的粪便钙卫蛋白、粪便脂质运载蛋白和/或粪便乳铁蛋白的水平降低。
115.权利要求114所述的方法，其中粪便钙卫蛋白的水平相对于基线测量值降低至少50％。
116.权利要求114所述的方法，其中粪便钙卫蛋白的水平相对于基线测量值降低至少65％。
117.权利要求114所述的方法，其中粪便乳铁蛋白的水平相对于基线测量值降低至少50％。
118.权利要求58-117所述的方法，其中所述方法引起受试者胃肠道微生物群系内与粘附侵入性大肠杆菌相关的基因的消耗。
119.权利要求118所述的方法，其中与粘附侵入性大肠杆菌相关的基因是fimH、ompA和ompC。
120.权利要求58-119中任一项所述的方法，其中施用所述寡糖组合物至少20、30、40或50天。
121.权利要求58-119中任一项所述的方法，其中施用所述寡糖组合物56天或10周。
122.权利要求58-119中任一项所述的方法，其中施用所述寡糖组合物20-100天，任选地50-75天。
123.权利要求58-119中任一项所述的方法，其中所述受试者患有溃疡性结肠炎，并且其中所述寡糖组合物的施用导致溃疡性结肠炎疾病活动相对于基线测量值降低。
124.权利要求123所述的方法，其中溃疡性结肠炎疾病活动的降低使用简单临床结肠炎活动指数(SCCAI)综合评分来测量。
125.权利要求58-124中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括施用标准护理治疗。
126.权利要求125所述的方法，其中所述标准护理治疗是5-ASA(美沙拉嗪)、硫唑嘌呤、维多珠单抗、英夫利昔单抗或阿达木单抗。
127.降低受试者中与炎症相关的一种或多种生物标志物(例如，粪便钙卫蛋白、粪便脂质运载蛋白和/或粪便乳铁蛋白)的水平的方法，所述受试者任选地为表现出炎症性疾病的受试者，包括以有效量向所述受试者施用权利要求1-57中任一项的寡糖组合物以相对于基线测量值降低一种或多种生物标志物的水平。
128.权利要求127所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物的水平在来自受试者的大便/粪便样品中测量。
129.降低受试者中一种或多种致病有机体(例如，促炎细菌分类群，例如肠杆菌科)的丰度的方法，所述受试者任选地为表现出炎症性疾病的受试者，包括以有效量向受试者施用权利要求1-57中任一项的寡糖组合物以降低一种或多种致病有机体的丰度。
130.权利要求129所述的方法，其中所述一种或多种致病有机体的丰度在来自受试者的大便/粪便样品中测量。
131.增加受试者中一种或多种共生分类群(例如，副拟杆菌属和拟杆菌属)的丰度的方法，所述受试者任选地为表现出炎症性疾病的受试者，包括以有效量向受试者施用权利要求1-57中任一项的寡糖组合物以增加一种或多种共生分类群的丰度。
132.权利要求131所述的方法，其中所述一种或多种共生分类群的丰度在来自受试者的大便/粪便样品中测量。
CN202180065168.9A 2020-09-25 2021-09-24 寡糖组合物及其使用方法 Pending CN116490192A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063083796P 2020-09-25 2020-09-25
US63/083,796 2020-09-25
PCT/US2021/052098 WO2022067131A1 (en) 2020-09-25 2021-09-24 Oligosaccharide compositions and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116490192A true CN116490192A (zh) 2023-07-25

Family

ID=80845871

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180065168.9A Pending CN116490192A (zh) 2020-09-25 2021-09-24 寡糖组合物及其使用方法

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP4216727A1 (zh)
JP (1) JP2023542536A (zh)
KR (1) KR20230076828A (zh)
CN (1) CN116490192A (zh)
AU (1) AU2021350104A1 (zh)
BR (1) BR112023005376A2 (zh)
CA (1) CA3196600A1 (zh)
WO (1) WO2022067131A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113163828B (zh) 2018-08-15 2024-04-26 剑桥糖质科学有限公司 新型组合物、其用途及其形成方法
WO2021032647A1 (en) 2019-08-16 2021-02-25 Cambridge Glycoscience Ltd Methods of treating biomass to produce oligosaccharides and related compositions
JP2023506464A (ja) 2019-12-12 2023-02-16 ケンブリッジ グリコサイエンス エルティーディー 低糖の多相食料品
WO2023242194A1 (en) * 2022-06-14 2023-12-21 Dsm Ip Assets B.V. Separation of human milk oligosaccharides from a fermentation broth
WO2024043298A1 (ja) * 2022-08-25 2024-02-29 株式会社明治 腸内細菌叢改善用組成物

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2983016A1 (en) * 2015-04-23 2016-10-27 Kaleido Biosciences, Inc. Microbiome regulators and related uses thereof
WO2020041531A2 (en) * 2018-08-21 2020-02-27 Kaleido Biosciences, Inc. Oligosaccharide compositions and methods of use thereof for reducing ammonia levels
SG11202104207TA (en) * 2018-11-08 2021-05-28 Kaleido Biosciences Inc Oligosaccharide compositions and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
JP2023542536A (ja) 2023-10-10
KR20230076828A (ko) 2023-05-31
CA3196600A1 (en) 2022-03-31
BR112023005376A2 (pt) 2023-04-25
WO2022067131A1 (en) 2022-03-31
AU2021350104A1 (en) 2023-06-08
EP4216727A1 (en) 2023-08-02
WO2022067131A9 (en) 2022-05-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN116490192A (zh) 寡糖组合物及其使用方法
JP2021063079A (ja) グリカン治療剤及びその関連方法
RU2740096C2 (ru) Bifidobacterium longum для лечения ожирения и ассоциированных метаболических расстройств
JP2018513196A (ja) マイクロバイオーム制御因子及び関連するその使用
Zhang et al. Prevention of loperamide induced constipation in mice by KGM and the mechanisms of different gastrointestinal tract microbiota regulation
US20180360092A1 (en) Lactobacillus casei for treating obesity and associated metabolic disorders
CN111587295A (zh) 来源于普氏粪杆菌的纳米囊泡及其用途
WO2018170118A1 (en) Methods and compositions for treating obesity, inflammation, or metabolic disorders with bacteriophages
JP2021502339A (ja) グリカン調製物及び高アンモニア血症のための使用方法
US11169101B2 (en) Oligosaccharide compositions and methods of use thereof
CN112041465A (zh) 来源于乳球菌属细菌的纳米囊泡及其用途
CN113056488B (zh) 寡糖组合物及其用于降低氨水平的使用方法
JP2022546117A (ja) 細菌種を含む組成物及びそれに関連する方法
CN114126625A (zh) 寡糖组合物及其使用方法
CN113558245A (zh) 用于提高免疫力的组合物
CN111936640A (zh) 来源于布劳特氏菌种细菌的纳米囊泡及其用途
US20230277573A1 (en) Oligosaccharide compositions and methods of use

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination