KR20230076828A - 올리고사카라이드 조성물 및 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용의 측면은 올리고사카라이드 조성물 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 염증성 및 면역 장애 및 질환의 치료를 위해 염증을 감소시키기 위한 마이크로바이옴 대사 요법으로서의 올리고사카라이드 조성물의 사용 방법이 또한 제공된다.
Description
본 개시내용은 올리고사카라이드 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다.
인간 건강을 유지시키거나 회복시키는 것은 다수의 도전과제에 직면해 있으며, 이들 중 다수는 효과적인 치료 옵션의 결여로부터 발생한다. 구체적으로, 궤양성 결장염 (UC) 및 크론병 (CD)을 포함하고 미국에서 대략 3백만명의 사람에게 이환된 염증성 장 질환 (IBD)은 효과적인 치료 옵션이 결여된 장의 만성 재발성 면역학적 매개 질환이다. IBD의 발병기전은 잘 이해되지 않지만, 감수성 개체에서 장 항상성을 변경시키고 염증을 촉발하는 유전적, 환경적, 장 장벽 및 면역학적 인자의 상호작용에 의해 유발되는 것으로 생각된다. 질환 및 장애, 예컨대 IBD에 대한 신규 요법 및 치료 요법이 계속 필요하다.
일부 측면에 따라, 예를 들어 질환을 치료하기 위해 장 마이크로바이옴 기관의 기능적 산출을 구동하는 데 유용한 올리고사카라이드 조성물을 이용하는 마이크로바이옴 대사 요법이 본원에 제공된다. 본 개시내용의 일부 측면은 올리고사카라이드 조성물이 대상체에서 단쇄 지방산 (SCFA), 예컨대 부티레이트, 아세테이트 및/또는 프로피오네이트의 수준을 증가시키고, 병원성 박테리아에 비해 공생 박테리아의 성장 및 존재비를 촉진하는 데 유용하다는 인식에 관한 것이며, 2가지 기능적 결과는 자가면역 및 알레르기성 장애 (예를 들어, 만성 염증성 장애, 예를 들어 염증성 장 질환, 예를 들어 궤양성 결장염 (UC) 및 크론병 (CD))를 포함한 다수의 염증성 및 면역 장애를 치료하는 데 유용하다. 따라서, 본원에 기재된 일부 측면에서, 본 개시내용의 올리고사카라이드 조성물은 궤양성 결장염을 포함한 염증성 및 면역 장애를 치료하는 데 효과적이다.
일부 측면에서, 복수의 올리고사카라이드를 포함하는 올리고사카라이드 조성물로서, 복수의 올리고사카라이드는 하기 표의 신호 2, 3 및 11 중 1개 이상을 포함하는 다중도-편집 구배-증강 1H-13C 이종핵 단일 양자 상관관계 (HSQC) NMR 스펙트럼을 특징으로 하며,
여기서 각각의 신호 1-11에 대한 곡선하 면적 (AUC)은 타원형 형상을 사용하여 1H 중심 위치 및 13C 중심 위치에 의해 정의되는 적분 영역의 적분값을 얻음으로써 결정되고, 여기서 스펙트럼은 2% 미만의 단량체를 갖는 올리고사카라이드 조성물의 샘플을 사용하여 생성되는 것인 올리고사카라이드 조성물이 본원에 제공된다:
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 신호 2, 3 및 11 중 2 또는 3개를 포함하며, 여기서 신호 2는 0.34-2.01 범위의 AUC (신호 1-11의 총 면적 대비 %)를 갖고, 신호 3은 7.28-25.71 범위의 AUC (신호 1-11의 총 면적 대비 %)를 갖고, 신호 11은 7.93-12.69 범위의 AUC (신호 1-11의 총 면적 대비 %)를 갖는다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 신호 2, 3 및 11 중 2 또는 3개를 포함하며, 여기서 신호 2는 0.68-1.68 범위의 AUC (신호 1-11의 총 면적 대비 %)를 갖고, 신호 3은 10.97-22.02 범위의 AUC (신호 1-11의 총 면적 대비 %)를 갖고, 신호 11은 8.88-11.74 범위의 AUC (신호 1-11의 총 면적 대비 %)를 갖는다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 신호 5를 추가로 포함하며, 여기서 신호 5는 0.23-3.87 범위의 AUC (신호 1-11의 총 면적 대비 %)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 신호 5를 추가로 포함하며, 여기서 신호 5는 0.96-3.14 범위의 AUC (신호 1-11의 총 면적 대비 %)를 갖는다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 신호 1, 4, 6, 7, 8, 9 및 10 중 1개 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)을 추가로 포함하며, 여기서 적어도 신호 1, 4, 6, 7, 8, 9 및 10은 하기와 같이 정의된다:
일부 실시양태에서, 신호 1-11 중 적어도 1개는 하기와 같이 정의된다:
일부 측면에서, 본원은 복수의 올리고사카라이드를 포함하는 올리고사카라이드 조성물로서, 복수의 올리고사카라이드는 하기 표의 신호 2, 3 및 11 중 1개 이상을 포함하는 다중도-편집 구배-증강 1H-13C 이종핵 단일 양자 상관관계 (HSQC) NMR 스펙트럼을 특징으로 하며, 여기서 각각의 신호 1-11에 대한 곡선하 면적 (AUC)은 타원형 형상을 사용하여 1H 중심 위치 및 13C 중심 위치에 의해 정의된 적분 영역의 적분값을 얻음으로써 결정되고, 여기서 스펙트럼은 2% 미만의 단량체를 갖는 올리고사카라이드 조성물의 샘플을 사용하여 생성된다:
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 신호 2, 3 및 11 중 2 또는 3개를 포함하며, 여기서 신호 2는 0.77-1.70 범위의 AUC (신호 1-11의 총 면적 대비 %)를 갖고, 신호 3은 10.52-22.14 범위의 AUC (신호 1-11의 총 면적 대비 %)를 갖고, 신호 11은 9.14-11.59 범위의 AUC (신호 1-11의 총 면적 대비 %)를 갖는다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 신호 2, 3 및 11 중 2 또는 3개를 포함하며, 여기서 신호 2는 1.05-1.45 범위의 AUC (신호 1-11의 총 면적 대비 %)를 갖고, 신호 3은 12.94-18.90 범위의 AUC (신호 1-11의 총 면적 대비 %)를 갖고, 신호 11은 9.73-10.99 범위의 AUC (신호 1-11의 총 면적 대비 %)를 갖는다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 신호 5를 추가로 포함하며, 여기서 신호 5는 0.77-3.24 범위의 AUC (신호 1-11의 총 면적 대비 %)를 갖는다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 신호 5를 추가로 포함하며, 여기서 신호 5는 1.26-2.42 범위의 AUC (신호 1-11의 총 면적 대비 %)를 갖는다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 신호 1, 4, 6, 7, 8, 9 및 10 중 1개 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)을 추가로 포함하며, 여기서 적어도 신호 1, 4, 6, 7, 8, 9 및 10은 하기와 같이 정의된다:
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 하기와 같이 정의되는 올리고사카라이드 조성물의 신호 1-11 중 적어도 1개를 포함한다:
일부 실시양태에서, 신호 1-11의 1H 중심 위치 및 13C 중심 위치에 의해 정의되는 적분 영역은 하기와 같이 추가로 정의된다:
일부 실시양태에서, NMR 스펙트럼은 조성물의 샘플을 하기 펄스 시퀀스 다이어그램, 획득 파라미터 및 가공 파라미터를 사용하여 가간섭성 선택을 위해 에코-안티에코 스킴을 사용하는 다중도-편집 구배-증강 1H-13C 이종핵 단일 양자 가간섭성 (HSQC) 실험 (예를 들어, 500 MHz에서 작동하는 NMR 기기에서)에 적용함으로써 수득된다:
펄스 시퀀스 다이어그램 (도 5)
획득 파라미터
1H 반송파 주파수 = 4 ppm
13C 반송파 주파수 = 65 ppm
획득 차원에서의 포인트 수 = 596개
획득 차원에서의 스펙트럼 범위 = 6.23 ppm 내지 1.83 ppm
간접 차원에서의 포인트 수 = 300개의 복합 포인트
간접 차원에서의 스펙트럼 범위 = 120 ppm 내지 10 ppm
재순환 지연 = 1초
1-결합 1H-13C 커플링 상수 = JCH = 146 Hz
스캔 횟수 = 8회
온도 = 298-299 K
용매 = D2O
가공 파라미터
직접 차원에서의 윈도우 함수 = 가우스 확장, 7.66 Hz
간접 차원에서의 윈도우 함수 = 가우스 확장, 26.48 Hz
가공 = 직접 차원에서의 512개의 복합 포인트, 간접 차원에서의 1024개의 복합 포인트.
일부 실시양태에서, NMR 스펙트럼은 조성물의 샘플을 하기 펄스 시퀀스 다이어그램, 획득 파라미터 및 가공 파라미터를 사용하여 가간섭성 선택을 위해 에코-안티에코 스킴을 사용하는 다중도-편집 구배-증강 1H-13C 이종핵 단일 양자 가간섭성 (HSQC) 실험 (예를 들어, 600 MHz에서 작동하는 NMR 기기에서)에 적용함으로써 수득된다:
펄스 시퀀스 다이어그램
획득 파라미터
1H 반송파 주파수 = 600.13 MHz
13C 반송파 주파수 = 150.91 MHz
펄스 시퀀스 = hsqcedetgpsisp2.3
획득 차원에서의 포인트 수 = 2048개
획득 차원에서의 스펙트럼 범위 = 6.75 ppm 내지 0.25 ppm
간접 차원에서의 포인트 수 = 512개
간접 차원에서의 스펙트럼 범위 = 120 ppm 내지 0 ppm
재순환 지연 = 1.5초
1-결합 1H-13C 커플링 상수 = JCH = 145 Hz
스캔 횟수 = 8회
온도 = 298-299 K
용매 = D2O
가공 파라미터
직접 차원에서의 윈도우 함수 = Qsine 2
간접 차원에서의 윈도우 함수 = Qsine 2
가공 = 직접 차원에서의 2048개의 복합 포인트, 간접 차원에서의 2048개의 복합 포인트
순방향 선형 예측 = 32개의 계수, 512개의 예측 포인트.
일부 실시양태에서, NMR 스펙트럼은 올리고사카라이드 조성물의 샘플에 대해 HSQC NMR을 수행함으로써 수득되며, 여기서 샘플은 D2O 중에 용해된다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 탈단량체화 절차를 거쳤다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 10% 미만의 단량체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 5% 미만의 단량체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 2% 미만의 단량체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 화학식 (I)로 본질적으로 이루어진 복수의 올리고사카라이드를 포함한다:
여기서 화학식 (I)에서의 R은 독립적으로 수소 및 화학식 (Ia), (Ib), (Ic), (Id)로부터 선택되고:
여기서 화학식 (Ia), (Ib), (Ic) 및 (Id)에서의 R은 독립적으로 상기 화학식 (I)에서와 같이 정의된다.
일부 측면에서, 복수의 올리고사카라이드를 포함하는 올리고사카라이드 조성물로서, 각각의 올리고사카라이드는 복수의 단량체 라디칼을 포함하고;
복수의 올리고사카라이드는 하기 단량체 라디칼 중 1종 이상을 포함하는 것인 올리고사카라이드 조성물이 본원에 제공된다:
(4) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 5.31-7.15 mol%를 나타내는 3-갈락토피라노스 모노라디칼;
(10) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 13.81-19.02 mol%를 나타내는 6-갈락토피라노스 모노라디칼;
(16) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 4.14-5.93 mol%를 나타내는 3,6-갈락토피라노스 및/또는 2,6-갈락토푸라노스 디라디칼; 및/또는
(17) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 1.98-2.99 mol%를 나타내는 2,6-갈락토피라노스 디라디칼.
일부 실시양태에서, 복수의 올리고사카라이드는 라디칼 (4), (10), (16) 및 (17)로부터 선택된 적어도 2, 3 또는 4종의 단량체 라디칼을 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 하기 단량체 라디칼 중 1종 이상을 추가로 포함한다:
(1) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 6.29-12.84 mol%를 나타내는 t-갈락토푸라노스 모노라디칼;
(2) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 20.45-28.28 mol%를 나타내는 t-갈락토피라노스 모노라디칼;
(3) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 2.73-3.46% mol%를 나타내는 2-갈락토푸라노스 및/또는 2-글루코푸라노스 모노라디칼;
(5) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 3.36-4.28 mol%를 나타내는 3-갈락토푸라노스 모노라디칼;
(6) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 4.12-4.45 mol%를 나타내는 2-갈락토피라노스 모노라디칼;
(7) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 4.65-5.87 mol%를 나타내는 4-갈락토피라노스 및/또는 5-갈락토푸라노스 모노라디칼;
(8) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.43-0.82 mol%를 나타내는 2,3-갈락토푸라노스 디라디칼;
(9) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 2.92-9.58 mol%를 나타내는 6-갈락토푸라노스 모노라디칼;
(11) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 1.41-1.99 mol%를 나타내는 3,4-갈락토피라노스 및/또는 3,5-갈락토푸라노스 및/또는 2,3-갈락토피라노스 디라디칼;
(12) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.88-1.21 mol%를 나타내는 2,4-글루코피라노스 및/또는 2,5-글루코푸라노스 및/또는 2,4-갈락토피라노스 및/또는 2,5-갈락토푸라노스 디라디칼;
(13) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.14-0.28 mol%를 나타내는 2,3,4-갈락토피라노스 및/또는 2,3,5-갈락토푸라노스 트리라디칼;
(14) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 1.69-2.27 mol%를 나타내는 3,6-갈락토푸라노스 디라디칼;
(15) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 3.93-5.26 mol%를 나타내는 4,6-갈락토피라노스 및/또는 5,6-갈락토푸라노스 디라디칼;
(18) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.91-1.68 mol%를 나타내는 3,4,6-갈락토피라노스 및/또는 3,5,6-갈락토푸라노스 및/또는 2,3,6-갈락토푸라노스 트리라디칼;
(19) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.01-3.10 mol%를 나타내는 2,3,6-갈락토피라노스 및/또는 2,4,6-갈락토피라노스 및/또는 2,5,6-갈락토푸라노스 트리라디칼; 및/또는
(20) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.01-0.28 mol%를 나타내는 2,3,4,6-갈락토피라노스 및/또는 2,3,5,6-갈락토푸라노스 쿼드라디칼.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 복수의 올리고사카라이드를 포함하고, 각각의 올리고사카라이드는 복수의 단량체 라디칼을 포함하고;
복수의 올리고사카라이드는 하기 단량체 라디칼 중 1종 이상을 포함한다:
(4) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 4.79-7.75 mol%를 나타내는 3-갈락토피라노스 모노라디칼;
(10) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 11.64-22.24 mol%를 나타내는 6-갈락토피라노스 모노라디칼;
(16) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 2.20-7.06 mol%를 나타내는 3,6-갈락토피라노스 및/또는 2,6-갈락토푸라노스 디라디칼; 및/또는
(17) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.89-3.63 mol%를 나타내는 2,6-갈락토피라노스 디라디칼.
일부 실시양태에서, 복수의 올리고사카라이드는 라디칼 (4), (10), (16) 및 (17)로부터 선택된 적어도 2, 3 또는 4종의 단량체 라디칼을 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 하기 단량체 라디칼 중 1종 이상을 추가로 포함한다:
(1) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 2.52-15.21 mol%를 나타내는 t-갈락토푸라노스 모노라디칼;
(2) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 13.49-40.02 mol%를 나타내는 t-갈락토피라노스 모노라디칼;
(3) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.64%-4.82 mol%를 나타내는 2-갈락토푸라노스 및/또는 2-글루코푸라노스 모노라디칼;
(5) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 2.22-5.03 mol%를 나타내는 3-갈락토푸라노스 모노라디칼;
(6) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 3.10-5.13 mol%를 나타내는 2-갈락토피라노스 모노라디칼;
(7) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 3.99-6.87 mol%를 나타내는 4-갈락토피라노스 및/또는 5-갈락토푸라노스 모노라디칼;
(8) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.00-1.93% mol%를 나타내는 2,3-갈락토푸라노스 디라디칼;
(9) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 1.52-10.39 mol%를 나타내는 6-갈락토푸라노스 모노라디칼;
(11) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.68-3.15 mol%를 나타내는 3,4-갈락토피라노스 및/또는 3,5-갈락토푸라노스 및/또는 2,3-갈락토피라노스 디라디칼;
(12) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.49-1.45 mol%를 나타내는 2,4-글루코피라노스 및/또는 2,5-글루코푸라노스 및/또는 2,4-갈락토피라노스 및/또는 2,5-갈락토푸라노스 디라디칼;
(13) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.00-0.67 mol%를 나타내는 2,3,4-갈락토피라노스 및/또는 2,3,5-갈락토푸라노스 트리라디칼;
(14) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.41-3.10 mol%를 나타내는 3,6-갈락토푸라노스 디라디칼;
(15) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 3.60-5.65 mol%를 나타내는 4,6-갈락토피라노스 및/또는 5,6-갈락토푸라노스 디라디칼;
(18) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.68-1.85 mol%를 나타내는 3,4,6-갈락토피라노스 및/또는 3,5,6-갈락토푸라노스 및/또는 2,3,6-갈락토푸라노스 트리라디칼;
(19) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.00-3.51 mol%를 나타내는 2,3,6-갈락토피라노스 및/또는 2,4,6-갈락토피라노스 및/또는 2,5,6-갈락토푸라노스 트리라디칼; 및/또는
(20) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.00-0.35 mol%를 나타내는 2,3,4,6-갈락토피라노스 및/또는 2,3,5,6-갈락토푸라노스 쿼드라디칼.
일부 실시양태에서, 복수의 올리고사카라이드는 라디칼 (1)-(3), (5)-(9), (11)-(15) 및 (18)-(20)으로부터 선택된 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16종의 단량체 라디칼을 포함한다.
일부 실시양태에서, 복수의 올리고사카라이드는 라디칼 (1)-(20)으로부터 선택된 각각의 단량체 라디칼을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단량체 라디칼의 몰 백분율은 퍼메틸화 검정을 사용하여 결정되며, 여기서 퍼메틸화 검정은 기체 크로마토그래피-질량 분광분석법 (GC-MS) 분석을 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 화학식 (I)로 본질적으로 이루어진 복수의 올리고사카라이드를 포함한다:
여기서 화학식 (I)에서의 R은 독립적으로 수소 및 화학식 (Ia), (Ib), (Ic), (Id)로부터 선택되고:
여기서 화학식 (Ia), (Ib), (Ic) 및 (Id)에서의 R은 독립적으로 상기 화학식 (I)에서와 같이 정의된다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물의 평균 중합도 (DP)는 약 DP11 내지 약 DP19이다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물의 평균 중합도 (DP)는 약 DP13 내지 약 DP17이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 85% 초과의 DP2+를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 87-95%의 DP2+를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 89-93%의 DP2+를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 58-94%의 총 식이성 섬유 (건조 기준)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 65-87%의 총 식이성 섬유 (건조 기준)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 화학식 (I)을 포함하는 복수의 올리고사카라이드를 포함하며:
여기서 화학식 (I)에서의 R은 독립적으로 수소 및 화학식 (Ia), (Ib), (Ic), (Id)로부터 선택되고:
여기서 화학식 (Ia), (Ib), (Ic) 및 (Id)에서의 R은 독립적으로 상기 화학식 (I)에 정의된 바와 같고;
여기서 올리고사카라이드 조성물은
(a) 양으로 하전된 수소 이온을 포함하는 산 촉매 하에 갈락토스 단량체를 포함하는 반응 혼합물을 형성하는 단계; 및
(b) 반응 혼합물을 그의 비점에서 유지하기에 충분한 열을 반응 혼합물에 전달함으로써 반응 혼합물에서의 산 촉매된 올리고사카라이드 형성을 촉진하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 제조된다.
일부 실시양태에서, 단계 (b)는 반응 혼합물에 양으로 하전된 수소 이온을 포함하는 산 촉매를, 총 갈락토스 단량체 함량 대비 양으로 하전된 수소 이온의 몰비가 적절한 범위 내에 있도록 하는 양으로 로딩하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (a) 및 (b)는 동시에 이루어진다. 일부 실시양태에서, 단계 (a)는 반응 혼합물을 교반 조건 하에 100℃ 내지 160℃ 범위의 온도로 가열하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (a)는 반응 혼합물을 교반 조건 하에 130℃ 내지 140℃ 범위의 온도로 가열하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (a)는 균질성 및 균일한 열 전달을 달성하기에 적합한 조건 하에 온도를 (예를 들어, 실온으로부터) 약 136℃로 점차 증가시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단계 (b)는 반응 혼합물을 대기압에서 또는 진공 하에, 128℃ 내지 140℃ (임의로 130℃ 내지 140℃) 범위의 온도에서, 산 촉매된 올리고사카라이드 조성물 형성을 촉진하는 조건 하에, 올리고사카라이드 조성물 중 갈락토스 단량체의 중량 퍼센트가 5-14% 범위일 때까지 유지하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (b)는 반응 혼합물을 대기압에서 또는 진공 하에, 128℃ 내지 140℃ (임의로 130℃ 내지 140℃) 범위의 온도에서, 산 촉매된 올리고사카라이드 조성물 형성을 촉진하는 조건 하에, 올리고사카라이드 조성물 중 갈락토스 단량체의 중량 퍼센트가 5-13% 범위일 때까지 유지하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (b)는 반응 혼합물을 대기압에서 또는 진공 하에, 128℃ 내지 140℃ (임의로 130℃ 내지 140℃) 범위의 온도에서, 산 촉매된 올리고사카라이드 조성물 형성을 촉진하는 조건 하에, 올리고사카라이드 조성물 중 갈락토스 단량체의 중량 퍼센트가 7-11% 범위일 때까지 유지하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (b)는 반응 혼합물을 대기압에서 또는 진공 하에, 약 136℃의 온도에서, 산 촉매된 올리고사카라이드 조성물 형성을 촉진하는 조건 하에, 올리고사카라이드 조성물 중 갈락토스 단량체의 중량 퍼센트가 5-13% 범위일 때까지 유지하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (b)는 반응 혼합물을 대기압에서 또는 진공 하에, 약 136℃의 온도에서, 산 촉매된 올리고사카라이드 조성물 형성을 촉진하는 조건 하에, 올리고사카라이드 조성물 중 갈락토스 단량체의 중량 퍼센트가 7-11% 범위일 때까지 유지하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 산 촉매는 표 1에 따른 1종 이상의 물리적 및 화학적 특성을 갖는 강산 양이온 교환 수지이고/거나 촉매는 > 3.0 mmol/g의 술폰산 모이어티 및 < 1.0 mmol/그램의 양이온성 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 촉매는 45-50 중량 퍼센트의 공칭 수분 함량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 산 촉매는 가용성 촉매이다. 일부 실시양태에서, 가용성 촉매는 유기 산이다. 일부 실시양태에서, 가용성 촉매는 약한 유기 산이다. 일부 실시양태에서, 가용성 촉매는 시트르산이다.
일부 실시양태에서, 방법은 (c) 반응 혼합물을, 예를 들어 물을 사용하여, 반응 혼합물의 온도가 55℃ 내지 95℃ 범위 (예를 들어, 85℃, 90℃)의 온도로 되도록 하면서 켄칭하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법 (예를 들어, 대규모 방법, 예를 들어 50 L, 2000 L 또는 50 L 초과의 방법)은 (c) 반응 혼합물을, 예를 들어 물을 사용하여 반응 혼합물의 온도가 20℃ 내지 40℃ 범위 (예를 들어, 20℃, 25℃)의 온도로 되도록 하면서 켄칭하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 (d) 산 촉매로부터 올리고사카라이드 조성물을 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 분리는 여과에 의해 촉매를 제거하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, (d)는 여과 전에 반응 혼합물을 약 100℃ 미만으로 냉각시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 (e) (d)의 올리고사카라이드 조성물을 물로 약 40-55 중량 퍼센트 (임의로 45-55 중량 퍼센트)의 농도로 희석하는 단계; (f) 희석된 조성물을 양이온 교환 수지에 통과시키는 단계; (g) 희석된 조성물을 탈색 중합체 수지에 통과시키는 단계; 및/또는 (h) 희석된 조성물을 음이온 교환 수지에 통과시키는 단계를 추가로 포함하며; 여기서 각각의 (f), (g) 및 (h)는 임의의 순서로 1회 이상 수행될 수 있다.
일부 측면에서, 대상체에서 염증을 감소시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 염증을 감소시키는 방법은 대상체의 위장관에 유효량의 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 측면에서, 염증성 및 면역 장애를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 염증성 및 면역 장애를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법은 대상체의 위장관에 유효량의 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물을 투여하여, 이에 의해 대상체를 치료하는 것을 포함한다.
일부 측면에서, 염증성 및 면역 장애를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체의 위장관에 유효량의 올리고사카라이드 조성물을 투여하며, 여기서 올리고사카라이드 조성물은 5-20의 평균 중합도를 갖고 화학식 (I)로부터 선택된 복수의 올리고사카라이드를 포함하고:
여기서 화학식 (I)에서의 R은 독립적으로 수소 및 화학식 (Ia), (Ib), (Ic), (Id)로부터 선택되고:
여기서 화학식 (Ia), (Ib), (Ic) 및 (Id)에서의 R은 독립적으로 상기 화학식 (I)에서와 같이 정의되고;
이에 의해 대상체를 치료하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 측면에서, 염증성 장 질환을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 염증성 장 질환을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법은 대상체의 위장관에 유효량의 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물을 투여하여, 이에 의해 대상체를 치료하는 것을 포함한다.
일부 측면에서, 염증성 장 질환을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체의 위장관에 유효량의 올리고사카라이드 조성물을 투여하며, 여기서 올리고사카라이드 조성물은 5-20의 평균 중합도를 갖고 화학식 (I)로부터 선택된 복수의 올리고사카라이드를 포함하고:
여기서 화학식 (I)에서의 R은 독립적으로 수소 및 화학식 (Ia), (Ib), (Ic), (Id)로부터 선택되고:
여기서 화학식 (Ia), (Ib), (Ic) 및 (Id)에서의 R은 독립적으로 상기 화학식 (I)에서와 같이 정의되고;
이에 의해 대상체를 치료하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 염증성 및 면역 장애는 만성 염증성 장애이다. 일부 실시양태에서, 만성 염증성 장애는 염증성 장 질환이다.
일부 실시양태에서, 염증성 장 질환은 궤양성 결장염이다. 일부 실시양태에서, 염증성 장 질환은 크론병이다. 일부 실시양태에서, 염증성 장 질환은 육아종성 결장염이다. 일부 실시양태에서, 염증성 장 질환은 불확정 결장염이다. 일부 실시양태에서, 염증성 장 질환은 전환 결장염이다. 일부 실시양태에서, 염증성 장 질환은 낭염이다. 일부 실시양태에서, 염증성 장 질환은 베체트병이다. 일부 실시양태에서, 염증성 장 질환은 현미경적 결장염이다. 일부 실시양태에서, 염증성 장 질환은 게실증-연관 결장염이다. 일부 실시양태에서, 염증성 장 질환은 콜라겐성 결장염이다. 일부 실시양태에서, 염증성 장 질환은 림프구성 결장염이다. 일부 실시양태에서, 염증성 장 질환은 소아-발병 염증성 장 질환이다.
일부 측면에서, 대상체에서 단쇄 지방산의 상대 또는 절대 존재비를 증가시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 단쇄 지방산의 상대 또는 절대 존재비를 증가시키는 방법은 대상체의 위장관에 유효량의 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단쇄 지방산의 상대 또는 절대 존재비는 기준선 측정치 (예를 들어, 여기서 기준선 측정치는 치료 전에 결정됨)와 비교하여 적어도 5%, 10%, 20% 또는 30%만큼 증가된다.
일부 실시양태에서, 단쇄 지방산은 부티레이트, 아세테이트 및/또는 프로피오네이트이다.
일부 측면에서, 대상체에서 염증유발 및/또는 병원성 박테리아의 상대 또는 절대 존재비를 감소시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 염증유발 및/또는 병원성 박테리아의 상대 또는 절대 존재비를 감소시키는 방법은 대상체의 위장관에 유효량의 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염증유발 및/또는 병원성 박테리아는 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 및/또는 루미노코카세아에(Ruminococcaceae)이다.
일부 측면에서, 대상체에서 공생 박테리아의 상대 또는 절대 존재비를 증가시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 공생 박테리아의 상대 또는 절대 존재비를 증가시키는 방법은 대상체의 위장관에 유효량의 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 공생 박테리아는 파라박테로이데스(Parabacteroides) 및/또는 박테로이데스(Bacteroides)이다.
일부 실시양태에서, 대상체는 인간 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 신생아 (조산 신생아, 만삭 신생아), 1세 이하의 영유아, 어린 아동 (예를 들어, 1세 내지 12세), 청소년 (예를 들어, 13-19세), 성인 (예를 들어, 20-64세) 또는 노인 (예를 들어, 65세 이상)이다.
일부 실시양태에서, 방법은 장 (예를 들어, 대장)에 올리고사카라이드 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 대상체에게 자기-투여된다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 경구 전달을 위한 제약 조성물로서 제제화된다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 대상체에게 경구로 투여된다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 대상체에게 1일에 1회 또는 1일에 2회 투여된다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체 (예를 들어, 대상체의 위장관)에서 총 단쇄 지방산의 존재비 또는 농도를 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체 (예를 들어, 대상체의 위장관)에서 부티레이트의 존재비 또는 농도를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체 (예를 들어, 대상체의 위장관)에서 프로피오네이트의 존재비 또는 농도를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체 (예를 들어, 대상체의 위장관)에서 아세테이트의 존재비 또는 농도를 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 총 SCFA의 존재비는 기준선 측정치 (예를 들어, 여기서 기준선 측정치는 치료 전에 결정됨)에 비해 적어도 5%, 10%, 20% 또는 30%만큼 증가된다. 일부 실시양태에서, 부티레이트, 프로피오네이트 및 아세테이트 중 적어도 1종의 존재비는 기준선 측정치 (예를 들어, 여기서 기준선 측정치는 치료 전에 결정됨)에 비해 적어도 5%, 10%, 20% 또는 30%만큼 증가된다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체의 위장관의 마이크로바이옴 내에서 공생 박테리아의 성장을 촉진한다 (예를 들어, 그의 상대 존재비를 증가시킴). 일부 실시양태에서, 방법은 대상체의 위장관의 마이크로바이옴 내에서 파라박테로이데스 및 박테로이데스의 성장을 촉진한다 (예를 들어, 그의 상대 존재비를 증가시킴).
일부 실시양태에서, 방법은 대상체의 위장관의 마이크로바이옴 내에서 염증유발 및/또는 병원성 박테리아의 존재비의 감소를 유발한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체의 위장관의 마이크로바이옴 내에서 염증유발 엔테로박테리아세아에의 존재비의 감소를 유발한다.
일부 실시양태에서, 방법은 기준선 측정치에 비해, 대상체에 속하는 대변/분변 샘플에서 분변 칼프로텍틴, 분변 리포칼린 및/또는 분변 락토페린의 수준의 감소를 유발한다. 일부 실시양태에서, 분변 칼프로텍틴의 수준은 기준선 측정치에 비해 적어도 50%만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 분변 칼프로텍틴의 수준은 기준선 측정치에 비해 적어도 65%만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, 분변 락토페린의 수준은 기준선 측정치에 비해 적어도 50%만큼 감소된다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체의 위장관의 마이크로바이옴 내에서 부착-침습성 이. 콜라이와 연관된 유전자의 고갈을 유발한다. 일부 실시양태에서, 부착-침습성 이. 콜라이와 연관된 유전자는 fimH, ompA 및 ompC이다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 적어도 20, 30, 40 또는 50일 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 56일 또는 10주 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 20-100일, 임의로 50-75일 동안 투여된다.
일부 실시양태에서, 대상체는 궤양성 결장염을 가지며, 여기서 올리고사카라이드 조성물의 투여는 기준선 측정치에 비해 궤양성 결장염 질환 활성의 감소를 유발한다. 일부 실시양태에서, 궤양성 결장염 질환 활성의 감소는 간이 임상 결장염 활성 지수 (SCCAI) 복합 점수를 사용하여 측정된다.
일부 실시양태에서, 방법은 표준 관리 치료를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 표준 관리 치료는 5-ASA (메살라민), 아자티오프린, 베돌리주맙, 인플릭시맙 또는 아달리무맙이다.
일부 측면은 대상체, 임의로 염증성 질환을 나타내는 대상체에서 염증과 연관된 1종 이상의 바이오마커 (예를 들어, 분변 칼프로텍틴, 분변 리포칼린 및/또는 분변 락토페린)의 수준을 감소시키는 방법으로서, 대상체에게 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항의 올리고사카라이드 조성물을 기준선 측정치에 비해 1종 이상의 바이오마커의 수준을 감소시키는 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
일부 측면은 대상체, 임의로 염증성 질환을 나타내는 대상체에서 1종 이상의 유해균 (예를 들어, 염증유발 박테리아 분류군, 예컨대 엔테로박테리아세아에)의 존재비를 감소시키는 방법으로서, 대상체에게 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항의 올리고사카라이드 조성물을 1종 이상의 유해균의 존재비를 감소시키는 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
일부 측면은 대상체, 임의로 염증성 질환을 나타내는 대상체에서 1종 이상의 공생균 분류군 (예를 들어, 파라박테로이데스 및 박테로이데스)의 존재비를 증가시키는 방법으로서, 대상체에게 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항의 올리고사카라이드 조성물을 1종 이상의 공생균 분류군의 존재비를 증가시키는 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 바이오마커의 수준, 1종 이상의 유해균의 존재비 및/또는 1종 이상의 공생균 분류군의 존재비는 대상체로부터의 분변/대변 샘플에서 측정된다.
도 1은 음성 대조군 (물)에 비해 8명의 건강한 인간 대상체로부터의 분변 샘플에서 부티레이트의 농도의 증가를 가져오는 선택된 올리고사카라이드 조성물의 능력을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 2a-2b는 음성 대조군 (물)에 비해 8명의 건강한 인간 대상체로부터의 분변 샘플에서 단쇄 지방산 (부티레이트, 프로피오네이트 및 아세테이트)의 농도의 증가를 가져오는 선택된 올리고사카라이드 조성물의 능력을 보여주는 그래프를 제공한다. 도 2a는 시험된 분변 샘플에 걸쳐 생산된 단쇄 지방산의 중앙 양 (mM 단위)을 보여준다. 도 2b는 각각의 시험된 분변 샘플에서 생산된 부티레이트, 프로피오네이트 및 아세테이트의 상대 비율을 보여준다.
도 3a-3b는 음성 대조군 (물)에 비해 8명의 건강한 인간 대상체로부터의 분변 샘플에서 병원성 및 공생 박테리아의 존재비를 조정하는 선택된 올리고사카라이드 조성물의 능력을 보여주는 그래프를 제공한다. 도 3a는 선택된 올리고사카라이드 조성물이 병원성 속 (엔테로박테리아세아에)의 상대 존재비의 감소를 유발한다는 것을 보여준다. 도 3b는 선택된 올리고사카라이드 조성물이 공생균 속 (파라박테로이데스 및 박테로이데스)의 상대 존재비의 증가를 유발한다는 것을 보여준다.
도 4는 궤양성 결장염 (UC)을 갖는 대상체에서 선택된 올리고사카라이드 조성물의 안전성 및 내약성, 뿐만 아니라 마이크로바이옴 변화 및 선택된 올리고사카라이드 조성물에 의해 조정되는 염증 바이오마커의 변화를 평가하기 위한 임상 식품 연구 시험에 대한 개략적 설계를 제공한다.
도 5는 예시적인 HSQC NMR 펄스 시퀀스 다이어그램을 제공한다.
도 6a-6c는 선택된 올리고사카라이드 조성물에 관한 HSQC NMR 데이터를 제공한다. 도 6a는 실시예 8에 기재된 방법을 사용하여 수득된 선택된 올리고사카라이드의 HSQC NMR 스펙트럼을 보여준다 (F2 차원 = 1H; F1 차원 = 13C). 도 6b는 타원형 형상을 사용하여 선택된 올리고사카라이드 조성물의 HSQC NMR 피크/신호 1-11의 좌표를 정의하는 적분 영역을 보여준다 (F2 차원 = 1H; F1 차원 = 13C). 도 6c는 장축 좌표 (F2 차원; 1H) 및 단축 좌표 (F1 차원; 13C)에 의해 정의된 타원형 형상의 예를 보여준다.
도 7a-7b는 실시예 8에 기재된 방법을 사용하여 수득된 선택된 올리고사카라이드의 HSQC NMR 스펙트럼의 영상을 제공한다 (F2 차원 = 1H; F1 차원 = 13C). 도 7a는 비-아노머 영역의 확대도를 보여준다. 주석은 선택된 올리고사카라이드 내에 존재하는 별개의 결합 유형의 할당된 위치; 및 선택된 올리고사카라이드 조성물의 피크/신호 7-11을 나타낸다. 도 7b는 아노머 영역의 확대도를 보여준다. 주석은 선택된 올리고사카라이드 내에 존재하는 별개의 결합 유형의 할당된 위치; 및 선택된 올리고사카라이드 조성물의 피크/신호 1-6을 나타낸다.
도 8은 물의 존재 하에 6시간의 기간에 걸쳐 다양한 온도에서 선택된 올리고사카라이드 조성물을 유지하는 효과를 입증하는 그래프를 제공한다.
도 9는 선택된 올리고사카라이드 조성물이 장 염증을 감소시키는 것으로 생각되는 예시적인 메카니즘을 제공한다.
도 10은 음성 대조군 (물)과 비교하여 10명의 건강한 인간 대상체로부터의 분변 샘플에서 총 단쇄 지방산 (SCFA) 및 개별 SCFA (아세테이트, 프로피오네이트 및 부티레이트)의 농도를 증가시키는 선택된 올리고사카라이드 조성물의 능력을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 11은 선택된 올리고사카라이드 조성물이 음성 대조군 (물)과 비교하여 10명의 건강한 인간 대상체로부터의 분변 샘플에서 마이크로바이옴의 조성을 이동시킨다는 것을 보여주는 브레이-커티스(Bray-Curtis) 비계량적 다차원 척도법 (NMDS) 오디네이션 플롯을 제공한다. 플롯 내의 각각의 데이터 포인트는 개별 분변 샘플로부터의 마이크로바이옴 조성을 나타낸다. 원형으로 표시된 데이터 포인트는 선택된 올리고사카라이드 조성물과 함께 인큐베이션된 샘플을 나타낸다.
도 12는 음성 대조군 (물)과 비교하여 선택된 올리고사카라이드 조성물과 함께 인큐베이션된 후 건강한 대상체로부터의 10개의 분변 샘플 (행)에서 박테리아 분류군 (열)의 상대 존재비의 log2-배수 변화를 보여주는 히트맵을 제공한다. 샘플에 걸쳐 고갈된 분류군 (유해균 포함)이 히트맵의 좌측에 나타나 있고; 풍부화된 분류군 (공생균 포함)이 히트맵의 중심 및 우측에 나타나 있다.
도 13a-13b는 음성 대조군 (물)에 비해 8명의 건강한 인간 대상체로부터의 분변 샘플에서 유해균 및 공생 박테리아의 존재비를 조정하는 선택된 올리고사카라이드 조성물의 능력을 보여주는 그래프를 제공한다. 도 13a는 공생균 속 (파라박테로이데스)의 상대 존재비에 대한 선택된 올리고사카라이드 조성물의 효과를 보여준다. 도 13b는 유해균 속 (엔테로박테리아세아에)의 상대 존재비에 대한 선택된 올리고사카라이드 조성물의 효과를 보여준다.
도 14a-14b는 음성 대조군 (최소 성장을 평가하기 위한, 첨가된 탄소 공급원이 없는 물) 및 양성 대조군 (검정의 최대 성장 능력을 평가하기 위한, 범용 탄소 공급원으로서의 글루코스)과 함께, 단일-균주 검정에서 공생 박테리아 분류군 (도 14a) (파라박테로이데스 메르다에(Parabacteroides merdae), 파라박테로이데스 디스타소니스(Parabacteroides distasonis), 박테로이데스 우니포르미스(Bacteroides uniformis), 박테로이데스 세타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron) 및 박테로이데스 칵카에(Bacteroides caccae)) 및 유해균 분류군 (도 14b) (에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 클레브시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae) 및 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica))의 성장에 대한 선택된 올리고사카라이드 조성물의 효과를 보여주는 그래프를 제공한다.
도 15a-15b는 실시예 11에 기재된 임상 시험에의 참여 후 궤양성 결장염 (UC) 인간 환자에서 분변 바이오마커의 수준을 감소시키는 선택된 올리고사카라이드 조성물의 능력을 보여주는 그래프를 제공한다. 도 15a는 데이터 세트로서 (좌측) 및 각각의 개체에 대해 (우측) 플롯팅된, 스크리닝 시 및 섭취 종료 시 (도 4 참조)의 환자의 분변 샘플에서의 분변 칼프로텍틴의 수준을 보여준다. 도 15b는 데이터 세트로서 (좌측) 및 각각의 개체에 대해 (우측) 플롯팅된, 섭취 전 및 섭취 종료 시 (도 4 참조)의 환자의 분변 샘플에서의 분변 락토페린의 수준을 보여준다.
도 16은 데이터 세트로서 (좌측) 및 각각의 개체에 대해 (우측) 플롯팅된, 섭취 전 및 섭취 종료 시 (도 4 참조)의, 실시예 11에 기재된 임상 시험에서 선택된 올리고사카라이드 조성물의 투여 후 궤양성 결장염 (UC) 환자에 대한 간이 임상 결장염 활성 지수 (SCCAI) 복합 점수를 제공한다.
도 17a-17b는 데이터 세트로서 (좌측) 및 각각의 개체에 대해 (우측) 플롯팅된, 섭취 전 및 섭취 종료 시 (도 4 참조)의, 실시예 11에 기재된 임상 시험에의 참여 후 5명의 궤양성 결장염 (UC) 환자로부터의 분변 샘플에서 선택된 병원성 및 공생 박테리아 분류군의 존재비를 보여주는 그래프를 제공한다. 도 17a는 파라박테로이데스 분류군의 상대 존재비를 보여준다. 도 17b는 엔테로박테리아세아에 분류군의 상대 존재비를 보여준다.
도 18은 데이터 세트로서 (좌측) 및 각각의 개체에 대해 (우측) 플롯팅된, 섭취 전 및 섭취 종료 시 (도 4 참조)의, 실시예 11에 기재된 임상 시험에의 참여 후 궤양성 결장염 (UC) 환자의 분변 샘플에서 부착-침습성 이. 콜라이와 연관된 3종의 유전자 (fimH, ompA 및 ompC)의 변화를 보여주는 그래프를 제공한다.
도 19는 선택된 올리고사카라이드 조성물을 확인하기 위해 수행된 스크리닝 노력을 보여주는 그래프를 제공하며, 이는 스크리닝된 선택된 올리고사카라이드 중 431종의 합성 올리고사카라이드에 걸친 평균 부티레이트 생산을 나타낸다.
도 20은 경도 내지 중등도 활성 궤양성 결장염을 갖는 환자를 치료하는 선택된 올리고사카라이드 조성물의 능력을 평가하기 위한 임상 연구에 대한 개략적 설계를 제공한다.
도 2a-2b는 음성 대조군 (물)에 비해 8명의 건강한 인간 대상체로부터의 분변 샘플에서 단쇄 지방산 (부티레이트, 프로피오네이트 및 아세테이트)의 농도의 증가를 가져오는 선택된 올리고사카라이드 조성물의 능력을 보여주는 그래프를 제공한다. 도 2a는 시험된 분변 샘플에 걸쳐 생산된 단쇄 지방산의 중앙 양 (mM 단위)을 보여준다. 도 2b는 각각의 시험된 분변 샘플에서 생산된 부티레이트, 프로피오네이트 및 아세테이트의 상대 비율을 보여준다.
도 3a-3b는 음성 대조군 (물)에 비해 8명의 건강한 인간 대상체로부터의 분변 샘플에서 병원성 및 공생 박테리아의 존재비를 조정하는 선택된 올리고사카라이드 조성물의 능력을 보여주는 그래프를 제공한다. 도 3a는 선택된 올리고사카라이드 조성물이 병원성 속 (엔테로박테리아세아에)의 상대 존재비의 감소를 유발한다는 것을 보여준다. 도 3b는 선택된 올리고사카라이드 조성물이 공생균 속 (파라박테로이데스 및 박테로이데스)의 상대 존재비의 증가를 유발한다는 것을 보여준다.
도 4는 궤양성 결장염 (UC)을 갖는 대상체에서 선택된 올리고사카라이드 조성물의 안전성 및 내약성, 뿐만 아니라 마이크로바이옴 변화 및 선택된 올리고사카라이드 조성물에 의해 조정되는 염증 바이오마커의 변화를 평가하기 위한 임상 식품 연구 시험에 대한 개략적 설계를 제공한다.
도 5는 예시적인 HSQC NMR 펄스 시퀀스 다이어그램을 제공한다.
도 6a-6c는 선택된 올리고사카라이드 조성물에 관한 HSQC NMR 데이터를 제공한다. 도 6a는 실시예 8에 기재된 방법을 사용하여 수득된 선택된 올리고사카라이드의 HSQC NMR 스펙트럼을 보여준다 (F2 차원 = 1H; F1 차원 = 13C). 도 6b는 타원형 형상을 사용하여 선택된 올리고사카라이드 조성물의 HSQC NMR 피크/신호 1-11의 좌표를 정의하는 적분 영역을 보여준다 (F2 차원 = 1H; F1 차원 = 13C). 도 6c는 장축 좌표 (F2 차원; 1H) 및 단축 좌표 (F1 차원; 13C)에 의해 정의된 타원형 형상의 예를 보여준다.
도 7a-7b는 실시예 8에 기재된 방법을 사용하여 수득된 선택된 올리고사카라이드의 HSQC NMR 스펙트럼의 영상을 제공한다 (F2 차원 = 1H; F1 차원 = 13C). 도 7a는 비-아노머 영역의 확대도를 보여준다. 주석은 선택된 올리고사카라이드 내에 존재하는 별개의 결합 유형의 할당된 위치; 및 선택된 올리고사카라이드 조성물의 피크/신호 7-11을 나타낸다. 도 7b는 아노머 영역의 확대도를 보여준다. 주석은 선택된 올리고사카라이드 내에 존재하는 별개의 결합 유형의 할당된 위치; 및 선택된 올리고사카라이드 조성물의 피크/신호 1-6을 나타낸다.
도 8은 물의 존재 하에 6시간의 기간에 걸쳐 다양한 온도에서 선택된 올리고사카라이드 조성물을 유지하는 효과를 입증하는 그래프를 제공한다.
도 9는 선택된 올리고사카라이드 조성물이 장 염증을 감소시키는 것으로 생각되는 예시적인 메카니즘을 제공한다.
도 10은 음성 대조군 (물)과 비교하여 10명의 건강한 인간 대상체로부터의 분변 샘플에서 총 단쇄 지방산 (SCFA) 및 개별 SCFA (아세테이트, 프로피오네이트 및 부티레이트)의 농도를 증가시키는 선택된 올리고사카라이드 조성물의 능력을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 11은 선택된 올리고사카라이드 조성물이 음성 대조군 (물)과 비교하여 10명의 건강한 인간 대상체로부터의 분변 샘플에서 마이크로바이옴의 조성을 이동시킨다는 것을 보여주는 브레이-커티스(Bray-Curtis) 비계량적 다차원 척도법 (NMDS) 오디네이션 플롯을 제공한다. 플롯 내의 각각의 데이터 포인트는 개별 분변 샘플로부터의 마이크로바이옴 조성을 나타낸다. 원형으로 표시된 데이터 포인트는 선택된 올리고사카라이드 조성물과 함께 인큐베이션된 샘플을 나타낸다.
도 12는 음성 대조군 (물)과 비교하여 선택된 올리고사카라이드 조성물과 함께 인큐베이션된 후 건강한 대상체로부터의 10개의 분변 샘플 (행)에서 박테리아 분류군 (열)의 상대 존재비의 log2-배수 변화를 보여주는 히트맵을 제공한다. 샘플에 걸쳐 고갈된 분류군 (유해균 포함)이 히트맵의 좌측에 나타나 있고; 풍부화된 분류군 (공생균 포함)이 히트맵의 중심 및 우측에 나타나 있다.
도 13a-13b는 음성 대조군 (물)에 비해 8명의 건강한 인간 대상체로부터의 분변 샘플에서 유해균 및 공생 박테리아의 존재비를 조정하는 선택된 올리고사카라이드 조성물의 능력을 보여주는 그래프를 제공한다. 도 13a는 공생균 속 (파라박테로이데스)의 상대 존재비에 대한 선택된 올리고사카라이드 조성물의 효과를 보여준다. 도 13b는 유해균 속 (엔테로박테리아세아에)의 상대 존재비에 대한 선택된 올리고사카라이드 조성물의 효과를 보여준다.
도 14a-14b는 음성 대조군 (최소 성장을 평가하기 위한, 첨가된 탄소 공급원이 없는 물) 및 양성 대조군 (검정의 최대 성장 능력을 평가하기 위한, 범용 탄소 공급원으로서의 글루코스)과 함께, 단일-균주 검정에서 공생 박테리아 분류군 (도 14a) (파라박테로이데스 메르다에(Parabacteroides merdae), 파라박테로이데스 디스타소니스(Parabacteroides distasonis), 박테로이데스 우니포르미스(Bacteroides uniformis), 박테로이데스 세타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron) 및 박테로이데스 칵카에(Bacteroides caccae)) 및 유해균 분류군 (도 14b) (에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 클레브시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae) 및 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica))의 성장에 대한 선택된 올리고사카라이드 조성물의 효과를 보여주는 그래프를 제공한다.
도 15a-15b는 실시예 11에 기재된 임상 시험에의 참여 후 궤양성 결장염 (UC) 인간 환자에서 분변 바이오마커의 수준을 감소시키는 선택된 올리고사카라이드 조성물의 능력을 보여주는 그래프를 제공한다. 도 15a는 데이터 세트로서 (좌측) 및 각각의 개체에 대해 (우측) 플롯팅된, 스크리닝 시 및 섭취 종료 시 (도 4 참조)의 환자의 분변 샘플에서의 분변 칼프로텍틴의 수준을 보여준다. 도 15b는 데이터 세트로서 (좌측) 및 각각의 개체에 대해 (우측) 플롯팅된, 섭취 전 및 섭취 종료 시 (도 4 참조)의 환자의 분변 샘플에서의 분변 락토페린의 수준을 보여준다.
도 16은 데이터 세트로서 (좌측) 및 각각의 개체에 대해 (우측) 플롯팅된, 섭취 전 및 섭취 종료 시 (도 4 참조)의, 실시예 11에 기재된 임상 시험에서 선택된 올리고사카라이드 조성물의 투여 후 궤양성 결장염 (UC) 환자에 대한 간이 임상 결장염 활성 지수 (SCCAI) 복합 점수를 제공한다.
도 17a-17b는 데이터 세트로서 (좌측) 및 각각의 개체에 대해 (우측) 플롯팅된, 섭취 전 및 섭취 종료 시 (도 4 참조)의, 실시예 11에 기재된 임상 시험에의 참여 후 5명의 궤양성 결장염 (UC) 환자로부터의 분변 샘플에서 선택된 병원성 및 공생 박테리아 분류군의 존재비를 보여주는 그래프를 제공한다. 도 17a는 파라박테로이데스 분류군의 상대 존재비를 보여준다. 도 17b는 엔테로박테리아세아에 분류군의 상대 존재비를 보여준다.
도 18은 데이터 세트로서 (좌측) 및 각각의 개체에 대해 (우측) 플롯팅된, 섭취 전 및 섭취 종료 시 (도 4 참조)의, 실시예 11에 기재된 임상 시험에의 참여 후 궤양성 결장염 (UC) 환자의 분변 샘플에서 부착-침습성 이. 콜라이와 연관된 3종의 유전자 (fimH, ompA 및 ompC)의 변화를 보여주는 그래프를 제공한다.
도 19는 선택된 올리고사카라이드 조성물을 확인하기 위해 수행된 스크리닝 노력을 보여주는 그래프를 제공하며, 이는 스크리닝된 선택된 올리고사카라이드 중 431종의 합성 올리고사카라이드에 걸친 평균 부티레이트 생산을 나타낸다.
도 20은 경도 내지 중등도 활성 궤양성 결장염을 갖는 환자를 치료하는 선택된 올리고사카라이드 조성물의 능력을 평가하기 위한 임상 연구에 대한 개략적 설계를 제공한다.
본원에 기재된 조성물 및 방법은 올리고사카라이드 조성물이 대상체에서 염증을 감소시키는 데 유용하다는 발견에 기초한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물은 대상체에서 증가된 수준의 단쇄 지방산 (SCFA), 예컨대 부티레이트, 프로피오네이트 및 아세테이트를 생산하는 데 유용하다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물은 대상체 (예를 들어, 대상체의 위장관)에서 공생 미생물 (예를 들어, 파라박테로이데스 및 박테로이데스)에 비해 염증유발 미생물 분류군 (예를 들어, 엔테로박테리아세아에 과로부터의 분류군)의 존재비를 감소시키는 데 유용하다. 일부 실시양태에서, 염증은 대상체에서 SCFA의 증가된 수준 및/또는 대상체 (예를 들어, 대상체의 위장관)에서 염증유발 미생물의 감소된 상대 존재비로 인해 대상체에서 감소된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물은 자가면역 및 알레르기성 장애를 포함한 염증성 및 면역 장애를 치료하는 데 유용하다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물은 만성 염증성 장애, 예를 들어 염증성 장 질환을 치료하는 데 유용하다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물은 염증성 장 질환, 예컨대 궤양성 결장염 (UC), 크론병 (CD), 육아종성 결장염, 불확정 결장염, 전환 결장염, 낭염, 베체트병, 현미경적 결장염, 게실증-연관 결장염, 콜라겐성 결장염, 림프구성 결장염 및 소아-발병 염증성 장 질환을 치료하는 데 유용하다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물은 염증성 장 질환, 예컨대 궤양성 결장염 (UC)을 치료하는 데 유용하다.
본 개시내용의 일부 측면은 대상체에서 상이한 유형의 단쇄 지방산, 예를 들어 부티레이트, 프로피오네이트 및 아세테이트의 농도를 조정, 예를 들어 증가시킬 수 있는 올리고사카라이드 조성물을 확인하기 위해 수행된 광범위한 스크리닝 노력의 결과에 기초한다. 수백종의 고유한 올리고사카라이드 조성물을 생체외 맥락에서 인간 위장관의 마이크로바이옴에 대한 그의 효과에 대해 검정하였다. 스크린에서 조사된 올리고사카라이드 조성물은 상이한 사카라이드 단량체, 예를 들어 덱스트로스 단량체, 크실로스 단량체 등을 사용하여, 상이한 반응 온도를 수반하는 조건 하에, 다양한 기간 동안 및/또는 상이한 촉매 조건의 존재 하에 제조되었다. 이러한 스크리닝 노력으로부터, 선택된 올리고사카라이드 조성물은 SCFA, 예를 들어 부티레이트, 프로피오네이트 및 아세테이트의 고도로 효과적인 조정제로서 확인되었다.
SCFA, 예컨대 부티레이트, 프로피오네이트 및 아세테이트는 대상체의 위장관에서 건강한 상피 기능, 면역 항상성 및 염증의 유지에 중요한 역할을 한다. 추가적으로, SCFA는 장 상피를 자극하여 병원성 박테리아에 대한 콜로니화 저항성을 발휘하도록 하고, 위장관에서 조절 T 세포의 분화 및 기능을 촉진한다. 부티레이트는 위장관의 상피 세포에 대한 에너지 공급원으로서 사용되고, 상피 완전성의 유지를 촉진한다. 상피 완전성의 유지는 선천성 및 적응성 면역 세포의 부적절한 활성화를 방지하는 데 중요하다. 부티레이트는 상피 및 면역 세포의 표면 상에 디스플레이된 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR)를 활성화시킬 뿐만 아니라, 이들 세포 유형의 핵에서 히스톤 데아세틸라제를 억제한다. 이들 숙주 세포 표적의 결속은 위장관에서 면역 기능 및 면역 항상성의 적절한 균형을 촉진한다. 프로피오네이트는 또한 이들 동일한 GPCR을 활성화시킴으로써 장 면역 항상성을 촉진할 수 있다. 대상체의 위장관에서 이들 SCFA의 증가된 수준은 위장관에서의 염증의 감소 및/또는 염증의 가능성 감소에 상응한다. 따라서, 대상체에게 본원에 기재된 선택된 올리고사카라이드 조성물을 투여하는 것은 상기 대상체에서 SCFA 수준의 증가를 유발하고, 궁극적으로 위장관에서 염증의 감소 및/또는 염증의 가능성 감소를 유발한다.
증가된 수준의 SCFA를 생산하는 것에 추가로, 선택된 올리고사카라이드 조성물의 발효는 공생 박테리아 (예를 들어, 파라박테로이데스 및 박테로이데스)의 성장을 유발하고, 위장관에서 영양적으로 경쟁적인 생태계를 생성한다. 이러한 경쟁적 환경은 장 항상성을 파괴하고 유해한 염증성 면역 반응을 자극할 수 있는 염증유발 병원성 박테리아 (예를 들어, 엔테로박테리아세아에 과로부터의 분류군)에 의한 콜로니화를 방지, 둔화 또는 제한하는 것을 돕는다. 선택된 올리고사카라이드 조성물의 투여로부터 발생하는, 염증유발 미생물의 상대 존재비를 감소시키는 위장관의 미생물 생태계의 이동은 위장관에서 염증의 감소 및/또는 염증의 가능성 감소를 유발한다.
따라서, 일부 실시양태에서, 이 올리고사카라이드 조성물은 장내 미생물 불균형, 공생 박테리아에 비해 병원성 박테리아의 높은 상대 존재비 및/또는 SCFA의 낮은 수준을 갖는 대상체를 치료하는 데 특히 유용하다. 일부 실시양태에서, 선택된 올리고사카라이드 조성물은 염증성 및 면역 장애를 치료하는 데 유용하다. 일부 실시양태에서, 선택된 올리고사카라이드 조성물은 자가면역 및 알레르기성 장애를 치료하는 데 유용하다. 일부 실시양태에서, 선택된 올리고사카라이드 조성물은 만성 염증성 장애를 치료하는 데 유용하다. 일부 실시양태에서, 선택된 올리고사카라이드 조성물은 염증성 장 질환 (예를 들어, 궤양성 결장염 (UC), 크론병 (CD), 육아종성 결장염, 불확정 결장염, 전환 결장염, 낭염, 베체트병, 현미경적 결장염, 게실증-연관 결장염, 콜라겐성 결장염, 림프구성 결장염 및 소아-발병 염증성 장 질환)을 치료하는 데 유용하다. 염증성 및 면역 장애, 특히 위장관에 영향을 미치는 만성 염증성 장애 (예를 들어, 염증성 장 질환)의 특징은 장 미생물총의 조성, 장내 미생물 불균형에서의 현저한 변경이며, 염증유발 분류군 (예를 들어, 엔테로박테리아세아에 과로부터의 분류군)의 존재의 증가 및 정상 면역 활성과 연관된 공생균 다양성의 감소를 나타내는 다수의 임상 연구에 걸친 재현가능한 발견이 존재한다. 따라서, 대상체의 위장관에서 단쇄 지방산의 증가된 생산 및/또는 염증유발 박테리아에 비해 공생 박테리아의 존재비의 증가 (예를 들어, 대상체의 위장관에 본원에 기재된 바와 같은 선택된 올리고사카라이드 조성물을 투여하는 것으로부터 발생됨)는 염증성 및 면역 장애, 예컨대 만성 염증성 장애 (예를 들어, 염증성 장 질환, 예를 들어 궤양성 결장염 또는 크론병)의 치료로 이어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 선택된 올리고사카라이드 조성물은 (a) 유익한 박테리아에 의한 성장, 대사 및/또는 영양소 이용을 자극하여 영양소 경쟁을 통해 병원성 성장을 간접적으로 제한함으로써; 및/또는 염증을 감소시키는 데 있어서 장 상피 기능을 지지하는 SCFA 및 다른 미생물 대사물의 생산을 촉진함으로써 염증, 예를 들어 만성 소화관 및/또는 전신 염증 (예를 들어, 궤양성 결장염과 연관된 염증)을 감소시키는 기능을 한다. 일부 실시양태에서, 선택된 올리고사카라이드 조성물은 도 9에 기재된 1개 이상 또는 모든 메카니즘을 사용하여 염증을 감소시키는 것으로 생각되며, 여기서 예를 들어 올리고사카라이드 조성물은 SCFA 및 다른 유용한 대사물을 생산하는 유익한 분류군 (예를 들어, 공생균 분류군)의 성장을 우선적으로 지지하고, (박테리아) 유해균 또는 병원체의 성장은 지지하지 않는다. SCFA 및 다른 대사물은 장 상피를 지지하고, 장 염증을 조정하며, 이는 결국 장벽 기능의 개선으로 이어질 수 있다. 숙주 상피 및 장 미생물총에서의 이들 변화는 UC 대상체에서 GI 관 염증을 직접적으로 저하시킬 수 있고; 전신 염증을 추가로 제한할 수 있다.
일부 실시양태에서, 선택된 올리고사카라이드 조성물은 염증성 장 질환, 예컨대 궤양성 결장염 (UC)을 치료하는 데 유용하다. 궤양성 결장염은 대장 및 직장의 점막에서의 재발성 염증 및 궤양을 유발한다. UC의 정확한 병리생리상태는 공지되어 있지 않지만, 다수의 계통의 증거는 질환이 장 항상성을 변경시키는 유전적 및 환경적 요인의 융합에 의해 유발되어, 이에 의해 면역-매개 염증을 촉발한다는 것을 시사한다. UC는 질환 활성 및 진행의 3가지 군 - 경도 활성 (변형된 메이요(Mayo) 점수 2-4), 중등도 활성 (변형된 메이요 점수 5-7) 및 중증 활성 (변형된 메이요 점수 8-9)을 포함한다. 경도 UC 활성을 갖는 대상체는 일반적으로 1일에 4회 이하의 혈액 동반 또는 비동반 대변을 보고, 표재성 점막에서의 제한된 홍반을 가지며, 전형적으로 완화를 촉진하는 장기 5-ASA 및 플레어를 통상적으로 관리하는 단기-과정 스테로이드를 사용한 생물제제에 대해 나이브이다. 중등도 UC 활성을 갖는 대상체는 일반적으로 1일에 5회 이상의 대변을 보고, 설사로 인한 경도이지만 증가하는 빈혈과 내시경검사에서의 결장의 중등도 궤양화를 갖는다. 중등도 UC 활성을 갖는 전형적인 대상체는 5-ASA 치료 후에 경도에서 중등도로 진행되고, 전형적으로 IS/스테로이드 및 초기-차수의 생물제제 (예를 들어, 항-TNF, 베돌리주맙)로 치료된다. 중증 UC 활성을 갖는 대상체는 일반적으로 내시경검사에서 점막 혈관 표식의 소실을 드러내는 다량의 혈성 설사로 1일에 8회 이상의 대변을 본다. 중등도에서 중증으로 진행되는 환자는 주로 생물제제 및 소분자로 치료되며, 결장절제술은 마지막-차수의 옵션으로서 간주된다.
대다수의 UC 환자는 30 내지 40세 남성에서 약간 상승된 유병률로 진단되고 (남성이 UC 환자의 ~60%를 차지함), 그의 30대 내지 50대 사이에 그의 최악의 증상을 경험한다. 환자가 나이듦에 따라, 그의 UC 질환 활성은 감소하는 경향이 있다. 유전적 소인이 UC 발생에 대한 주요 위험 인자로 간주되지만, 환경적 촉발인자도 염증의 발병에 필요할 수 있는 것으로 시사되었다. UC 환자는 종종 자가면역 장외 징후 (예를 들어, 류마티스 관절염, 원발성 경화성 담관염)의 형태로 동반이환을 경험하고, 따라서 그의 UC 치료에 추가로, 다른 자가면역 상태에 대한 추가의 의학적 또는 약리학적 개입을 요구할 수 있다.
UC는 미생물 분변 시험, 내시경검사, 바이오마커 분석 및 상용 혈액 패널을 사용하여 진단될 수 있다. 초기 미생물 분변 시험은 PCR을 통해 결장 염증의 감염성 원인 (예를 들어, 살모넬라(Salmonella), 씨. 디피실레(C. Difficile), 캄필로박터(Campylobacter) 감염)을 결정하는 데 사용될 수 있으며, 현미경적 분변 분석이 또한 통상의 장 기생충에 대해 수행될 수 있다. UC 진단은, 예를 들어 결장 점막에 걸친 연속 궤양화를 확인하기 위해 내시경검사에 의해 확인될 수 있다 (반면에 이환 조직의 "스킵 영역"은 크론 진단을 지지함). UC 진단을 위한 바이오마커 분석은, 일부 실시양태에서, 완화를 모니터링하기 위한 C-반응성 단백질 (CRP) 수준의 매년 시험을 포함한다.
일부 실시양태에서, 선택된 올리고사카라이드 조성물은 염증성 장 질환, 예컨대 크론병 (CD)을 치료하는 데 유용하다. 크론병은 위장관 (특히 소장 및 결장의 마지막 절편에서)의 염증을 유발하여, 복통, 중증 설사, 피로, 체중 감소 및 영양실조로 이어진다.
일부 실시양태에서, 선택된 올리고사카라이드 조성물은 염증성 장 질환, 예컨대 육아종성 결장염을 치료하는 데 유용하다. 육아종성 결장염은 위장관의 염증, 벽 비후 및 벽 계층화의 소실을 유발한다. 일부 실시양태에서, 육아종성 결장염은 회장 말단부에서 가장 우세하다.
일부 실시양태에서, 선택된 올리고사카라이드 조성물은 염증성 장 질환, 예컨대 불확정 결장염을 치료하는 데 유용하다. 불확정 결장염은 위장관의 염증 및 염증성 장 질환의 전형적 증상을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 조직학 결과가 어떠한 다른 염증성 장 질환 (예를 들어, UC 또는 CD)에 대해서도 결정적이지 않기 때문에 불확정 결장염으로 진단된다.
일부 실시양태에서, 선택된 올리고사카라이드 조성물은 염증성 장 질환, 예컨대 전환 결장염을 치료하는 데 유용하다. 전환 결장염은 외과적 수술 (예를 들어, 회장조루술 또는 결장조루술)의 합병증으로부터 발생하는 결장의 염증이며, 종종 수술 후 1년 내에 발생한다.
일부 실시양태에서, 선택된 올리고사카라이드 조성물은 염증성 장 질환, 예컨대 낭염을 치료하는 데 유용하다. 낭염은 다른 염증성 장 질환, 예컨대 궤양성 결장염 또는 위장관의 다른 질환, 특정 다른 질환을 치료하기 위한 외과적 수술 (예를 들어, J 낭 수술) 동안 생성된 낭 내벽에서의 염증이다. J 낭 수술을 받는 환자의 대략 25-50%는 낭염을 경험한다.
일부 실시양태에서, 선택된 올리고사카라이드 조성물은 염증성 장 질환, 예컨대 베체트병을 치료하는 데 유용하다. 베체트병은 신체 전반에 걸쳐 혈관 염증을 유발하는 희귀 장애이다. 일부 실시양태에서, 위장관은 중등도 내지 중증 염증, 복통, 설사 및 출혈을 경험한다.
일부 실시양태에서, 선택된 올리고사카라이드 조성물은 염증성 장 질환, 예컨대 현미경적 결장염을 치료하는 데 유용하다. 현미경적 결장염은 지속적인 물설사를 유발하는 대장의 염증을 유발한다. 일부 실시양태에서, 현미경적 결장염은 콜라겐성 결장염 (결장 조직에서의 콜라겐의 두꺼운 층을 특징으로 함), 림프구성 결장염 (결장 조직에서의 증가된 림프구를 특징으로 함) 또는 불완전한 현미경적 결장염 (콜라겐성 및 림프구성 결장염의 특색의 조합을 특징으로 함)으로 추가로 분류된다.
일부 실시양태에서, 선택된 올리고사카라이드 조성물은 염증성 장 질환, 예컨대 게실증-연관 결장염을 치료하는 데 유용하다. 게실증-연관 결장염은 게실 질환에 의해 이환된 S자형 결장에서의 만성 염증을 특징으로 한다. 염증은 내강 점막에 위치할 수 있다.
일부 실시양태에서, 선택된 올리고사카라이드 조성물은 염증성 장 질환, 예컨대 소아-발병 염증성 장 질환을 치료하는 데 유용하다. 전형적으로 결장에서 염증을 유발하고 표준 관리 의약에 대해 저항성일 수 있는 소아-발병 염증성 장 질환은 17세 미만의 사람에게 이환된다. 일부 실시양태에서, 소아-발병 염증성 장 질환은 조기-발병 염증성 장 질환 (10세 미만의 질환 발병을 특징으로 함), 매우 조기-발병의 염증성 장 질환 (6세 미만의 질환 발병을 특징으로 함), 영아 염증성 장 질환 (2세 미만의 질환 발병을 특징으로 함) 또는 신생아 염증성 장 질환 (생후 28일 미만의 질환 발병을 특징으로 함)으로 추가로 분류된다.
정의된 용어의 설명을 포함한 본 개시내용의 추가 측면이 하기에 제공된다.
I. 정의
교반 조건: 본원에 사용된 용어 "교반 조건"은 고체 (예를 들어, 고체 촉매)의 분산, 열 전달의 균일성 또는 다른 유사한 파라미터와 관련하여 혼합물 (예를 들어, 갈락토스 단량체를 포함하는 반응 혼합물)의 실질적으로 균일한 또는 균질한 상태를 촉진 또는 유지하는 조건을 지칭한다. 교반 조건은 일반적으로 반응 혼합물의 교반, 진탕 및/또는 혼합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 교반 조건은 기체 또는 다른 액체를 용액에 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 교반 조건은 촉매, 예를 들어 산 촉매의 실질적으로 균일한 또는 균질한 분포를 유지하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 모노사카라이드 제제는 올리고사카라이드 조성물을 합성하기 위해 균질성 및 균일한 열 전달을 달성하기에 적합한 조건 하에 산 촉매의 존재 하에 가열된다.
대략: 본원에 사용된 용어 "대략" 또는 "약"은 1개 이상의 관심 값에 적용 시, 언급된 참조 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 언급되지 않는 한 또는 달리 문맥으로부터 명백하지 않는 한, 언급된 참조 값의 어느 한 방향 (초과 또는 미만)으로 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 미만 내에 속하는 값의 범위를 지칭한다 (이러한 수가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우는 제외함).
유효량: 본원에 사용된 용어 "유효량"은, 예를 들어 대상체 또는 환자에서 생물학적 반응을 도출하는 데 필요하고 충분한 올리고사카라이드 조성물의 투여되는 양 또는 농도를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물의 유효량은 대상체에서 (예를 들어, 대상체의 위장관에서) 단쇄 지방산 (예를 들어, 부티레이트, 프로피오네이트 및/또는 아세테이트)의 농도를 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물의 유효량은 적어도 1종의 미생물 종의 농도 또는 수를 조정, 예를 들어 증가 또는 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물의 유효량은 대상체에서 염증유발 미생물 및/또는 병원체 (예를 들어, 약물 또는 항생제 저항성 병원체 또는 MDR 병원체)의 획득, 그의 콜로니화를 감소시킬 수 있거나 또는 그의 저장소를 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물의 유효량은 공생 미생물에 비해 염증유발 및/또는 병원성 미생물의 존재비를 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물의 유효량은 자가면역 및 알레르기성 장애 (예를 들어, 만성 염증성 장애, 예컨대 염증성 장 질환)를 갖는 대상체를 치료할 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물의 유효량은 궤양성 결장염 (UC), 크론병 (CD), 육아종성 결장염, 불확정 결장염, 전환 결장염, 낭염, 베체트병, 현미경적 결장염, 게실증-연관 결장염, 콜라겐성 결장염, 림프구성 결장염 및/또는 소아-발병 염증성 장 질환을 치료할 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물의 유효량은 대상체에서 자가면역 및 알레르기성 장애 (예를 들어, 만성 염증성 장애, 예컨대 염증성 장 질환)의 증상 (예를 들어, 증상의 중증도 또는 수)을 조정, 예를 들어 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물의 유효량은 대상체에서 효소의 활성 또는 수준을 조정, 예를 들어 증가 또는 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물의 유효량은 대사물의 가공을 조정, 예를 들어 증가 또는 감소시킬 수 있다.
갈락토스 단량체: 본원에 사용된 용어 "갈락토스 단량체"는 일반적으로 D-갈락토스로 공지된 갈락토스 단량체의 D-이성질체를 지칭한다.
모노사카라이드 제제: 본원에 사용된 용어 "모노사카라이드 제제"는 갈락토스 단량체를 포함하는 제제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 모노사카라이드 제제는 갈락토스 단량체를 포함한다.
올리고사카라이드: 본원에 사용된 용어 "올리고사카라이드" (일부 문맥에서 용어 "올리고사카라이드"와 상호교환가능하게 사용될 수 있음)는 글리코시드 결합을 통해 함께 연결된 갈락토스 단량체를 포함하는 사카라이드 분자 (적어도 2의 중합도 (DP) (예를 들어, DP2+)를 가짐)를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드는 글리코시드 결합에 의해 연결된 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9 또는 적어도 10개의 모노사카라이드 서브유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드는 글리코시드 결합에 의해 연결된 3-20, 4-16, 5-15, 8-12, 5-25, 10-25, 20-50, 40-80 또는 75-100개 범위의 모노사카라이드이다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드는 적어도 1개의 1,2; 1,3; 1,4; 및/또는 1,6 글리코시드 결합을 포함한다. 올리고사카라이드는 선형 또는 분지형일 수 있다. 올리고사카라이드는 알파-배위인 1개 이상의 글리코시드 결합 및/또는 베타-배위인 1개 이상의 글리코시드 결합을 가질 수 있다.
제약 조성물: 본원에 사용된 "제약 조성물"은 질환의 완화, 치료 또는 예방에서 약리학적 활성 또는 다른 직접 효과를 갖는 조성물 및/또는 그의 완성된 투여 형태 또는 제제를 지칭하고, 인간 용도를 위한 것이다. 제약 조성물 또는 제약 제제는 전형적으로 우수 제조 관리기준 (GMP) 조건 하에 제조된다. 제약 조성물 또는 제제는 멸균 또는 비-멸균일 수 있다. 비-멸균인 경우에, 이러한 제약 조성물 또는 제제는 전형적으로 미국 약전 (USP) 또는 유럽 약전 (EP)에 기재된 바와 같은 비-멸균 제약 제품에 대한 미생물학적 규격 및 기준을 충족시킨다. 본원에 기재된 임의의 올리고사카라이드 조성물은 제약 조성물로서 제제화될 수 있다.
대상체: 본원에 사용된 용어 "대상체"는 인간 대상체 또는 환자를 지칭한다. 대상체는 신생아 (조산 신생아, 만삭 신생아), 1세 이하의 영유아, 어린 아동 (예를 들어, 1세 내지 12세), 청소년 (예를 들어, 13-19세), 성인 (예를 들어, 20-64세) 또는 노인 (예를 들어, 65세 이상)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 신생아 (생후 1개월까지), 영유아 (생후 1개월 내지 2년), 발육중인 아동 (2-12세) 및 청소년 (12-16세)을 포함한 소아 집단 또는 그의 하위집단이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 건강한 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 건강한 대상체에 비해 감소된 수준의 SCFA, 예를 들어 부티레이트, 프로피오네이트 및/또는 아세테이트를 갖는 환자이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 자가면역 및/또는 알레르기성 장애 (예를 들어, 만성 염증성 장애)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 염증성 장 질환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 궤양성 결장염 (UC), 크론병 (CD), 육아종성 결장염, 불확정 결장염, 전환 결장염, 낭염, 베체트병, 현미경적 결장염, 게실증-연관 결장염, 콜라겐성 결장염, 림프구성 결장염 또는 소아-발병 염증성 장 질환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 건강한 대상체에 비해 감소된 수준의 공생 박테리아 (예를 들어, 파라박테로이데스 및 박테로이데스)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 건강한 대상체에 비해 증가된 수준의 병원성 박테리아 (예를 들어, 엔테로박테리아세아에)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 건강한 대상체와 비교하여 공생 박테리아에 비해 병원성 박테리아의 상승된 비를 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 20 내지 70세, 20 내지 60세, 25 내지 60세, 또는 25 내지 55세이다. 일부 실시양태에서, 대상체는, 예를 들어 염증성 장 질환 (예를 들어, UC, CD)에 추가로, 예를 들어 자가면역 상태, 예를 들어 류마티스 관절염 같은 적어도 1종의 동반이환을 갖는다. 한 실시양태에서, 대상체는 경도 질환 (예를 들어, 경도 UC)을 나타낸다. 예를 들어, 대상체는 궤양성 결장염에 대한 메이요 점수 / 질환 활성 지수 (DAI) 2-4, 예를 들어 1일에 4회 미만의 혈액 동반 또는 비동반 대변을 보고, 표재성 점막에서의 제한된 홍반을 나타낸다. 한 실시양태에서, 대상체는 중등도 질환 (예를 들어, 중등도 UC)을 나타낸다. 예를 들어, 대상체는 궤양성 결장염에 대한 메이요 점수 / 질환 활성 지수 (DAI) 5-7, 예를 들어 1일에 5회 이상의 대변을 보고, 설사로 인한 경도이지만 증가하는 빈혈과 내시경검사에서의 결장의 중등도 궤양화를 나타낸다. 한 실시양태에서, 대상체는 중증 질환 (예를 들어, 중증 UC)을 나타낸다. 예를 들어, 대상체는 궤양성 결장염에 대한 메이요 점수 / 질환 활성 지수 (DAI) 8-9, 예를 들어 내시경검사에서 점막 혈관 표식의 소실을 드러내는 다량의 혈성 설사로 1일에 8회 이상의 대변을 본다. 한 실시양태에서, 대상체는 경도 내지 중등도 질환 (예를 들어, 경도 내지 중등도 UC)을 나타낸다. 한 실시양태에서, 대상체는 중등도 내지 중증 질환 (예를 들어, 중등도 내지 중증 UC)을 나타낸다.
치료 및 치료하는: 본원에 사용된 용어 "치료하는" 및 "치료"는 대상체 (예를 들어, 유해 상태, 장애 또는 질환을 앓고 있는 증후성 대상체)에게 조성물을 투여하여, 증상의 중증도 및/또는 빈도의 감소에 영향을 미치고/거나, 증상 및/또는 그의 기저 원인을 제거하고/거나, 손상의 개선 또는 복원을 용이하게 하고/거나, 특정한 유해 상태, 장애 또는 질환에 걸리기 쉽거나 또는 상태, 장애 또는 질환이 발생할 것으로 의심되거나 발생할 위험이 있는 무증상 대상체에서 유해 상태, 장애 또는 질환을 예방하는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 대상체를 올리고사카라이드 조성물로 치료하는 것은 대상체에서 단쇄 지방산 (SCFA), 예를 들어 부티레이트, 프로피오네이트 및/또는 아세테이트의 상대 또는 절대 수준을 조정, 예를 들어 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 대상체를 올리고사카라이드 조성물로 치료하는 것은 자가면역 및/또는 알레르기성 장애 (예를 들어, 만성 염증성 장애)의 중증도를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 대상체를 올리고사카라이드 조성물로 치료하는 것은 염증성 장 질환 (예를 들어, 궤양성 결장염, 크론병, 육아종성 결장염, 불확정 결장염, 전환 결장염, 낭염, 베체트병, 현미경적 결장염, 게실증-연관 결장염, 콜라겐성 결장염, 림프구성 결장염 및/또는 소아-발병 염증성 장 질환)의 중증도를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 대상체를 올리고사카라이드 조성물로 치료하는 것은 자가면역 및/또는 알레르기성 장애 (예를 들어, 만성 염증성 장애, 예를 들어 염증성 장 질환, 예를 들어 궤양성 결장염 또는 크론병)를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 사람의 삶의 질을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 대상체를 올리고사카라이드 조성물로 치료하는 것은 자가면역 및/또는 알레르기성 장애 (예를 들어, 만성 염증성 장애, 예를 들어 염증성 장 질환, 예를 들어 궤양성 결장염 또는 크론병)를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 사람의 증상 (예를 들어, 설사, 열, 피로, 복통, 혈변, 염증, 체중 감소)의 수 및/또는 중증도를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 대상체를 올리고사카라이드 조성물로 치료하는 것은 자가면역 및/또는 알레르기성 장애 (예를 들어, 만성 염증성 장애, 예를 들어 염증성 장 질환, 예를 들어 궤양성 결장염 또는 크론병)의 악화, 진행 또는 발병을 예방한다. 일부 실시양태에서, 대상체를 올리고사카라이드 조성물로 치료하는 것은 만성 염증성 장애 (예를 들어, 염증성 장 질환, 예를 들어 궤양성 결장염 또는 크론병)의 증상 재발의 수 및/또는 비율을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 대상체 집단을 올리고사카라이드 조성물로 치료하는 것은 자가면역 및/또는 알레르기성 장애 (예를 들어, 만성 염증성 장애, 예를 들어 염증성 장 질환, 예를 들어 궤양성 결장염 또는 크론병)를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 치료된 사람의 평균 삶의 질을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 대상체 집단을 올리고사카라이드 조성물로 치료하는 것은 자가면역 및/또는 알레르기성 장애 (예를 들어, 만성 염증성 장애, 예를 들어 염증성 장 질환, 예를 들어 궤양성 결장염 또는 크론병)를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 치료된 사람의 증상 (예를 들어, 설사, 열, 피로, 복통, 혈변, 염증, 체중 감소)의 평균 수 및/또는 중증도를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 대상체를 올리고사카라이드 조성물로 치료하는 것은 대조군 또는 표준 관리 치료에 비해 증상의 수, 증상의 중증도, 치료될 질환의 중증도 및 질환의 진행 중 1개 이상에서의 적어도 5% 개선 (예를 들어, 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50% 개선)을 유발한다. 예를 들어, 증상의 임상 완화, 예를 들어 10주, 26주 또는 52주 후 (예를 들어, 치료 시작 후). 치료는 염증과 연관된 바이오마커, 예컨대 분변 칼프로텍틴, 분변 락토페린 및 분변 리포칼린을 포함한 1종 이상의 질환 연관 바이오마커를 측정함으로써 평가될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 치료는 점막 치유 (예를 들어, 장 내층)를 평가함으로써 평가될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 치료는, 예를 들어 대상체의 장 증상, 정서적 건강, 전신 시스템 및 사회적 기능을 평가하는, 예를 들어 32-항목 염증성 장 질환 설문지 (IBDQ-32)를 사용하여 삶의 질 (QoL)을 평가함으로써 평가될 수 있다. 한 실시양태에서, QoL 점수는 자기-보고될 수 있다. 치료는 또한 간이 임상 결장염 활성 지수 (SCCAI) 복합 점수를 사용하여 평가될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Walmsley, R S; Ayres, R C S; Pounder, R E; Allan, R N (1998). "A simple clinical colitis activity index". Gut. 43 (1): 29-32]에 보고된 바와 같음.)
II. 올리고사카라이드 조성물
인간 대상체에서 염증을 저하시키기 위한 올리고사카라이드 조성물 및 그의 사용 방법이 본원에 제공된다.
한 측면에서, 화학식 (I)로부터 선택된 복수의 올리고사카라이드를 포함하는 올리고사카라이드 조성물이 본원에 제공된다:
여기서 화학식 (I)에서의 R은 독립적으로 수소 및 화학식 (Ia), (Ib), (Ic), (Id)로부터 선택되고:
여기서 화학식 (Ia), (Ib), (Ic) 및 (Id)에서의 R은 독립적으로 상기 화학식 (I)에서와 같이 정의된다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 초기에 갈락토스 단량체를 포함하는 제제를 100℃ 내지 160℃, 100℃ 내지 120℃, 110℃ 내지 130℃, 120℃ 내지 140℃, 130℃ 내지 150℃ 또는 약 135℃ 범위의 온도로 가열하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조된다. 가열은 교반 조건 하에 수행될 수 있다. 가열은 균질성 및 균일한 열 전달을 달성하기에 적합한 조건 하에 온도를 (예를 들어, 실온으로부터) 약 130℃, 약 135℃, 약 140℃, 약 145℃ 또는 약 150℃로 점차 증가시키는 것을 포함할 수 있다.
양으로 하전된 수소 이온을 포함하는 산 촉매가 제제에 첨가된다 (예를 들어, 가열 전에). 일부 실시양태에서, 산 촉매는 고체 촉매이다. 일부 실시양태에서, 촉매는 표 1에 따른 1종 이상의 물리적 및 화학적 특성을 갖는 강산 양이온 교환 수지이다. 일부 실시양태에서, 촉매는 > 3.0 mmol/g의 술폰산 모이어티 및 < 1.0 mmol/그램의 양이온성 모이어티를 포함한다. 특정 실시양태에서, 촉매는 45-50 중량 퍼센트의 공칭 수분 함량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 촉매는 가용성 촉매, 예를 들어 유기 산 촉매이다. 일부 실시양태에서, 촉매는 시트르산, 아세트산, 부티르산 또는 프로피온산이다. 특정 실시양태에서, 촉매는 갈락토스 단량체와 동시에 첨가된다.
표 1: 강산 양이온 교환 수지 특성의 비제한적 예
일부 실시양태에서, 촉매를 제제로 로딩한 후, 생성된 반응 혼합물은 산 촉매된 올리고사카라이드 형성을 촉진하는 조건 하에 대기압에서 및 100℃ 내지 160℃, 100℃ 내지 120℃, 110℃ 내지 130℃, 120℃ 내지 140℃, 130℃ 내지 150℃ 또는 약 135℃ 범위의 온도에서 유지된다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물 중 총 갈락토스 단량체 함량의 중량 퍼센트가 2-14% (임의로 2-5%, 4-8%, 5-13%, 7-10%, 7-11%, 9-14% 또는 8-12%)의 범위이면, 반응 혼합물이 켄칭된다. 켄칭은 전형적으로 물 (예를 들어, 탈이온수)을 사용하여 반응 혼합물을 희석하고, 반응 혼합물의 온도를 55℃ 내지 95℃로 점차 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 켄칭에 사용되는 물은 약 95℃이다. 물은 혼합물의 응고를 피하기에 충분한 조건 하에 반응 혼합물에 첨가될 수 있다. 특정 실시양태에서, 물은 증발에 의해 반응 혼합물로부터 제거될 수 있다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 50-55 중량 퍼센트의 용해된 고체를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 켄칭은 다양한 승온에서 선택된 올리고사카라이드 조성물의 안정성을 입증하는 도 8 및 실시예 19의 개시내용에 따라 적시에 수행되어야 한다.
최종적으로, 정제된 올리고사카라이드 조성물을 수득하기 위해, 전형적으로 켄칭된 반응 혼합물을 물로 약 35-60 중량 퍼센트 (임의로 35-50 중량 퍼센트)의 농도로 약 85℃ 미만의 온도 (예를 들어, 실온)에서 희석한 다음, 혼합물을 필터 또는 일련의 크로마토그래피 수지에 통과시킴으로써 조성물이 얻어진다. 일부 실시양태에서, 최종 정제된 올리고사카라이드 조성물은 켄칭된 반응 혼합물을 어떠한 크로마토그래피 수지의 사용도 없이 물로 약 35-60 중량 퍼센트 (임의로 35-50 중량 퍼센트)의 농도로 약 85℃ 미만의 온도 (예를 들어, 실온)에서 희석함으로써 수득된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 산 촉매로부터 분리된다. 특정 실시양태에서, 사용되는 필터는 0.45 μm 필터이다. 대안적으로, 일련의 크로마토그래피 수지가 사용될 수 있고, 일반적으로 양이온 교환 수지, 음이온 교환 수지 및/또는 탈색 중합체 수지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 임의의 또는 모든 유형의 수지가 임의의 순서로 1회 이상 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 실온에서 저장 시 미생물 성장에 필요한 수준 미만의 물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 대규모 방법 (예를 들어, 50 L 초과의 규모, 500-5000 L, 1000-5000 L, 1000-4000 L, 1000-3000 L, 1500-3000 L, 예를 들어 반응물 반응기의 크기)에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물의 대규모 제조 방법은, 예를 들어 실시예 12에 기재된 바와 같은 50 L 방법 (예를 들어, 50 L 반응기)이다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물의 대규모 제조 방법은, 예를 들어 실시예 13에 기재된 바와 같은 2000 L 방법 (예를 들어, 2000 L 반응기)이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이용가능한 반응기 및 그에 이용가능한 기기 (예를 들어, 반응기, 교반기, 임펠러, 모터 등에 대한 크기, 형상, 물질 등의 선택)에 기초하여 본원에 기재된 대규모 방법 (예를 들어, 실시예 12 및 13에 의해 기재된 바와 같음)을 변형시키는 방법을 이해할 것이다. 예를 들어, 실시예 13에 의해 기재된 대규모 방법 (2000 L 규모)에 대한 변형은 비점 (예를 들어, 약 112℃)으로부터 반응 유지 온도 (예를 들어, 약 130℃)로의 온도 증가를 변경시키는 것 (예를 들어, 온도 증가를 신속화 또는 저속화하는 것); 및/또는 단계적 방식으로 교반 속도를 변경시켜 (예를 들어, 반응기 및 그의 모터에 의한 전력 사용을 감소시키기 위해), 예를 들어 반응 물질의 증가된 점도를 가능하게 하는 것을 수반할 수 있다.
특정 실시양태에서, 모든 올리고사카라이드의 평균 중합도는 11-19, 임의로 13-17의 범위이다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 45-55 중량 퍼센트 범위의 물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 1900-2800, 임의로 2214-2715 범위의 MWw (중량-평균 분자량) (g/mol)을 갖는 올리고사카라이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 2070-3090 범위의 MWw (중량-평균 분자량) (g/mol)을 갖는 올리고사카라이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 1050-1250, 임의로 1095-1201 범위의 MWn (수-평균 분자량) (g/mol)을 갖는 올리고사카라이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 1110-1350 범위의 MWn (수-평균 분자량) (g/mol)을 갖는 올리고사카라이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물을 포함하는 용액은 2.50-3.50 범위의 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물을 포함하는 용액은 2.00-5.00, 임의로 2.00-4.80 범위의 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 89-94 중량 퍼센트 범위의 적어도 2의 중합도 (DP2+)를 갖는 올리고머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 85-95 중량 퍼센트, 임의로 88-90 중량 퍼센트 범위의 적어도 2의 중합도 (DP2+)를 갖는 올리고머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 80-98 중량 퍼센트 범위의 적어도 2의 중합도 (DP2+)를 갖는 올리고머를 포함한다.
추가로, 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 탈단량체화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 탈단량체화는 잔류 사카라이드 단량체의 제거를 포함한다. 일부 실시양태에서, 탈단량체화는 크로마토그래피 수지를 사용하여 수행된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 존재하는 단량체의 퍼센트에 따라 상이한 조성물이 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 약 1%, 약 3%, 약 5%, 약 10% 또는 약 15%의 단량체 함량으로 탈단량체화된다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 약 1-3%, 약 3-6%, 약 5-8%, 약 7-10% 또는 약 10-15%의 단량체 함량으로 탈단량체화된다. 한 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 1% 미만의 단량체 함량으로 탈단량체화된다. 한 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 약 7% 내지 10%의 단량체 함량으로 탈단량체화된다. 한 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 약 0.1% 내지 2% 미만의 단량체 함량으로 탈단량체화된다. 한 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 약 1% 내지 3%의 단량체 함량으로 탈단량체화된다. 한 실시양태에서, 탈단량체화는 삼투 분리에 의해 달성된다. 제2 실시양태에서, 탈단량체화는 접선 유동 여과 (TFF)에 의해 달성된다. 제3 실시양태에서, 탈단량체화는 에탄올 침전에 의해 달성된다.
일부 실시양태에서, 상이한 단량체 함량을 갖는 올리고사카라이드 조성물은 또한 총 식이성 섬유, 수분, 총 식이성 섬유 (건조 기준) 또는 퍼센트 덱스트로스 당량 (DE)에 대해 상이한 측정치를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 총 식이성 섬유는 AOAC 2011.25의 방법에 따라 측정된다. 일부 실시양태에서, 수분은 60℃에서 진공 오븐을 사용하여 측정된다. 일부 실시양태에서, 총 식이성 섬유는 (건조 기준)으로 계산된다. 일부 실시양태에서, 퍼센트 DE는 식품 화학물질 규격집 (FCC)에 따라 측정된다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 58-94 퍼센트 (건조 기준)의 총 식이성 섬유 함량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 65-87 퍼센트 (건조 기준)의 총 식이성 섬유 함량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 73-81 퍼센트 (건조 기준)의 총 식이성 섬유 함량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 50-80, 55-80, 60-80, 50-70, 55-70, 60-70, 50-65, 55-65 또는 60-65 퍼센트 (건조 기준)의 총 식이성 섬유 함량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 약 50, 약 55, 약 58, 약 60, 약 62 또는 약 65 퍼센트 (건조 기준)의 총 식이성 섬유 함량을 갖는다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 58-94 퍼센트 (건조 기준)의 총 가용성 식이성 섬유 함량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 65-87 퍼센트 (건조 기준)의 총 가용성 식이성 섬유 함량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 73-81 퍼센트 (건조 기준)의 총 가용성 식이성 섬유 함량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 50-80, 55-80, 60-80, 50-70, 55-70, 60-70, 50-65, 55-65 또는 60-65 퍼센트 (건조 기준)의 총 가용성 식이성 섬유 함량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 약 50, 약 55, 약 58, 약 60, 약 62 또는 약 65 퍼센트 (건조 기준)의 총 가용성 식이성 섬유 함량을 갖는다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 5-50 퍼센트의 총 환원당 함량 (덱스트로스 당량 (DE) (건조 고체))을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따른 올리고사카라이드 조성물의 제조는 배치 공정 또는 연속 공정으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 반응기의 내용물을 교반 조건 (예를 들어, 연속적으로 혼합 또는 블렌딩)에 적용하고, 모든 또는 실질적인 양의 반응 생성물을 꺼내는 (예를 들어, 단리 및/또는 회수하는) 배치 공정으로 제조된다.
특정 실시양태에서, 촉매의 사용 방법은 수성 환경에서 수행된다. 1종의 적합한 수성 용매는 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있는 물이다. 일반적으로, 일부 실시양태에서, 보다 낮은 농도의 이온 종 (예를 들어, 나트륨, 인, 암모늄 또는 마그네슘의 염)을 함유한 물 공급원이 사용될 수 있으며, 이는 이러한 이온 종이 촉매의 유효성을 감소시킬 수 있기 때문이다. 수성 용매가 물인 일부 실시양태에서, 물은 10% 미만의 이온 종 (예를 들어, 나트륨, 인, 암모늄, 마그네슘의 염)을 갖는다. 수성 용매가 물인 일부 실시양태에서, 물은 적어도 0.1 메가옴-센티미터, 적어도 1 메가옴-센티미터, 적어도 2 메가옴-센티미터, 적어도 5 메가옴-센티미터 또는 적어도 10 메가옴-센티미터의 저항률을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법의 반응이 진행됨에 따라, 물 (예컨대 방출된 물)이 1종 이상의 사카라이드 단량체의 각각의 글리코시드 커플링과 함께 생산된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 일정 기간에 걸쳐 반응 혼합물에 존재하는 물의 양 및/또는 물 대 단량체 또는 촉매의 비를 모니터링하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 반응 혼합물의 물 함량은 반응 과정에 걸쳐, 예를 들어 생산된 방출된 물을 제거하면서 변경될 수 있다. 예를 들어, 증발에 의한, 예컨대 증류를 통한 방법을 포함한 적절한 방법이 반응 혼합물 중 물 (예를 들어, 방출된 물)을 제거하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 반응 혼합물에 물을 포함시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 증발을 통해 반응 혼합물로부터 물을 제거하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제제에 양으로 하전된 수소 이온을 포함하는 산 촉매가 로딩된다. 일부 실시양태에서, 산 촉매는 고체 촉매 (예를 들어, 다우엑스 마라톤(Dowex Marathon) C)이다. 일부 실시양태에서, 산 촉매는 가용성 촉매 (예를 들어, 시트르산)이다.
일부 실시양태에서, 총 갈락토스 단량체 함량 대비 양으로 하전된 수소 이온의 몰비는 적절한 범위이다. 일부 실시양태에서, 총 갈락토스 단량체 함량 대비 양으로 하전된 수소 이온의 몰비는 0.01 내지 0.1, 0.02 내지 0.08, 0.03 내지 0.06 또는 0.05 내지 0.06의 범위이다. 일부 실시양태에서, 총 갈락토스 단량체 함량 대비 양으로 하전된 수소 이온의 몰비는 0.003 내지 0.01, 0.005 내지 0.02, 0.01 내지 0.02, 0.01 내지 0.03, 0.02 내지 0.03, 0.02 내지 0.04, 0.03 내지 0.05, 0.03 내지 0.08, 0.04 내지 0.07, 0.05 내지 0.1, 0.05 내지 0.2, 0.1 내지 0.2, 0.1 내지 0.3 또는 0.2 내지 0.3의 범위이다.
일부 실시양태에서, 총 갈락토스 단량체 함량 대비 가용성 산 촉매 (예를 들어, 시트르산 촉매)의 몰비는 적절한 범위이다. 일부 실시양태에서, 총 갈락토스 단량체 함량 대비 가용성 산 촉매 (예를 들어, 시트르산 촉매)의 몰비는 0.01 내지 0.1, 0.02 내지 0.08, 0.03 내지 0.06 또는 0.05 내지 0.06의 범위이다. 일부 실시양태에서, 총 갈락토스 단량체 함량 대비 가용성 산 촉매 (예를 들어, 시트르산 촉매)의 몰비는 0.003 내지 0.01, 0.005 내지 0.02, 0.01 내지 0.02, 0.01 내지 0.03, 0.02 내지 0.03, 0.02 내지 0.04, 0.03 내지 0.05, 0.03 내지 0.08, 0.04 내지 0.07, 0.05 내지 0.1, 0.05 내지 0.2, 0.1 내지 0.2, 0.1 내지 0.3 또는 0.2 내지 0.3의 범위이다.
일부 실시양태에서, 물을 반응 혼합물에 첨가하여 반응 혼합물의 온도가 100℃ 이하로 되도록 함으로써 반응을 켄칭한다. 일부 실시양태에서, 켄칭에 사용되는 물은 탈이온수이다. 일부 실시양태에서, 켄칭에 사용되는 물은 USP 물이다. 일부 실시양태에서, 물은 약 60℃ 내지 약 100℃의 온도를 갖는다. 특정 실시양태에서, 켄칭에 사용되는 물은 약 95℃이다. 일부 실시양태에서, 물은 혼합물의 응고를 피하기에 충분한 조건 하에 반응 혼합물에 첨가된다.
반응 혼합물의 점도는 반응 과정에 걸쳐 측정 및/또는 변경될 수 있다. 일반적으로, 점도는 유동에 대한 유체의 내부 저항성 (예를 들어, "두께")의 측정치를 지칭하고, 센티포아즈 (cP) 또는 파스칼-초로 표현된다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물의 점도는 약 100 cP 내지 약 95,000 cP, 약 5,000 cP 내지 약 75,000 cP, 약 5,000 내지 약 50,000 cP 또는 약 10,000 내지 약 50,000 cP이다. 특정 실시양태에서, 반응 혼합물의 점도는 약 50 cP 내지 약 200 cP이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 올리고사카라이드 조성물은 1개 이상의 추가의 가공 단계에 적용될 수 있다. 추가의 가공 단계는, 예를 들어 정제 단계를 포함할 수 있다. 정제 단계는, 예를 들어 분리, 탈단량체화, 희석, 농축, 여과, 탈염 또는 이온-교환, 크로마토그래피 분리 또는 탈색 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 희석 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 탈이온수가 희석에 사용된다. 특정 실시양태에서, USP 물이 희석에 사용된다. 특정 실시양태에서, 희석 후, 올리고사카라이드 조성물은 약 5-75, 25-65, 35-65, 45-55 또는 47-53 중량 퍼센트 범위의 물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 희석 후, 올리고사카라이드 조성물은 약 35-65 중량 퍼센트 범위의 물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 희석 후, 올리고사카라이드 조성물은 약 40-50 중량 퍼센트 범위의 물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 탈색 단계를 추가로 포함한다. 제조된 1종 이상의 올리고사카라이드 조성물은, 예를 들어 흡수제를 사용한 처리, 활성탄, 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 수지를 사용함) 및/또는 여과 (예를 들어, 마이크로여과)를 포함한 적절한 방법을 사용하여 탈색 단계를 겪을 수 있다.
일부 실시양태에서, 제조된 1종 이상의 올리고사카라이드 조성물은 염, 미네랄 및/또는 다른 이온 종을 제거하기 위한 물질과 접촉된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제조된 1종 이상의 올리고사카라이드 조성물은 음이온 교환 칼럼을 통해 유동한다. 다른 실시양태에서, 제조된 올리고사카라이드 조성물은 음이온/양이온 교환 칼럼 쌍을 통해 유동한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 농축 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 농축된 올리고사카라이드 조성물을 제조하기 위해 증발 (예를 들어, 진공 증발)에 적용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 올리고사카라이드 분말을 제조하기 위해 분무 건조 단계에 적용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 증발 단계 및 분무 건조 단계 둘 다에 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 물을 제거하고 분말화 생성물을 제조하기 위해 동결건조 (예를 들어, 동결 건조) 단계에 적용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 분획화 단계를 추가로 포함한다. 제조 및 정제된 올리고사카라이드 조성물은 후속적으로, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피, 흡착/탈착 (예를 들어, 저압 활성탄 크로마토그래피) 또는 여과 (예를 들어, 한외여과 또는 투석여과)를 포함한 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 분자량에 의해 분리될 수 있다. 특정 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 98% 초과의 짧은 (약 DP1-2), 중간 (약 DP3-10), 긴 (약 DP11-18) 또는 매우 긴 (약 DP>18) 종을 나타내는 풀로 분리된다.
특정 실시양태에서, 제조된 올리고사카라이드 조성물은 탄소질 물질 상에의 흡착 및 후속적으로 상기 물질을 1%, 5%, 10%, 20%, 50% 또는 100%의 농도의 물 중 유기 용매의 혼합물로 세척하는 것에 의한 분획의 탈착에 의해 분획화된다. 한 실시양태에서, 흡착 물질은 활성탄이다. 또 다른 실시양태에서, 흡착 물질은 5%, 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 부분 (부피 또는 중량 기준)의 활성탄과 벌킹제, 예컨대 규조토 또는 셀라이트 545의 혼합물이다.
추가 실시양태에서, 제조된 올리고사카라이드 조성물은 고성능 액체 크로마토그래피 시스템에의 통과에 의해 분리된다. 특정 변형법에서, 제조된 올리고사카라이드 조성물은 이온-친화성 크로마토그래피, 친수성 상호작용 크로마토그래피, 또는 겔-투과 및 겔-여과를 포함한 크기-배제 크로마토그래피에 의해 분리된다.
일부 실시양태에서, 촉매는 여과에 의해 제거된다. 특정 실시양태에서, 0.45 μm 필터가 여과 동안 촉매를 제거하기 위해 사용된다. 다른 실시양태에서, 저분자량 물질은 여과 방법에 의해 제거된다. 특정 변형법에서, 저분자량 물질은 투석, 한외여과, 투석여과 또는 접선 유동 여과에 의해 제거될 수 있다. 특정 실시양태에서, 여과는 정적 투석 튜브 장치에서 수행된다. 다른 실시양태에서, 여과는 동적 유동 여과 시스템에서 수행된다. 다른 실시양태에서, 여과는 원심력-구동 여과 카트리지에서 수행된다. 특정 실시양태에서, 반응 혼합물은 여과 전에 약 85℃ 미만으로 냉각된다.
특정 실시양태에서, 모든 올리고사카라이드의 평균 중합도는 11-19의 범위이다. 특정 실시양태에서, 모든 올리고사카라이드의 평균 중합도는 10-16의 범위이다. 특정 실시양태에서, 모든 올리고사카라이드의 평균 중합도는 13-17의 범위이다. 특정 실시양태에서, 모든 올리고사카라이드의 평균 중합도는 약 15이다. 일부 실시양태에서, 모든 올리고사카라이드의 평균 중합도는 5-20, 6-19, 11-16, 12-18, 10-17, 7-15, 7-12, 7-10, 7-8, 9-10, 10-11, 11-11, 11-15, 12-13, 12-14 13-14, 14-15, 15-16, 17-18, 15-20, 3-8, 4-7 또는 5-6의 범위이다. 일부 실시양태에서, 모든 올리고사카라이드의 평균 중합도 (DP)는 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20 또는 약 21이다.
특정 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물 중 갈락토스 단량체의 중량 퍼센트는 6-12의 범위이다. 특정 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물 중 갈락토스 단량체의 중량 퍼센트는 8-10의 범위이다. 특정 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물 중 갈락토스 단량체의 중량 퍼센트는 5-13의 범위이다. 특정 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물 중 갈락토스 단량체의 중량 퍼센트는 6-7의 범위이다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 H-[C6H9-11O5]n-OH의 화학식을 포함하는 중합체의 혼합물이며, 여기서 혼합물의 단일 중합체 중 단량체 단위의 총수는 2 내지 대략 60개 (n = 2-60)의 범위이고, 혼합물에 대한 단량체 단위의 평균 값은 대략 15.1개이다. 각각의 단량체 단위는 비치환될 수 있거나, 임의의 글리코시드 이성질체에 의해 또 다른 갈락토스 단위로 단일, 이중 또는 삼중 치환될 수 있다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 5-75 중량 퍼센트 범위의 물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 25-65 중량 퍼센트 범위의 물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 35-65 중량 퍼센트 범위의 물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 45-55 중량 퍼센트 범위의 물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 2214-2715 범위의 MWw (g/mol)을 갖는 올리고사카라이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 1816-3070 범위의 MWw (g/mol)을 갖는 올리고사카라이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 1400-3500, 1800-3100, 1500-2000, 1700-2200, 1900-2400, 2100-2600, 2300-2800, 2500-3000 또는 2700-3200 범위의 MWw (g/mol)을 갖는 올리고사카라이드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 1095-1201 범위의 MWn (g/mol)을 갖는 올리고사카라이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 1011-1299 범위의 MWn (g/mol)을 갖는 올리고사카라이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 900-1100, 1000-1200, 1100-1400, 1200-1500, 1300-1600 또는 1400-1700 범위의 MWn (g/mol)을 갖는 올리고사카라이드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물을 포함하는 용액은 1.50-6.00 범위의 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물을 포함하는 용액은 1.50-5.00 범위의 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물을 포함하는 용액은 2.00-4.00 범위의 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물을 포함하는 용액은 2.50-3.50 범위의 pH를 갖는다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 약 13% 내지 약 30% 범위의 분지화도를 갖는 올리고사카라이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 약 15% 내지 약 26% 범위의 분지화도를 갖는 올리고사카라이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 20% 내지 21% 범위의 분지화도를 갖는 올리고사카라이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 5-50%, 5-40%, 5-30%, 5-20%, 5-15%, 10-50%, 10-40%, 10-30%, 10-25%, 15-30% 또는 15-20% 범위의 분지화도를 갖는 올리고사카라이드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 80-100 중량 퍼센트 범위의 2개 이상의 반복 단위 (DP2+)를 갖는 올리고머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 87-96 중량 퍼센트 범위의 2개 이상의 반복 단위 (DP2+)를 갖는 올리고머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 88-94 중량 퍼센트 범위의 2개 이상의 반복 단위 (DP2+)를 갖는 올리고머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 90-92 중량 퍼센트 범위의 2개 이상의 반복 단위 (DP2+)를 갖는 올리고머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 80-85, 85-87, 86-88, 87-90, 88-91, 89-92, 90-93, 91-94, 92-95, 93-96 또는 95-98 중량 퍼센트 범위의 2개 이상의 반복 단위 (DP2+)를 갖는 올리고머를 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 1.8-2.4의 다분산 지수 (PDI)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 2.0-2.3의 다분산 지수 (PDI)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 1.0-1.2, 1.2-1.3, 1.3-1.4, 1.4-1.5, 1.5-1.6, 1.7-1.8, 1.8-2.0, 2.0-2.2, 2.2-2.4 또는 2.4-2.6의 PDI를 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 약 1.6, 약 1.7, 약 1.8, 약 1.9, 약 2.0, 약 2.1, 약 2.2, 약 2.3 또는 약 2.4의 PDI를 갖는다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물 중 올리고사카라이드의 MWw, MWn, PDI, 단량체 함량 (DP1) 및/또는 DP2+ 값은 실시예 6에 기재된 크기 배제 크로마토그래피 방법을 사용하여 결정된다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 80-85, 85-87, 86-88, 87-90, 88-91, 89-92, 90-93, 91-94 또는 92-95 중량 퍼센트 범위의 적어도 3개의 연결된 단량체 단위 (DP3+)를 갖는 올리고머를 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 6.4% 내지 11.4%의 단량체 (DP1)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 5% 내지 10%, 7% 내지 12%, 11% 내지 18%, 10% 내지 15% 또는 12% 내지 17%의 단량체 (DP1)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 적어도 2개의 연결된 단량체 단위 (DP2+)를 갖는 88.6% 내지 94.6%의 올리고머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 80% 내지 81%, 81% 내지 82%, 82% 내지 83%, 84% 내지 85%, 85% 내지 86%, 86% 내지 87%, 87% 내지 88%, 88% 내지 90% 또는 89% 내지 95%의 적어도 2개의 연결된 단량체 단위 (DP2+)를 갖는 올리고머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 84% 내지 85%, 85% 내지 86%, 86% 내지 87%, 87% 내지 88% 또는 88% 내지 90%의 적어도 3개의 연결된 단량체 단위 (DP3+)를 갖는 올리고머를 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 0.10% 미만의 총 불순물 (단량체 제외)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 0.05% 미만의 총 불순물 (단량체 제외)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 0.20%, 0.15%, 0.10% 또는 0.05% 미만의 총 불순물 (단량체 제외)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 0.10% w/w 미만의 글루쿠론산, 0.10% w/w 미만의 락트산, 0.10% w/w 미만의 포름산, 0.10% w/w 미만의 아세트산 및 0.10% w/w 미만의 히드록시메틸푸르푸랄 (HMF)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 검출불가능한 수준의 락트산, 포름산, 레불린산 및 HMF를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 0.19% w/w의 시트르산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 0.15-0.22% w/w, 0.10-1.00% w/w, 0.50-1.50% w/w, 1.00-2.00% w/w, 2.00-3.00% w/w, 2.00-2.50% w/w 또는 2.50-3.00% w/w의 시트르산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 2214-2715의 MWw, 1095-1201의 MWn 및/또는 2.0-2.3의 PDI를 포함한다.
특정 실시양태에서, NMR에 의해 분석된 올리고사카라이드 조성물은 모노사카라이드 단량체 (DP1)를 함유하며, 즉 DP1 성분은 NMR 분석 전에 조성물로부터 제거되지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, NMR에 의해 분석된 올리고사카라이드 조성물은 10%-25%의 DP1 단량체를 함유한다. 특정 실시양태에서, NMR에 의해 분석된 조성물은 탈단량체화되며, 즉 조성물의 DP1 성분의 일부 또는 모두가 NMR 분석 전에, 예를 들어 실시예 8에 기재된 방법에 의해 제거된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, NMR에 의해 분석된 올리고사카라이드 조성물은 0.05% 내지 10%의 DP1 단량체를 함유한다.
본원에 기재되고 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 올리고사카라이드 조성물은 퍼메틸화 분석을 사용하여 선행 기술 조성물과 구별되고 특징화될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Zhao, Y., et al. 'Rapid, sensitive structure analysis of oligosaccharides,' PNAS March 4, 1997 94 (5) 1629-1633; Kailemia, M.J., et al. 'Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: A review of recent developments,' Anal Chem. 2014 Jan 7; 86(1): 196-212]을 참조한다. 따라서, 또 다른 측면에서, 예를 들어 인간에서 최소한으로 소화가능한 복수의 올리고사카라이드인, 단량체 라디칼을 포함하는 복수의 올리고사카라이드를 포함하는 올리고사카라이드 조성물이 본원에 제공된다. 복수의 올리고사카라이드 중 상이한 유형의 단량체 라디칼의 몰 백분율은 실시예 9에 기재된 바와 같은 퍼메틸화 검정을 사용하여 정량화될 수 있다. 퍼메틸화 검정은 조성물의 탈단량체화된 샘플에 대해 수행된다.
일부 실시양태에서, 복수의 올리고사카라이드는 라디칼 (1)-(20)으로부터 선택된 2종 이상의 단량체 라디칼을 포함한다:
(1) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 4.11-15.02 mol% (임의로 6.29-12.84 mol%)를 나타내는 t-갈락토푸라노스 모노라디칼;
(2) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 17.74-31.28 mol% (임의로 20.45-28.28 mol%)를 나타내는 t-갈락토피라노스 모노라디칼;
(3) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 2.48-3.70 mol% (임의로 2.73-3.46 mol%)를 나타내는 2-갈락토푸라노스 및/또는 2-글루코푸라노스 모노라디칼;
(4) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 4.70-7.76 mol% (임의로 5.31-7.15 mol%)를 나타내는 3-갈락토피라노스 모노라디칼;
(5) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 3.05-4.58 mol% (임의로 3.36-4.28 mol%)를 나타내는 3-갈락토푸라노스 모노라디칼;
(6) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 4.01-4.56 mol% (임의로 4.12-4.45 mol%)를 나타내는 2-갈락토피라노스 모노라디칼;
(7) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 4.24-6.28 mol% (임의로 4.65-5.87 mol%)를 나타내는 4-갈락토피라노스 및/또는 5-갈락토푸라노스 모노라디칼;
(8) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.30-0.95 mol% (임의로 0.43-0.82 mol%)를 나타내는 2,3-갈락토푸라노스 디라디칼;
(9) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.70-11.80 mol% (임의로 2.92-9.58 mol%)를 나타내는 6-갈락토푸라노스 모노라디칼;
(10) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 12.07-20.76 mol% (임의로 13.81-19.02 mol%)를 나타내는 6-갈락토피라노스 모노라디칼;
(11) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 1.22-2.19 mol% (임의로 1.41-1.99 mol%)를 나타내는 3,4-갈락토피라노스 및/또는 3,5-갈락토푸라노스 및/또는 2,3-갈락토피라노스 디라디칼;
(12) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.77-1.32 mol% (임의로 0.88-1.21 mol%)를 나타내는 2,4-글루코피라노스 및/또는 2,5-글루코푸라노스 및/또는 2,4-갈락토피라노스 및/또는 2,5-갈락토푸라노스 디라디칼;
(13) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.09-0.32 mol% (임의로 0.14-0.28 mol%)를 나타내는 2,3,4-갈락토피라노스 및/또는 2,3,5-갈락토푸라노스 트리라디칼;
(14) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 1.49-2.46 mol% (임의로 1.69-2.27 mol%)를 나타내는 3,6-갈락토푸라노스 디라디칼;
(15) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 3.49-5.70 mol% (임의로 3.93-5.26 mol%)를 나타내는 4,6-갈락토피라노스 및/또는 5,6-갈락토푸라노스 디라디칼;
(16) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 3.54-6.52 mol% (임의로 4.14-5.93 mol%)를 나타내는 3,6-갈락토피라노스 및/또는 2,6-갈락토푸라노스 디라디칼;
(17) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 1.65-3.32 mol% (임의로 1.98-2.99 mol%)를 나타내는 2,6-갈락토피라노스 디라디칼;
(18) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.65-1.94 mol% (임의로 0.91-1.68 mol%)를 나타내는 3,4,6-갈락토피라노스 및/또는 3,5,6-갈락토푸라노스 및/또는 2,3,6-갈락토푸라노스 트리라디칼;
(19) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.01-4.14 mol% (임의로 0.01-3.10 mol%)를 나타내는 2,3,6-갈락토피라노스 및/또는 2,4,6-갈락토피라노스 및/또는 2,5,6-갈락토푸라노스 트리라디칼; 및/또는
(20) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.01-0.44 mol% (임의로 0.01-0.28 mol%)를 나타내는 2,3,4,6-갈락토피라노스 및/또는 2,3,5,6-갈락토푸라노스 쿼드라디칼.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물 중 총 글리코시드 결합의 14-30%는 1,2 글리코시드 결합이다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물 중 총 글리코시드 결합의 16.7-26.2%는 1,2 글리코시드 결합이다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물 중 총 글리코시드 결합의 약 20% 또는 약 21%는 1,2 글리코시드 결합이다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물 중 총 글리코시드 결합의 약 8.7-33.6% (임의로 약 12.4-28.0%)는 1,2 글리코시드 결합이다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물 중 총 글리코시드 결합의 15-50%, 15-40%, 15-30%, 15-20%, 20-40%, 20-30%, 25-50%, 25-30% 또는 30-45%는 1,2 글리코시드 결합이다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물 중 총 글리코시드 결합의 약 15-32%는 1,3 글리코시드 결합이다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물 중 총 글리코시드 결합의 약 21% 또는 약 22%는 1,3 글리코시드 결합이다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물 중 총 글리코시드 결합의 17.4-27.8%는 1,3 글리코시드 결합이다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물 중 총 글리코시드 결합의 약 11.0-34.4% (임의로 14.4-29.2%)는 1,3 글리코시드 결합이다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물 중 총 글리코시드 결합의 10-50%, 15-40%, 15-30%, 15-25%, 10-40%, 10-30%, 10-25%, 15-30% 또는 15-20%는 1,3 글리코시드 결합이다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물 중 총 글리코시드 결합의 약 10-22%는 1,4 글리코시드 결합이다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물 중 총 글리코시드 결합의 약 16%는 1,4 글리코시드 결합이다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물 중 총 글리코시드 결합의 11.9-19.7%는 1,4 글리코시드 결합이다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물 중 총 글리코시드 결합의 9.5-23.5% (임의로 11.4-20.4%)는 1,4 글리코시드 결합이다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물 중 총 글리코시드 결합의 5-35%, 10-30%, 10-25%, 10-20%, 5-20%, 5-15% 또는 20-30%는 1,4 글리코시드 결합이다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물 중 총 글리코시드 결합의 약 24-57%는 1,6 글리코시드 결합이다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물 중 총 글리코시드 결합의 약 39% 또는 약 40%는 1,6 글리코시드 결합이다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물 중 총 글리코시드 결합의 29.4-50.1%는 1,6 글리코시드 결합이다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물 중 총 글리코시드 결합의 20.9-57.8% (임의로 27.6-50.2%)는 1,6 글리코시드 결합이다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물 중 총 글리코시드 결합의 25-60%, 25-50%, 25-40%, 30-60%, 30-50%, 30-40% 또는 35-45%는 1,6 글리코시드 결합이다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 26-49%의 총 푸라노스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 약 38% 또는 약 44%의 총 푸라노스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 19-71% (임의로 28-61%)의 총 푸라노스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 15-75%, 15-65%, 15-50%, 15-40%, 20-40%, 25-35% 또는 25-40%의 총 푸라노스를 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 적어도 1종의 갈락토푸라노스 또는 갈락토피라노스 라디칼을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단량체 라디칼 (1)-(20)을 표 2에 제시된 몰 백분율로 포함하는 복수의 올리고사카라이드를 포함하는 올리고사카라이드 조성물이 제공된다.
표 2. 퍼메틸화 데이터
선택된 올리고사카라이드 조성물의 개별 배치를 특징화하는 퍼메틸화 데이터는 실시예 9 및 16에 기재되어 있다. 실시예 9 및 16에 기재된 이들 데이터의 복합물은, 표 3에 제시된 바와 같이, 선택된 올리고사카라이드 조성물에 존재하는 단량체 라디칼을 기재하는 모든 시험된 배치 및 반복물에 걸쳐 평균 데이터와 표준 편차 (std. dev.)를 제시하기 위해 하기에 제공된다.
표 3. 퍼메틸화 데이터 (복합 데이터)
특정 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 단량체가 없다 (예를 들어, 탈단량체화됨). 다른 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 단량체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 단량체 라디칼 (1)-(20)을 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어진 복수의 올리고사카라이드를 포함하는 올리고사카라이드 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 라디칼 (1)-(20)으로부터 선택된 적어도 1종 (예를 들어, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9 또는 적어도 10종)의 단량체 라디칼을 표 2에 제시된 적어도 1종 (예를 들어, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9 또는 적어도 10종)의 상응하는 몰 백분율로 포함하는 복수의 올리고사카라이드를 포함하는 올리고사카라이드 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 단량체 라디칼 (1)-(20)을 표 2에 제시된 몰 백분율로 포함하거나 또는 그로 이루어진 복수의 올리고사카라이드를 포함하는 올리고사카라이드 조성물이 제공된다.
본원에 기재되고 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 올리고사카라이드 조성물은 2차원 이종핵 NMR을 사용하여 선행 기술 조성물과 구별되고 특징화될 수 있다. 따라서, 또 다른 측면에서, 예를 들어 인간에서 최소한으로 소화가능한 복수의 올리고사카라이드를 포함하는 올리고사카라이드 조성물로서, 복수의 올리고사카라이드는 표 4의 신호 1-11 중 1개 이상을 포함하는 다중도-편집 구배-증강 1H-13C 이종핵 단일 양자 상관관계 (HSQC) NMR 스펙트럼을 특징으로 하며, 여기서 스펙트럼은 2% 미만의 단량체를 갖는 올리고사카라이드 조성물의 샘플을 사용하여 생성된 것인 올리고사카라이드 조성물이 제공된다:
표 4. HSQC NMR 데이터
따라서, 또 다른 측면에서, 예를 들어 인간에서 최소한으로 소화가능한 복수의 올리고사카라이드를 포함하는 올리고사카라이드 조성물로서, 복수의 올리고사카라이드는 표 5의 신호 1-11 중 1개 이상을 포함하는 다중도-편집 구배-증강 1H-13C 이종핵 단일 양자 상관관계 (HSQC) NMR 스펙트럼을 특징으로 하며, 여기서 스펙트럼은 2% 미만의 단량체를 갖는 올리고사카라이드 조성물의 샘플을 사용하여 생성된 것인 올리고사카라이드 조성물이 제공된다:
표 5. HSQC NMR 데이터
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 하기 표 6에서와 같이 정의되는 올리고사카라이드 조성물의 신호 1-11 중 적어도 1개를 포함한다:
표 6. HSQC NMR 데이터
선택된 올리고사카라이드 조성물의 개별 배치를 특징화하는 HSQC NMR 스펙트럼은 실시예 8 및 15에 기재되어 있다. 실시예 8 및 15에 기재된 데이터의 복합물은 하기 표 7에서와 같이 정의되는 평균 HSQC NMR 스펙트럼을 제공한다:
표 7. HSQC NMR 데이터 (복합 데이터)
본원에 사용된 용어 "이종핵 단일 양자 상관관계 (HSQC) NMR"은 용어 "이종핵 단일 양자 가간섭성 (HSQC) NMR"과 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "곡선하 면적" 또는 "AUC"는 NMR 스펙트럼에서의 피크/신호의 상대 크기 (즉, 상대 강도, 상대 부피) (예를 들어, 선택된 올리고사카라이드 조성물의 HSQC NMR 스펙트럼의 신호 1-11 대비 상대 크기)를 지칭한다. 본원에 정의된 피크/신호의 AUC 또는 상대 크기는 타원형 형상을 사용한 적분 영역의 적분값을 나타낸다. 타원형 형상은 장축 좌표 및 단축 좌표에 의해 정의될 수 있다. 장축 좌표 (F2 차원; 1H) 및 단축 좌표 (F1 차원; 13C)에 의해 정의된 타원형 형상의 예가 도 6c에 제시된다. 따라서, AUC는 이어서 타원형 위 또는 아래의 부피를 얻기 위해 그 타원형 형상의 한계 내에서 적분함으로써 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 다중도-편집 구배-증강 1H-13C 이종핵 단일 양자 상관관계 (HSQC) NMR 스펙트럼을 특징으로 하는 복수의 올리고사카라이드를 갖는 올리고사카라이드 조성물은 하기 표 8에서와 같이 정의되는 1H 적분 영역 및 13C 적분 영역을 갖는 신호 1-11 중 1개 이상을 포함한다:
표 8. HSQC NMR 적분 영역의 좌표
일부 실시양태에서, NMR 스펙트럼은 올리고사카라이드 조성물의 샘플에 대해 하기 펄스 시퀀스 다이어그램, 획득 파라미터 및 가공 파라미터를 사용하여 가간섭성 선택을 위해 에코-안티에코 스킴을 사용하는 다중도-편집 구배-증강 1H-13C 이종핵 단일 양자 가간섭성 (HSQC) 실험을 수행함으로써 수득된다:
펄스 시퀀스 다이어그램 (도 5)
획득 파라미터
1H 반송파 주파수 = 4 ppm
13C 반송파 주파수 = 65 ppm
획득 차원에서의 포인트 수 = 596개
획득 차원에서의 스펙트럼 범위 = 6.23 ppm 내지 1.83 ppm
간접 차원에서의 포인트 수 = 300개의 복합 포인트
간접 차원에서의 스펙트럼 범위 = 120 ppm 내지 10 ppm
재순환 지연 = 1초
1-결합 1H-13C 커플링 상수 = JCH = 146 Hz
스캔 횟수 = 8회
온도 = 298-299 K
용매 = D2O
가공 파라미터
직접 차원에서의 윈도우 함수 = 가우스 확장, 7.66 Hz
간접 차원에서의 윈도우 함수 = 가우스 확장, 26.48 Hz
가공 = 직접 차원에서의 512개의 복합 포인트, 간접 차원에서의 1024개의 복합 포인트.
특정 실시양태에서, NMR 스펙트럼은 조성물의 샘플에 대해 HSQC NMR을 수행함으로써 수득되며, 여기서 샘플은 중수소화 용매 중 용액이다. 적합한 중수소화 용매는 중수소화 아세토니트릴, 중수소화 아세톤, 중수소화 메탄올, D2O 및 그의 혼합물을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 중수소화 용매는 D2O이다. 추가로, 일부 실시양태에서, HSQC NMR을 특징으로 하는 올리고사카라이드 조성물은 올리고사카라이드 조성물이 10% 미만의 단량체 (예를 들어, 8%, 6%, 5%, 4%, 2% 또는 1% 미만의 단량체)를 포함하도록 탈단량체화 절차를 거쳤다.
특정 실시양태에서, NMR 스펙트럼은 실시예 8에 기재된 조건을 사용하여 수득된다.
예시적인 올리고사카라이드 조성물은 본원에 기재된 절차에 따라 제조될 수 있다.
III. 사용 방법
염증의 감소를 필요로 하는 대상체에서 염증을 감소시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 (예를 들어, 대상체의 위장관에) 본원에 기재된 선택된 올리고사카라이드 조성물을 투여하여 대상체에서 염증을 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물은 염증성 및 면역 장애 (예를 들어, 자가면역 및 알레르기성 장애)를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에서 염증을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물은 만성 염증 장애 (예를 들어, 염증성 장 질환, 예를 들어 UC 또는 CD)를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에서 염증을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물은 대상체 (예를 들어, 만성 염증 장애, 예컨대 궤양성 결장염 (UC)을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체)에서 국부 염증 (예를 들어, 장 염증)을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물은 대상체에서 국부 염증 (예를 들어, 장 염증), 예를 들어 국부 염증의 중증도 및/또는 염증발생 국부 영역 (예를 들어, 염증의 장 영역)의 크기를 감소시키는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물은 궤양성 결장염 (UC), 크론병 (CD), 육아종성 결장염, 불확정 결장염, 전환 결장염, 낭염, 베체트병, 현미경적 결장염, 게실증-연관 결장염, 콜라겐성 결장염, 림프구성 결장염 및 소아-발병 염증성 장 질환을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에서 염증을 감소시키는 데 사용될 수 있다.
염증 장애, 예컨대 궤양성 결장염 (UC)의 치료는 대변 및/또는 혈액에서 염증의 바이오마커의 수준을 결정함으로써 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 염증은 국부로 평가된다 (예를 들어, 국부 장 염증). 일부 실시양태에서, 염증은 전신으로 평가된다 (예를 들어, 전신 염증). 일부 실시양태에서, 인간 대상체에 대한 본원에 기재된 선택된 올리고사카라이드 조성물의 투여는 (예를 들어, 대변/분변 샘플에서) 염증의 1종 이상의 바이오마커의 조정을 유발한다. 선택된 올리고사카라이드 조성물에 의해 조정되는 염증의 바이오마커의 예는 칼프로텍틴 (예를 들어, 분변 칼프로텍틴), 락토페린 (예를 들어, 분변 락토페린) 및 리포칼린 (예를 들어, 분변 리포칼린)을 포함한다. 선택된 올리고사카라이드 조성물에 의해 조정될 수 있는 염증의 바이오마커의 추가의 예는 고-민감성 C-반응성 단백질 (hsCRP), LPS-결합 단백질 (LBP), 장 지방산-결합 단백질 (I-FABP), TNFα, IL-1β, IL-6, IL-12, IFNγ, IL-2, IL-4, IL-13, IL-8 및 IL-10을 포함한다.
칼프로텍틴은 병원체, 예컨대 호중구, 단핵구 및 대식세포에 대한 면역 반응에 관여하는 세포에서 발견되는 단백질 바이오마커이다 (Gaya et al., 2002, QJM: An International Journal of Medicine, Volume 95, Issue 9, September 2002, Pages 557-558; Roseth et al., 2004, Scandinavian Journal of Gastroenterology, 39:10, 1017-1020). 이는 호중구에서 세포질 단백질의 많게는 60%를 차지할 수 있다. 장 염증 동안, 호중구는 장 상피를 통해 장 내강으로 이동하여, 대변 중 칼프로텍틴의 양이 증가되도록 한다 (Masoodi et al., 2011, Ger Med Sci). 분변 칼프로텍틴의 수준은 장 내강 내 호중구의 수와 상관관계가 있고, 염증성 장 질환 (IBD), 예컨대 크론병 및 궤양성 결장염에서 상승된다 (Konikoff M.R., Inflamm Bowel Dis. 2006 Jun;12(6):524-34.).
일부 실시양태에서, 대상체에 대한 올리고사카라이드 조성물, 예를 들어 유효 용량의 올리고사카라이드 조성물의 투여는, 대상체에 속하는 대변/분변 샘플 중 분변 칼프로텍틴 수준이 참조 측정치 (예를 들어, 조성물의 투여 전에 수득된 측정치)에 비해 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 감소되도록 한다. 일부 실시양태에서, 대상체에 대한 올리고사카라이드 조성물의 투여는, 대상체에 속하는 대변/분변 샘플 중 분변 칼프로텍틴 수준이 참조 측정치 (예를 들어, 조성물의 투여 전에 수득된 측정치)에 비해 1-10%, 5-20%, 10-25%, 20-40%, 30-50%, 40-60%, 50-70%, 60-80%, 70-90%, 80-100% 또는 90-100%만큼 감소되도록 한다. 일부 실시양태에서, 대상체에 대한 올리고사카라이드 조성물의 투여는, 대상체에 속하는 대변/분변 샘플 중 분변 칼프로텍틴 수준이 치료 (예를 들어, 제1 투여 후, 예를 들어 대상체에 대한 유효 용량의 선택된 올리고사카라이드의 제1 투여 후) 약 1주, 2주, 4주, 6주, 8주, 10주, 12주, 26주, 52주 내에 감소되도록 한다.
일부 실시양태에서, 대상체에 속하는 대변/분변 샘플 중 분변 칼프로텍틴의 수준은 대상체에 대한 올리고사카라이드 조성물의 투여 후 200 μg/g, 150 μg/g, 100 μg/g, 75 μg/g 또는 50 μg/g 미만이다.
일부 실시양태에서, 대상체에 대한 올리고사카라이드 조성물, 예를 들어 유효 용량의 올리고사카라이드 조성물의 투여는, 대상체에 속하는 대변/분변 샘플 중 분변 락토페린 수준이 참조 측정치 (예를 들어, 조성물의 투여 전에 수득된 측정치)에 비해 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 감소되도록 한다. 일부 실시양태에서, 대상체에 대한 올리고사카라이드 조성물의 투여는, 대상체에 속하는 대변/분변 샘플 중 분변 락토페린의 수준이 참조 측정치 (예를 들어, 조성물의 투여 전에 수득된 측정치)에 비해 1-10%, 5-20%, 10-25%, 20-40%, 30-50%, 40-60%, 50-70%, 60-80%, 70-90%, 80-100% 또는 90-100%만큼 감소되도록 한다. 일부 실시양태에서, 대상체에 대한 올리고사카라이드 조성물의 투여는, 대상체에 속하는 대변/분변 샘플 중 분변 락토페린의 수준이 치료 (예를 들어, 제1 투여 후, 예를 들어 대상체에 대한 유효 용량의 선택된 올리고사카라이드의 제1 투여 후) 약 1주, 2주, 4주, 6주, 8주, 10주, 12주, 26주, 52주 내에 감소되도록 한다.
일부 실시양태에서, 대상체에 속하는 대변/분변 샘플 중 분변 락토페린의 수준은 대상체에 대한 올리고사카라이드 조성물의 투여 후 20 μg/g, 15 μg/g, 10 μg/g, 5 μg/g 또는 3 μg/g 미만이다.
일부 실시양태에서, 대상체에 대한 올리고사카라이드 조성물, 예를 들어 유효 용량의 올리고사카라이드 조성물의 투여는, 대상체에 속하는 대변/분변 샘플 중 분변 리포칼린 수준이 참조 측정치 (예를 들어, 조성물의 투여 전에 수득된 측정치)에 비해 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 감소되도록 한다. 일부 실시양태에서, 대상체에 대한 올리고사카라이드 조성물의 투여는, 대상체에 속하는 대변/분변 샘플 중 분변 리포칼린 수준이 참조 측정치 (예를 들어, 조성물의 투여 전에 수득된 측정치)에 비해 1-10%, 5-20%, 10-25%, 20-40%, 30-50%, 40-60%, 50-70%, 60-80%, 70-90%, 80-100% 또는 90-100%만큼 감소되도록 한다. 일부 실시양태에서, 대상체에 대한 올리고사카라이드 조성물의 투여는, 대상체에 속하는 대변/분변 샘플 중 분변 리포칼린의 수준이 치료 (예를 들어, 제1 투여 후, 예를 들어 대상체에 대한 유효 용량의 선택된 올리고사카라이드의 제1 투여 후) 약 1주, 2주, 4주, 6주, 8주, 10주, 12주, 26주, 52주 내에 감소되도록 한다.
일부 실시양태에서, 대상체에 속하는 대변/분변 샘플 중 분변 리포칼린의 수준은 대상체에 대한 올리고사카라이드 조성물의 투여 후 2000 ng/g, 1500 ng/g, 1000 ng/g, 500 ng/g 또는 250 ng/g 미만이다.
일부 실시양태에서, 대상체에 대한 올리고사카라이드 조성물의 투여는 대상체에 속하는 대변/분변 샘플에서 분변 칼프로텍틴, 분변 락토페린 및/또는 분변 리포칼린의 수준의 감소를 유발하며 칼프로텍틴, 락토페린 및/또는 리포칼린의 혈장 수준의 유사한 감소는 유발하지 않는다. 이는, 일부 실시양태에서, 선택된 올리고사카라이드 조성물이 국부로, 예를 들어 국부 장 염증에 대해 작용할 수 있다는 것을 나타낸다.
본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물은 단쇄 지방산 (SCFA), 예를 들어 부티레이트, 아세테이트 및 프로피오네이트의 수준을 조정, 예를 들어 증가시키는 데 사용될 수 있다. 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물은, 예를 들어 염증성 상태 또는 질환, 예를 들어 만성 염증성 상태, 예컨대, 예를 들어 염증성 장 질환, 예컨대 UC 및 CD를 나타내는 대상체에서 단쇄 지방산 (SCFA), 예를 들어 부티레이트, 아세테이트 및 프로피오네이트의 수준을 조정, 예를 들어 증가시키는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물은 대상체에서 단쇄 지방산 (SCFA), 예를 들어 부티레이트, 아세테이트 및 프로피오네이트의 수준을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물은 대상체의 위장관에서 단쇄 지방산 (SCFA), 예를 들어 부티레이트, 아세테이트 및 프로피오네이트의 수준을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물을 투여함으로써 대상체에서 부티레이트의 농도를 증가시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물을 투여함으로써 대상체에서 프로피오네이트의 농도를 증가시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물을 투여함으로써 대상체에서 아세테이트의 농도를 증가시키는 방법이 본원에 제공된다.
본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물은 공생 미생물에 비해 병원성 및/또는 염증유발 미생물의 존재비를 조정, 예를 들어 감소시키는 데 사용될 수 있다. 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물은, 예를 들어 염증성 상태 또는 질환, 예를 들어 만성 염증성 상태, 예컨대, 예를 들어 염증성 장 질환, 예컨대 UC 및 CD를 나타내는 대상체에서 공생 미생물에 비해 병원성 및/또는 염증유발 미생물의 존재비를 조정, 예를 들어 감소시키는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물은 공생 미생물 (예를 들어, 파라박테로이데스 및 박테로이데스)의 성장 및/또는 존재비 (예를 들어, 상대 존재비)를 촉진하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물은 유해균 및/또는 염증유발 미생물 분류군 (예를 들어, 엔테로박테리아세아에 과로부터의 분류군)의 성장 및/또는 존재비 (예를 들어, 상대 존재비)를 감소시키는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물은 병원성 및/또는 염증유발 박테리아에 비해 공생 박테리아의 비를 증가시키는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 (예를 들어, 대상체의 위장관에) 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물을 투여함으로써 상기 대상체에서 공생 미생물에 비해 병원성 및/또는 염증유발 미생물의 존재비를 감소시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 (예를 들어, 대상체의 위장관에) 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물을 투여함으로써 상기 대상체에서 병원성 및/또는 염증유발 미생물에 비해 공생 미생물의 존재비를 증가시키는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 염증의 감소를 필요로 하는 대상체에서 SCFA (예를 들어, 부티레이트, 프로피오네이트 및/또는 아세테이트)의 총 농도 또는 양을 증가시킴으로써 (예를 들어, 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물을 투여하는 것에 의함) 염증의 감소를 필요로 하는 대상체에서 염증을 감소시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 염증의 감소를 필요로 하는 대상체, 예를 들어 염증성 상태 또는 질환, 예를 들어 만성 염증성 상태, 예컨대, 예를 들어 염증성 장 질환, 예컨대 UC 및 CD를 나타내는 대상체에게 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물을 투여하여 대상체 (예를 들어, 대상체의 위장관)에서 공생 미생물에 비해 병원성 및/또는 염증유발 미생물의 존재비를 감소시킴으로써 염증의 감소를 필요로 하는 대상체에서 염증을 감소시키는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물은 자가면역 및/또는 알레르기성 장애 (예를 들어, 만성 염증성 장애, 예를 들어 염증성 장 질환, 예를 들어 궤양성 결장염, 크론병, 육아종성 결장염, 불확정 결장염, 전환 결장염, 낭염, 베체트병, 현미경적 결장염, 게실증-연관 결장염, 콜라겐성 결장염, 림프구성 결장염 및/또는 소아-발병 염증성 장 질환)를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에서 단쇄 지방산 (SCFA), 예를 들어 부티레이트, 아세테이트 및 프로피오네이트의 수준을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 선택된 올리고사카라이드 조성물은 그를 필요로 하는 대상체에서 (예를 들어, 위장관에서) 단쇄 지방산 (SCFA), 예를 들어 부티레이트, 아세테이트 및 프로피오네이트의 수준을 증가시키는 데 유효한 양으로 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물은 자가면역 및/또는 알레르기성 장애 (예를 들어, 만성 염증성 장애, 예를 들어 염증성 장 질환, 예를 들어 궤양성 결장염, 크론병, 육아종성 결장염, 불확정 결장염, 전환 결장염, 낭염, 베체트병, 현미경적 결장염, 게실증-연관 결장염, 콜라겐성 결장염, 림프구성 결장염 및/또는 소아-발병 염증성 장 질환)를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에서 (예를 들어, 대상체의 위장관에서) 공생 미생물에 비해 병원성 및/또는 염증유발 미생물의 존재비를 감소시키는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 선택된 올리고사카라이드 조성물은 그를 필요로 하는 대상체에서 공생 미생물에 비해 병원성 및/또는 염증유발 미생물의 존재비를 감소시키는 데 유효한 양으로 대상체에게 (예를 들어, 대상체의 위장관에) 투여된다.
일부 실시양태에서, 대상체에 대한 올리고사카라이드 조성물의 투여는 장내 미생물 불균형 및 공생 박테리아에 비해 병원성 박테리아의 높은 상대 존재비 및/또는 SCFA의 낮은 수준과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 대상체에 대한 올리고사카라이드 조성물의 투여는 자가면역 및/또는 알레르기성 장애 (예를 들어, 만성 염증성 장애, 예를 들어 염증성 장 질환, 예를 들어 궤양성 결장염, 크론병, 육아종성 결장염, 불확정 결장염, 전환 결장염, 낭염, 베체트병, 현미경적 결장염, 게실증-연관 결장염, 콜라겐성 결장염, 림프구성 결장염 및/또는 소아-발병 염증성 장 질환)를 치료하는 데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 대상체에 대한 올리고사카라이드 조성물의 투여는 궤양성 결장염을 치료하는 데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 대상체에 대한 올리고사카라이드 조성물의 투여는 크론병을 치료하는 데 효과적이다.
일부 실시양태에서, 자가면역 및/또는 알레르기성 장애 (예를 들어, 만성 염증성 장애)를 갖는 대상체에 대한 올리고사카라이드 조성물의 투여는 (예를 들어, 대상체의 위장관에서) 단쇄 지방산 (SCFA), 예를 들어 부티레이트, 아세테이트 및 프로피오네이트의 수준을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 염증성 장 질환 (예를 들어, 궤양성 결장염, 크론병, 육아종성 결장염, 불확정 결장염, 전환 결장염, 낭염, 베체트병, 현미경적 결장염, 게실증-연관 결장염, 콜라겐성 결장염, 림프구성 결장염 및/또는 소아-발병 염증성 장 질환)을 갖는 대상체에 대한 올리고사카라이드 조성물의 투여는 (예를 들어, 대상체의 위장관에서) 단쇄 지방산 (SCFA), 예를 들어 부티레이트, 아세테이트 및 프로피오네이트의 수준을 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 대상체에서 미생물 군집 조성 및/또는 미생물 군집의 대사 산출량을 조정하여, 예를 들어 환경을 조정하여, 예를 들어 단쇄 지방산 (예를 들어, 부티레이트, 아세테이트 및/또는 프로피오네이트)의 수준을 조정하는 (예를 들어, 증가시키는) 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물은 프로피오네이트-생산 박테리아 (예를 들어, 파라박테로이데스 문에 속함)의 성장 및/또는 존재비 (예를 들어, 상대 존재비)를 촉진한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물은 부티레이트-생산 박테리아 (예를 들어, 라크노스피라세아에(Lachnospiraceae) 및 유박테리아세아에(Eubacteriaceae))의 성장 및/또는 존재비 (예를 들어, 상대 존재비)를 촉진한다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 미생물 군집을 조정하고 GI 관의 환경을 변경 (예를 들어, pH 변경, 락트산 변경, 미생물 밀도 변경 등)시키는 유효량으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 대상체에 대한 올리고사카라이드 조성물의 투여는 대상체에서의 (예를 들어, 대상체의 위장관에서의) 총 단쇄 지방산의 수준이 참조 측정치 (예를 들어, 조성물의 투여 전에 수득된 측정치)에 비해 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150% 또는 200%만큼 증가되도록 한다. 일부 실시양태에서, 대상체에 대한 올리고사카라이드 조성물의 투여는 대상체에서의 (예를 들어, 대상체의 위장관에서의) 총 단쇄 지방산의 수준이 참조 측정치 (예를 들어, 조성물의 투여 전에 수득된 측정치)에 비해 1-10%, 5-20%, 10-25%, 20-40%, 30-50%, 40-60%, 50-70%, 60-80%, 70-90%, 80-100%, 90-110%, 100-125%, 110-150%, 125-175% 또는 150-200%만큼 증가되도록 한다.
일부 실시양태에서, 대상체에서의 단쇄 지방산의 기준선 측정치의 참조는 문헌 [Venegas, D.P. et al., Short Chain Fatty Acids (SCFAs)-Mediated Gut Epithelial and Immune Regulation and Its Relevance for Inflammatory Bowel Diseases., Front. Immunol., Vol. 10, Art. 277, 11 March 2019]에 기재된 바와 같다. 일부 실시양태에서, 대상체에서의 단쇄 지방산의 기준선 측정치의 참조는 문헌 [Cummings, J.H. et al., Short chain fatty acids in human large intestine, portal, hepatic and venous blood., Gut, 1987, 28, 1221-1227]에 기재된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 대상체에 대한 올리고사카라이드 조성물의 투여는 대상체에서의 (예를 들어, 대상체의 위장관에서의) 부티레이트의 수준이 참조 측정치 (예를 들어, 조성물의 투여 전에 수득된 측정치)에 비해 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150% 또는 200%만큼 증가되도록 한다. 일부 실시양태에서, 대상체에 대한 올리고사카라이드 조성물의 투여는 대상체에서의 (예를 들어, 대상체의 위장관에서의) 부티레이트의 수준이 참조 측정치에 비해 1-10%, 5-20%, 10-25%, 20-40%, 30-50%, 40-60%, 50-70%, 60-80%, 70-90%, 80-100%, 90-110%, 100-125%, 110-150%, 125-175% 또는 150-200%만큼 증가되도록 한다.
일부 실시양태에서, 대상체에 대한 올리고사카라이드 조성물의 투여는 대상체에서의 (예를 들어, 대상체의 위장관에서의) 아세테이트의 수준이 참조 측정치 (예를 들어, 조성물의 투여 전에 수득된 측정치)에 비해 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150% 또는 200%만큼 증가되도록 한다. 일부 실시양태에서, 대상체에 대한 올리고사카라이드 조성물의 투여는 대상체에서의 (예를 들어, 대상체의 위장관에서의) 아세테이트의 수준이 참조 측정치에 비해 1-10%, 5-20%, 10-25%, 20-40%, 30-50%, 40-60%, 50-70%, 60-80%, 70-90%, 80-100%, 90-110%, 100-125%, 110-150%, 125-175% 또는 150-200%만큼 증가되도록 한다.
일부 실시양태에서, 대상체에 대한 올리고사카라이드 조성물의 투여는 대상체에서의 (예를 들어, 대상체의 위장관에서의) 프로피오네이트의 수준이 참조 측정치 (예를 들어, 조성물의 투여 전에 수득된 측정치)에 비해 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150% 또는 200%만큼 증가되도록 한다. 일부 실시양태에서, 대상체에 대한 올리고사카라이드 조성물의 투여는 대상체에서의 (예를 들어, 대상체의 위장관에서의) 프로피오네이트의 수준이 참조 측정치에 비해 1-10%, 5-20%, 10-25%, 20-40%, 30-50%, 40-60%, 50-70%, 60-80%, 70-90%, 80-100%, 90-110%, 100-125%, 110-150%, 125-175% 또는 150-200%만큼 증가되도록 한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 자가면역 및/또는 알레르기성 장애 (예를 들어, 만성 염증성 장애)의 적어도 1종 (예를 들어, 1, 2, 3 또는 4종 또는 그 초과)의 증상을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 염증성 장 질환 (예를 들어, 궤양성 결장염, 크론병, 육아종성 결장염, 불확정 결장염, 전환 결장염, 낭염, 베체트병, 현미경적 결장염, 게실증-연관 결장염, 콜라겐성 결장염, 림프구성 결장염 및/또는 소아-발병 염증성 장 질환)의 적어도 1종의 증상 (예를 들어, 1, 2, 3 또는 4종 또는 그 초과)을 치료하는 데 사용될 수 있다. 염증성 장 질환의 증상은 설사의 빈도, 설사의 중증도, 복통 및 경련, 묽은변, 혈변, 직장 통증, 직장 출혈, 배변 절박, 절박에도 불구하고 배변 불능, 체중 감소, 식욕 상실, 피로 및 열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 자가면역 및/또는 알레르기성 장애 (예를 들어, 만성 염증성 장애, 예를 들어 염증성 장 질환, 예를 들어 궤양성 결장염, 크론병, 육아종성 결장염, 불확정 결장염, 전환 결장염, 낭염, 베체트병, 현미경적 결장염, 게실증-연관 결장염, 콜라겐성 결장염, 림프구성 결장염 및/또는 소아-발병 염증성 장 질환)를 갖는 대상체를 치료하는 것은 올리고사카라이드 조성물의 투여와 표준 관리 치료를 조합하는 것을 포함한다. 표준 관리 치료는 스테로이드, 코르티코스테로이드 (예를 들어, 프레드니손 및/또는 부데소니드), 면역조정제 약물 (예를 들어, 아자티오프린, 메르캅토퓨린, 시클로스포린 및/또는 토파시티닙), 아미노살리실레이트 (예를 들어, 5-아미노살리실산 및 그의 유도체, 술파살라진 (아줄피딘), 메살라민 (아사콜 HD, 델지콜 등), 발살라지드 (콜라잘) 및 올살라진 (디펜툼)) 및 생물제제 (예를 들어, 항-TNF 분자, 예컨대 아달리무맙, 인플릭시맙, 골리무맙, 세르톨리주맙 페골, 항-인테그린 분자, 예컨대 나탈리주맙, 베돌리주맙 및/또는 IL-12 및/또는 IL-23 효능제, 예컨대 우스테키누맙)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 궤양성 결장염을 갖는 대상체를 치료하는 것은 표준 관리 치료 (예를 들어, 코르티코스테로이드, 스테로이드, 아미노살리실레이트, 면역조정제 약물, 생물제제 등을 사용한 치료)와 공동으로의 올리고사카라이드 조성물의 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 크론병을 갖는 대상체를 치료하는 것은 표준 관리 치료 (예를 들어, 코르티코스테로이드, 스테로이드, 아미노살리실레이트, 면역조정제 약물, 생물제제 등을 사용한 치료)와 공동으로의 올리고사카라이드 조성물의 투여를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 올리고사카라이드 조성물을 필요로 하는 자가면역 및/또는 알레르기성 장애 (예를 들어, 만성 염증성 장애, 예를 들어 염증성 장 질환, 예를 들어 궤양성 결장염, 크론병, 육아종성 결장염, 불확정 결장염, 전환 결장염, 낭염, 베체트병, 현미경적 결장염, 게실증-연관 결장염, 콜라겐성 결장염, 림프구성 결장염 및/또는 소아과-발병 염증성 장 질환)를 갖는 대상체는 이전에 상기 장애에 대한 수술 (예를 들어, 위장관의 손상된 부분을 제거하기 위한 수술) 또는 표준 관리 치료 개입 (예를 들어, 코르티코스테로이드, 스테로이드, 아미노살리실레이트, 면역조정제 약물, 생물제제 등을 사용한 치료)을 받은 대상체이다.
본원에 제공된 화합물 및 조성물은 대상체의 미생물총에 존재하는 박테리아 분류군 (예를 들어 1, 2, 3, 4, 5종 또는 그 초과의 분류군)을 조정하는 방법에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조정은 염증유발 및/또는 병원성 미생물 분류군 (예를 들어, 엔테로박테리아세아에 과로부터의 분류군)의 존재비 (예를 들어, 상대 존재비)의 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조정은 공생 미생물 분류군 (예를 들어, 파라박테로이데스 및 박테로이데스)에 비해 염증유발 및/또는 병원성 미생물 분류군 (예를 들어, 엔테로박테리아세아에 과로부터의 분류군)의 존재비의 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조정은 엔테로박테리아세아에 및/또는 루미노코카세아에의 존재비 (예를 들어, 상대 존재비)의 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조정은 엔테로박테리아세아에 에스케리키아 및/또는 루미노코카세아에 파에칼리박테리움(Faecalibacterium)의 존재비 (예를 들어, 상대 존재비)의 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조정은 공생 미생물 분류군 (예를 들어, 파라박테로이데스 및 박테로이데스로부터의 분류군)의 존재비 (예를 들어, 상대 존재비)의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조정은 파라박테로이데스 및 에이센베르기엘라(Eisenbergiella)의 존재비 (예를 들어, 상대 존재비)의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조정은 염증유발 및/또는 병원성 미생물 분류군 (예를 들어, 엔테로박테리아세아에 과로부터의 분류군)에 비해 공생 미생물 분류군 (예를 들어, 파라박테로이데스 및 박테로이데스로부터의 분류군)의 존재비의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조정은 박테로이다세아에(Bacteroidaceae) 및/또는 탄네렐라세아에(Tannerellaceae)의 존재비 (예를 들어, 상대 존재비)의 증가를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조정은 박테로이다세아에 박테로이데스, 탄네렐라세아에 파라박테로이데스, 에스케리키아, 클레브시엘라, 시겔라(Shigella) 및/또는 시트로박터(Citrobacter)의 존재비 (예를 들어, 상대 존재비)의 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조정은 미생물총의 구조에서의 변화, 예컨대, 예를 들어 또 다른 분류군 대비 또는 조정의 부재 하에 관찰될 것 대비 분류군의 상대 조성에서의 변화 또는 분류군의 상대 존재비에서의 변화를 포함한다. 다른 실시양태에서, 조정은 미생물총의 기능에서의 변화, 예컨대 유전자 발현에서의 변화, 유전자 카피수, DNA의 전체 존재비, 유전자 산물 (예를 들어, RNA 또는 단백질)의 수준 또는 미생물총의 대사 산출량에서의 변화, 또는 숙주의 기능적 경로에서의 변화 (예를 들어, 유전자 발현, 유전자 산물의 수준 또는 숙주 세포 또는 숙주 과정의 대사 산출량에서의 변화)를 포함한다. WO 2016/122889 및 WO 2016/172657 (이는 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 미생물 분류군을 조정하는 방법이 본원에 기재된 방법에 사용하기에 적합하다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물은 프로피오네이트-생산 박테리아 (예를 들어, 파라박테로이데스 문에 속함)의 성장 및/또는 존재비 (예를 들어, 상대 존재비)를 촉진한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물은 부티레이트-생산 박테리아 (예를 들어, 라크노스피라세아에 및 유박테리아세아에)의 성장 및/또는 존재비 (예를 들어, 상대 존재비)를 촉진한다.
본원에 기재된 방법은 대상체에게 본원에 기재된 조성물, 예를 들어 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물을 포함하는 조성물을 분류군 조정에 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 박테리아 분류군의 존재비는 조성물이 투여될 때 다른 분류군에 비해 (또는 한 시점에서 또 다른 시점까지에 비해) 증가할 수 있고, 증가는 적어도 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 250%, 500%, 750% 증가 또는 적어도 1000% 증가일 수 있다. 박테리아 분류군의 존재비는 또한 조성물이 투여될 때 다른 분류군에 비해 (또는 한 시점에서 또 다른 시점까지에 비해) 감소할 수 있고, 감소는 적어도 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 감소 또는 적어도 99.9% 감소일 수 있다. 조성물의 투여는 대상체의 위장 미생물총에서 목적하는 및/또는 비-목적하는 박테리아 분류군의 존재비를 조정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 예를 들어 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물을 포함하는 본원에 기재된 조성물은 (예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10종 또는 그 초과)의 박테리아 분류군 중 1종 이상의 성장 (및 총수)을 조정하거나 (예를 들어 실질적으로 증가 또는 실질적으로 감소시키거나) 또는 그의 총 (위장) 군집에서의 상대 표현/존재비를 실질적으로 증가 또는 실질적으로 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 예를 들어 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물을 포함하는 본원에 기재된 조성물은 (예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10종 또는 그 초과)의 공생 박테리아 분류군 중 1종 이상의 성장, 예를 들어 총수 또는 총 (위장) 군집에서의 상대 표현/존재비를 실질적으로 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물을 포함하는 본원에 기재된 조성물은 파라박테로이데스 및 박테로이데스의 성장, 예를 들어 총수 또는 총 (위장) 군집에서의 상대 표현/존재비를 실질적으로 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물을 포함하는 본원에 기재된 조성물은 박테로이다세아에 및/또는 탄네렐라세아에의 성장, 예를 들어 총수 또는 총 (위장) 군집에서의 상대 표현/존재비를 실질적으로 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 예를 들어 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물을 포함하는 본원에 기재된 조성물은 박테리아 분류군 중 1종 이상 (예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10종 또는 그 초과)의 성장, 예를 들어 총수 또는 총 (위장) 군집에서의 상대 표현/존재비를 실질적으로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물을 포함하는 본원에 기재된 조성물은 엔테로박테리아세아에 및/또는 루미노코카세아에의 성장, 예를 들어 총수 또는 총 (위장) 군집에서의 상대 표현/존재비를 실질적으로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물을 포함하는 본원에 기재된 조성물은 엔테로박테리아세아에 에스케리키아 및/또는 루미노코카세아에 파에칼리박테리움의 성장, 예를 들어 총수 또는 총 (위장) 군집에서의 상대 표현/존재비를 실질적으로 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 대상체 (예를 들어, 대상체의 장)에 대한 선택된 올리고사카라이드 조성물의 투여는 대상체의 위장관의 마이크로바이옴 내에서 부착-침습성 에스케리키아 콜라이와 연관된 유전자의 고갈 (즉, 수준의 감소)을 유발한다 (예를 들어, 대상체의 분변 샘플에서 측정 시). 수준의 평가 (예를 들어, 메타게놈 평가)는 부착-침습성 에스케리키아 콜라이의 농도 및 존재비를 평가하기 위한 메카니즘을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 부착-침습성 에스케리키아 콜라이와 연관된 유전자의 수준의 평가는 이. 콜라이 유전자의 판게놈을 정량화하는 데 사용되는 판게놈-기반 필로게놈 분석 (PanPhlAn) (예를 들어, 메타게놈 데이터의 것)을 사용하여 (예를 들어, 이러한 유전자의 90% 아미노산 동일성 유전자 클러스터의 판게놈 참조물을 사용하여) 수행된다. 이들 박테리아 분류군은 염증성 장 질환, 예컨대 궤양성 결장염의 발병기전에 연루되어 왔다. 예를 들어, 문헌 [Palmela C., et al. "Adherent-invasive Escherichia coli in inflammatory bowel disease," Gut 2018;67:574-587]을 참조한다. 부착-침습성 이. 콜라이와 연관된 유전자는 fimH, ompA, ompC, fim 오페론/fimH, chiA, nlpI, yfgL, ibeA, afaC, vat-AIEC, fliC, vgrG, hcp, vasD, vasG, impL, impK 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체에 대한 올리고사카라이드 조성물의 투여는, 대상체의 위장관의 마이크로바이옴 내에서 부착-침습성 에스케리키아 콜라이와 연관된 유전자 (예를 들어, fimH, ompA, ompC)가 참조 측정치 (예를 들어, 조성물의 투여 전에 수득된, 예를 들어 대상체의 분변 샘플에서 측정된 측정치)에 비해 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 고갈되도록 한다 (즉, 수준이 감소되도록 함). 일부 실시양태에서, 대상체에 대한 올리고사카라이드 조성물의 투여는, 대상체의 위장관의 마이크로바이옴 내에서 부착-침습성 에스케리키아 콜라이와 연관된 유전자 (예를 들어, fimH, ompA, ompC)가 참조 측정치 (예를 들어, 조성물의 투여 전에 수득된, 예를 들어 대상체의 분변 샘플에서 측정된 측정치)에 비해 1-10%, 5-20%, 10-25%, 20-40%, 30-50%, 40-60%, 50-70%, 60-80%, 70-90%, 80-100%, 90-100%만큼 고갈되도록 한다 (즉, 수준이 감소되도록 함).
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물은, 예를 들어 참조 박테리아 분류군 또는 종보다 더 높은 비율로 콜레스테롤을 소비하는 박테리아 분류군 및 종의 성장, 예를 들어 총수 또는 총 (위장) 군집에서의 상대 표현/존재비를 조정한다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은, 예를 들어 경구 투여를 위한 재구성 (예를 들어, 물 중)을 위한 분말로서 제제화된다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 경구 투여를 위한 고체 형태 (예를 들어, 저작성 정제 또는 점착성)로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 공급 튜브에 의한 전달을 위한 제약 조성물로서 제제화된다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 총 비경구 영양 (TPN)에 의한 전달을 위한 제약 조성물로서 제제화된다.
올리고사카라이드 조성물은 대상체에게 매일, 매주, 격주 또는 매월 기준으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 대상체에게 매일 투여된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 대상체에게 1일에 1회 초과 (예를 들어, 1일에 2, 3 또는 4회)로 투여된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 대상체에게 1주에 1회 초과 (예를 들어, 1주에 2, 3 또는 4회)로 투여된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 대상체에게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10주 동안 연이어 1일에 1회 또는 2회 투여된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 대상체에게 만성적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 대상체에게 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월 또는 그 초과의 연속 개월 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 보다 높은 용량은 초기에, 예를 들어 1-2주, 1-4주, 1-6주, 1-8주, 1-10주, 1-12주 동안 투여되고, 용량은, 예를 들어 대상체에 대한 만성 또는 장기간 투여를 위해 (예를 들어, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%만큼) 저하된다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 만성 장애 (예를 들어, 염증성 장 질환)를 갖는 대상체에게 매일 또는 매주 기준으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 만성 장애 (예를 들어, 염증성 장 질환)를 갖는 대상체에게 상기 장애를 치료하는 데 유효한 양으로 1일 2회 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물은 만성 장애 (예를 들어, 염증성 장 질환)를 갖는 대상체에게 최대 허용 용량으로 1일 2회 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물의 유효량은 매일 투여되는 총 5-200 그램, 5-150 그램, 5-100 그램, 5-75 그램, 5-50 그램, 5-25 그램, 10-50 그램, 25-50 그램, 30-60 그램, 50-75 그램, 50-100 그램 또는 40-80 그램이다.
본 개시내용의 올리고사카라이드 조성물은 대상체에 의해 잘 허용된다 (예를 들어, 올리고사카라이드 조성물은 대상체에서 불편감, 예를 들어 가스 생산 또는 위장 불편감을 유발하지 않거나 최소한으로 유발함). 일부 실시양태에서, 5-200 그램, 5-150 그램, 5-100 그램, 5-75 그램, 5-50 그램, 5-25 그램, 10-50 그램, 25-50 그램, 30-60 그램, 50-75 그램, 50-100 그램 또는 40-80 그램의 총 1일 용량이 대상체에 의해 잘 허용된다. 일부 실시양태에서, 올리고사카라이드 조성물의 최대 허용 용량은 매일 투여되는 5-200 그램, 5-150 그램, 5-100 그램, 5-75 그램, 5-50 그램, 5-25 그램, 10-50 그램, 25-50 그램, 30-60 그램, 50-75 그램, 50-100 그램, 40-80 그램 또는 그 초과의 그램이다. 대상체에게 단일 시간에 또는 단일 용량으로 투여되는 본원에 기재된 바와 같은 올리고사카라이드 조성물의 임의의 투여량은 대상체에 의해 잘 허용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체에게 단일 시간에 또는 단일 용량으로 투여되는 올리고사카라이드 조성물의 양은 유사한 양의 상업적 저-소화성 당, 예컨대 프룩토올리고사카라이드 (FOS)보다 대상체에 의해 더 잘 허용된다. 상업적 저-소화성 당은, 예를 들어 고용량일 경우 대상체에서 불량하게 허용되는 것으로 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Grabitske, H.A., Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 49:327-360 (2009)] 참조). 예를 들어, FOS의 내약성 연구는 1일에 20 그램의 FOS가 경도 위장 증상을 유발하고, 1일에 30 그램의 FOS가 주요 불편감 및 위장 증상을 유발한다는 것을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물은 공생 또는 프로바이오틱 박테리아 분류군 및 일반적으로 안전한 것으로 인정되는 (GRAS) 박테리아 또는 공지된 공생 또는 프로바이오틱 미생물과 공-투여된다. 일부 실시양태에서, 프로바이오틱 또는 공생 박테리아 분류군 (또는 그의 제제)은 대상체에 대한 올리고사카라이드 조성물의 투여 전 또는 후에 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로바이오틱 또는 공생 박테리아 분류군 (또는 그의 제제)은 대상체에 대한 올리고사카라이드 조성물의 투여와 동시에 대상체에게 투여될 수 있다.
공생 또는 프로바이오틱 박테리아는 또한 프로바이오틱으로 지칭된다. 프로바이오틱스는 발효 동안 프로바이오틱 박테리아에 의해 생성된 대사물을 포함할 수 있다. 이들 대사물은 발효 배지로, 예를 들어 숙주 유기체 (예를 들어, 대상체)로 방출될 수 있거나 또는 이들은 박테리아 내에 저장될 수 있다. 프로바이오틱 박테리아는 박테리아, 박테리아 균질물, 박테리아 단백질, 박테리아 추출물, 박테리아 발효 상청액 및 그의 조합을 포함하며, 이는, 예를 들어 치료 용량으로 제공되는 경우에 숙주 동물에게 유익한 기능을 수행한다.
유용한 프로바이오틱스는 적어도 1종의 락트산 및/또는 아세트산 및/또는 프로피온산 생산 박테리아, 예를 들어 탄수화물, 예컨대 글루코스 및 락토스를 분해함으로써 락트산 및/또는 아세트산 및/또는 프로피온산을 생산하는 미생물을 포함한다. 바람직하게는, 프로바이오틱 박테리아는 락트산 박테리아이다. 실시양태에서, 락트산 박테리아는 락토바실루스(Lactobacillus), 류코노스톡(Leuconostoc), 페디오코쿠스(Pediococcus), 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 및 비피도박테리움(Bifidobacterium)을 포함한다. 적합한 프로바이오틱 박테리아는 또한 숙주의 장내 미생물 균형을 개선시킴으로써 숙주에게 유익하게 영향을 미치는 다른 박테리아, 예컨대, 비제한적으로 효모, 예컨대 사카로미세스(Saccharomyces), 데바리오미세스(Debaryomyces), 칸디다(Candida), 피키아(Pichia) 및 토룰롭시스(Torulopsis), 곰팡이, 예컨대 아스페르길루스(Aspergillus), 리조푸스(Rhizopus), 뮤코르(Mucor) 및 페니실리움(Penicillium) 및 토룰롭시스(Torulopsis), 및 다른 박테리아, 예컨대 비제한적으로 속 박테로이데스(Bacteroides), 클로스트리디움(Clostridium), 푸소박테리움(Fusobacterium), 멜리소코쿠스(Melissococcus), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 엔테로코쿠스(Enterococcus), 락토코쿠스(Lactococcus), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 펩토스트렙토코쿠스(Peptostreptococcus), 바실루스(Bacillus), 페디오코쿠스(Pediococcus), 미크로코쿠스(Micrococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 웨이셀라(Weissella), 아에로코쿠스(Aerococcus) 및 오에노코쿠스(Oenococcus), 및 그의 조합을 포함할 수 있다.
본원의 개시내용에 유용한 락트산 박테리아의 비제한적 예는 스트렙토코쿠스 락티스(Streptococcus lactis), 스트렙토코쿠스 크레모리스(Streptococcus cremoris), 스트렙토코쿠스 디아세틸락티스(Streptococcus diacetylactis), 스트렙토코쿠스 써모필루스(Streptococcus thermophilus), 락토바실루스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실루스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실루스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실루스 비피두스(Lactobacillus bifidus), 락토바실루스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실루스 락티스(Lactobacillus lactis), 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실루스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실루스 델브루엑키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실루스 써모필루스(Lactobacillus thermophilus), 락토바실루스 페르멘티(Lactobacillus fermenti), 락토바실루스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실루스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis), 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) 및 페디오코쿠스 세레비지아에(Pediococcus cerevisiae) 및 그의 조합, 특히 락토바실루스, 비피도박테리움 및 그의 조합의 균주를 포함한다.
본 개시내용에서 특히 유용한 공생 또는 프로바이오틱 박테리아는 (인간 투여를 위해) 인간 기원 (또는 프로바이오틱 박테리아가 투여되는 포유동물의 기원)이고, 숙주에 대해 비-병원성이고, 기술적 과정에 저항하고 (즉, 가공 동안 및 전달 비히클에서 생존가능하고 활성을 유지할 수 있음), 위 산도 및 담즙 독성에 대해 저항성이고, 장 상피 조직에 부착하고, 위장관에서 콜로니화하는 능력을 갖고, 항미생물 물질을 생산하고, 숙주에서 면역 반응을 조정하고, 대사 활성 (예를 들어, 콜레스테롤 동화, 락타제 활성, 비타민 생산)에 영향을 미치는 것들을 포함한다.
공생 또는 프로바이오틱 박테리아는 단일 균주 또는 다중 균주의 조합으로서 사용될 수 있으며, 여기서 프로바이오틱 박테리아의 용량 중 박테리아의 총수는 용량 당 약 1 x 103 내지 약 1 x 1014 또는 약 1 x 10 내지 약 1 x 1012 또는 약 1 x 107 내지 약 1 x 1011 CFU이다.
공생 또는 프로바이오틱 박테리아는, 프로바이오틱 박테리아가 살아있지만 "가사상태" 또는 졸림 상태인 동안 올리고사카라이드 조성물과 함께 제제화될 수 있다. 동결-건조되면, 프로바이오틱 박테리아의 생존 배양물(들)은 배양물을 소생시킬 수분에 대한 노출을 최소화하도록 취급되는데, 이는 소생되면, 배양물이 높은 수분 환경 또는 배지에서 곧 배양되지 않는 한 높은 이환율을 경험할 수 있기 때문이다. 추가적으로, 배양물은 이환율을 감소시키기 위해 (특히 수분의 존재 하에) 고온에 대한 가능한 노출을 감소시키도록 취급된다.
프로바이오틱 박테리아는 분말화된 건조 형태로 사용될 수 있다. 프로바이오틱 박테리아는 또한 올리고사카라이드 조성물로 투여될 수 있거나 또는 올리고사카라이드 조성물과 동시에 또는 상이한 시간에 투여되는 별개의 올리고사카라이드 조성물로 투여될 수 있다.
적합한 다른 프로바이오틱 박테리아는 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 비. 아니말리스(B. animalis), 비. 비피둠(B. bifidum), 비. 롱굼(B. longum), 비. 아돌레센티스(B. adolescentis) 및 비. 인판티스(B. infantis)를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물에서 및/또는 그와 조합하여 사용될 수 있는 공생 박테리아 분류군은 악케르만시아(Akkermansia), 아나에로코쿠스(Anaerococcus), 박테로이데스(Bacteroides), 비피도박테리움(Bifidobacterium) (비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 비. 아니말리스(B. animalis), 비. 비피둠(B. bifidum), 비. 롱굼(B. longum), 비. 아돌레센티스(B. adolescentis), 비. 브레베(B. breve) 및 비. 인판티스(B. infantis) 포함), 블라우티아(Blautia), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 디알리스테르(Dialister), 유박테리움(Eubacterium), 파에칼리박테리움(Faecalibacterium), 피네골디아(Finegoldia), 푸소박테리움(Fusobacterium), 락토바실루스(Lactobacillus) (엘. 아시도필루스(L. acidophilus), 엘. 헬베티쿠스(L. helveticus), 엘. 비피두스(L. bifidus), 엘. 락티스(L. lactis), 엘. 페르멘티(L. fermenti), 엘. 살리바리우스(L. salivarius), 엘. 파라카세이(L. paracasei), 엘. 브레비스(L. brevis), 엘. 델브루엑키이(L. delbrueckii), 엘. 써모필레스(L. thermophiles), 엘. 크리스파투스(L. crispatus), 엘. 카세이(L. casei), 엘. 람노수스(L. rhamnosus), 엘. 레우테리(L. reuteri), 엘. 페르멘툼(L. fermentum), 엘. 플란타룸(L. plantarum), 엘. 스포로게네스(L. sporogenes) 및 엘. 불가리쿠스(L. bulgaricus) 포함), 펩토코쿠스(Peptococcus), 펩토스트렙토코쿠스(Peptostreptococcus), 펩토니필루스(Peptoniphilus), 프레보텔라(Prevotella), 로세부리아(Roseburia), 루미노코쿠스(Ruminococcus), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 및/또는 스트렙토코쿠스(Streptococcus) (에스. 락티스(S. lactis), 에스. 크레모리스(S. cremoris), 에스. 디아세틸락티스(S. diacetylactis), 에스. 써모필레스(S. thermophiles) 포함)를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기재된 올리고사카라이드 조성물에서 및/또는 그와 조합하여 사용될 수 있는 공생 박테리아 분류군, 예를 들어 GRAS 균주는 바실루스 코아굴란스(Bacillus coagulans) GBI-30, 6086; 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스(Lactis) BB-12; 비피도박테리움 브레베 야쿨트(Yakult); 비피도박테리움 인판티스 35624; 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 UNO 19 (DR10); 비피도박테리움 롱굼 BB536; 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) M-17; 에스케리키아 콜라이 니슬(Nissle) 1917; 락토바실루스 아시도필루스 DDS-1; 락토바실루스 아시도필루스 LA-5; 락토바실루스 아시도필루스 NCFM; 락토바실루스 카세이 DN 114-001 (락토바실루스 카세이 이뮤니타스(들)(Immunitas(s))/데펜시스(Defensis)); 락토바실루스 카세이 CRL431; 락토바실루스 카세이 F19; 락토바실루스 파라카세이 Stl l (또는 NCC2461); 락토바실루스 존소니이(Lactobacillus johnsonii) Lai (락토바실루스 LCI, 락토바실루스 존소니이 NCC533); 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) L1A; 락토바실루스 플란타룸 299V; 락토바실루스 레우테리 ATTC 55730 (락토바실루스 레우테리 SD2112); 락토바실루스 람노수스 ATCC 53013; 락토바실루스 람노수스 LB21; 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) (보울라르디이(boulardii)) lyo; 락토바실루스 람노수스 GR-1과 락토바실루스 레우테리 RC-14의 혼합물; 락토바실루스 아시도필루스 NCFM과 비피도박테리움 락티스 BB-12 또는 BL-04의 혼합물; 락토바실루스 아시도필루스 CL1285와 락토바실루스 카세이의 혼합물; 및 락토바실루스 헬베티쿠스 R0052, 락토바실루스 람노수스 R0011 및/또는 락토바실루스 람노수스 GG (LGG)의 혼합물을 포함한다.
IV. 키트
키트가 또한 고려된다. 예를 들어, 키트는 올리고사카라이드 조성물의 단위 투여 형태 및 치료에서의 조성물의 사용에 대한 지침서를 함유하는 포장 삽입물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 건조 분말 포맷으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 용액, 분말 또는 정제로 제공된다. 키트는 올리고사카라이드 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 의한 사용에 적합한 포장 내에 포함한다. 본원에 기재된 임의의 조성물은 키트의 형태로 포장될 수 있다. 키트는 전체 치료 과정 또는 치료 과정의 한 부분에 충분한 양의 올리고사카라이드 조성물을 함유할 수 있다. 올리고사카라이드 조성물의 용량은 개별적으로 포장될 수 있거나 또는 올리고사카라이드 조성물은 벌크로 또는 그의 조합으로 제공될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 키트는 치료 요법에서의 투여 지점에 상응하는 올리고사카라이드 조성물의 개별 용량을 적합한 포장에 제공하며, 여기서 용량은 1개 이상의 패킷으로 포장된다.
키트는 서면 자료, 예컨대 지침서, 예상 결과서, 증명서, 설명서, 경고문, 임상 데이터, 건강 전문가에 대한 정보 등을 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 키트는 키트가 단지 건강 전문가의 지시 하에 사용하기 위한 것임을 나타내는 라벨 또는 다른 정보를 함유한다. 용기는 스쿠프, 시린지, 병, 컵, 어플리케이터 또는 다른 측정 또는 서빙 장치를 추가로 포함할 수 있다.
실시예
실시예 1. 올리고사카라이드 조성물의 존재 하의 건강한 대변 샘플에서의 단쇄 지방산 (SCFA)의 생산
수백종의 상이한 합성 올리고사카라이드 조성물 (431종의 총 조성물)을 건강한 분변 대변 샘플에서 대사물 (예를 들어, 단쇄 지방산, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트 및 부티레이트)의 수준을 조정하는 (예를 들어, 감소시키는) 그의 능력에 대해 시험하였다.
분변 샘플을 공여자로부터 수집하고, 동결시키고, 사용 시까지 -80℃에서 저장하였다. 동결된 분변 샘플을 혐기성 챔버로 옮기고, 해동되도록 하고, 15% 글리세롤로 보충된 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중 20% 고체의 최종 농도로 균질화시켰다. 이어서, 20% 분변 슬러리를 여과하여 큰 파편을 제거하고, 분취하고, 혐기성 챔버로부터 꺼내고, 즉시 드라이 아이스 상에서 동결시킨 후, -80℃에서 저장하였다. 실험 당일에, 각각의 20% 분변 슬러리의 하나의 1 mL 분취물을 해동시키고, 혐기성 챔버에서 박테리아 성장 배지 (0.1% w/v 트립티카제 펩톤 및 0.75 mM 우레아로 보충된 클로스트리디움 최소 배지) 중에 최종 농도 1%로 희석하였다. 이어서, 1% 분변 슬러리 용액을 멸균수 (음성 대조군) 또는 올리고사카라이드 제제의 제제 (최종 농도 0.5%)를 함유하는 96 딥 웰 플레이트의 웰에 분배하였다. 각각의 샘플의 3개의 반복물을 제조하였다. 분변 미생물 배양물을 37℃에서 45시간 동안 혐기성으로 인큐베이션하였다. 건강한 대상체로부터의 3개의 상이한 분변 미생물 군집으로 초기 생체외 스크리닝을 수행하였다.
45-시간 인큐베이션 기간 후, 분변 미생물 배양물을 함유하는 96-웰 딥 웰 플레이트를 혐기성 챔버로부터 꺼내고, 얼음 상에 보관하였다. 플레이트를 4℃에서 10분 동안 원심분리 (3,000 x g)에 의해 침강시켰다. 분변 미생물총 배양물 상청액 및 펠릿을 수집하고, -80℃에서 저장하였다. 상청액 샘플을 해동시키고, 불꽃 이온화 검출기 동반 기체 크로마토그래피 (GC-FID)에 의해 분석하여 분변 샘플에서 생산된 단쇄 지방산 (아세테이트, 프로피오네이트 및 부티레이트)의 농도를 정량화하였다.
음성 대조군을 사용한 각각의 SCFA의 값을 올리고사카라이드 조성물을 사용한 값으로부터 차감함으로써 정규화된 SCFA 농도를 계산하였다. 이 계산을 수행하여 선택된 올리고사카라이드 조성물이 이들 검정 조건 하에서 부티레이트 생산을 증가시키는 정도를 결정하였다.
수백종의 시험된 올리고사카라이드 조성물 중 하나인, 본 출원 전반에 걸쳐 기재된 바와 같은 선택된 올리고사카라이드 조성물 (예를 들어, 실시예 2-4, 12 및 13의 방법에 의해 제조된 바와 같음)은 부티레이트 생산을 유의하게 증가시키는 것으로 결정되었다 (음성 대조군에 비해 3개의 시험된 분변 군집에 걸쳐 4.2 mM 부티레이트의 중앙값 증가) (도 19).
실시예 2. 가용성 산 촉매를 사용한 갈락토스로부터의 100 g 규모의 올리고사카라이드 조성물의 제조
100 그램 규모로 실시예 1에 기재된 바와 같은 선택된 올리고사카라이드 조성물의 합성을 위한 절차를 개발하였다. 100 g의 갈락토스 및 85% 용해된 고체의 출발 농도를 달성하기에 충분한 양의 물을 반응 용기 (1 L 3구 둥근 바닥 플라스크)에 첨가하였다. 반응 용기에 오버헤드 교반기로 구성된 가열 맨틀을 장착하였다. 프로브 열전쌍을 격막을 통해 용기 내에 배치하여, 프로브 팁이 교반 블레이드 위에 놓이고 반응 용기의 벽과 접촉하지 않도록 하였다. 촉매를 첨가하기 전, 반응 용기에 환류 위치에서 응축기를 장착하였다.
절차는 촉매로서의 시트르산 (1.5-3% w/w) 및 켄칭을 위한 탈이온수를 사용하였다. 촉매를 첨가한 후, 반응 용기를 증류 위치에 장착하여 반응 과정 내내 과량의 물을 제거하였다.
온도 제어기를 표적 온도 (130 내지 140℃)로 설정하고, 시럽의 온도가 주위 (대기) 압력 하에 표적 온도가 되었을 때, 용기의 내용물의 교반을 개시하여 당 고체의 균일한 열 전달 및 용융을 촉진하였다.
촉매의 첨가 시, HPLC에 의해 반응을 추적함으로써 결정된 바와 같이, 약 2.5-5시간 동안 연속 혼합 하에 표적 온도에서 반응물을 유지하였다. 이어서, 일정한 교반을 유지하면서 가열을 껐다.
이어서, 대략 60 mL의 탈이온(DI)수 (실온)를 천천히 첨가함으로써 반응물을 켄칭하여 생성물 혼합물이 50 - 60 wt% 용해된 고체의 최종 농도를 표적으로 하도록 희석하고 냉각시켰다. 본 실시예의 일부 실시양태에서, 60-100 mL의 탈이온(DI)수 (실온)를 천천히 첨가함으로써 반응물을 켄칭하여 생성물 혼합물이 45 - 65 wt% 용해된 고체의 최종 농도를 표적으로 하도록 희석하고 냉각시켰다. 일반적으로, 올리고사카라이드 조성물을 냉각시키고 희석할 때 물 첨가 속도 조절을 수행하여 혼합물 점도를 제어하였다.
실시예 3. 가용성 산 촉매를 사용한 갈락토스로부터의 10 kg 규모의 선택된 올리고사카라이드 조성물의 제조
10 킬로그램 규모로 실시예 1에 기재된 바와 같은 선택된 올리고사카라이드 조성물의 합성을 위한 절차를 개발하였다. 9.1 kg의 무수 갈락토스, 0.27 kg의 시트르산 무수 산 촉매 및 1.45 kg의 물을 반응 용기 (22L 리틀포드-데이(Littleford-Day) 수평 플로우 혼합기)에 첨가하였다. 증류 응축기 유닛을 반응기에 부착하였다. 내용물을 대략 30 RPM으로 교반하고, 용기 온도를 대기압에서 3.5 - 4.0시간의 기간에 걸쳐 약 136℃로 점차 증가시켰다. 혼합물을 이 온도에서 1 - 1.5시간 동안 유지한 후, 가열을 정지하고, 사전-가열된 물을 반응기 내용물의 온도가 120℃로 감소될 때까지 60 mL/분의 비율로, 이어서 반응기 내용물의 온도가 110℃로 감소될 때까지 150 mL/분으로, 이어서 총 7.5 kg의 물이 첨가되고 반응기 내용물의 온도가 100℃ 미만으로 감소될 때까지 480 mL/분으로 반응 혼합물에 점차 첨가하였다. 추가의 1.6 kg 물을 추가의 희석을 위해 반응기에 첨가하였다. 반응 혼합물을 용기로부터 배출시켜, 17.0 - 17.6 kg의 조 올리고사카라이드를 수용액 (대략 49 - 52 wt%)으로서 생성하였다.
올리고사카라이드 조성물을 양이온 교환 수지 (다우엑스® 모노스피어 88H) 칼럼, 탈색 중합체 수지 (다우엑스® 옵티포어 SD-2)의 2개의 칼럼 및 음이온 교환 수지 (다우엑스® 모노스피어 77WBA) 칼럼에 유동시킴으로써 정제하였다. 이어서, 생성된 약 43 wt%의 농도를 갖는 정제된 물질을 진공 회전 증발에 의해 약 70 wt% 고체의 최종 농도로 농축시켜 정제된 올리고사카라이드 조성물을 수득하였다.
실시예 4. 고체 산 촉매를 사용한 갈락토스로부터의 100 g 규모의 올리고사카라이드 조성물의 제조
100 그램 규모로 실시예 1에 기재된 바와 같은 선택된 올리고사카라이드 조성물의 합성을 위한 절차를 개발하였다. 100 g의 갈락토스 및 85% 용해된 고체의 출발 농도를 달성하기에 충분한 양의 물을 반응 용기 (1 L 3구 둥근 바닥 플라스크)에 첨가하였다. 반응 용기에 오버헤드 교반기로 구성된 가열 맨틀을 장착하였다. 프로브 열전쌍을 격막을 통해 용기 내에 배치하여, 프로브 팁이 교반 블레이드 위에 놓이고 반응 용기의 벽과 접촉하지 않도록 하였다. 촉매를 첨가하기 전, 반응 용기에 환류 위치에서 응축기를 장착하였다.
절차는 촉매로서의 습윤 (45-55% 수분 함량) 다우엑스 마라톤-C, H+ 형태 (1-5% w/w, 건조 기준) 및 켄칭을 위한 탈이온수를 사용하였다. 촉매를 첨가한 후, 반응 용기를 증류 위치에 장착하여 반응 과정 내내 과량의 물을 제거하였다.
온도 제어기를 표적 온도 (130 내지 145℃)로 설정하고, 시럽의 온도가 주위 (대기) 압력 하에 표적 온도가 되었을 때, 용기의 내용물의 교반을 개시하여 당 고체의 균일한 열 전달 및 용융을 촉진하였다.
촉매의 첨가 시, HPLC에 의해 반응을 추적함으로써 결정된 바와 같이, 약 2-4시간 동안 연속 혼합 하에 표적 온도에서 반응물을 유지하였다. 이어서, 일정한 교반을 유지하면서 가열을 껐다.
이어서, 대략 60 mL의 탈이온(DI)수 (실온)를 천천히 첨가함으로써 반응물을 켄칭하여 생성물 혼합물이 50 - 60 wt% 용해된 고체의 최종 농도를 표적으로 하도록 희석하고 냉각시켰다. 본 실시예의 일부 실시양태에서, 생성물 혼합물을 50 - 65 wt%의 용해된 고체의 최종 농도가 되도록 하였다. 일반적으로, 올리고사카라이드 조성물을 냉각시키고 희석할 때 물 첨가 속도 조절을 수행하여 혼합물 점도를 제어하였다. 켄칭되면, 소결 유리 깔때기를 사용하여 고체 촉매를 여과한다.
실시예 5. 탈단량체화 절차
실시예 2-4, 12 및 13에서 제조된 바와 같은 선택된 올리고사카라이드 조성물의 개별 배치를 하기 기재된 바와 같은 2가지 절차 중 하나를 사용하여 탈단량체화하였다.
크로마토그래피 방법
선택된 올리고사카라이드 조성물의 개별 배치를 회전 증발기 상에서 이온-교환 수지 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)로의 처리 후 브릭스(Brix) 굴절계에 의해 측정 시 대략 50 브릭스로 농축시켰다. 생성된 시럽 (건조 기준 최대 4 g)을 루어-팁 시린지를 사용하여 텔레다인 ISCO 레디셉 Rf 골드 아민(Teledyne ISCO RediSep Rf Gold Amine) 칼럼 (55 그램 고정상) 상에 로딩하였다. 다른 유사한 칼럼, 예컨대 바이오타지(Biotage) SNAP KP-NH 카트리지가 또한 사용될 수 있다. 샘플을 ELSD 검출기가 장착된 바이오타지 이솔레라 상에서 55 칼럼 부피에 걸쳐 20/80에서 50/50 (v/v) 탈이온수/ACN 이동상 구배를 사용하여 정제하였다. 다른 플래쉬 크로마토그래피 시스템, 예컨대 텔레다인 ISCO Rf가 또한 사용될 수 있다. 유량은 칼럼 및 시스템에 대한 제조업체의 규격서에 따라 설정하였다. 단량체 분획이 ~16 칼럼 부피에서 완전히 용리된 후, 나머지 올리고사카라이드 조성물이 용리되어 수집될 때까지 이동상을 100% 물로 설정하였다. 단량체-무함유 분획을 회전 증발에 의해 농축시켜 탈단량체화된 생성물을 수득하였다.
에탄올 침전
실시예 2-4, 12 및 13에서 제조된 바와 같은 선택된 올리고사카라이드 조성물의 개별 배치를 회전 증발기 상에서 이온-교환 수지 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)로의 처리 후 브릭스 굴절계에 의해 측정 시 대략 25 브릭스로 농축시켰다. 100 mL의 농축된 올리고사카라이드 조성물을 10 mL/분 이하의 비율로 900 mL의 순수한 USP-등급 에탄올을 함유하는 격렬히 교반되는 비커에 부었다. 첨가가 완료되었으면, 침전된 고체를 실온에서 또는 실온보다 약간 낮은 온도에서 추가로 15분 동안 교반하였다. 현탁액을 5℃에서 4시간 동안 4000 rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 경사분리하고, 침전된 고체 (펠릿)를 25 브릭스의 최종 농도로 물 중에 용해시키고, >65 브릭스로 재농축시켰다. 이어서, 이 시럽을 25 브릭스로 다시 희석하고, 1회 더 농축시켜 잔류 에탄올의 제거를 보장하였다. 생성된 시럽을 25 브릭스로 다시 희석하고, -78℃로 냉각시키고, 동결건조시켜 탈단량체화된 생성물을 수득하였다.
실시예 6. 크기 배제 크로마토그래피
실시예 1에 기재되고 실시예 2-4, 12 및 13에 기재된 방법에 따라 제조된 바와 같은 선택된 올리고사카라이드 조성물의 배치의 중량-평균 분자량 (MWw), 수-평균 분자량 (MWn) 및 다분산 지수 (PDI)를 SEC HPLC에 의해 결정하였다.
방법
이들 방법은 하기 2개의 칼럼이 직렬로 장착된 굴절률 (RI) 검출기를 동반한 애질런트(Agilent) 1100의 사용을 포함하였다: 쇼덱스(Shodex) OHpak SB-802 HQ, 8.0 x 300 mm, 8 μm, P/N F6429100 및 쇼덱스 OHpak SB-803 HQ, 8.0 x 300 mm, 6 μm, P/N F6429102. 관련 기술분야에 공지된 등가의 칼럼이 또한 사용될 수 있다.
34 g의 NaNO3 (ACS 등급 시약)을 칭량하고 2000 mL의 탈이온(DI)수 (밀리큐(MiliQ) 물 필터로부터) 중에 용해시킴으로써 이동상 (0.1 M NaNO3)을 제조하였다. 용액을 0.2 μm 필터를 통해 여과하였다.
20 mg의 표준물을 칭량하여 별개의 20 mL 섬광 바이알에 넣고, 각각의 바이알에 2.0 mL의 DI수를 첨가함으로써 중합체 표준 용액 (10.0 mg/mL)을 제조하였다.
샘플 A를 이중으로 제조하였다. 대략 300 mg의 올리고사카라이드 조성물 샘플을 칭량하여 20 mL 섬광 바이알에 넣고, 10 mL의 DI수를 첨가하였다. 용액을 혼합하고, 0.2 μm 폴리에테르술폰 막을 갖는 아크로디스크(Acrodisc) 25 mm 시린지 필터를 통해 여과하였다. 샘플 B를 이중으로 제조하였다. 대략 210 mg의 올리고사카라이드 샘플을 칭량하여 20 mL 섬광 바이알에 넣고, 10 mL의 DI수를 첨가하였다. 용액을 혼합하고, 0.2 μm 폴리에테르술폰 막을 갖는 아크로디스크 25 mm 시린지 필터를 통해 여과하였다.
유량을 적어도 2시간 0.7-0.9 mL/분으로 설정한 후, 칼럼 온도 및 RI 검출기를 각각 40℃로 설정하고 RI 검출기 퍼지를 켜면서 샘플을 실행시켰다.
DI수로 이루어진 블랭크 샘플을 실행시켰다. 각각의 표준물의 샘플을 실행시켰다. 샘플 A를 실행시켰다. 샘플 B를 실행시켰다.
일부 실험에서, 모든 샘플에 대한 주입 부피가 10 μL이고 실행 시간이 28분인 샘플의 실행 전에, 검출기 퍼지를 끄고, 허용가능한 기준선이 수득될 때까지 펌프를 0.7-0.9 mL/분으로 실행시켰다. 15 내지 22분 사이의 피크를 적분하였다.
다른 실험에서, 모든 샘플에 대한 주입 부피가 10 μL이고 실행 시간이 40분인 샘플의 실행 전에, 검출기 퍼지를 끄고, 허용가능한 기준선이 수득될 때까지 펌프를 0.7-0.9 mL/분으로 실행시켰다.
엠파워(Empower) 3 소프트웨어에서의 보정 곡선 피트 유형을 3차로 설정하였다. 엠파워 3 소프트웨어를 사용하여 넓은 피크에 대해 분자량 분포 및 다분산도를 계산하였다. 생성물 피크 (DP2+)의 Mw, Mn 및 다분산도를 보고하였다.
결과
실시예 3에 기재된 방법을 사용하여 10 kg 규모로 제조된 선택된 올리고사카라이드 조성물의 6개의 배치를 상기 기재된 SEC 방법을 사용하여 분석하였다. 실시예 2에 기재된 방법에 의해 제조된 선택된 올리고사카라이드 조성물의 소규모 배치를 탈단량체화하였다.
실시예 3에 따라 제조된 올리고사카라이드 조성물의 검정된 배치는 2443 g/mol의 평균 MWw (2214-2715 g/mol의 범위), 1155 g/mol의 평균 MWn (1095-1201 g/mol의 범위) 및 2.1의 평균 PDI (2.0-2.3의 범위)를 갖는 올리고사카라이드를 포함하였다. 검정된 배치는 91.1%의 평균 DP2+ (90.0-91.9의 범위) 및 15.1의 평균 중합도 (DP) (13.6-16.7의 범위)를 추가로 포함하였다.
실시예 13에 기재된 방법을 사용하여 500 kg (2000 L) 규모로 제조된 선택된 올리고사카라이드 조성물의 4개의 배치를 상기 기재된 SEC 방법을 사용하여 분석하였다. 실시예 13에 따라 제조된 올리고사카라이드 조성물의 분석된 배치는 2056 g/mol의 평균 MWw (1968-2109 g/mol의 범위) 및 1107 g/mol의 평균 MWn (1071-1138 g/mol의 범위)을 갖는 올리고사카라이드를 포함하였다. 검정된 배치는 89.1%의 평균 DP2+ (88.1-90.2%의 범위) 및 12.7의 평균 중합도 (DP) (12.1-13.0의 범위)를 추가로 포함하였다.
실시예 7. 불순물의 결정을 위한 SEC HPLC 방법론
실시예 3의 방법에 의해 제조된 바와 같은 선택된 올리고사카라이드 조성물의 배치 및 샘플의 잔류 유기 산 불순물 및 관련 물질의 존재를 SEC HPLC에 의해 결정하였다.
방법
이들 방법은 가드 칼럼 (바이오-라드(Bio-Rad) 마이크로가드 양이온 H+ 카트리지, PIN 125-0129 또는 등가물) 및 바이오-라드 아미넥스 HPX-87H, 300 x 7.8 mm, 9 μm, PIN 125-0140 칼럼 또는 등가물이 장착된 굴절률 (RI) 검출기를 동반한 애질런트 1100의 사용을 포함하였다.
병을 2000 mL DI수로 채우고 2.7 mL의 H2SO4를 천천히 첨가함으로써 이동상 (물 중 25 mM H2SO4)을 제조하였다. 용액을 0.2 μm 필터를 통해 여과하였다.
50 ± 2 mg의 참조 표준물을 측정하여 100-mL 부피 플라스크에 넣고, 이동상을 100-mL 표시까지 첨가하고, 잘 혼합함으로써 표준 용액을 제조하였다.
선택된 올리고사카라이드 조성물의 샘플 (샘플 A)을 이중으로 제조하였다. 대략 1000 mg의 올리고사카라이드 샘플을 칭량하여 10 mL 부피 플라스크에 넣고, 이동상을 표시까지 첨가하였다. 용액을 혼합하고, 0.2 μm 폴리에테르술폰 막을 갖는 PES 시린지 필터를 통해 여과하였다.
선택된 올리고사카라이드 조성물의 샘플 (샘플 B)을 이중으로 제조하였다. 대략 700 mg의 올리고사카라이드 샘플을 칭량하여 10 mL 부피 플라스크에 넣고, 이동상을 표시까지 첨가하였다. 용액을 혼합하고, 0.2 μm 폴리에테르술폰 막을 갖는 PES 시린지 필터를 통해 여과하였다.
유량을 적어도 2시간 0.65 mL/분으로 설정한 후, 칼럼 온도를 50℃로 설정하고 RI 검출기 온도를 50℃로 설정하고 RI 검출기 퍼지를 켜면서 샘플을 실행시켰다.
모든 샘플에 대한 주입 부피가 50 μL이고 실행 시간이 40분인 샘플의 실행 전에, 검출기 퍼지를 끄고, 허용가능한 기준선이 수득될 때까지 펌프를 0.65 mL/분으로 실행시켰다.
DI수로 이루어진 블랭크 샘플을 실행시켰다. 표준물, 샘플 A 및 샘플 B를 각각 독립적으로 실행시켰다.
7.5분 (글루쿠론산), 9.4분 (말레산), 11.3분 (레보글루코산), 11.9분 (락트산), 13.1분 (포름산), 14.2분 (아세트산), 15.5분 (레불린산), 31.8분 (히드록시메틸푸르푸랄, HMF) 및 8.3분 (글루코스)에서의 피크를 적분하였다. 엠파워 3 소프트웨어에서의 보정 곡선 피트 유형을 3차로 설정하였다.
결과
실시예 3의 방법에 의해 제조된 바와 같은 선택된 올리고사카라이드의 6개의 배치를 상기 방법을 사용하여 시험하였다. 선택된 올리고사카라이드 조성물의 샘플은 0.19% w/w의 시트르산 (0.18-0.19% w/w의 범위) 및 검출불가능한 수준의 락트산, 포름산, 레불린산 및 HMF를 포함하였다.
실시예 8. 브루커(Bruker) NMR 기계를 사용한 HSQC NMR 분석 절차
실시예 1에 기재되고 실시예 2 및 3에 기재된 바와 같이 제조된 선택된 올리고사카라이드 조성물의 샘플의 HSQC NMR 스펙트럼의 결정을 하기 기재된 프로토콜에 따라 브루커 NMR 기계를 사용하여 수행하였다.
방법
샘플 제조:
30 mg의 올리고사카라이드 조성물의 사전 동결건조된 고체 샘플을 내부 표준물로서 0.1% 아세톤을 함유한 300 μL의 D2O 중에 용해시켰다. 이어서, 용액을 3mm NMR 튜브에 넣었다.
NMR 실험:
13C로 조정되는 Z-축 구배를 갖는 XDB 광대역 프로브가 장착된, 499.83 MHz (125.69 MHz 13C)에서 작동하고 25℃에서 작동하는 브루커 NMR에서 각각의 샘플을 분석하였다. 각각의 샘플에 대해 가간섭성 선택을 위해 에코-안티에코 스킴을 사용하는 다중도-편집 구배-증강 1H-13C 이종핵 단일 양자 가간섭성 (HSQC) 실험을 수행하였다. 하기 펄스 시퀀스 다이어그램 및 획득 및 가공 파라미터를 사용하여 각각의 샘플에 대한 NMR 스펙트럼을 수득하였다:
펄스 시퀀스 다이어그램 (도 5)
획득 파라미터
1H 반송파 주파수 = 4 ppm
13C 반송파 주파수 = 65 ppm
획득 차원에서의 포인트 수 = 596개
획득 차원에서의 스펙트럼 범위 = 6.23 ppm 내지 1.83 ppm
간접 차원에서의 포인트 수 = 300개의 복합 포인트
간접 차원에서의 스펙트럼 범위 = 120 ppm 내지 10 ppm
재순환 지연 = 1초
1-결합 1H-13C 커플링 상수 = JCH = 146 Hz
스캔 횟수 = 8회
온도 = 298-299 K
용매 = D2O
가공 파라미터
직접 차원에서의 윈도우 함수 = 가우스 확장, 7.66 Hz
간접 차원에서의 윈도우 함수 = 가우스 확장, 26.48 Hz
가공 = 직접 차원에서의 512개의 복합 포인트, 간접 차원에서의 1024개의 복합 포인트.
스펙트럼 분석
생성된 스펙트럼을 메스트렐랩 리서치(Mestrelab Research) (스페인 산티아고 데 콤포스텔라)로부터의 MNova 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석하였다. 스펙트럼은 내부 아세톤 신호 (1H - 2.22 ppm; 13C - 30.8 ppm)를 참조로 하였고, F2 및 F1 차원 둘 다에서 영역2D 방법을 사용하여 위상화되었다. 90도 이동된 사인을 사용한 아포디제이션을 F2 및 F1 차원 둘 다에 적용하였다. 각각의 스펙트럼에 대해, 개별 신호 (C-H 상관관계)를, 타원형 형상을 갖는 "미리 정의된 적분 영역"을 사용하여 그의 각각의 피크의 적분에 의해 정량화하였다. 도 6b는 선택된 올리고사카라이드 조성물의 HSQC NMR 피크/신호 1-11의 좌표를 정의하는 적분 영역을 보여준다. 도 6c는 장축 좌표 (F2 차원; 1H) 및 단축 좌표 (F1 차원; 13C)에 의해 정의된 타원형 형상의 예를 보여준다. 적분 영역 및 스펙트럼으로부터의 값의 결과 표를 100의 합계에 대해 정규화하여 값이 총계 대비 백분율을 나타내도록 하였다. 피크 적분 영역은 단량체와 연관된 피크를 피하고 스펙트럼의 구별되는 특색에 초점을 맞추도록 선택하였다.
결과
실시예 3에 기재된 방법에 따라 제조된 선택된 올리고사카라이드 조성물의 6개의 배치 (15.1 (± 1.3)의 평균 DP를 가짐) 및 실시예 2에 기재된 방법에 따라 제조된 선택된 올리고사카라이드 조성물의 2개의 배치를 상기 기재된 NMR 방법을 사용하여 분석하였다.
선택된 올리고사카라이드 조성물의 배치의 샘플을 실시예 5에 기재된 바와 같은 에탄올 침전 절차에 따라 탈단량체화한 후 HSQC NMR에 의해 분석하였다. 선택된 올리고사카라이드 조성물의 배치의 샘플을 또한 탈단량체화 없이 HSQC NMR에 의해 분석하였다. 주목할 만하게, 탈단량체화 전후의 샘플의 HSQC NMR 스펙트럼의 분석은 실질적으로 유사한 피크 (예를 들어, 신호 1-11에서의 유사한 상대 AUC 값)를 제공하였다. 표 9는 타원형 형상을 경계짓는 (즉, 정의하는) 미리 정의된 적분 영역 또는 좌표를 제공한다.
표 9. 선택된 올리고사카라이드 조성물에 대한 HSQC NMR 적분 영역의 좌표
실시예 2 및 3에 기재된 바와 같은 방법에 따라 제조된 (그리고 탈단량체화되지 않은) 선택된 올리고사카라이드 조성물의 8개의 총 배치의 NMR 스펙트럼에 대해 수집된 각각의 피크의 상대 크기 (곡선하 면적 (AUC))를 하기 표 10에 제시된 바와 같이 추가로 결정하였다:
표 10. HSQC NMR 데이터 (실시예 2 및 3에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 제조된 배치; 탈단량체화되지 않음)
실시예 2 및 3에 기재된 바와 같은 방법에 따라 제조되고 실시예 5에 기재된 바와 같은 에탄올 침전 절차에 따라 탈단량체화된 선택된 올리고사카라이드 조성물의 8개의 총 배치의 NMR 스펙트럼에 대해 수집된 각각의 피크의 상대 크기 (곡선하 면적 (AUC))를 하기 표 11에 제시된 바와 같이 추가로 결정하였다:
표 11. HSQC NMR 데이터 (실시예 2 및 3에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 제조된 배치; 탈단량체화됨)
실시예 3에 기재된 바와 같은 방법에 따라 제조된 (그리고 탈단량체화되지 않은) 선택된 올리고사카라이드 조성물의 6개의 총 배치의 NMR 스펙트럼에 대해 수집된 각각의 피크의 상대 크기 (곡선하 면적 (AUC))를 하기 표 12에 제시된 바와 같이 추가로 결정하였다:
표 12. HSQC NMR 데이터 (실시예 3에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 제조된 배치)
상업적으로 입수가능한 올리고사카라이드 (갈락토올리고사카라이드, 락토스, 멜리비오스, 인간 유액 올리고사카라이드 2-a-L-푸코피라노실-D-락토스 및 인간 유액 올리고사카라이드 락토-N-네오테트라오스)의 샘플을 상기 기재된 바와 같이 HSQC NMR에 의해 분석하였다. 각각의 상업적으로 입수가능한 올리고사카라이드의 NMR 스펙트럼을 선택된 올리고사카라이드의 할당된 피크 적분 영역 (즉, 표 9에서의 피크 신호 1-11)과 오버레이하고, 이들 적분 영역 각각의 상대 AUC를 하기 제시된 바와 같이 결정하였다. 이들 실험은 선택된 올리고사카라이드 조성물의 HSQC NMR 스펙트럼이 시험된 상업적으로 입수가능한 올리고사카라이드의 것과 유의하게 상이한다는 것을 입증한다 (표 13).
표 13. 선택된 올리고사카라이드 조성물에 대한 적분 영역을 사용한 상업적으로 입수가능한 올리고사카라이드의 HSQC NMR 데이터
*NS = 피크 신호가 검출되지 않음
실시예 9. 퍼메틸화 분석을 사용한 글리코시드 결합 분포의 결정
하기 기재된 프로토콜에 따라 퍼메틸화 분석을 사용하여, 실시예 2의 방법에 의해 제조된 바와 같은 선택된 올리고사카라이드 조성물 샘플의 글리코시드 결합 분포의 결정을 수행하였다. 퍼메틸화 분석 전에 샘플을 탈단량체화하였다.
사용된 시약은 메탄올, 아세트산, 중수소화붕소나트륨, 탄산나트륨, 디클로로메탄, 이소프로판올, 트리플루오로아세트산 (TFA) 및 아세트산 무수물이었다. 장비는 가열 블록, 건조 장치, 모세관 칼럼 및 RID/MSD 검출기가 장착된 기체 크로마토그래프 및 30 미터 RTX®-2330 (레스텍(RESTEK))을 포함하였다. 모든 유도 절차를 후드에서 수행하였다.
알디톨 아세테이트의 제조
A. 표준물 제조
하기 표준 분석물의 1 mg/mL 용액을 제조하였다: 아라비노스, 람노스, 푸코스, 크실로스, 만노스, 갈락토스, 글루코스 및 이노시톨. 바이알에서 각각 50 μL의 아라비노스, 크실로스, 푸코스, 글루코스, 만노스 및 갈락토스를 20 μL의 이노시톨과 혼합함으로써 표준물을 제조하였다. 표준물을 후속적으로 동결건조시켰다.
B. 샘플 제조
바이알에서 100-500 μg의 선택된 올리고사카라이드 조성물 (분석 저울 상에서 칭량됨)을 20 μg (20 μL)의 이노시톨과 혼합함으로써 각각의 샘플을 제조하였다.
C. 가수분해
200 μL의 2 M 트리플루오로아세트산 (TFA)을 샘플(들)에 첨가하였다. 샘플을 함유하는 바이알을 단단히 캡핑하고, 가열 블록 상에서 121℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 2시간 후, 샘플을 가열 블록으로부터 꺼내고, 실온으로 냉각되도록 하였다. 이어서, 샘플을 N2/공기로 건조시켰다. 200 μL의 IPA (이소프로판올)를 첨가하고, N2/공기로 다시 건조시켰다. 이 가수분해 단계 (121℃에서 2시간 동안 TFA의 첨가; 이소프로판올로 세척)를 2회 반복하였다.
샘플에 대해 기재된 바와 같이, 표준물도 TFA를 사용하여 유사하게 가수분해시켰다.
D. 환원 및 아세틸화
1 M 수산화암모늄 중에서 10 mg/mL 중수소화붕소나트륨 용액을 제조하였다. 200 μL의 이 용액을 샘플에 첨가하였다. 이어서, 샘플을 실온에서 적어도 1시간 동안 또는 밤새 인큐베이션하였다. 중수소화붕소나트륨 용액과 함께 인큐베이션한 후, 5 방울의 빙초산을 샘플에 첨가하고, 이어서 5 방울의 메탄올을 첨가하였다. 이어서, 샘플을 건조시켰다. 500 μL의 9:1 MeOH:HOAc를 샘플에 첨가하고, 후속적으로 건조시켰다 (2회 반복). 이어서, 500 μL MeOH를 샘플에 첨가하고, 후속적으로 건조시켰다 (1회 반복). 이는 샘플 바이알의 측면 상에 딱딱한 백색 잔류물을 생산하였다.
이어서, 250 μL 아세트산 무수물을 샘플 바이알에 첨가하고, 샘플을 볼텍싱하여 용해시켰다. 230 μL 농축 TFA를 샘플에 첨가하고, 샘플을 50℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 열로부터 꺼내고, 실온으로 냉각되도록 하였다. 대략 1 mL 이소프로판올을 첨가하고, 샘플을 건조시켰다. 이어서, 대략 200 μL 이소프로판올을 첨가하고, 샘플을 다시 건조시켰다. 이어서, 대략 1 mL의 0.2M 탄산나트륨을 샘플에 첨가하고, 이를 서서히 혼합하였다. 대략 2 mL 디클로로메탄을 최종적으로 샘플에 첨가한 후, 이를 볼텍싱하고, 잠시 원심분리하였다. 수성 상부 층을 폐기하였다. 1 mL 물을 첨가하고, 샘플을 볼텍싱하고, 잠시 원심분리하였다. 이 단계를 반복한 후, 유기 층 (하부)을 꺼내고, 또 다른 바이알로 옮겼다. 샘플을 N2/공기를 사용하여 약 100 μL의 최종 부피로 농축시켰다. 이어서, 1 μL의 최종 샘플을 GC-MS 상에 주입하였다.
GC 온도 프로그램 SP2330을 GC-MS 분석에 이용하였다. 초기 온도는 80℃였고, 초기 시간은 2.0분이었다. 제1 경사는 170℃의 최종 온도 및 0.0분의 최종 시간으로 30℃/분의 비율이었다. 제2 경사는 240℃의 최종 온도 및 20.0분의 최종 시간으로 4℃/분의 비율이었다.
하코모리(Hakomori) 메틸화에 의한 폴리- 및 올리고사카라이드의 글리코실-연결 분석
A. NaOH 염기의 제조
유리 스크류 탑 튜브에서, 100 μL의 50/50 NaOH 용액 및 200 μL의 건조 MeOH를 합하였다. 플라스틱 피펫을 NaOH에 사용하고, 유리 피펫을 MeOH에 사용하였다. 용액을 잠시 볼텍싱하고, 대략 4 mL 건조 DMSO를 첨가하고, 용액을 다시 볼텍싱하였다. 튜브를 원심분리하여 용액을 농축시키고, DMSO 및 염을 펠릿으로부터 피펫팅해내었다. 펠릿으로부터 모든 물을 제거하기 위해 이전 2 단계를 약 4회 반복하였다. 모든 백색 잔류물을 튜브의 측면으로부터 제거하였다. 모든 잔류물이 제거되고 펠릿이 투명해졌으면, 약 1 mL 건조 DMSO를 첨가하고, 용액을 볼텍싱하였다. 이때 염기가 사용할 준비가 되었다. 필요할 때마다 염기를 새로 제조하였다.
B. 퍼메틸화
600-1000 μg의 선택된 올리고사카라이드 조성물 (분석 저울 상에서 칭량됨)을 200 μL DMSO와 혼합함으로써 각각의 샘플을 제조하였다. 올리고사카라이드 조성물이 용해될 때까지 샘플을 밤새 교반하였다.
동등량의 NaOH 염기 (400 μL)를 샘플에 첨가한 후, 샘플을 다시 교반기 상에 놓고, 10분 동안 잘 혼합하였다. 100 μL의 아이오도메탄 (CH3I)을 샘플에 첨가하였다. 샘플을 교반기 상에서 20분 동안 혼합한 다음, 이전 단계 (NaOH 염기 및 아이오도메탄의 첨가)를 반복하였다.
대략 2 mL 초순수 물을 샘플에 첨가하고, 샘플을 흐려질 정도로 잘 혼합하였다. 피펫의 팁을 튜브 바닥의 샘플 용액에 넣고, CH3I을 매우 낮은 유량의 공기로 버블링하였다. CH3I이 버블링됨에 따라 샘플은 투명해졌다. 피펫을 용액 주위로 이동시켜 모든 CH3I이 사라졌다는 것을 확인하였다. 이어서, 대략 2 mL 메틸렌 클로라이드를 첨가하고, 용액을 30초 동안 볼텍싱에 의해 잘 혼합하였다. 이어서, 샘플을 원심분리하고, 상부 수성 층을 제거하였다. 대략 2 mL의 물을 첨가하고, 샘플을 혼합한 다음, 잠시 원심분리하고, 이어서 상부 수성 층을 제거하였다. 메틸렌 클로라이드 및 물의 첨가를 반복하였다. 유기 하부 층을 꺼내고, 또 다른 튜브로 옮기고, N2를 사용하여 건조시켰다. 알디톨 아세테이트를 사용하여 분석을 계속하였다.
C. 가수분해
200 μL의 2 M 트리플루오로아세트산 (TFA)을 샘플(들)에 첨가하였다. 샘플을 함유하는 바이알을 단단히 캡핑하고, 가열 블록 상에서 121℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 2시간 후, 샘플을 가열 블록으로부터 꺼내고, 실온으로 냉각되도록 하였다. 이어서, 샘플을 N2/공기로 건조시켰다. 200 μL의 IPA (이소프로판올)를 첨가하고, N2/공기로 다시 건조시켰다. 이 가수분해 단계 (121℃에서 2시간 동안 TFA의 첨가; 이소프로판올로 세척)를 2회 반복하였다.
D. 환원 및 아세틸화
1 M 수산화암모늄 중에서 10 mg/mL 중수소화붕소나트륨 용액을 제조하였다. 200 μL의 이 용액을 샘플에 첨가하였다. 이어서, 샘플을 실온에서 적어도 1시간 동안 또는 밤새 인큐베이션하였다. 중수소화붕소나트륨 용액과 함께 인큐베이션한 후, 5 방울의 빙초산을 샘플에 첨가하고, 이어서 5 방울의 메탄올을 첨가하였다. 이어서, 샘플을 건조시켰다. 500 μL의 9:1 MeOH:HOAc를 샘플에 첨가하고, 후속적으로 건조시켰다 (2회 반복). 이어서, 500 μL MeOH를 샘플에 첨가하고, 후속적으로 건조시켰다 (1회 반복). 이는 샘플 바이알의 측면 상에 딱딱한 백색 잔류물을 생산하였다.
이어서, 250 μL 아세트산 무수물을 샘플 바이알에 첨가하고, 샘플을 볼텍싱하여 용해시켰다. 230 μL 농축 TFA를 샘플에 첨가하고, 샘플을 50℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 열로부터 꺼내고, 실온으로 냉각되도록 하였다. 대략 1 mL 이소프로판올을 첨가하고, 샘플을 건조시켰다. 이어서, 대략 200 μL 이소프로판올을 첨가하고, 샘플을 다시 건조시켰다. 이어서, 대략 1 mL의 0.2M 탄산나트륨을 샘플에 첨가하고, 이를 서서히 혼합하였다. 대략 2 mL 디클로로메탄을 최종적으로 샘플에 첨가한 후, 이를 볼텍싱하고, 잠시 원심분리하였다. 수성 상부 층을 폐기하였다. 1 mL 물을 첨가하고, 샘플을 볼텍싱하고, 잠시 원심분리하였다. 이 단계를 반복한 후, 유기 층 (하부)을 꺼내고, 또 다른 바이알로 옮겼다. 샘플을 N2/공기를 사용하여 약 100 μL의 최종 부피로 농축시켰다. 이어서, 1 μL의 최종 샘플을 GC-MS 상에 주입하였다.
GC 온도 프로그램 SP2330을 GC-MS 분석에 이용하였다. 초기 온도는 80℃였고, 초기 시간은 2.0분이었다. 제1 경사는 170℃의 최종 온도 및 0.0분의 최종 시간으로 30℃/분의 비율이었다. 제2 경사는 240℃의 최종 온도 및 20.0분의 최종 시간으로 4℃/분의 비율이었다.
결과
실시예 3에 기재된 방법에 의해 제조된 탈단량체화된 올리고사카라이드 조성물의 6개의 배치에 대해 상기 기재된 방법을 사용하여 퍼메틸화 데이터를 수집하였다. 각각의 배치를 이중으로 분석하였다. 탈단량체화된 올리고사카라이드 조성물의 이들 6개의 배치에 존재하는 라디칼에 관한 데이터가 하기 표 14에 제공된다:
표 14. 퍼메틸화 데이터 (실시예 3에 기재된 방법에 의해 제조된 탈단량체화된 올리고사카라이드 조성물)
실시예 10. 선택된 올리고사카라이드 조성물은 생체외 분변 샘플에서 SCFA 생산을 증가시킨다
실시예 3에 기재된 바와 같은 방법에 의해 제조된 바와 같은 화학식 (I)로부터 선택된 복수의 올리고사카라이드를 포함하는 선택된 올리고사카라이드 조성물이 건강한 대상체의 분변 현탁액에서 단쇄 지방산 (SCFA)의 생산을 증가시키는 능력을 평가하였다.
건강한 대상체로부터의 8개의 분변 샘플을 수집하고, 동결시키고, 사용 시까지 -80℃에서 저장하였다. 동결된 분변 샘플을 혐기성 챔버로 옮기고, 해동되도록 하고, 15% 글리세롤로 보충된 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중 20% 고체의 최종 농도로 균질화시켰다. 이어서, 20% 분변 슬러리를 여과하여 큰 파편을 제거하고, 분취하고, 혐기성 챔버로부터 꺼내고, 즉시 드라이 아이스 상에서 동결시킨 후, -80℃에서 저장하였다. 실험 당일에, 각각의 20% 분변 슬러리의 하나의 1 mL 분취물을 해동시키고, 혐기성 챔버에서 박테리아 성장 배지 (0.1% w/v 트립티카제 펩톤 및 0.75 mM 우레아로 보충된 클로스트리디움 최소 배지) 중에 최종 농도 1%로 희석하였다. 이어서, 1% 분변 슬러리 용액을 멸균수 (음성 대조군) 또는 올리고사카라이드 제제의 제제 (최종 농도 0.5%)를 함유하는 96 딥 웰 플레이트의 웰에 분배하였다. 각각의 샘플의 3개의 반복물을 제조하였다. 분변 미생물 배양물을 37℃에서 45시간 동안 혐기성으로 인큐베이션하였다.
45-시간 인큐베이션 기간 후, 분변 미생물 배양물을 함유하는 96-웰 딥 웰 플레이트를 혐기성 챔버로부터 꺼내고, 얼음 상에 보관하였다. 플레이트를 4℃에서 10분 동안 원심분리 (3,000 x g)에 의해 침강시켰다. 분변 미생물총 배양물 상청액 및 펠릿을 수집하고, -80℃에서 저장하였다. 상청액 샘플을 해동시키고, 불꽃 이온화 검출기 동반 기체 크로마토그래피 (GC-FID)에 의해 분석하여 분변 샘플에서 생산된 단쇄 지방산 (아세테이트, 프로피오네이트 및 부티레이트)의 농도를 정량화하였다.
분변 군집과 선택된 올리고사카라이드 조성물의 인큐베이션은 시험된 분변 군집에 걸쳐 중앙값 대략 5.1 mM의 총 SCFA의 생산을 유발하였다 (음성 대조군과 비교하여 4.6 mM의 증가) (도 1). 주목할 만하게, 선택된 올리고사카라이드 조성물은 8개의 분변 군집 각각에서 부티레이트 생산을 증가시켰다.
부티레이트에 추가로, 선택된 올리고사카라이드 조성물은 또한 이들 분변 군집으로부터 아세테이트 및 프로피오네이트의 생산을 증가시켰다. 분변 군집과 선택된 올리고사카라이드 조성물의 인큐베이션은 중앙 농도 27.4 mM의 총 SCFA (즉, 아세테이트, 프로피오네이트 및 부티레이트의 합계)의 생산을 유발하였다 (도 2a). 반대로, 음성 대조군은 단지 5.6 mM의 총 SCFA의 생산을 유발하였다. 선택된 올리고사카라이드 조성물에 의해 유발된 총 SCFA 생산의 이러한 증가는 부티레이트 및 프로피오네이트의 상대 비율의 변동을 나타냈다. 선택된 올리고사카라이드 조성물과 함께 인큐베이션된 8개의 분변 군집 중 4개에서, 생산된 총 SCFA의 20-40%가 부티레이트인 반면, 프로피오네이트는 총계의 보다 작은 비율을 차지하였다 (도 2b). 다른 4개의 분변 군집에서는, 프로피오네이트가 부티레이트보다 생산된 총 SCFA의 더 큰 비율을 차지하였다.
선택된 올리고사카라이드 조성물이 분변 군집의 분류학적 조성을 어떻게 변화시켰는지를 결정하기 위해, 분변 미생물 배양물 펠릿을 16S rRNA 앰플리콘 서열분석에 적용하였다. 배양 펠릿을 해동시키고, 모두에 대해 매그어트랙트 파워마이크로바이옴(MagAttract PowerMicrobiome) DNA/RNA 키트 (퀴아젠(Qiagen))를 제조업체의 지침서에 따라 사용하여 게놈 DNA (gDNA) 추출에 적용하였다. gDNA를 퀀트-iT 피코그린(Quant-iT Picogreen) dsDNA 검정 키트 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))를 사용하여 정량화하고, 1 ng/μL로 정규화하였다. 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 및 서열분석을 이전에 기재된 변형된 프로토콜을 사용하여 수행하였다 (Caporaso et al. 2011). 간략하게, PCR 생성물을 16S rRNA 유전자의 V4 영역을 표적화하는 바코딩된 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 후속적으로, PCR 생성물을 AMPure XP PCR 정제 시스템 (베크만 쿨터(Beckman Coulter))을 사용하여 정제하였다. PCR 생성물을 정제하고, 1% 아가로스 겔 상에 전개시키고, 브로민화에티듐으로 염색하고, 영상화하여, 정확한 앰플리콘의 존재를 확인하였다. 정제된 PCR 농도를 정량화하고 (gDNA에 대해 상기 기재된 바와 같음), 4nM의 농도로 정규화하고, 풀링하여, 5 μL의 각각의 앰플리콘으로 이루어진 최종 라이브러리를 생성하였다. 일루미나(Illumina) Miseq 상에서 문헌 [Caporaso et al. 2011]에 약술된 바와 같이 MiSeq 시약 키트 v2를 (500 사이클) 사용하여 16S rRNA 서열분석을 수행하였다.
선택된 올리고사카라이드 조성물은 시험된 8개의 군집 각각에서 음성 대조군과 비교하여 유해균 엔테로박테리아세아에 과의 상대 존재비를 유의하게 감소시켰다 (도 3a). 선택된 올리고사카라이드 조성물은 또한 공생균 파라박테로이데스 및 박테로이데스 속의 상대 존재비를 유의하게 증가시켰다 (도 3b).
이들 데이터는 집합적으로, 선택된 올리고사카라이드 조성물이 총 SCFA를 강건하게 및 일관되게 증가시키고; 유해균 (즉, 엔테로박테리아세아에)의 양을 감소시키면서 공생 박테리아 (즉, 파라박테로이데스 및 박테로이데스)의 양을 증가시킨다는 것을 입증한다.
실시예 11. 궤양성 결장염 질환을 갖는 환자에서 선택된 올리고사카라이드 조성물의 안전성 및 내약성을 평가하기 위한 인간 시험
실시예 3-4, 12 및 13에 기재된 바와 같은 방법에 의해 제조된 바와 같은 선택된 올리고사카라이드 조성물의 안전성 및 내약성을 궤양성 결장염 (UC) 환자에서 평가하였다. 추가의 관찰은 환자의 마이크로바이옴의 변화뿐만 아니라 선택된 바이오마커 및 건강 평가를 포함하였다. 적격 환자 (18-75세)는 경구 메살라민 및/또는 퓨린 유사체를 사용한 치료 동안 경도 내지 중등도 UC 증상을 가졌다.
경도 내지 중등도 UC 증상을 갖는 10명의 환자가 연구에 들어갔다. 연구는 도 4에 상술된 바와 같은 스크리닝 기간 (14±2일), 치료 기간 (56±3일) 및 추적 기간 (28±3일)으로 이루어졌다.
포함 및 배제 기준을 충족한 환자는 14일 +2 스크리닝 기간에 들어가는 데 적격이었으며, 여기서 혈액 및 대변 샘플을 수집하고, 3-일 식이 다이어리를 작성하였다.
포함 기준은 하기를 포함하였다:
● ≥18세 내지 ≤75세의 남성 또는 여성임
● 체질량 지수가 ≥18.5 내지 <45 kg/m2임
● 내시경검사에 의한 UC (>1년)의 확인된 진단
● 스크리닝 1주 내에 1일에 ≥3회 내지 <8회 장 운동을 갖는 경도 내지 중등도 UC 증상
● 임상시험 책임자 (PI) 판단에 기초하여 스크리닝 방문 전 적어도 4주의 UC 증상학
● 환자가 궤양성 결장염을 위한 의약을 복용하는 경우 무작위화 전 2주 동안 안정한 의약 요법을 계속 받았음
배제 기준은 하기를 포함하였다:
● 크론병 또는 불확정 질환의 가능한 또는 확인된 진단
● IBD 또는 다른 병인, 예를 들어 성적으로 전파된 감염, 항문 외상, 살모넬라 및/또는 시겔라 감염으로 인한 직장에 제한된 고립성 원위 직장염의 이전 의료 병력
● 스크리닝 전 지난 28일 내의 항생제 치료
● 임의의 비-UC 관련 면역억제 또는 자가면역 상태 또는 임의의 비-UC 관련 면역억제 또는 자가면역 상태에 대한 치료는 배제되며; 전신 코르티코스테로이드 > 프레드니손 10 mg QD는 배제됨
● 임의의 면역억제 상태 또는 퓨린 유사체 이외의 다른 면역억제 의약을 사용한 치료 및 정의된 바와 같은 전신 코르티코스테로이드 없음
● 초기 분변 칼프로텍틴 <250 μg/g인 환자
환자는 안전성 평가를 완료하기 위해 기준선 (제1일) 대면 방문이 스케줄링되었다. 3-일 식이 다이어리를 돌려주고, 생화학적 마커 및 마이크로바이옴 조성을 평가하기 위해 환자를 채혈하고 대변 샘플을 수집하였다. 간이 임상 결장염 활성 지수 (SCCAI) 복합 점수 및 평균 피로 중증도 척도 (FSS)를 실시하였다. 이들 평가의 완료 후에, 환자는 감독 하에 선택된 올리고사카라이드 조성물의 제1 용량을 소비하도록 지시받았다. 이어서, 환자는 해산하고, 선택된 올리고사카라이드 조성물을 가정에서 1일 2회 경구로, 하기 설명된 바와 같은 투여량 증대 적정 하에 계속 복용하였다.
환자는 각각의 연구 방문 전 주 동안 3-일 식이 다이어리를 작성하였고, 스크리닝 (제-14일 +2일), 기준선 (제1일), 치료 종료 (제56일) 및 추적 (제84일 ±2일)에 참가하였다. 임의의 유해 효과를 문서화하는 로그 기록은 가정에서 환자에 의해 매일 작성되었고, 각각의 대면, 전화 및 실제 방문에서 현장 직원에 의해 검토되었다.
제30일 (±2일)에, 환자를 인터뷰하여 연구 준수를 확인하고 건강 상태 또는 치료-발현성 유해 효과 (TEAE)에서의 임의의 변화를 평가하였으며, SCCAI를 실시하였다.
치료의 마지막 날 (제56일; 섭취 기간의 종료)에, 환자는 3-일 식이 다이어리를 돌려주었고, TEAE 로그 기록이 검토되었고; 대변 샘플 및 혈액이 수집되었고; SCCAI 및 FSS가 실시되었고, 이어서 환자는 28일 추적 기간에 들어갔다. 추적 기간 동안, 환자는 3-일 식이 다이어리 및 TEAE 로그 기록을 작성하였다. 추적 기간의 종료 시에 생화학적 마커 및 마이크로바이옴 조성에 대한 변화를 평가하기 위해 대변 샘플을 수집하였다.
제84일 후에, 대상체는 본 연구를 완료하였다. 제84일까지 완료한 환자를 8주 후에 접촉하여 UC 확장 설문지, SCCAI를 작성하도록 하고 대변 및 혈액 샘플 (혈액 샘플은 실행가능한 경우 수집하였음)을 제공하도록 함으로써 연구 제품 섭취 3개월 후 선택된 올리고사카라이드 조성물의 철회가 염증 바이오마커 및 마이크로바이옴 구조와 기능에 미치는 효과를 평가하였다.
제14일 및 제44일 (둘 다 ±3일)에, 환자는 연구 준수를 검토하고 건강 상태 또는 TEAE에서의 임의의 변화를 평가하기 위한 전화 통화를 받았다.
환자는 선택된 올리고사카라이드 조성물을 하기 투여 스케줄에 따라 1일 2회 투여되는 각각의 용량에 대해 적어도 120 mL의 물 중에서 재구성 후 경구로 소비하였다:
안전성 및 내약성을 하기에 기초하여 결정하였다:
● 인과율, 중증도 및 심각성 평가를 포함한 임의의 치료-발현성 유해 사건 (TEAE)을 경험한 환자의 수
● 내약성: 치료-관련 유해 사건 (AE) 및 AE로 인한 중단
● 하기의 기준선으로부터의 변화:
○ 활력 징후
○ 안전성 실험실 분석
● 신체 검사
탐색적 종점 파라미터는 하기를 포함하였다:
● 연구 치료의 종료까지 핵산 서열분석에 의해 측정 시 알파 다양성, 분류학 및 박테리아의 존재비 (엔테로박테리아세아에 포함; 총계 대비 및 대변 그램당)의 기준선으로부터의 변화
● 대변 및 혈액 중 염증의 생화학적 및 다른 바이오마커의 기준선으로부터 섭취 기간의 종료까지의 변화
● 임상 준비(run-in) 샘플을 선택된 올리고사카라이드 조성물과 함께 생체외 배양 시스템을 사용하여 인큐베이션한 후 박테리아 분류군 (즉, 장 마이크로바이옴 조성)의 존재비로서, 대상체에서 준비기와 섭취 종료 사이에 관찰된 경우와 비교한 상대 존재비의 측정치
● 간이 임상 결장염 활성 지수 (SCCAI) 복합 점수의 기준선으로부터 섭취 기간의 종료까지의 변화
● 평균 피로 중증도 척도 (FSS) 점수의 기준선으로부터 섭취 기간의 종료까지의 변화
● 평균 FSS 점수에 있어서 섭취 기간의 종료까지 피로 (평균 FSS 점수 ≥4로 정의됨)를 갖는 환자의 비율
● 평균 FSS 점수에 있어서 추적 기간의 종료까지 피로 (평균 FSS 점수 ≥4로 정의됨)를 갖는 환자의 비율
● UC를 위한 건강관리시설 이용, 예컨대 입원, 건강관리 전문가에 대한 비-일상적 방문
결과
스크리닝 시 및 섭취 기간의 종료 시에 환자로부터 수집된 분변 샘플에서 EliA 칼프로텍틴 2 시험 (파디아 래보러토리 시스템즈(Phadia Laboratory Systems))을 사용하여 칼프로텍틴을 측정하였다. 분변 칼프로텍틴의 농도는 스크리닝에서 섭취 종료까지 연구에서 조사된 10명의 참가자에 걸쳐 중앙값 68.7%만큼 감소하였다 (도 15a). 분변 칼프로텍틴은 10명의 참가자 중 7명에서 적어도 50%만큼 감소하였다. 표 18은 초기 스크리닝 시 (선택된 올리고사카라이드 조성물의 투여 전), 섭취 종료 시 (선택된 올리고사카라이드 조성물의 투여 후) 각각의 참가자에 대한 분변 칼프로텍틴의 수준 (μg/g 분변)을 제공하고, 퍼센트 변화를 포함한다.
표 18. 각각의 참가자에 대한 분변 칼프로텍틴 (μg/g 분변)
칼프로텍틴은 병원체, 예컨대 호중구, 단핵구 및 대식세포에 대한 면역 반응에 관여하는 세포에서 발견되는 단백질이다 (Gaya et al., 2002, Q J Med; Roseth et al., 2004, Scand J Gastroenterol). 이는 호중구에서 세포질 단백질의 많게는 60%를 차지할 수 있다. 장 염증 동안, 호중구는 장 상피를 통해 장 내강으로 이동하여, 대변 중 칼프로텍틴의 양이 증가되도록 한다 (Masoodi et al., Ger Med Sci. 2011 Feb 16;9:Doc03.). 분변 칼프로텍틴의 수준은 장 내강 내 호중구의 수와 상관관계가 있고, 염증성 장 질환 (IBD), 예컨대 크론병 및 궤양성 결장염에서 상승된다 (Konikoff M.R., Inflamm Bowel Dis. 2006 Jun;12(6):524-34).
또한 스크리닝 시 (섭취 전) 및 섭취 기간의 종료 시에 환자로부터 수집된 분변 샘플에서 장 염증의 2종의 다른 단백질 바이오마커를 측정하였다. ELISA 검정 (바이오벤더(BioVendor))을 사용하여 분변 락토페린 및 리포칼린을 측정하였다. 분변 락토페린 농도는 스크리닝에서 섭취 종료까지 시험된 6명의 참가자에 걸쳐 중앙값 69.2%만큼 감소하였다 (도 15b). 분변 락토페린 농도는 6명의 참가자 중 5명에서 적어도 50%만큼 감소하였다. 분변 락토페린은 IBD 질환 활성의 특이적이고 선택적인 바이오마커인 것으로 나타났다 (Dai et al., Scand J Gastroenterol., Volume 42, 2007 - Issue 12, Pages 1440-1444, 2007).
분변 리포칼린 농도는 6명의 참가자 중 3명에서 감소하는, 감소된 수준을 향한 경향을 나타냈다.
분변 염증 바이오마커의 이들 감소는 궤양성 결장염을 갖는 환자에 대한 선택된 올리고사카라이드 조성물의 투여로부터 발생하는 국부 장 염증의 감소를 시사하며, 이는 본원에 기재된 선택된 올리고사카라이드 조성물이 염증성 질환, 예컨대 UC를 포함한 염증성 장 질환을 갖는 환자의 치료에 유용할 수 있다는 것을 시사한다.
또한 섭취 기간 전 및 종료 시에 간이 임상 결장염 활성 지수 (SCCAI)를 사용하여 연구 참가자에서 질환 활성을 평가하였다. SCCAI는 이 척도를 사용하여 평가된 8명의 참가자 중 5명에서 감소하였다 (도 16).
또한 5명의 연구 참가자의 혈장 샘플에서 추가의 염증 단백질 바이오마커를 측정하였다. 이들 바이오마커는 고-민감성 C-반응성 단백질 (hsCRP), 칼프로텍틴, 리포칼린 및 LPS-결합 단백질 (LBP)을 포함하였다. 또한 혈장 샘플에서 장 상피 완전성의 바이오마커인 장 지방산-결합 단백질 (I-FABP)을 측정하였다. 섭취 기간 후에 이들 혈장 바이오마커의 작은 변화가 관찰되었다. 그러나, 섭취 전 각각의 바이오마커의 수준은 일반적으로 낮았고, 건강한 대상체에 대해 예상되는 범위 내에 있었다.
전신 염증의 바이오마커로서의 시토카인의 패널을 혈장 샘플에서 측정하였다. 이 패널은 TNFα, IL-1β, IL-6, IL-12, IFNγ, IL-2, IL-4, IL-13, IL-8 및 IL-10을 포함하였다. 이들 시토카인의 작은 변화만이 관찰되었다. 섭취 시 이들 시토카인의 수준은 일반적으로 낮았고, 건강한 대상체에 대해 예상되는 범위 내에 있었다.
스크리닝 시 및 섭취 기간의 종료 시에 5명의 환자에서 파라박테로이데스 속 (공생균 분류군의 구성원) 및 엔테로박테리아세아에 과 (유해균 분류군의 구성원)의 메타게놈 상대 존재비를 조사하였다. 대상체로부터 수집된 분변 샘플에서 평가 시, 선택된 올리고사카라이드 조성물을 사용한 치료 후 5명의 환자 중 4명에서 파라박테로이데스의 상대 존재비가 증가하였고 (도 17a), 5명의 참가자 모두에서 엔테로박테리아세아에의 상대 존재비가 감소하였다 (도 17b). 이들 데이터는 선택된 올리고사카라이드 조성물이 궤양성 결장염을 갖는 인간 환자의 장 마이크로바이옴을 변경시킬 수 있다는 것을 입증한다. 구체적으로, 이들 데이터는 선택된 올리고사카라이드 조성물이 궤양성 결장염을 갖는 인간 환자에서 유해균 (예를 들어, 엔테로박테리아세아에)에 비해 공생균 분류군 (예를 들어, 파라박테로이데스)의 존재비를 증가시켰다는 것을 입증한다.
또한 메타게놈학을 이용하여 선택된 올리고사카라이드의 투여가 부착-침습성 이. 콜라이 유해균의 감소를 유발한다는 것을 입증하였다. 부착-침습성 이. 콜라이와 연관된 병독성 시그너쳐를 확인하기 위해, 판게놈-기반 필로게놈 분석 (PanPhlAn)을 사용하여 90% 아미노산 동일성 유전자 클러스터의 판게놈 참조물을 사용하여 이. 콜라이 유전자의 판게놈을 정량화하였다. 유전자 참조물의 존재비를 KEGG KO 유전자 패밀리 분류 수준으로 집계하였다. 이러한 분석은 선택된 올리고사카라이드 조성물의 섭취 후에 부착-침습성 이. 콜라이 분리주와 연관된 3종의 유전자 주석 (fimH, ompA 및 ompC)이 감소되었다는 것을 입증하였다. 이들 데이터는 선택된 올리고사카라이드 조성물이 궤양성 결장염을 갖는 인간 환자의 장 마이크로바이옴에서 부착-침습성 이. 콜라이의 존재비를 감소시킬 수 있다는 것을 입증한다. 이는 부착-침습성 이. 콜라이가 궤양성 결장염의 발병기전에 연루되었기 때문에 유의하다.
데이터는 선택된 올리고사카라이드가 염증성 장 질환, 예를 들어 UC 및 CD와 같은 염증성 질환에 관여하는 여러 경로/메카니즘에 영향을 미칠 수 있다는 것을 시사한다 (예를 들어, 도 9 참조). 데이터는 선택된 올리고사카라이드가 (a) SCFA (예를 들어, 부티레이트)를 증가시키고 (도 1, 2, 10 및 19), (b) 공생균 (예를 들어, 파라박테로이데스)의 존재비를 증가시키고, 유해균 (예를 들어, 엔테로박테리아세아에) (도 3, 12, 13, 14 및 17) 및 이. 콜라이 (도 18)의 존재비를 감소시키고, (c) 장 염증 (예를 들어, 분변 칼프로텍틴 및 락토페린)을 감소시키고 (도 15), (d) 삶의 질 (QoL, 예를 들어 SCCAI 점수)을 개선시킨다 (도 16)는 것을 시사한다. 집합적으로, 데이터는 본원에 기재된 선택된 올리고사카라이드 조성물이 염증성 질환, 예컨대 염증성 장 질환, 예를 들어 UC 및 CD를 나타내는 환자를 치료하는 데 유용하다는 것을 시사한다.
실시예 12. 가용성 산 촉매를 사용한 갈락토스로부터의 25 kg 규모의 선택된 올리고사카라이드 조성물의 제조
25 킬로그램 규모로 실시예 1에 기재된 바와 같은 선택된 올리고사카라이드 조성물의 합성을 위한 절차를 개발하였다. 25 kg의 무수 갈락토스, 0.38 kg의 시트르산 무수 산 촉매 및 6.5 kg의 물을 증류 응축기 유닛이 장착된 반응 용기 (오일-재킷형 50 L 연속 교반 탱크 반응기 (CSTR))에 첨가하였다. 내용물을 대략 120 rpm으로 교반하고, 용기 온도를 대기압에서 2-4.0시간의 기간에 걸쳐 약 130℃로 증가시켰다. 혼합물을 이 온도에서 추가의 3-5시간 동안 유지한 후, 가열을 정지하고, 급속-냉각 절차를 개시하였다. 30분의 냉각 후, 6 L의 사전-가열된 물 (켄칭수)을 500 mL/분의 비율로 반응 혼합물에 신속하게 첨가하였다. 모든 켄칭수가 첨가되었으면, 반응기 내용물을 완전히 용해될 때까지 혼합하고, 55℃ 이하의 내부 온도로 냉각시켰다. 반응 혼합물을 용기로부터 배출시켜, 대략 45-50 kg의 조 올리고사카라이드를 수용액 (대략 47 - 55 wt%)으로서 생성하였다.
올리고사카라이드 조성물을 0.45 마이크로미터 필터를 통해 유동시킴으로써 정제하여 대략 45-50 kg의 여과된 조성물을 수득하였다.
실시예 13. 가용성 산 촉매를 사용한 갈락토스로부터의 500 kg 규모의 선택된 올리고사카라이드 조성물의 제조
500 킬로그램 (2000 L) 규모로 실시예 1에 기재된 바와 같은 선택된 올리고사카라이드 조성물의 합성을 위한 절차를 개발하였다. 125 kg의 물을 먼저 깨끗한 유리-라이닝된 2000 L 연속 교반 탱크 반응기에 첨가하였다. 물을 대략 60 rpm으로 교반하고, 반응기의 재킷을 85℃로 가열하였다. 이어서, 500 kg의 무수 갈락토스 및 7.5 kg의 시트르산 무수 산 촉매를 반응기에 첨가하였다.
내용물을 대략 60 rpm으로 교반하고, 용기 온도를 대기압에서 2-4.0시간의 기간에 걸쳐 약 130℃로 증가시켰다. 혼합물을 이 온도에서 적어도 추가의 5시간 동안 유지한 후, 가열을 정지하고, 시간 내에 내용물의 온도를 25℃ 이하로 감소시키기 위한 냉각 절차를 개시하였다. 반응기의 재킷의 온도를 감소시키고, 대략 190 kg의 온수 (65℃)를 약 10분에 걸쳐 반응기의 내용물에 첨가하였다. 이어서, 반응기의 재킷의 온도를 추가로 감소시키고, 추가의 대략 310 kg의 실온수를 반응기의 내용물에 첨가하고, 내용물을 실온으로 냉각되도록 하였다.
후속적으로, 올리고사카라이드 조성물을 0.45 마이크로미터 필터를 통해 유동시킴으로써 정제하였다.
실시예 14. 분무 건조 절차
실시예 13에서 제조된 바와 같은 선택된 올리고사카라이드 조성물의 개별 배치를 분무-건조시켰다. 회전 아토마이저가 장착된 SPX 안히드로 마이크라스프레이(Anhydro MicraSpray) 400 기기의 챔버를 불활성화시켜 챔버 내부의 산소 농도를 < 1%로 만들었다. 건조 기체 유동을 시작하고, 440 kg/hr로 설정하였다. 건조 기체 유동이 안정해졌으면, 분무 건조 기기를 하기 설정점으로 설정하였다: (i) 분무 건조기 압력 설정점 = 1050 mbar; (ii) 분무 건조기 챔버 스킨 히터 = 60℃; (iii) 재순환 팬 프리-히터 = 20℃; (iv) 스팀 히터 입구 = 90℃; (v) 회전 아토마이저 속도 = 25000 RPM; (vi) 사이클론 스킨 히터 = 90℃; 및 (vii) 백하우스 스킨 히터 = 40℃. 상기 분무 건조기 공정 파라미터가 안정화되었으면, 블랭크 용액 (정제수)을 켜고 7.5 kg/hr로 설정하고, 스팀 히터 입구 온도를 145℃로 증가시켰다.
분무 건조기 출구 온도가 대략 90℃로 안정화된 후, 용매 공급물을 블랭크 용액 (정제수)에서 공급 용액 (선택된 올리고사카라이드 조성물)으로 교체하고, 공급 속도를 15.0 kg/hr로 조정하였다. 분무-건조된 올리고사카라이드 조성물을 기기에 의해 건조되었을 때 800L 원추형 용기에 수집하였다.
실시예 15. 브루커 NMR 기계를 사용한 선택된 올리고사카라이드 조성물의 대규모 배치의 HSQC NMR 분석
실시예 1에 기재되고 실시예 12 및 13에 기재된 바와 같이 제조된 선택된 올리고사카라이드 조성물의 샘플의 HSQC NMR 스펙트럼의 결정을 브루커 NMR 기계를 사용하여 수득하고, 실시예 8에 기재된 HSQC NMR 방법에 따라 메스트렐랩 리서치로부터의 MNova 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석하였다.
결과
실시예 12에 기재된 방법에 따라 제조된 선택된 올리고사카라이드 조성물의 단일 배치 (25 kg 갈락토스; 50 L 규모) 및 실시예 13에 기재된 방법에 따라 제조된 선택된 올리고사카라이드 조성물의 4개의 배치 (500 kg 갈락토스; 2000 L 규모) (12.7 (± 0.4)의 평균 DP를 가짐)를 실시예 8에 기재된 HSQC NMR 방법을 사용하여 분석하였다. HSQC NMR 분석 전에, 샘플을 실시예 5에 기재된 에탄올 침전 절차를 사용하여 탈단량체화하였다.
선택된 올리고사카라이드 조성물의 분석된 배치의 NMR 스펙트럼에 대해 수집된 각각의 피크의 상대 크기 (즉, 타원형 형상을 갖는 표 9의 미리 정의된 적분 영역을 사용한 피크/신호 1-11의 적분값; 본원에서 곡선하 면적 (AUC)으로 지칭됨)를 하기 표 15에 제시된 바와 같이 결정하였다:
표 15. HSQC NMR 데이터 (실시예 12 및 13에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 제조된 배치)
선택된 올리고사카라이드 조성물의 대규모 배치 (실시예 12 및 13에 기재된 방법을 사용하여 제조됨)에 대한 이들 HSQC NMR 데이터는 실시예 2-4에 기재된 방법을 사용하여 제조된 선택된 올리고사카라이드 조성물의 배치에 대해 입증된 바와 같이 미리 정의된 적분 영역을 사용한 피크/신호 1-11의 실질적으로 유사한 상대 적분값을 제공한다. 따라서, 이들 데이터는 대규모 (예를 들어, 500 kg 갈락토스; 2000 L 규모)로 선택된 올리고사카라이드 조성물을 제조하는 것이 선택된 올리고사카라이드 조성물의 화학적 특성을 유의하게 변화시키지 않는다는 것을 입증한다.
상기 분석된 2000 L 배치 중 하나 (2000 L 배치 #1)를 실시예 14에 기재된 분무 건조 절차에 추가로 적용하였다. 분무 건조 절차 후, HSQC NMR 분석을 위해 30 mg의 분무 건조된 조성물 (실시예 5에 기재된 에탄올 침전 절차를 사용한 탈단량체화 후)을 내부 표준으로서의 0.1% 아세톤을 함유하는 300 μL의 D2O 중에 용해시킴으로써 분무 건조된 조성물의 샘플을 제조하였다. 이어서, 용액을 실시예 8에 기재된 HSQC NMR 방법을 사용하여 3mm NMR 튜브에 넣었다. 선택된 올리고사카라이드 조성물의 분석된 배치의 NMR 스펙트럼에 대해 수집된 각각의 피크의 상대 크기 (즉, 타원형 형상을 갖는 표 9의 미리 정의된 적분 영역을 사용한 피크/신호 1-11의 적분값; 본원에서 곡선하 면적 (AUC)으로 지칭됨)를 하기 표 16에 제시된 바와 같이 결정하고, 분무 건조 전 2000 L 배치 #1의 NMR 스펙트럼과 비교하였다:
표 16. HSQC NMR 데이터 (분무 건조 전 및 후)
분무 건조 전 및 후 2000 L 배치 #1의 HSQC NMR 스펙트럼은 서로 실질적으로 유사하며, 각각의 피크의 상대 크기 (즉, 타원형 형상을 갖는 표 9의 미리 정의된 적분 영역을 사용한 피크/신호 1-11의 적분값; 본원에서 곡선하 면적 (AUC)으로 지칭됨)에서 단지 경미한 변동만이 존재한다. 따라서, 이들 HSQC NMR 데이터는 분무 건조가 선택된 올리고사카라이드 조성물의 HSQC NMR 스펙트럼 및 화학적 특성에 거의 내지 전혀 영향을 미치지 않는다는 것을 입증한다.
실시예 16. 퍼메틸화 분석을 사용한 선택된 올리고사카라이드 조성물의 대규모 배치의 글리코시드 결합 분포의 결정
실시예 1에 기재되고 실시예 12 및 13에 기재된 바와 같이 제조된 선택된 올리고사카라이드 조성물의 샘플의 글리코시드 결합 분포의 결정을 실시예 9에 기재된 방법에 따라 퍼메틸화 분석을 사용하여 수행하였다. 퍼메틸화 분석 전에 샘플을 탈단량체화하였다. 실시예 12에 기재된 방법에 따라 제조된 선택된 올리고사카라이드 조성물의 단일 배치 (25 kg 갈락토스; 50 L 규모) 및 실시예 13에 기재된 방법에 따라 제조된 선택된 올리고사카라이드 조성물의 4개의 배치 (500 kg 갈락토스; 2000 L 규모) (12.7 (± 0.4)의 평균 DP를 가짐)를 본 실시예에서 시험하였다.
결과
퍼메틸화 데이터를 수집하고, 각각의 배치를 3개의 기술적 반복물로 분석하였다. 탈단량체화된 올리고사카라이드 조성물의 이들 배치에 존재하는 라디칼과 관련된 3개의 기술적 반복물 사이의 평균 데이터와 표준 편차 (std. dev.)가 하기 표 17에 제공된다:
표 17. 퍼메틸화 데이터 (실시예 12 및 13에 기재된 방법에 의해 제조된 탈단량체화된 올리고사카라이드 조성물)
실시예 17. 선택된 올리고사카라이드 조성물의 스펙트럼에서의 HSQC NMR 피크/신호의 할당
실시예 1에 기재되고 실시예 12 및 13에 기재된 바와 같이 제조된 선택된 올리고사카라이드 조성물의 HSQC NMR 스펙트럼의 결정을 하기 기재된 프로토콜에 따라 브루커 NMR 기계를 사용하여 수행하여, 주석이 달린 특정 피크/신호를 선택된 올리고사카라이드 조성물 내에 존재하는 별개의 결합 유형에 속하는 것으로 할당하였다.
방법
샘플 제조:
30 mg의 올리고사카라이드 조성물의 사전 동결건조된 고체 샘플을 내부 표준물로서 0.1% 아세톤을 함유한 300 μL의 D2O 중에 용해시켰다. 이어서, 용액을 3mm NMR 튜브에 넣었다.
NMR 실험:
1H/19F, 13C, 15N, 31P를 갖는 CP QCI 프로브가 장착된, 600MHz에서 작동하는 브루커 NMR에서 각각의 샘플을 분석하였다.
각각의 샘플을 하기 펄스 시퀀스 다이어그램을 사용하여 PEP 및 역-inept에서 구배를 갖는 반전, 리포커싱 및 매칭 스위프 단열적 펄스를 사용한 위상-민감성, 다중도-편집 구배-증강 1H-13C 이종핵 단일 양자 가간섭성 (HSQC) 실험에 적용하였다:
펄스 시퀀스 다이어그램
획득 파라미터
1H 반송파 주파수 = 600.13 MHz
13C 반송파 주파수 = 150.91 MHz
펄스 시퀀스 = hsqcedetgpsisp2.3
획득 차원에서의 포인트 수 = 2048개
획득 차원에서의 스펙트럼 범위 = 6.75 ppm 내지 0.25 ppm
간접 차원에서의 포인트 수 = 512개
간접 차원에서의 스펙트럼 범위 = 120 ppm 내지 0 ppm
재순환 지연 = 1.5초
1-결합 1H-13C 커플링 상수 = JCH = 145 Hz
스캔 횟수 = 8회
온도 = 298-299 K
용매 = D2O
가공 파라미터
직접 차원에서의 윈도우 함수 = Qsine 2
간접 차원에서의 윈도우 함수 = Qsine 2
가공 = 직접 차원에서의 2048개의 복합 포인트, 간접 차원에서의 2048개의 복합 포인트
순방향 선형 예측 = 32개의 계수, 512개의 예측 포인트.
스펙트럼 분석 및 결과
생성된 스펙트럼을 메스트렐랩 리서치 (스페인 산티아고 데 콤포스텔라)로부터의 MNova 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석하였다. 스펙트럼은 내부 아세톤 신호 (1H - 2.22 ppm; 13C - 30.8 ppm)를 참조로 하였고, F2 및 F1 차원 둘 다에서 영역2D 방법을 사용하여 위상화되었다. 90도 이동된 사인을 사용한 아포디제이션을 F2 및 F1 차원 둘 다에 적용하였다. 피크/신호를 선택된 올리고사카라이드 내에 존재하는 별개의 결합 유형에 속하는 것으로서 할당하는 것은 "1H NMR 구조적-리포터-그룹 개념" (Leeuwen et al. Carbohydrate Research 343 (2008), 1114-1119), 문헌의 화학적 이동, H2BC 및 HMBC 상관관계와 같은 전략에 기초하였다. 분석에 사용된 이량체는 (카르보신스, 인크(Carbosynth, Inc)): Galp-b(1-2)-Galp, Galp-a(1-2)-Galp, Galp-a(1-3)-Galp, Galp-b(1-3)-Galp, Galp-b(1-4)-Galp, Galp-a(1-4)-Galp, Galp-b(1-6)-Galp 및 Galp-a(1-6)-Galp를 포함하였다. 연결 존재비를 퍼메틸화 데이터와 비교하고, 문헌 값 및 다른 올리고사카라이드 조성물과 상호 참조하였다. 할당이 도 7a-7b에 제공된다.
실시예 18. 선택된 올리고사카라이드 조성물의 안정성
선택된 올리고사카라이드 조성물을 승온에서 일정 기간 동안 인큐베이션함으로써 선택된 올리고사카라이드 조성물의 안정성을 평가하였다. 선택된 올리고사카라이드 조성물 (50% w:v)의 샘플의 150 mL 분취물을 오일-재킷형 250 mL 반응기에서 표적 온도 (70℃, 80℃, 90℃ 또는 100℃)가 되도록 한 다음, 6시간의 기간에 걸쳐 주기적으로 샘플링하였다 (t0 = 표적 온도에 도달한 시점). 샘플을 실시예 6에 기재된 방법을 사용하여 SEC 상에서 실행시켜 다양한 시점에서 Mw, Mn 및 퍼센트 DP2+를 결정하였다. 도 8은 인큐베이션의 종점 (즉, 시간=6시간)에서 선택된 올리고사카라이드 조성물의 샘플의 Mw, Mn 및 퍼센트 DP2+를 보여준다. 선택된 올리고사카라이드 조성물의 구조적 완전성은 연장된 기간 (즉, 6시간) 동안 물의 존재 하에 70℃ 및 80℃의 온도에의 노출에 의해 최소한으로 영향을 받는다. 그러나, 물의 존재 하에 보다 높은 온도에 대한 노출은 Mw, Mn 및 %DP2+에 의해 측정 시 선택된 올리고사카라이드 조성물에 포함된 올리고사카라이드의 가수분해 및 평균 길이의 단축을 유발할 수 있다.
이는 선택된 올리고사카라이드 조성물의 화학 구조가 연장된 기간 (즉, 6시간) 동안 70℃ 및 80℃의 승온에서의 유지에 의해 최소한으로 영향을 받는다는 것을 시사한다. 추가로, 이들 데이터는, 이들 데이터를 고려하여 선택된 올리고사카라이드 조성물의 구조적 완전성을 유지하기 위해, 선택된 올리고사카라이드 조성물의 제조 (예를 들어, 대규모 제조, 예를 들어 실시예 12 및 13을 사용한 제조) 후 후가공 단계 (예를 들어, 켄칭)가 적시에 수행되어야 한다는 것을 시사한다. 예를 들어, 선택된 올리고사카라이드 조성물을 냉각시키기 위해 선택된 올리고사카라이드 조성물의 제조 후 반응 혼합물의 켄칭이 본 실시예에 따라 적시에 수행되어야 한다.
실시예 19. 선택된 올리고사카라이드 조성물은 생체외 배양 시스템에서 건강한 대상체로부터의 분변 샘플에서 SCFA의 생산을 증가시킨다.
10명의 건강한 대상체로부터의 분변 샘플을 0.75 mM 우레아 및 0.1% (w/v) 트립티카제 펩톤으로 보충된 클로스트리디움 최소 배지 (Theriot et al., 2014, Nature Communications) 중에서 선택된 올리고사카라이드 조성물 없이 (음성 대조군) 또는 0.5% (w/v)의 최종 농도의 선택된 올리고사카라이드 조성물과 함께 37℃에서 45시간 동안 혐기성으로 인큐베이션하였다. 각각의 분변 샘플 인큐베이션을 3개의 생물학적 반복물로 수행하였다. 인큐베이션 후, 샘플을 원심분리에 의해 침강시키고, 배양물 상청액을 수집하였다. 불꽃-이온화 검출 동반 기체 크로마토그래피 (GC-FID)를 사용하여 배양물 상청액에서 SCFA 농도를 정량화하였다.
샘플 반복물에 걸친 평균 SCFA 값을 박스-휘스커 플롯에 포함시키고, p-값을 양측 대응표본 t-검정을 사용하여 결정하였다 (도 10). 선택된 올리고사카라이드 조성물은 10개의 분변 샘플에 걸쳐 SCFA의 생산을 중앙 농도 47.0 mM로 증가시켰으며, 이와 비교하여 음성 대조군의 경우는 15.2 mM이었다. 추가로, 선택된 올리고사카라이드 조성물은 시험된 10개의 분변 샘플 각각에서 3종의 SCFA (즉, 아세테이트, 프로피오네이트 및 부티레이트) 각각을 증가시켰다. 선택된 올리고사카라이드 조성물과의 인큐베이션은, 음성 대조군 (물)의 경우 중앙값 10.0 mM 아세테이트, 3.1 mM 프로피오네이트 및 2.1 mM 부티레이트와 비교하여, 중앙값 27.8 mM 아세테이트, 15.0 mM 프로피오네이트 및 6.1 mM 부티레이트를 생산하였다.
게놈 DNA 농도를 또한 퀀트-iT 피코그린 dsDNA 검정 키트 (인비트로젠(Invitrogen))를 사용하여 결정하였다. 게놈 DNA를 박테리아 16S rRNA 유전자를 표적화하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 정량적 PCR에 적용하였다. 추출된 게놈 DNA의 농도 및 배양물의 단위 부피당 16S rRNA 유전자의 카피수가 각각의 배양물에서의 박테리아의 존재비의 측정치이다. 선택된 올리고사카라이드 조성물과 함께 인큐베이션된 분변 샘플에 걸친 중앙 게놈 DNA 농도는 음성 대조군의 경우 2.7 ng/μL와 비교하여 30.2 ng/μL였다. 유사하게, 선택된 올리고사카라이드 조성물과 함께 인큐베이션된 분변 샘플로부터의 중앙 16S rRNA 유전자 카피는 음성 대조군의 경우 2.2 x 107 카피/μL와 비교하여 1.1 x 108 카피/μL였다. 게놈 DNA 농도 및 16S rRNA 유전자 카피 둘 다에 대한 선택된 올리고사카라이드 조성물과 음성 대조군 사이의 차이는 양측 대응표본 t-검정에 의해 통계적으로 유의한 것으로 결정되었다 (p-값 < 0.0001).
이들 결과는 선택된 올리고사카라이드 조성물이 상이한 건강한 대상체로부터의 분변 미생물총에 의해 일관되게 발효 (소비)된다는 것을 입증한다. 이러한 발효는 균형잡힌 SCFA 생산 프로파일을 생성하며, 이는 선택된 올리고사카라이드 조성물이 SCFA, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트 및 부티레이트를 생산하는 다양한 세트의 공생 장 박테리아의 강건한 성장 및 대사를 지지한다는 것을 시사한다.
실시예 20. 선택된 올리고사카라이드 조성물은 생체외 배양 시스템에서 건강한 대상체로부터의 분변 샘플에서 분변 마이크로바이옴을 조정한다.
선택된 올리고사카라이드 조성물과의 인큐베이션에 의해 생성된 분류학적 조성의 이동을 이해하기 위해, 분변 마이크로바이옴을 샷건 메타게놈 서열분석 (디버시젠(Diversigen), 미국 미네소타주)에 의해 특징화하였다. 넥스테라(Nextera)XT 키트를 사용하여 샷건 메타게놈 서열분석 라이브러리를 제조한 후, 일루미나 NextSeq 플랫폼 상에서 라이브러리당 적어도 1천만개의 판독물까지 서열분석하였다. RefSeq v87에서 종당 처음 20종의 균주를 포함한 데이터베이스를 사용하여 SHOGUN 파이프라인에 의해 샷건 메타게놈 서열분석 데이터로부터의 분류군 카운트 표를 생성하였다. 모든 샘플 사이의 속 수준 분류군 표에 대해 브레이-커티스 비유사성을 컴퓨터 계산하였다. 비계량적 다차원 척도법 (NMDS) 오디네이션 플롯에서, 선택된 올리고사카라이드 조성물과 함께 인큐베이션된 분변 샘플은 대조군 샘플과 별개의 마이크로바이옴 조성을 나타내는 클러스터를 형성한다 (도 11). 이는 95% 신뢰 구간에서 대조군 (평균 0.35, 표준 편차 0.075) 내 및 선택된 올리고사카라이드 조성물과 함께 인큐베이션된 샘플 (평균 0.299, 표준 편차 0.123) 내의 보다 일관된 클러스터에 비해 평균 브레이-커티스 이동 0.53 (표준 편차 0.06)으로서 정량화된다. 이들 데이터는 선택된 올리고사카라이드 조성물이 심지어 (예를 들어, 선택된 올리고사카라이드 조성물의 투여 전에) 비일관된 투입 마이크로바이옴 조성 프로파일을 갖는 대상체 또는 샘플에서 인큐베이션된 경우에도 일관된 마이크로바이옴 조성 프로파일을 생성할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 21. 선택된 올리고사카라이드 조성물은 선택된 올리고사카라이드 조성물과의 인큐베이션 후에 개별 분변 샘플에서 분류학적 변화를 생성한다.
선택된 올리고사카라이드 조성물과의 인큐베이션에 의해 조정된 (예를 들어, 상대 또는 절대 존재비가 증가 또는 감소된) 속 및 종을 확인하기 위해, 마이크로바이옴 속 및 종 분류군 표를 대조군에 비해 선택된 올리고사카라이드 조성물과의 인큐베이션의 log2-배수 비 및 평균 0.1%에 대해 필터링하였다. 이는 건강한 대상체에서 일관되게 풍부화된 공생균 분류군의 세트 (예를 들어 파라박테로이데스, 에이센베르기엘라) 및 일관되게 고갈된 유해균의 세트 (예를 들어 에스케리키아, 클레브시엘라, 시겔라, 시트로박터)를 생산하였다 (도 12). 마이크로바이옴 조성의 자연적인 차이에도 불구하고, 선택된 올리고사카라이드 조성물은 공생 박테리아의 세트를 선택적으로 및 일관되게 풍부화할 수 있고 유해균을 일관되게 고갈시킬 수 있었다. 구체적으로, 선택된 올리고사카라이드 조성물은 파라박테로이데스 속에 속하는 분류군을 풍부화하였다. 건강한 대상체의 10개의 분변 샘플에 걸친 파라박테로이데스 속의 상대 존재비 중앙값은 음성 대조군 (물)의 경우 0.2%에서 선택된 올리고사카라이드 조성물의 경우 40.4%로 증가하였다 (도 13a). 파라박테로이데스 속은 광범위한 글리칸 이용 시스템을 코딩하고 전형적으로 글리칸 발효의 부산물로서 프로피오네이트를 생산하는 박테리아로 이루어진 박테로이데스 문에 속한다 (Reichardt et al., The ISME Journal volume 8, pages1323-1335 (2014)). 파라박테로이데스 속은 또한 분변 미생물총 이식 후 UC 환자에서의 완화와 연관된 것으로 나타났다 (Paramsothy et al., Lancet. 2017 Mar 25;389(10075):1218-1228.). 파라박테로이데스 속의 구성원에 추가로, 선택된 올리고사카라이드 조성물은 또한 피르미쿠테스(Firmicutes) 문의 특정한 분류군을 풍부화하였다. 선택된 올리고사카라이드 조성물은 에이센베르기엘라 및 푸시카테니박터(Fusicatenibacter) 속 (둘 다 라크노스피라세아에 과에 속함)의 상대 존재비를 증가시켰다. 이 과는 에이센베르기엘라 타이이 종 (선택된 올리고사카라이드 조성물에 의해 풍부화됨)을 포함한, 글리칸 발효의 부산물로서 부티레이트를 생산하는 다수의 종을 함유한다. 선택된 올리고사카라이드 조성물은 또한 라크노스피라세아에 과의 2종의 미분류 종, 뿐만 아니라 유박테리움 속의 미분류 종을 풍부화하였다.
이들 풍부화는 박테로이데테스 문 및 라크노스피라세아에 과의 구성원이 건강한 비-IBD 대조군과 비교하여 IBD 환자의 분변 샘플에서 고갈된 것으로 나타났기 때문에 주목할 만하다 (Frank et al., PNAS August 21, 2007 104 (34) 13780-13785). 추가로, 이들 박테리아 군에 의해 생산된 부티레이트 및 프로피오네이트는 결장 상피 세포에 대한 에너지의 공급원을 제공하고, 상피 완전성 및 기능을 지지하며, 장 면역 반응을 조정하여 결장염을 감소시킨다 (Pryde et al., FEMS Microbiol Lett. 2002 Dec 17;217(2):133-9.; Smith et al., SCIENCE, 1 Feb 2013, Vol 339, Issue 6119, pp. 548-554), Arpaia et al., Nature. 2013 Dec 19;504(7480):451-5. doi: 10.1038/nature12726. Epub 2013 Nov 13.). 구체적으로, 선택된 올리고사카라이드 조성물은 여러 유해균 분류군을 보유하는 것으로 공지된 엔테로박테리아세아에 과에 속하는 분류군을 고갈시켰다. 10개의 분변 샘플에 걸친 엔테로박테리아세아에 과의 상대 존재비 중앙값은 음성 대조군 (물)의 경우 38.2%에서 선택된 올리고사카라이드 조성물의 경우 10.8%로 감소하였다 (도 13b). 선택된 올리고사카라이드 조성물은 또한 엔테로박테리아세아에 과의 여러 속, 예컨대 에스케리키아, 시겔라, 살모넬라 및 시트로박터 속의 상대 존재비를 감소시켰다. 이들 데이터는 선택된 올리고사카라이드 조성물이 궤양성 결장염을 갖는 환자에서 질환과 연관된 분류학상 군인 엔테로박테리아세아에 과에 속하는 수많은 상이한 유해균 분류군을 고갈시킬 수 있다는 것을 보여준다 (Caruso et al., Nat Rev Immunol. 2020 Jul;20(7):411-426. doi: 10.1038/s41577-019-0268-7.).
실시예 22. 선택된 올리고사카라이드 조성물은 단일배양물에서 공생 박테리아의 성장 및 존재비를 선택적으로 지지하였고, 유해균의 성장은 지지하지 않았다.
분변 샘플의 생체외 인큐베이션 후에 관찰된 분류학적 풍부화 및 고갈은 특정 공생 박테리아가 선택된 올리고사카라이드 조성물을 성장을 위한 기질로서 이용하는 능력을 보유하는 반면, 유해균은 그 능력이 결여되어 있다는 것을 시사하였다. 선택된 공생균 및 유해균 종을 배양 배지 중에서 선택된 올리고사카라이드 조성물 없이 (음성 대조군) 또는 0.5% w/v의 선택된 올리고사카라이드 조성물과 함께 또는 글루코스와 함께 (양성 대조군) 혐기성으로 인큐베이션하였다. 각각의 배양물의 광학 밀도를 바이오텍 파워웨이브(BioTek Powerwave) 분광광도계를 사용하여 24-48시간 동안 15분마다 측정하였다. 각각의 배양을 3개의 생물학적 반복물로 수행하였다. 평균 최대 광학 밀도 값을 배양 반복물에 걸쳐 결정하고, 막대 플롯에 포함시켰다. 선택된 올리고사카라이드 조성물은 음성 대조군에 비해 2종의 상이한 파라박테로이데스 종 (파라박테로이데스 메르다에 및 파라박테로이데스 디스타소니스)의 강한 성장을 지지한 것으로 밝혀졌으며, 이는 이들 종이 발효를 위해 선택된 올리고사카라이드 조성물을 이용할 수 있다는 것을 나타낸다 (도 14a). 선택된 올리고사카라이드 조성물은 또한 음성 대조군에 비해 3종의 상이한 박테로이데스 종 (박테로이데스 우니포르미스, 박테로이데스 세타이오타오미크론 및 박테로이데스 칵카에)의 성장 수준을 지지하였으며, 이는 이들 종이 또한 선택된 올리고사카라이드 조성물을 성장 기질로서 사용할 수 있다는 것을 입증한다. 반대로, 음성 대조군에 비해 유해균 종 에스케리키아 콜라이, 클레브시엘라 뉴모니아에, 엔테로박터 클로아카에 및 살모넬라 엔테리카에서는 성장이 관찰되지 않았다 (도 14b).
에스케리키아 콜라이 및 클레브시엘라 뉴모니아에 종의 5종의 상이한 균주, 뿐만 아니라 엔테로박터 클로아카에의 3종의 상이한 균주를 시험하였다. 각각의 다른 종의 한 균주를 시험하였다. 유해균 막대 그래프에 제시된 개별 포인트는 시험된 종의 개별 균주에 대한 평균 값을 나타낸다.
이들 데이터는 파라박테로이데스 및 박테로이데스 속의 공생 박테리아가 선택된 올리고사카라이드 조성물을 성장 기질로서 이용할 수 있지만, 엔테로박테리아세아에 과의 유해균 종은 그 능력이 결여되어 있다는 것을 보여준다. 생체외 메타게놈 서열분석 데이터와 함께, 이들 단일배양물 데이터는 선택된 올리고사카라이드 조성물이 궤양성 결장염을 앓고 있는 환자에서 공생 장 박테리아의 성장을 선택적으로 지지하고 장에 콜로니화되는 유해균에 비해 공생균에 생태학적 이점을 제공할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 23. 메살라민은 선택된 올리고사카라이드 조성물의 생체외 발효에 영향을 미치지 않는다.
5-아미노살리실산 (5-ASA), 예컨대 메살라민은 경도 내지 중등도 궤양성 결장염을 갖는 환자의 치료를 위한 표준 관리 화합물이다. 메살라민의 존재 하에 미생물 분류군의 성장을 지지하는 선택된 올리고사카라이드 조성물의 능력을 결정하였다. 10명의 건강한 대상체로부터의 분변 샘플을 보충된 클로스트리디움 최소 배지 중에서 선택된 올리고사카라이드 조성물 없이 (음성 대조군) 또는 선택된 올리고사카라이드 조성물과 함께 혐기성으로 인큐베이션하였다. 선택된 올리고사카라이드 조성물을 갖는 샘플을 또한 0.0, 0.5, 2, 8, 32, 125 또는 500 μM 메살라민과 함께 인큐베이션하였다. 각각의 분변 샘플 인큐베이션을 3개의 생물학적 반복물로 수행하였다. 인큐베이션 후, GC-FID에 의한 SCFA 정량화를 위해, 샘플을 원심분리에 의해 침강시키고, 배양물 상청액을 수집하였다.
이전에 관찰된 바와 같이, 선택된 올리고사카라이드 조성물과의 인큐베이션은 음성 대조군 (물)과 비교하여 총 SCFA의 농도 및 개별적으로 각각의 아세테이트, 부티레이트 및 프로피오네이트의 농도를 증가시켰다. 중요하게는, 메살라민과 함께 인큐베이션된 샘플 중 어떠한 것도 선택된 올리고사카라이드 조성물에 의한 SCFA 생산에서 임의의 유의한 차이를 나타내지 않았다.
메살라민이 선택된 올리고사카라이드 조성물과의 인큐베이션에 의해 생산된 분류학적 조성의 이동을 이해하는 데 영향을 미쳤는지 이해하기 위해, 분변 샘플을 16S rRNA 앰플리콘 서열분석에 의해 특징화하였다. 게놈 DNA를 DN이지 파워소일(DNeasy PowerSoil) 추출 플레이트 (퀴아젠)를 사용하여 분변 샘플로부터 추출하고, 퀀트-iT 피코그린 dsDNA 검정 (인비트로젠)을 사용하여 정량화하였다. 515F/806R 프라이머 세트를 사용한 PCR 증폭에 의해 16S rRNA 라이브러리를 제조한 후, 일루미나 NextSeq 플랫폼 상에서 적어도 25000개의 판독물까지 서열분석하였다. 16S rRNA 유전자의 서열을 UNOISE 클러스터링 및 미가공 서열의 디노이징에 이어서 DADA2/RDP 분류학적 호출에 의해 분석하였다. 10개의 분변 샘플로부터의 샘플의 16S rRNA 서열분석을 선택된 올리고사카라이드 조성물과 함께 및 메살라민 없이 인큐베이션된 샘플의 브레이-커티스 비유사성을 사용하여 비교하였다. 시험된 모든 5-ASA 농도는 반복 서열분석 비유사성 (0.06 (S.D. 0.03))과 비슷한 평균 브레이-커티스 비유사성 (0.06 (S.D. 0.02))을 가졌으며, 이는 메살라민의 존재가 선택된 올리고사카라이드 조성물에 의해 생산된 분변 마이크로바이옴 조성에 대해 매우 낮은 효과를 가졌다는 것을 시사한다. 비교로서, 선택된 올리고사카라이드 조성물과 함께 및 메살라민 없이 인큐베이션된 샘플 내의 변동은 0.31 (S.D. 0.05)이었고, 음성 대조군과의 비유사성은 0.46 (S.D. 0.03)이었다. 종합하면, 이들 결과는 메살라민이 건강한 대상체로부터의 분변 샘플에서 선택된 올리고사카라이드 조성물의 생체외 발효를 방해하지 않는다는 것을 나타냈다.
실시예 24. 궤양성 결장염 질환을 갖는 환자를 치료하는 선택된 올리고사카라이드 조성물의 능력을 평가하기 위한 임상 시험
실시예 3-4, 12 및 13에 기재된 바와 같은 방법에 의해 제조된 바와 같은 선택된 올리고사카라이드 조성물의 능력을, 2A상, 무작위화, 이중-맹검, 대조, 다기관 연구에서 궤양성 결장염 (UC) 환자를 치료하는 그의 능력에 대해 평가하여, 경도 내지 중등도 활성 궤양성 결장염을 갖는 참가자에서 선택된 올리고사카라이드 조성물의 안전성 및 효능을 평가한다. UC 활성은 3-7의 변형된 메이요 점수 (MMS) (경도로서 3-4 및 중등도로서 5-7의 MMS 포함)에 의해 결정된다. MMS 3 내지 4 (경도)를 갖는 참가자의 등록은 EMS가 2가 아닌 한 총 연구 집단의 대략 30%로 제한된다. 170 μg/g 이상의 분변 칼프로텍틴 (FC) 수준이 무작위화 전에 요구된다. 최대 90명의 참가자가 등록된다.
연구는 2 단계로 수행된다. 스크리닝 기간의 완료 후, 단계 1로 무작위화된 참가자는 고용량의 선택된 올리고사카라이드 조성물 또는 대조군을 처음 2주에 걸쳐 용량 증량 방식으로 받아 나머지 8주 동안 최대 투여에 도달한다. ~45명의 참가자가 단계 1에서 치료를 완료한 후에 중간 분석 (IA)이 계획된다. 단계 1 등록이 완료되면 즉시 단계 2 등록이 시작된다. IA의 결과는 전체 90명의 참가자까지 등록을 계속할 지 또는 연구를 중단할 지를 결정한다. 단계 2에 무작위화된 참가자는 저용량의 선택된 올리고사카라이드 조성물 또는 대조군을 처음 2주에 걸쳐 용량 증량 방식으로 받아 나머지 8주 동안 최대 투여에 도달한다.
스크리닝 기간: 도 20은 연구 설계의 개관을 제공한다. 참가자는 제-28일 내지 제0일에 사전 동의서에 서명하고 스크리닝 평가를 완료한다. 참가자는 분변 칼프로텍틴, 분변 대사물 및 마이크로바이옴의 평가를 위해 첫 아침 대변 샘플을 제공하도록 요청받는다. 혈액 샘플이 기준선 실험실 평가를 위해 수집된다. 참가자는 매일 대변 빈도 및 직장 출혈을 기록할 것이다. 중앙기관 판독 내시경 메이요 하위점수 (EMS) 및 변형된 메이요 점수 및 총 메이요 점수 (MMS/TMS)의 기록을 위해 내시경검사가 수행된다. 3-7의 MMS당 적격 참가자가 시험에 무작위화된다. 또한 무작위화에 적격인 참가자에서 조직학의 중앙기관 판독을 얻는다. 참가자는 스크리닝 기간의 완료를 위해 28일까지 허용된다.
치료 기간: 제1일에, 참가자를 혈청학적 바이오마커 평가를 위해 채혈하고, 첫 아침 FC 대변 샘플을 수집한다. 참가자는 e-다이어리를 사용하여 IBDQ 및 2-성분 메이요 점수 (즉, 대변 빈도 하위점수 및 직장 출혈 하위점수)를 작성하도록 지시받는다. 참가자를 무작위화하고, 현장에서 감독 하에 연구 약물의 제1 용량을 투여한 다음, 해산시켜 가정에서 10주 동안 1일 2회 (BID) 경구로 연구 약물의 자기-투여를 계속하도록 한다. 치료 기간 동안 후속 방문에서의 연구 평가는 메이요 점수 (기준선 및 치료 종료 시에 의사의 전반적 평가에 의함), IBDQ, 실험실 분석을 위한 혈액 샘플의 수집 및 첫 아침 FC 대변 샘플 수집 및 마이크로바이옴 대변 샘플 수집을 포함할 것이다. EMS 및 조직학의 중앙기관 판독을 위한 내시경검사를 EOT 방문 시에 또는 EOT 전 1주 내에 수행한다. 조기에 연구를 중단한 참가자는 대체하지 않는다.
선택된 올리고사카라이드 조성물은 하기 적정 스케줄에 따라 경구로 복용되는, 120 mL 물 중에서의 재구성을 위한 분말 (9 g 사쉐)로서 공급된다:
단계 1:
고용량의 선택된 올리고사카라이드 조성물 (36 g BID로 증량)
제1일 내지 제7일: 선택된 올리고사카라이드 조성물을 9 g BID로 투여함
제8일 내지 제14일: 선택된 올리고사카라이드 조성물을 18 g BID로 투여함
제15일 내지 제70일: 선택된 올리고사카라이드 조성물을 36 g BID로 투여함
단계 2:
저용량의 선택된 올리고사카라이드 조성물 (18 g BID로 증량)
제1일 내지 제7일: 선택된 올리고사카라이드 조성물을 9 g BID로 투여함
제8일 내지 제70일: 선택된 올리고사카라이드 조성물을 18 g BID로 투여함
추적 방문: EOT 방문 2주 후에, 방문 전 5일에 걸쳐 총 3개의 첫 아침 대변 샘플을 수집하고; 혈청학적 바이오마커 평가를 위해 방문 시에 혈액 샘플을 수집한다.
포함 기준은 하기를 포함한다:
스크리닝 전 적어도 3개월 동안 UC로 무작위화할 때 ≥18세 및 ≤75세의 남성 또는 여성임.
사전 동의를 제공할 의향이 있고 제공할 수 있음.
체질량 지수가 ≥17 및 <40 kg/m2임.
3 내지 7의 변형된 메이요 점수 (MMS), 1 또는 2의 EMS 및 출혈 메이요 하위점수 (BMS) >1에 의해 입증된 바와 같은 경도 내지 중등도 UC를 가짐. EMS 1은 30%로 제한되고, MMS 3 또는 4는 EMS가 2가 아닌 한 30%로 제한됨.
무작위화 전 28일 내에 스크리닝 내시경검사가 수행됨.
스크리닝 전 UC 의약:
현재 UC 의약으로 치료되고 있지 않은 경우: 스크리닝 전 28일 동안 어떠한 UC 의약도 복용하지 않았음.
현재 UC 의약으로 치료되고 있는 경우: 스크리닝 전 28일 동안 UC 의약의 안정한 요법을 받음. UC 요법은 부데소니드 > 9 mg 매일 또는 프레드니손 > 10 mg 매일 (또는 등가의 코르티코스테로이드)을 포함할 수 없음. 배제 의약의 전체 목록 참조.
참가자는 연구 지속기간 동안 임의의 현재 보충제 및 비타민의 동일한 요법을 계속 복용할 의향이 있어야 함.
분변 칼프로텍틴 >170 μg/g (스크리닝 V1에서 결정됨)임.
배제 기준은 하기를 포함한다:
크론병, 불확정 질환 또는 현미경적 결장염의 병력.
다른 병인, 예를 들어 성적으로 전파된 감염, 항문 외상, 살모넬라 및/또는 시겔라 감염과 관련된 염증성 장 질환.
UC의 병력은 항문 가장자리 위 15 cm로 제한됨.
스크리닝 전 30일 내에 충란 및/또는 기생충 또는 병원성 대변 배양물에 대한 알려진 대변 시험에서 양성임.
참가자는 클로스트리디움 디피실레에 대한 PCR 대변 시험에서 음성이어야 함. PCR 시험 양성인 참가자는 대변 배양물을 사용하여 1회 재시험될 수 있음.
시험을 방해할 수 있는 알려진 활성 COVID-19 감염 또는 합병증을 갖는 참가자.
스크리닝 V1 전 24주 내에 장과 관련된 주요 복강내 수술 및/또는 연구 동안 계획된 침습 수술/입원/절차 (연구 기간 동안 스케줄링된 하부 내시경검사 포함).
알려지거나 의심되는 독성 거대결장증 또는 소장 박테리아 과도성장을 갖는 참가자.
게실염, 위 우회술, 결장조루술, 결장절제술, 회장낭 항문 문합술 (IPAA) 또는 이전의 장 수술의 과거 의료 병력을 갖는 참가자. 최소 침습 수술 (예컨대 담낭절제술 또는 충수절제술)을 받은 참가자는 임상시험 책임자 (PI) 판단으로 등록될 수 있음.
스크리닝 전 24주 내에 사용된 생물제제 또는 소분자 (예를 들어, 인플릭시맙, 아달리무맙, 골리무맙, 세르톨리주맙, 베돌리주맙, 우스테키누맙, 나탈리주맙, 야누스 키나제/신호 전달자 및 전사 활성화제 [Jak-Stat] 억제제 및 스핑고신-1-포스페이트 [S1P] 효능제).
스크리닝 방문 전에 스테로이드 관장제 또는 좌제 또는 메살라민 관장제 또는 좌제를 중단할 수 없음.
스크리닝 전 마지막 24주 내에 분변 미생물총 이식 (FMT)을 받았음.
대조군 성분 (에리트리톨) 또는 선택된 올리고사카라이드 조성물의 성분 (예를 들어, 갈락토스)을 함유하는 식제품에 대한 알려진 알레르기 또는 불내성; 예를 들어, 갈락토스혈증을 갖는 참가자.
스크리닝 전 7일 내에 임의의 항설사 의약의 사용. 이 참가 기준에 실패한 참가자는 마지막 항설사 의약 사용 ≥7일 후에 재스크리닝될 수 있음.
스크리닝 전 28일 내에 전신 항생제 치료 (경구 또는 주사제)
현재 상승된 알라닌 트랜스아미나제 (ALT) 또는 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST) >2.5배 정상 상한치 (ULN) 및/또는 총 빌리루빈 >1.5배 ULN인 참가자.
PI의 견해에서 참가자의 안전성 또는 준수 또는 연구 결과의 해석에 영향을 미칠 수 있는, 임의의 심혈관, 신장, 간, 내분비, 감염성, 혈액, 종양, 신경-정신 또는 면역-매개 장애의 이전 진단. 참가자의 제2형 당뇨병이 임상연구자의 판단으로 제어되었고, 증후성 고혈당 또는 저혈당 사건에 적용되지 않았으며, 비-인슐린 의약이 이전 12주에 걸쳐 안정하였다면, 이들은 포함인 것으로 간주될 수 있음.
스크리닝 방문 전 28일 또는 5회의 반감기 중 어느 것이든 더 긴 기간 내에 임의의 다른 임상시험용 약물을 사용한 치료.
1차 종점은 하기를 포함한다:
● 환자의 분변 샘플에서 분변 칼프로텍틴 (FC)의 제10주에서의 기준선으로부터의 변화.
2차 종점은 하기를 포함한다:
● 치료-발현성 유해 사건 (TEAE)을 경험한 참가자의 수
● 치료-관련 유해 사건 (TRAE)을 경험한 참가자의 수
● TRAE로 인한 치료 중단을 갖는 참가자의 수
● 다음의 기준선으로부터의 변화: 활력 징후, 안전성 실험실 분석, 신체 검사
탐색적 종점은 하기를 포함한다:
● 총 메이요 점수의 개별 성분 및 성분의 조합을 사용한 완화 상태의 참가자의 비율
● 변형된 메이요 점수 (MMS)의 제10주에서의 기준선으로부터의 변화. MMS는 대변 빈도 하위점수 (SMS), 직장 출혈 하위점수 (BMS) 및 내시경 메이요 하위점수 (EMS)만으로 구성된다.
● 게보스(Geboes) 지수의 제10주에서의 기준선으로부터의 변화
● 32-항목 염증성 장 질환 설문지 (IBDQ-32)에서의 기준선으로부터의 변화
등가물 및 용어
본원에 예시적으로 기재된 개시내용은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에 적합하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본원의 각각의 경우에 용어 "포함하는", "본질적으로 이루어진" 및 "이루어진" 중 임의의 것은 다른 2개의 용어 중 어느 하나로 대체될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 제한이 아니라 설명의 관점에서 사용되고, 이러한 용어 및 표현의 사용에 있어서 제시 및 기재된 특색 또는 그의 부분의 임의의 등가물을 배제하려는 의도는 없으며, 본 개시내용의 범주 내에서 다양한 변형이 가능한 것으로 인식된다. 따라서, 본 개시내용이 바람직한 실시양태에 의해 구체적으로 개시되었지만, 본원에 개시된 임의적인 특색, 개념의 변형 및 변경이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이루어질 수 있고, 이러한 변형 및 변경은 본 개시내용의 범주 내에 있는 것으로 간주된다는 것이 이해되어야 한다.
추가로, 본 개시내용의 특색 또는 측면이 마쿠쉬 군 또는 다른 대안적 군의 관점에서 기재되는 경우에, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시내용이 또한 마쿠쉬 군 또는 다른 군의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 하위군의 관점에서 기재된다는 것을 인식할 것이다.
본 발명을 기재하는 문맥에서 (특히 하기 청구범위의 문맥에서) 단수 용어 및 유사한 지시대상의 사용은, 본원에 달리 나타내지 않거나 문맥에 의해 명백하게 모순되지 않는 한, 단수형 및 복수형 둘 다를 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 용어 "포함하는", "갖는", "비롯한" 및 "함유하는"은 달리 나타내지 않는 한 개방형 용어 (즉, "포함하나 이에 제한되지는 않는"을 의미함)로 해석되어야 한다. 본원에서 값의 범위에 대한 언급은 본원에 달리 나타내지 않는 한, 단지 범위 내에 속하는 각각의 별개의 값을 개별적으로 지칭하는 약칭 방법으로서의 역할을 하는 것으로 의도되고, 각각의 별개의 값은 본원에 개별적으로 언급된 것처럼 명세서에 포함된다. 본원에 기재된 모든 방법은 본원에 달리 나타내지 않거나 문맥에 의해 달리 명백하게 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 및 모든 예 또는 예시적인 어휘 (예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 보다 잘 예시하는 것으로 의도되며, 달리 청구되지 않는 한 본 발명의 범주에 대한 제한을 부과하지 않는다. 본 명세서의 어떠한 용어도 임의의 비-청구된 요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명의 실시양태가 본원에 기재된다. 이들 실시양태의 변형은 상기 설명을 읽으면 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명해질 수 있다.
본 발명자들은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 경우에 이러한 변형을 사용할 것으로 예상하고, 본 발명자들은 본 발명이 본원에 구체적으로 기재된 것과 달리 실시되는 것을 의도한다. 따라서, 본 발명은 적용가능한 법률에 의해 허용되는 바와 같이 본원에 첨부된 청구범위에 인용된 대상의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 더욱이, 본원에 달리 나타내지 않거나 문맥에 의해 달리 명백하게 모순되지 않는 한, 그의 모든 가능한 변형에서 상기 기재된 요소의 임의의 조합이 본 발명에 의해 포괄된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상용 실험만을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
Claims (132)
- 복수의 올리고사카라이드를 포함하는 올리고사카라이드 조성물로서, 복수의 올리고사카라이드는 하기 표의 신호 2, 3 및 11 중 1개 이상을 포함하는 다중도-편집 구배-증강 1H-13C 이종핵 단일 양자 상관관계 (HSQC) NMR 스펙트럼을 특징으로 하며,
여기서 각각의 신호 1-11에 대한 곡선하 면적 (AUC)은 타원형 형상을 사용하여 1H 중심 위치 및 13C 중심 위치에 의해 정의되는 적분 영역의 적분값을 얻음으로써 결정되고, 여기서 스펙트럼은 2% 미만의 단량체를 갖는 올리고사카라이드 조성물의 샘플을 사용하여 생성되는 것인 올리고사카라이드 조성물:
.
- 제1항에 있어서, 신호 2, 3 및 11 중 2 또는 3개를 포함하며, 여기서 신호 2는 0.34-2.01 범위의 AUC (신호 1-11의 총 면적 대비 %)를 갖고, 신호 3은 7.28-25.71 범위의 AUC (신호 1-11의 총 면적 대비 %)를 갖고, 신호 11은 7.93-12.69 범위의 AUC (신호 1-11의 총 면적 대비 %)를 갖는 것인 올리고사카라이드 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 신호 2, 3 및 11 중 2 또는 3개를 포함하며, 여기서 신호 2는 0.68-1.68 범위의 AUC (신호 1-11의 총 면적 대비 %)를 갖고, 신호 3은 10.97-22.02 범위의 AUC (신호 1-11의 총 면적 대비 %)를 갖고, 신호 11은 8.88-11.74 범위의 AUC (신호 1-11의 총 면적 대비 %)를 갖는 것인 올리고사카라이드 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 5를 추가로 포함하며, 여기서 신호 5는 0.23-3.87 범위의 AUC (신호 1-11의 총 면적 대비 %)를 갖는 것인 올리고사카라이드 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 5를 추가로 포함하며, 여기서 신호 5는 0.96-3.14 범위의 AUC (신호 1-11의 총 면적 대비 %)를 갖는 것인 올리고사카라이드 조성물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 1, 4, 6, 7, 8, 9 및 10 중 1개 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)을 추가로 포함하며, 여기서 적어도 신호 1, 4, 6, 7, 8, 9 및 10은 하기와 같이 정의되는 것인 올리고사카라이드 조성물:
.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 1-11 중 적어도 1개가 하기와 같이 정의되는 것인 올리고사카라이드 조성물:
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- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 1-11의 1H 중심 위치 및 13C 중심 위치에 의해 정의되는 적분 영역이 하기와 같이 추가로 정의되는 것인 올리고사카라이드 조성물:
.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, NMR 스펙트럼이 조성물의 샘플에 대해 하기 펄스 시퀀스 다이어그램, 획득 파라미터 및 가공 파라미터를 사용하여 가간섭성 선택을 위해 에코-안티에코 스킴을 사용하는 다중도-편집 구배-증강 1H-13C 이종핵 단일 양자 가간섭성 (HSQC) 실험을 수행함으로써 수득되는 것인 올리고사카라이드 조성물:
펄스 시퀀스 다이어그램 (도 5)
획득 파라미터
1H 반송파 주파수 = 4 ppm
13C 반송파 주파수 = 65 ppm
획득 차원에서의 포인트 수 = 596개
획득 차원에서의 스펙트럼 범위 = 6.23 ppm 내지 1.83 ppm
간접 차원에서의 포인트 수 = 300개의 복합 포인트
간접 차원에서의 스펙트럼 범위 = 120 ppm 내지 10 ppm
재순환 지연 = 1초
1-결합 1H-13C 커플링 상수 = JCH = 146 Hz
스캔 횟수 = 8회
온도 = 298-299 K
용매 = D2O
가공 파라미터
직접 차원에서의 윈도우 함수 = 가우스 확장, 7.66 Hz
간접 차원에서의 윈도우 함수 = 가우스 확장, 26.48 Hz
가공 = 직접 차원에서의 512개의 복합 포인트, 간접 차원에서의 1024개의 복합 포인트. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, NMR 스펙트럼이 올리고사카라이드 조성물의 샘플에 대해 HSQC NMR을 수행함으로써 수득되며, 여기서 샘플은 D2O 중에 용해되는 것인 올리고사카라이드 조성물.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 탈단량체화 절차를 거친 올리고사카라이드 조성물.
- 제11항에 있어서, 탈단량체화 절차가 에탄올 침전인 올리고사카라이드 조성물.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 10% 미만 또는 5% 미만의 단량체를 포함하는 올리고사카라이드 조성물.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 2% 미만의 단량체를 포함하는 올리고사카라이드 조성물.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (I)로 본질적으로 이루어진 복수의 올리고사카라이드를 포함하는 올리고사카라이드 조성물:
여기서 화학식 (I)에서의 R은 독립적으로 수소 및 화학식 (Ia), (Ib), (Ic), (Id)로부터 선택되고:
여기서 화학식 (Ia), (Ib), (Ic) 및 (Id)에서의 R은 독립적으로 상기 화학식 (I)에서와 같이 정의된다. - 복수의 올리고사카라이드를 포함하는 올리고사카라이드 조성물로서, 각각의 올리고사카라이드는 복수의 단량체 라디칼을 포함하고;
복수의 올리고사카라이드는 하기 단량체 라디칼 중 1종 이상을 포함하는 것인 올리고사카라이드 조성물:
(4) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 5.31-7.15 mol%를 나타내는 3-갈락토피라노스 모노라디칼;
(10) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 13.81-19.02 mol%를 나타내는 6-갈락토피라노스 모노라디칼;
(16) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 4.14-5.93 mol%를 나타내는 3,6-갈락토피라노스 및/또는 2,6-갈락토푸라노스 디라디칼; 및/또는
(17) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 1.98-2.99 mol%를 나타내는 2,6-갈락토피라노스 디라디칼. - 제16항에 있어서, 복수의 올리고사카라이드가 라디칼 (4), (10), (16) 및 (17)로부터 선택된 적어도 2, 3 또는 4종의 단량체 라디칼을 포함하는 것인 올리고사카라이드 조성물.
- 제16항 또는 제17항에 있어서, 하기 단량체 라디칼 중 1종 이상을 추가로 포함하는 올리고사카라이드 조성물:
(1) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 6.29-12.84 mol%를 나타내는 t-갈락토푸라노스 모노라디칼;
(2) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 20.45-28.28 mol%를 나타내는 t-갈락토피라노스 모노라디칼;
(3) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 2.73-3.46% mol%를 나타내는 2-갈락토푸라노스 및/또는 2-글루코푸라노스 모노라디칼;
(5) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 3.36-4.28 mol%를 나타내는 3-갈락토푸라노스 모노라디칼;
(6) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 4.12-4.45 mol%를 나타내는 2-갈락토피라노스 모노라디칼;
(7) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 4.65-5.87 mol%를 나타내는 4-갈락토피라노스 및/또는 5-갈락토푸라노스 모노라디칼;
(8) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.43-0.82 mol%를 나타내는 2,3-갈락토푸라노스 디라디칼;
(9) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 2.92-9.58 mol%를 나타내는 6-갈락토푸라노스 모노라디칼;
(11) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 1.41-1.99 mol%를 나타내는 3,4-갈락토피라노스 및/또는 3,5-갈락토푸라노스 및/또는 2,3-갈락토피라노스 디라디칼;
(12) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.88-1.21 mol%를 나타내는 2,4-글루코피라노스 및/또는 2,5-글루코푸라노스 및/또는 2,4-갈락토피라노스 및/또는 2,5-갈락토푸라노스 디라디칼;
(13) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.14-0.28 mol%를 나타내는 2,3,4-갈락토피라노스 및/또는 2,3,5-갈락토푸라노스 트리라디칼;
(14) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 1.69-2.27 mol%를 나타내는 3,6-갈락토푸라노스 디라디칼;
(15) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 3.93-5.26 mol%를 나타내는 4,6-갈락토피라노스 및/또는 5,6-갈락토푸라노스 디라디칼;
(18) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.91-1.68 mol%를 나타내는 3,4,6-갈락토피라노스 및/또는 3,5,6-갈락토푸라노스 및/또는 2,3,6-갈락토푸라노스 트리라디칼;
(19) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.01-3.10 mol%를 나타내는 2,3,6-갈락토피라노스 및/또는 2,4,6-갈락토피라노스 및/또는 2,5,6-갈락토푸라노스 트리라디칼; 및/또는
(20) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.01-0.28 mol%를 나타내는 2,3,4,6-갈락토피라노스 및/또는 2,3,5,6-갈락토푸라노스 쿼드라디칼. - 제B3항에 있어서, 복수의 올리고사카라이드가 라디칼 (1)-(3), (5)-(9), (11)-(15) 및 (18)-(20)으로부터 선택된 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16종의 단량체 라디칼을 포함하는 것인 올리고사카라이드 조성물.
- 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 올리고사카라이드가 라디칼 (1)-(20)으로부터 선택된 각각의 단량체 라디칼을 포함하는 것인 올리고사카라이드 조성물.
- 복수의 올리고사카라이드를 포함하는 올리고사카라이드 조성물로서, 각각의 올리고사카라이드는 복수의 단량체 라디칼을 포함하고;
복수의 올리고사카라이드는 하기 단량체 라디칼 중 1종 이상을 포함하는 것인 올리고사카라이드 조성물:
(4) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 4.79-7.75 mol%를 나타내는 3-갈락토피라노스 모노라디칼;
(10) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 11.64-22.24 mol%를 나타내는 6-갈락토피라노스 모노라디칼;
(16) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 2.20-7.06 mol%를 나타내는 3,6-갈락토피라노스 및/또는 2,6-갈락토푸라노스 디라디칼; 및/또는
(17) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.89-3.63 mol%를 나타내는 2,6-갈락토피라노스 디라디칼. - 제21항에 있어서, 복수의 올리고사카라이드가 라디칼 (4), (10), (16) 및 (17)로부터 선택된 적어도 2, 3 또는 4종의 단량체 라디칼을 포함하는 것인 올리고사카라이드 조성물.
- 제21항 또는 제22항에 있어서, 하기 단량체 라디칼 중 1종 이상을 추가로 포함하는 올리고사카라이드 조성물:
(1) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 2.52-15.21 mol%를 나타내는 t-갈락토푸라노스 모노라디칼;
(2) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 13.49-40.02 mol%를 나타내는 t-갈락토피라노스 모노라디칼;
(3) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.64%-4.82 mol%를 나타내는 2-갈락토푸라노스 및/또는 2-글루코푸라노스 모노라디칼;
(5) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 2.22-5.03 mol%를 나타내는 3-갈락토푸라노스 모노라디칼;
(6) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 3.10-5.13 mol%를 나타내는 2-갈락토피라노스 모노라디칼;
(7) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 3.99-6.87 mol%를 나타내는 4-갈락토피라노스 및/또는 5-갈락토푸라노스 모노라디칼;
(8) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.00-1.93% mol%를 나타내는 2,3-갈락토푸라노스 디라디칼;
(9) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 1.52-10.39 mol%를 나타내는 6-갈락토푸라노스 모노라디칼;
(11) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.68-3.15 mol%를 나타내는 3,4-갈락토피라노스 및/또는 3,5-갈락토푸라노스 및/또는 2,3-갈락토피라노스 디라디칼;
(12) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.49-1.45 mol%를 나타내는 2,4-글루코피라노스 및/또는 2,5-글루코푸라노스 및/또는 2,4-갈락토피라노스 및/또는 2,5-갈락토푸라노스 디라디칼;
(13) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.00-0.67 mol%를 나타내는 2,3,4-갈락토피라노스 및/또는 2,3,5-갈락토푸라노스 트리라디칼;
(14) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.41-3.10 mol%를 나타내는 3,6-갈락토푸라노스 디라디칼;
(15) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 3.60-5.65 mol%를 나타내는 4,6-갈락토피라노스 및/또는 5,6-갈락토푸라노스 디라디칼;
(18) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.68-1.85 mol%를 나타내는 3,4,6-갈락토피라노스 및/또는 3,5,6-갈락토푸라노스 및/또는 2,3,6-갈락토푸라노스 트리라디칼;
(19) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.00-3.51 mol%를 나타내는 2,3,6-갈락토피라노스 및/또는 2,4,6-갈락토피라노스 및/또는 2,5,6-갈락토푸라노스 트리라디칼; 및/또는
(20) 복수의 올리고사카라이드에서 단량체 라디칼의 0.00-0.35 mol%를 나타내는 2,3,4,6-갈락토피라노스 및/또는 2,3,5,6-갈락토푸라노스 쿼드라디칼. - 제23항에 있어서, 복수의 올리고사카라이드가 라디칼 (1)-(3), (5)-(9), (11)-(15) 및 (18)-(20)으로부터 선택된 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16종의 단량체 라디칼을 포함하는 것인 올리고사카라이드 조성물.
- 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 올리고사카라이드가 라디칼 (1)-(20)으로부터 선택된 각각의 단량체 라디칼을 포함하는 것인 올리고사카라이드 조성물.
- 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 단량체 라디칼의 몰 백분율이 퍼메틸화 검정을 사용하여 결정되며, 여기서 퍼메틸화 검정은 기체 크로마토그래피-질량 분광분석법 (GC-MS) 분석을 포함하는 것인 올리고사카라이드 조성물.
- 제16항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (I)로 본질적으로 이루어진 복수의 올리고사카라이드를 포함하는 올리고사카라이드 조성물:
여기서 화학식 (I)에서의 R은 독립적으로 수소 및 화학식 (Ia), (Ib), (Ic), (Id)로부터 선택되고:
여기서 화학식 (Ia), (Ib), (Ic) 및 (Id)에서의 R은 독립적으로 상기 화학식 (I)에서와 같이 정의된다. - 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고사카라이드 조성물의 평균 중합도 (DP)가 약 DP11 내지 약 DP19인 올리고사카라이드 조성물.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고사카라이드 조성물의 평균 중합도 (DP)가 약 DP13 내지 약 DP17인 올리고사카라이드 조성물.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 87-95%의 DP2+를 포함하는 올리고사카라이드 조성물.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 89-93%의 DP2+를 포함하는 올리고사카라이드 조성물.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 58-94%의 총 식이성 섬유 (건조 기준)를 포함하는 올리고사카라이드 조성물.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 65-87%의 총 식이성 섬유 (건조 기준)를 포함하는 올리고사카라이드 조성물.
- 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (I)을 포함하는 복수의 올리고사카라이드를 포함하는 올리고사카라이드 조성물로서,
여기서 화학식 (I)에서의 R은 독립적으로 수소 및 화학식 (Ia), (Ib), (Ic), (Id)로부터 선택되고:
여기서 화학식 (Ia), (Ib), (Ic) 및 (Id)에서의 R은 독립적으로 상기 화학식 (I)에 정의된 바와 같고;
여기서 올리고사카라이드 조성물은
(a) 양으로 하전된 수소 이온을 포함하는 산 촉매 하에 갈락토스 단량체를 포함하는 반응 혼합물을 형성하는 단계; 및
(b) 반응 혼합물을 그의 비점에서 유지하기에 충분한 열을 반응 혼합물에 전달함으로써 반응 혼합물에서의 산 촉매된 올리고사카라이드 형성을 촉진하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 올리고사카라이드 조성물. - 제34항에 있어서, 단계 (b)가 반응 혼합물에 양으로 하전된 수소 이온을 포함하는 산 촉매를, 총 갈락토스 단량체 함량 대비 양으로 하전된 수소 이온의 몰비가 적절한 범위 내에 있도록 하는 양으로 로딩하는 것을 포함하는 것인 조성물.
- 제34항 또는 제35항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)가 동시에 이루어지는 것인 조성물.
- 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)가 반응 혼합물을 교반 조건 하에 100℃ 내지 160℃ 범위의 온도로 가열하는 것을 포함하는 것인 조성물.
- 제37항에 있어서, 단계 (a)가 반응 혼합물을 교반 조건 하에 128℃ 내지 140℃ 범위의 온도로 가열하는 것을 포함하는 것인 조성물.
- 제38항에 있어서, 단계 (a)가 반응 혼합물을 교반 조건 하에 130℃ 내지 140℃ 범위의 온도로 가열하는 것을 포함하는 것인 조성물.
- 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)가 균질성 및 균일한 열 전달을 달성하기에 적합한 조건 하에 온도를 (예를 들어, 실온으로부터) 약 136℃로 점차 증가시키는 것을 포함하는 것인 조성물.
- 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 반응 혼합물을 대기압에서 또는 진공 하에, 128℃ 내지 140℃ 범위의 온도에서, 산 촉매된 올리고사카라이드 조성물 형성을 촉진하는 조건 하에, 올리고사카라이드 조성물 중 갈락토스 단량체의 중량 퍼센트가 5-13% 범위일 때까지 유지하는 것을 포함하는 것인 조성물.
- 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 반응 혼합물을 대기압에서 또는 진공 하에, 130℃ 내지 140℃ 범위의 온도에서, 산 촉매된 올리고사카라이드 조성물 형성을 촉진하는 조건 하에, 올리고사카라이드 조성물 중 갈락토스 단량체의 중량 퍼센트가 5-13% 범위일 때까지 유지하는 것을 포함하는 것인 조성물.
- 제34항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 반응 혼합물을 대기압에서 또는 진공 하에, 130℃ 내지 140℃ 범위의 온도에서, 산 촉매된 올리고사카라이드 조성물 형성을 촉진하는 조건 하에, 올리고사카라이드 조성물 중 갈락토스 단량체의 중량 퍼센트가 7-11% 범위일 때까지 유지하는 것을 포함하는 것인 조성물.
- 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 반응 혼합물을 대기압에서 또는 진공 하에, 약 136℃의 온도에서, 산 촉매된 올리고사카라이드 조성물 형성을 촉진하는 조건 하에, 올리고사카라이드 조성물 중 갈락토스 단량체의 중량 퍼센트가 5-13% 범위일 때까지 유지하는 것을 포함하는 것인 조성물.
- 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 반응 혼합물을 대기압에서 또는 진공 하에, 약 136℃의 온도에서, 산 촉매된 올리고사카라이드 조성물 형성을 촉진하는 조건 하에, 올리고사카라이드 조성물 중 갈락토스 단량체의 중량 퍼센트가 7-11% 범위일 때까지 유지하는 것을 포함하는 것인 조성물.
- 제34항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 산 촉매가 표 1에 따른 1종 이상의 물리적 및 화학적 특성을 갖는 강산 양이온 교환 수지이고/거나 촉매가 > 3.0 mmol/g의 술폰산 모이어티 및 < 1.0 mmol/그램의 양이온성 모이어티를 포함하는 것인 조성물.
- 제46항에 있어서, 촉매가 45-50 중량 퍼센트의 공칭 수분 함량을 갖는 것인 조성물.
- 제34항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 산 촉매가 가용성 촉매인 조성물.
- 제48항에 있어서, 가용성 촉매가 유기 산인 조성물.
- 제48항 또는 제49항에 있어서, 가용성 촉매가 약한 유기 산인 조성물.
- 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 촉매가 시트르산인 조성물.
- 제34항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이
(c) 반응 혼합물을, 예를 들어 물을 사용하여, 반응 혼합물의 온도가 55℃ 내지 95℃ 범위 (예를 들어, 85℃, 90℃)의 온도로 되도록 하면서 켄칭하는 단계
를 추가로 포함하는 것인 조성물. - 제34항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이
(c) 반응 혼합물을, 예를 들어 물을 사용하여, 반응 혼합물의 온도가 20℃ 내지 40℃ 범위 (예를 들어, 20℃, 25℃)의 온도로 되도록 하면서 켄칭하는 단계
를 추가로 포함하는 것인 조성물. - 제52항에 있어서, 방법이
(d) 산 촉매로부터 올리고사카라이드 조성물을 분리하는 단계
를 추가로 포함하는 것인 조성물. - 제54항에 있어서, (d)에서의 상기 분리가 여과에 의해 촉매를 제거하는 것을 포함하는 것인 조성물.
- 제54항 또는 제55항에 있어서, (d)가 여과 전에 반응 혼합물을 약 100℃ 미만으로 냉각시키는 것을 포함하는 것인 조성물.
- 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이
(e) (d)의 올리고사카라이드 조성물을 물로 약 40-55 중량 퍼센트, 임의로 45-55 중량 퍼센트의 농도로 희석하는 단계;
(f) 희석된 조성물을 양이온 교환 수지에 통과시키는 단계;
(g) 희석된 조성물을 탈색 중합체 수지에 통과시키는 단계; 및/또는
(h) 희석된 조성물을 음이온 교환 수지에 통과시키는 단계
를 추가로 포함하며, 여기서 각각의 (f), (g) 및 (h)는 임의의 순서로 1회 이상 수행될 수 있는 것인 조성물. - 대상체에서 염증을 감소시키는 방법으로서, 대상체의 위장관에 유효량의 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 따른 올리고사카라이드 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
- 제58항에 있어서, 대상체의 위장관에서 염증을 감소시키는 방법.
- 염증성 및 면역 장애를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체의 위장관에 유효량의 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 따른 올리고사카라이드 조성물을 투여하여, 이에 의해 대상체를 치료하는 것을 포함하는 방법.
- 염증성 및 면역 장애를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체의 위장관에 유효량의 올리고사카라이드 조성물을 투여하며, 여기서 올리고사카라이드 조성물은 5-20의 평균 중합도를 갖고 화학식 (I)로부터 선택된 복수의 올리고사카라이드를 포함하고:
여기서 화학식 (I)에서의 R은 독립적으로 수소 및 화학식 (Ia), (Ib), (Ic), (Id)로부터 선택되고:
여기서 화학식 (Ia), (Ib), (Ic) 및 (Id)에서의 R은 독립적으로 상기 화학식 (I)에서와 같이 정의되고;
이에 의해 대상체를 치료하는 것을 포함하는 방법. - 제60항 또는 제61항에 있어서, 염증성 및 면역 장애가 만성 염증성 장애인 방법.
- 제62항에 있어서, 만성 염증성 장애가 염증성 장 질환인 방법.
- 제63항에 있어서, 염증성 장 질환이 궤양성 결장염인 방법.
- 제64항에 있어서, 염증성 장 질환이 크론병인 방법.
- 제64항에 있어서, 염증성 장 질환이 육아종성 결장염인 방법.
- 제63항에 있어서, 염증성 장 질환이 불확정 결장염인 방법.
- 제63항에 있어서, 염증성 장 질환이 전환 결장염인 방법.
- 제63항에 있어서, 염증성 장 질환이 낭염인 방법.
- 제63항에 있어서, 염증성 장 질환이 베체트병인 방법.
- 제63항에 있어서, 염증성 장 질환이 현미경적 결장염인 방법.
- 제63항에 있어서, 염증성 장 질환이 게실증-연관 결장염인 방법.
- 제63항에 있어서, 염증성 장 질환이 콜라겐성 결장염인 방법.
- 제63항에 있어서, 염증성 장 질환이 림프구성 결장염인 방법.
- 제63항에 있어서, 염증성 장 질환이 소아-발병 염증성 장 질환인 방법.
- 염증성 장 질환을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체의 위장관에 유효량의 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 따른 올리고사카라이드 조성물을 투여하여, 이에 의해 대상체를 치료하는 것을 포함하는 방법.
- 염증성 장 질환을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체의 위장관에 유효량의 올리고사카라이드 조성물을 투여하며, 여기서 올리고사카라이드 조성물은 5-20의 평균 중합도를 갖고 화학식 (I)로부터 선택된 복수의 올리고사카라이드를 포함하고:
여기서 화학식 (I)에서의 R은 독립적으로 수소 및 화학식 (Ia), (Ib), (Ic), (Id)로부터 선택되고:
여기서 화학식 (Ia), (Ib), (Ic) 및 (Id)에서의 R은 독립적으로 상기 화학식 (I)에서와 같이 정의되고;
이에 의해 대상체를 치료하는 것을 포함하는 방법. - 제77항에 있어서, 염증성 장 질환이 궤양성 결장염인 방법.
- 제77항에 있어서, 염증성 장 질환이 크론병인 방법.
- 제77항에 있어서, 염증성 장 질환이 육아종성 결장염인 방법.
- 제77항에 있어서, 염증성 장 질환이 불확정 결장염인 방법.
- 제77항에 있어서, 염증성 장 질환이 전환 결장염인 방법.
- 제77항에 있어서, 염증성 장 질환이 낭염인 방법.
- 제77항에 있어서, 염증성 장 질환이 베체트병인 방법.
- 제77항에 있어서, 염증성 장 질환이 현미경적 결장염인 방법.
- 제77항에 있어서, 염증성 장 질환이 게실증-연관 결장염인 방법.
- 제77항에 있어서, 염증성 장 질환이 콜라겐성 결장염인 방법.
- 제77항에 있어서, 염증성 장 질환이 림프구성 결장염인 방법.
- 제77항에 있어서, 염증성 장 질환이 소아-발병 염증성 장 질환인 방법.
- 대상체에서 단쇄 지방산의 상대 또는 절대 존재비를 증가시키는 방법으로서, 대상체의 위장관에 유효량의 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 따른 올리고사카라이드 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
- 제90항에 있어서, 단쇄 지방산의 상대 또는 절대 존재비가 기준선 측정치 (예를 들어, 여기서 기준선 측정치는 치료 전에 결정됨)와 비교하여 적어도 5%, 10%, 20% 또는 30%만큼 증가되는 것인 방법.
- 제90항 또는 제91항에 있어서, 단쇄 지방산이 부티레이트, 아세테이트 및/또는 프로피오네이트인 방법.
- 대상체에서 염증유발 및/또는 병원성 박테리아의 상대 또는 절대 존재비를 감소시키는 방법으로서, 대상체의 위장관에 유효량의 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 따른 올리고사카라이드 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
- 제93항에 있어서, 염증유발 및/또는 병원성 박테리아가 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 및/또는 루미노코카세아에(Ruminococcaceae)인 방법.
- 대상체에서 공생 박테리아의 상대 또는 절대 존재비를 증가시키는 방법으로서, 대상체의 위장관에 유효량의 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 따른 올리고사카라이드 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
- 제95항에 있어서, 공생 박테리아가 파라박테로이데스(Parabacteroides) 및/또는 박테로이데스(Bacteroides)인 방법.
- 제58항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간 대상체인 방법.
- 제97항에 있어서, 대상체가 신생아 (조산 신생아, 만삭 신생아), 1세 이하의 영유아, 어린 아동 (예를 들어, 1세 내지 12세), 청소년 (예를 들어, 13-19세), 성인 (예를 들어, 20-64세) 또는 노인 (예를 들어, 65세 이상)인 방법.
- 제58항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 장 (예를 들어, 대장)에 올리고사카라이드 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
- 제58항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고사카라이드 조성물이 대상체에게 자기-투여되는 것인 방법.
- 제58항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고사카라이드 조성물이 경구 전달을 위한 제약 조성물로서 제제화되는 것인 방법.
- 제58항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고사카라이드 조성물이 대상체에게 경구로 투여되는 것인 방법.
- 제58항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고사카라이드 조성물이 대상체에게 1일에 1회 또는 1일에 2회 투여되는 것인 방법.
- 제58항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체 (예를 들어, 대상체의 위장관)에서 총 단쇄 지방산의 존재비 또는 농도를 증가시키는 방법.
- 제58항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체 (예를 들어, 대상체의 위장관)에서 부티레이트의 존재비 또는 농도를 증가시키는 방법.
- 제58항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체 (예를 들어, 대상체의 위장관)에서 프로피오네이트의 존재비 또는 농도를 증가시키는 방법.
- 제58항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체 (예를 들어, 대상체의 위장관)에서 아세테이트의 존재비 또는 농도를 증가시키는 방법.
- 제104항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 총 SCFA의 존재비가 기준선 측정치 (예를 들어, 여기서 기준선 측정치는 치료 전에 결정됨)에 비해 적어도 5%, 10%, 20% 또는 30%만큼 증가되는 것인 방법.
- 제104항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 부티레이트, 프로피오네이트 및 아세테이트 중 적어도 1종의 존재비가 기준선 측정치 (예를 들어, 여기서 기준선 측정치는 치료 전에 결정됨)에 비해 적어도 5%, 10%, 20% 또는 30%만큼 증가되는 것인 방법.
- 제58항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 위장관의 마이크로바이옴 내에서 공생 박테리아의 성장을 촉진하는 (예를 들어, 그의 상대 존재비를 증가시키는) 방법.
- 제58항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 위장관의 마이크로바이옴 내에서 파라박테로이데스 및 박테로이데스의 성장을 촉진하는 (예를 들어, 그의 상대 존재비를 증가시키는) 방법.
- 제58항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 위장관의 마이크로바이옴 내에서 염증유발 및/또는 병원성 박테리아의 존재비의 감소를 유발하는 방법.
- 제58항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 위장관의 마이크로바이옴 내에서 염증유발 엔테로박테리아세아에의 존재비의 감소를 유발하는 방법.
- 제58항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고사카라이드 조성물의 투여가 기준선 측정치에 비해, 대상체에 속하는 대변/분변 샘플에서 분변 칼프로텍틴, 분변 리포칼린 및/또는 분변 락토페린의 수준의 감소를 유발하는 것인 방법.
- 제114항에 있어서, 분변 칼프로텍틴의 수준이 기준선 측정치에 비해 적어도 50%만큼 감소되는 것인 방법.
- 제114항에 있어서, 분변 칼프로텍틴의 수준이 기준선 측정치에 비해 적어도 65%만큼 감소되는 것인 방법.
- 제114항에 있어서, 분변 락토페린의 수준이 기준선 측정치에 비해 적어도 50%만큼 감소되는 것인 방법.
- 제58항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 위장관의 마이크로바이옴 내에서 부착-침습성 이. 콜라이와 연관된 유전자의 고갈을 유발하는 방법.
- 제118항에 있어서, 부착-침습성 이. 콜라이와 연관된 유전자가 fimH, ompA 및 ompC인 방법.
- 제58항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고사카라이드 조성물이 적어도 20, 30, 40 또는 50일 동안 투여되는 것인 방법.
- 제58항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고사카라이드 조성물이 56일 또는 10주 동안 투여되는 것인 방법.
- 제58항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고사카라이드 조성물이 20-100일, 임의로 50-75일 동안 투여되는 것인 방법.
- 제58항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 궤양성 결장염을 가지며, 올리고사카라이드 조성물의 투여가 기준선 측정치에 비해 궤양성 결장염 질환 활성의 감소를 유발하는 것인 방법.
- 제123항에 있어서, 궤양성 결장염 질환 활성의 감소가 간이 임상 결장염 활성 지수 (SCCAI) 복합 점수를 사용하여 측정되는 것인 방법.
- 제58항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 표준 관리 치료를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제125항에 있어서, 표준 관리 치료가 5-ASA (메살라민), 아자티오프린, 베돌리주맙, 인플릭시맙 또는 아달리무맙인 방법.
- 대상체, 임의로 염증성 질환을 나타내는 대상체에서 염증과 연관된 1종 이상의 바이오마커 (예를 들어, 분변 칼프로텍틴, 분변 리포칼린 및/또는 분변 락토페린)의 수준을 감소시키는 방법으로서, 대상체에게 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항의 올리고사카라이드 조성물을 기준선 측정치에 비해 1종 이상의 바이오마커의 수준을 감소시키는 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
- 제127항에 있어서, 1종 이상의 바이오마커의 수준이 대상체로부터의 분변/대변 샘플에서 측정되는 것인 방법.
- 대상체, 임의로 염증성 질환을 나타내는 대상체에서 1종 이상의 유해균 (예를 들어, 염증유발 박테리아 분류군, 예컨대 엔테로박테리아세아에)의 존재비를 감소시키는 방법으로서, 대상체에게 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항의 올리고사카라이드 조성물을 1종 이상의 유해균의 존재비를 감소시키는 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
- 제129항에 있어서, 1종 이상의 유해균의 존재비가 대상체로부터의 분변/대변 샘플에서 측정되는 것인 방법.
- 대상체, 임의로 염증성 질환을 나타내는 대상체에서 1종 이상의 공생균 분류군 (예를 들어, 파라박테로이데스 및 박테로이데스)의 존재비를 증가시키는 방법으로서, 대상체에게 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항의 올리고사카라이드 조성물을 1종 이상의 공생균 분류군의 존재비를 증가시키는 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
- 제131항에 있어서, 1종 이상의 공생균 분류군의 존재비가 대상체로부터의 분변/대변 샘플에서 측정되는 것인 방법.
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