CN116482386A - 检测糖尿病肾病的蛋白标志物及其应用、试剂或试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了检测糖尿病肾病的蛋白标志物及其应用、试剂或试剂盒。所述蛋白标志物选自下列蛋白中的任意一种或两种:尿液迁移体内含的蛋白酪氨酸磷酸酶受体S、尿液外泌体内含的细胞骨架相关蛋白4。蛋白标志物可有效区分糖尿病肾病与健康人以及糖尿病肾病与糖尿病患者。
Description
技术领域
本发明涉及医学诊断领域,具体涉及糖尿病肾病的蛋白标志物及其应用、试剂或试剂盒。
背景技术
糖尿病肾病是糖尿病最主要的并发症之一,它不仅是导致终末期肾脏病的首要因素,也是糖尿病患者死亡的主要原因之一。糖尿病肾病早期无明显症状,且目前也无方便快捷准确的诊断方法,因此在日常检测中极容易被忽略。糖尿病肾病患者往往一旦被确诊即已经进入不可逆状态,只能进行有限的干预性治疗,肾脏依然会持续恶化,直至进展为终末期肾病,严重影响患者生活质量、大幅增加经济负担甚至导致寿命缩短。研究表明,若糖尿病肾病患者能够在早期筛查过程中得以确认并进行有效的治疗,糖尿病肾病患者终末期肾病的发生风险和死亡风险都会显著降低。因此,亟需研发可用于糖尿病肾病早期诊断的方便快捷准确的方法。
在糖尿病患者体内,足细胞会因为长期处于高血糖等恶劣环境中会出现密度和数量减少、足突增宽、足细胞脱落等改变,且可从尿中丢失,继而导致糖尿病肾病的发生。足细胞损伤是糖尿病肾病发生发展的早期事件,因此检测尿液中的足细胞可能是糖尿病肾病早期诊断最有效的方法之一。然而,囿于在糖尿病肾病早期,脱落的足细胞很少且很难捕获,再加上其它肾脏损伤也会导致足细胞脱落,因此在应用尿液中的足细胞作为糖尿病肾病早期诊断的过程中面临极大的困难。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供糖尿病肾病的蛋白标志物及其应用。
根据本发明的一个方面,提供了检测糖尿病肾病的蛋白标志物,所述蛋白标志物选自下列蛋白中的任意一种或两种:尿液迁移体内含的蛋白酪氨酸磷酸酶受体S(PTPRS)、尿液外泌体内含的细胞骨架相关蛋白4(CKAP4)。
根据本发明的第二个方面,提供了蛋白标志物的检测试剂在制备糖尿病肾病诊断或辅助诊断的试剂、试纸条、试剂盒或生物芯片中的应用,所述分子标记物包括PTPRS蛋白、CKAP4蛋白。其中,所述检测试剂检测尿液迁移体中的PTPRS蛋白的量和/或尿液外泌体中的CKAP4蛋白的量。
根据本发明的第三个方面,提供了糖尿病肾病诊断或辅助诊断的试剂、试纸条、试剂盒或生物芯片,包含检测PTPRS蛋白和/或CKAP4蛋白的检测试剂。所述检测试剂包括PTPRS和/或CKAP4的单克隆抗体或多克隆抗体。
可通过选自蛋白免疫印迹法、酶联免疫吸附法、放射免疫分析法、放射免疫扩散法、双向扩散法、火箭免疫电泳法、组织免疫染色法、免疫沉淀分析法、补体结合分析法、流式细胞分析法以及蛋白质芯片法中的一种或多种方法检测PTPRS蛋白和/或CKAP4蛋白的量。
所述的检测试剂盒可包括从样品中分离迁移体和/或外泌体的试剂。其中,所述分离迁移体和/或外泌体的试剂包括偶联有或结合有凝集素的固相载体。所述固相载体可为表面经高分子材料包埋的复合磁珠,所述复合磁珠包括:葡聚糖磁珠、琼脂糖磁珠、树脂或环氧树脂、聚苯乙烯磁珠复合磁珠中的任一种或者两种及以上。所述的凝集素可选自下组:麦胚素(WGA)、刀豆凝集素(ConA)、花生凝集素(PNA)或其组合。
本发明通过大规模筛选和验证,鉴定到糖尿病肾病患者尿液外泌体中特异性表达的CKAP4和在迁移体中特异性表达的PTPRS,作为糖尿病肾病诊断的标志物。该标志物可有效区分糖尿病肾病与健康人以及糖尿病肾病与糖尿病患者。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他附图。
图1为足细胞(HPC)在正常(con)、以及高糖(HG)和嘌呤霉素(PAN)刺激后分泌的迁移体(exosome)和外泌体(migrasome)蛋白质谱热图。
图2来自健康人(Normal)、膜性肾病患者(MN)、IgA患者(IgA)、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)患者和糖尿病肾病(DN)患者尿液迁移体(图2中的A,mig)和外泌体(图2中的B,exo)中差异表达的蛋白。
图3用免疫荧光检测PTPRS(图3中的A)和CKAP4(图3中的B)在健康人(Normal)和糖尿病肾病(DN)患者组织样本中的表达及相对表达量。
图4利用免疫印迹(western blotting)检测健康人(Normal)和糖尿病肾病(DN)患者中WGA偶联的磁珠捕获尿液中的迁移体中的PTPRS(图4中的A)和外泌体中的CKAP4(图4中的B)。
图5正常人、糖尿病人和糖尿病肾病(DN)患者中迁移体PTPRS和外泌体CKAP4的含量及ROC曲线,A:迁移体中PTPRS蛋白的含量,B:迁移体PTPRS区分糖尿病肾病与健康人及糖尿病肾病与糖尿病患者的ROC曲线,C:外泌体中CKAP4蛋白的含量,D:外泌体CKAP4区分糖尿病肾病与健康人及及糖尿病肾病与糖尿病患者的ROC曲线。
图6迁移体PTPRS和外泌体CKAP4联合使用区分糖尿病肾病与健康人(图6中的A)及糖尿病肾病与糖尿病患者(图6中的B)的ROC曲线。
实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本文中使用的术语“样品”或“样本”是指与受试者特异性相关联的材料,从其中可以确定、计算或推断出与受试者有关的特定信息。样本可以全部或部分由来自受试者的生物材料构成。
术语“蛋白质标志物”和“生物标志物”在本文中可互换使用。应当理解,在本文所述的诊断方法中,蛋白质标记不一定需要蛋白质的完整氨基酸序列,在许多情况下蛋白质标记由足以用作代表性标记的保守部分或片段组成,这些保守部分或片段足以作为抗体识别表位。
本文使用的术语“蛋白表达量”、“蛋白量”是通过使用特异性结合相应标志蛋白的抗体检测抗原—抗体复合物,确认受试者的生物样品中的标志蛋白的存在和表达水平以评估肾功能的过程。具体分析方法的示例包括但不限于蛋白免疫印迹法、酶联免疫吸附法、放射免疫分析法、放射免疫扩散法、双向扩散法、火箭免疫电泳法、组织免疫染色法、免疫沉淀分析法、补体结合分析法、流式细胞分析法以及蛋白质芯片法等。
本文使用的术语“抗体”,作为本领域中使用的已知术语,是指针对抗原结构域的特定蛋白分子。为了本发明的目的,抗体是指特异性结合本发明的生物标志蛋白的抗体,并且这种抗体可以根据常规方法由标志基因编码的蛋白制备,所述标志基因根据常规方法克隆表达载体中的每个基因获得。这里,抗体还包括能够由蛋白制成的部分肽,并且本发明的部分肽包括至少7个氨基酸,优选9个氨基酸,更优选12个或更多个氨基酸。本发明的抗体的类型没有特别限制,并且抗体包括所有免疫球蛋白抗体,以及多克隆抗体、单克隆抗体或其部分,只要其具有抗原结合能力即可。此外,本发明的抗体包括特异性抗体,例如人源化抗体。用于检测本发明的抗体包括具有两条全长轻链和两条全长重链的完整形式,以及抗体分子的功能片段。抗体分子的功能片段是指至少具有抗原结合功能的片段,并且包括Fab、F(ab')、F(ab')2和Fv。
本文使用的术语“迁移体(migrasome)”,是在细胞定向迁移过程中由细胞尾部的收缩丝产生的直径为0.5~2um的单层膜囊泡结构。迁移体含有大量的诸如核酸、蛋白质、脂肪等在内的生物活性物质,在细胞间通讯过程中发挥了重要的作用,参与并调控了多种生理和病理活动。迁移体存在于血液和多种体液中,例如血清、尿液等。一些血液或体液中的迁移体含量与某些疾病(如糖尿病肾病等)密切相关。
本文使用的术语“凝集素”,是指能够特异性识别糖基化修饰蛋白。凝集素是一类能够结合多糖基团的蛋白质,主要分布在细胞外基质中。细胞外基质中分布大量的糖蛋白和多糖基团,凝集素能够通过结合多糖基团来介导细胞之间的稳固连接。优选的凝集素包括植物来源凝集素,如刀豆素A(Concocnvalina,ConA)、麦胚素(Wheat germ agglutinin,WGA)、花生凝集素(Peanut agglutinin,PNA)和大豆凝集素(Soybean agglutinin,SBA)等,能够高效地结合多糖基团。在本发明中,一类优选的凝集素为带有第一可检测标记(尤其是荧光标记)的凝集素。与抗体相比,本发明的带有可检测标记(尤其是荧光标记)的凝集素,不仅具有更高的稳定性和抗干扰性能,还出乎意料地具有针对迁移体的高特异性的捕获能力,可以更有利地特异性捕获各种不同样品中的不同类型的迁移体。
本文使用的术语“固相载体”,是指表面经高分子材料包埋的复合磁珠,主要包括:葡聚糖磁珠、琼脂糖磁珠、树脂或环氧树脂、聚苯乙烯磁珠等复合磁珠中的任意一种,或者两种及以上的磁性载体混合物,所述固体载体粒径分布范围为1um-200um,优选为10um-200um,更进一步优选为30um-150um。在固相载体的生产中,同一批次生产固相载体的粒径也不是均一的,因此固相载体的粒径描述通常既可以采用平均粒径的方式,也可以采用本发明中粒径分布范围的方式。
流式细胞术(flow cytometry,FCM)在科学研究中具有同时在单一样品中检测和分析标记多种分子的特点,是一种高通量的在功能水平上对单列细胞或其它粒子进行逐个、多参数、快速、准确定量分析和分选的检测技术,该技术具有检测速度快、检测参数多、采集数据信息量大、分析全面、分选纯度高以及方法灵活等特性。目前最高分选速度已达到每秒钟3万个细胞。该技术的迅速发展,主要取决于荧光染料强大特性,特别是不同的荧光标记或是不同强度的荧光都可以在流式细胞仪中分辨开。这种独特的性质,提示可以使用流式细胞仪在同一样品中同时检测多个不同标记的指标,从而达到快速和方便的检测目的。流式细胞仪主要用于细胞的表面标记检测与细胞分群,若要检测某一分子则必须要有其他粒子作为载体,且该载体大小必须是纳米级并具有良好的粒径均一度。目前在磁场辅助分离技术,特别是生物磁分离技术中应用比较成熟便是磁性微球,磁性微球材料便具备粒径大小均一、磁响应性强以及水中分散性好等特性。FCM技术具有较高高的准确性和高通量检测特性,可以将FCM快速、高通量、多参数和准确定量分析等特性应用于蛋白质浓度的检测,同时选择大小为纳米级、粒径均匀的磁性微球材料作为流式细胞仪的载体,建立荧光免疫磁性微球联合流式细胞仪检测迁移体种类及数量。
本发明首先通过蛋白质谱测序检测尿液中囊泡蛋白,筛选糖尿病肾病患者尿液中特异性蛋白,随后通过流式细胞仪检测尿液囊泡上的这些特异性蛋白,鉴定可作为糖尿病肾病诊断标志物的尿液囊泡特异性表达蛋白。
本发明使用的试剂、耗材信息如表1所示。
表1本发明使用的试剂、耗材信息
实施例1. 尿液囊泡蛋白质谱测序
1、收集来自健康人、膜性肾病患者、IgA肾病患者、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)患者和糖尿病肾病患者尿液各50毫升,3000 rpm离心30分钟,弃去沉淀,保留上清。人肾小球足细胞系(购自美国ATCC公司)(HPC)使用含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素及ITS的RPMI-1640培养基培养。HPC在33℃和5%CO2下培养增殖,然后转移到37℃和5%CO2中分化10-12天。使用50 μg/ml LPS分别处理HPC 3h、6h及12h,使用25 μg/ml、50μg/ml及75 μg/ml LPS分别处理HPC 6h,分别检测迁移体的产生情况;使用75 μg/ml PAN分别处理HPC 6h、12h及24h,使用50 μg/ml、75 μg/ml及100 μg/ml PAN分别处理HPC 24h,分别检测迁移体的产生情况。使用60 mM HG分别处理HPC 12h、24h及48h,使用40mM、60mM及100mM HG处理HPC 48h,分别检测迁移体的产生情况。收集足细胞正常培养和各种刺激下的培养液,各50毫升,3000 rpm离心30分钟,弃去沉淀,保留上清。
2、将第一步获得的上清,10000 rpm离心60分钟,收集沉淀,此即为迁移体(migrasome),同时保留上清。
3、将第二步保留的上清,120000 rpm离心70分钟,收集沉淀,此即为外泌体(exosome)。
分别对迁移体(migrasome)和外泌体(exosome)利用UltiMate 3000 RSLCnano系统液相色谱及装有FAIMS Pro™(Thermo Scientific™,美国圣何塞)接口的OrbitrapExploris 480 质谱仪(Thermo Scientific,美国圣何塞)进行数据非依赖采集(DIA),鉴定差异蛋白。
检测结果
对来自足细胞和刺激后的足细胞(高糖/PAN)分泌的迁移体和外泌体蛋白进行分析,由热图可知,足细胞刺激前后其迁移体和外泌体蛋白有显著变化(图1)。健康人、膜性肾病患者、IgA患者、FSGS患者和糖尿病肾病患者尿液的迁移体和外泌体蛋白也具有显著差别(图2)。
通过比较足细胞培液样本(图1)和尿液样本(图2)差异表达的蛋白,筛选在糖尿病肾病患者尿液中表达显著增加并且在足细胞刺激后表达显著增加的迁移体蛋白(表1,显示了部分结果)和外泌体蛋白(表2,显示了部分结果),作为糖尿病肾病诊断的潜在标志物。其中,来自迁移体的PTPRS蛋白和来自外泌体的CKAP4蛋白作为膜蛋白进行进一步的验证。
表2.糖尿病肾病患者尿液及足细胞配液中迁移体特异性蛋白丰度(单位:Intensity)
蛋白名称 | 正常人 | 膜性肾病 | IgA肾病 | FSGS | 糖尿病肾病 | 对照足细胞 | 嘌呤霉素处理足细胞 | 高糖处理足细胞 |
PTPRS | 0 | 391837 | 0 | 0 | 88886.7 | 0 | 0 | 189630 |
表3.糖尿病肾病患者尿液及足细胞配液中外泌体特异性蛋白丰度(单位:Intensity)
蛋白名称 | 正常人 | 膜性肾病 | IgA肾病 | FSGS | 糖尿病肾病 | 对照足细胞 | 嘌呤霉素处理足细胞 | 高糖处理足细胞 |
CKAP4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 118098 | 0 | 1236580 | 0 |
实施例2 糖尿病肾病病人组织PTPRS和CKAP4高表达并用免疫荧光检测。
用免疫荧光检测糖尿病肾病病人组织PTPRS和CKAP4蛋白的表达,步骤如下:
1、自江苏省人民医院收集肾癌癌旁组织和糖尿病肾病病人组织样本,进行OCT包埋和冰冻切片。
2、从负80℃取出冰冻切片,恢复至室温。室温下,在4%多聚甲醛中孵育组织切片10min,用冰PBS洗涤组织切片3次。
3、用1% BSA 22.52 mg/ml甘氨酸的PBST(PBS+0.1%Tween 20)孵育细胞30 min,分别与封闭CKAP4抗体和PTPRS抗体非特异性结合。
4、室温下用稀释抗体(溶于1% BSA的PBST中)(CKAP4 1:200;PTPRS 1:200)湿盒中4℃孵育过夜。
5、倒出一抗,用PBS洗涤细胞3次,每次5 min。
6、室温下分别用荧光二抗488和荧光二抗594(1:500)室温孵育1h。
7、倒出二抗溶液,用PBS闭光洗涤细胞3次,每次5 min。
8 PBS配制DAPI(1:2000),孵育细胞1 min。
9 用PBS闭光洗涤细胞3次,每次5 min。
10 滴封片剂封片,避光4℃保存。
检测结果:对3对肾癌癌旁组织和糖尿病肾病病人组织样本进行免疫荧光染色,染色结果表明,相比较于肾癌癌旁组织,糖尿病肾病病人组织样本PTPRS和CKAP4表达水平显著增高(图3),这和糖尿病肾病病人尿液PTPRS和CKAP4表达水平一致,为PTPRS和CKAP4作为糖尿病肾病病人诊断标志物提供了有利证据。
实施例3 WGA偶联的磁珠捕获尿液中的迁移体和外泌体作为糖尿病肾病检测的标志物并western blotting检测
1、收集健康人、糖尿病肾病患者尿液,4000g 4℃离心20分钟去除细胞碎片,取1mL尿液加入5 mL麦胚凝集素(WGA)(Invitrogen, Wheat Germ Agglutinin (WGA),货号:W11261)偶联的磁珠,并在4℃置于混合仪上共孵育1h。
2、将EP管置于磁分离架上磁性分离去除上清液,加入1000 mL含0.1%BSA的PBS溶液(pH 7.2)洗涤3次后,重新悬浮于100 mL含1% BSA的PBS溶液中室温孵育30 min。
3、随后将EP管置于磁性分离架内,富集磁珠,弃上清液。提取磁珠捕获的囊泡蛋白,进行western blotting实验,检测PTPRS蛋白和CKAP4蛋白(图4)。
实施例4 WGA偶联的磁珠捕获尿液中的迁移体和外泌体作为糖尿病肾病检测的标志物
1、收集20例健康人、20例糖尿病、20例糖尿病肾病患者尿液(患者样本信息如表格4所示),3000g 4℃离心30分钟去除细胞碎片,取1mL尿液加入5 mL WGA偶联的磁珠,并在4℃置于混合仪上共孵育1h。
2、将EP管置于磁分离架上磁性分离去除上清液,加入1000mL含0.1%BSA的PBS 溶液(pH 7.2)洗涤3次后,重新悬浮于100 mL含1% BSA的PBS溶液中室温孵育30min。
3、随后将EP管置于磁性分离架内,富集磁珠,弃上清液。重新悬浮于100mL含0.1%BSA的PBS溶液中。
4、向EP管中加入0.5mL PTPRS抗体(兔源)和CKAP4抗体(鼠源),置于混合仪上室温孵育1h,随后将EP管置于磁性分离架内,富集磁珠,弃上清液。加入1000mL含0.1% BSA的PBS溶液洗涤3次后,重新悬浮于250mL含0.1%BSA的PBS溶液中。
5、向EP管中加入0.5 mL anti-rabbit荧光二抗(488)和anti-mouse荧光二抗(594),置于混合仪上室温孵育1h,随后将EP管置于磁性分离架内,富集磁珠,弃上清液。加入1000mL含0.1% BSA的PBS溶液洗涤3次后,重新悬浮于300 mL PBS溶液中,利用荧光显微镜(OLYMPUS,研究级显微镜系统IXplore Standard)和流式细胞仪(赛默飞Attune NxT流式细胞仪)进行检测。
表4 糖尿病肾病、健康人与糖尿病患者的病理信息统计
检测结果:对捕获的尿液囊泡进行流式细胞仪检测,检测结果表明,迁移体PTPRS和外泌体CKAP4的量在20例糖尿病肾病患者尿液中比20例正常人和20例糖尿病患者显著上升(图5中的A和C)。利用受试者工作特征曲线 (receiver operating characteristiccurve,简称ROC曲线)分析,迁移体的PTPRS区分糖尿病肾病与健康人以及糖尿病肾病与糖尿病患者的曲线下面积分别为0.9313和0.8927,外泌体的CKAP4区分糖尿病肾病与健康人以及糖尿病肾病与糖尿病患者的曲线下面积分别为0.9719和0.9672(图5中的B和D)。迁移体的PTPRS和外泌体的CKAP4联合使用区分糖尿病肾病与健康人以及糖尿病肾病与糖尿病患者的曲线下面积分别为1.000和0.9975(图6)。
因此,迁移体的PTPRS和外泌体的CKAP4可以作为糖尿病肾病诊断的标志物。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.检测糖尿病肾病的蛋白标志物,其特征在于,所述蛋白标志物选自下列蛋白中的任意一种或两种:尿液迁移体内含的蛋白酪氨酸磷酸酶受体S(PTPRS)、尿液外泌体内含的细胞骨架相关蛋白4(CKAP4)。
2.蛋白标志物的检测试剂在制备糖尿病肾病诊断或辅助诊断的试剂、试纸条、试剂盒或生物芯片中的应用,所述蛋白标志物包括PTPRS蛋白、CKAP4蛋白。
3.根据权利要求2所述的应用,其中,所述检测试剂检测尿液迁移体中的PTPRS蛋白的量和/或尿液外泌体中的CKAP4蛋白的量。
4.一种糖尿病肾病诊断或辅助诊断的试剂、试纸条、试剂盒或生物芯片,其特征在于,包含检测PTPRS蛋白和/或CKAP4蛋白的检测试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂、试纸条、试剂盒或生物芯片,其中,所述检测试剂包括PTPRS和/或CKAP4的单克隆抗体或多克隆抗体。
6.根据权利要求4所述的试剂、试纸条、试剂盒或生物芯片,其中,通过选自蛋白免疫印迹法、酶联免疫吸附法、放射免疫分析法、放射免疫扩散法、双向扩散法、火箭免疫电泳法、组织免疫染色法、免疫沉淀分析法、补体结合分析法、流式细胞分析法以及蛋白质芯片法中的一种或多种方法检测PTPRS蛋白和/或CKAP4蛋白的量。
7.根据根据权利要求5所述的试剂、试纸条、试剂盒或生物芯片,其中,所述的检测试剂盒包括从样品中分离迁移体和/或外泌体的试剂。
8.根据根据权利要求7所述的试剂、试纸条、试剂盒或生物芯片,其中,所述分离迁移体和/或外泌体的试剂包括偶联有或结合有凝集素的固相载体。
9.根据根据权利要求8所述的试剂、试纸条、试剂盒或生物芯片,所述固相载体是表面经高分子材料包埋的复合磁珠,所述复合磁珠包括:葡聚糖磁珠、琼脂糖磁珠、树脂或环氧树脂、聚苯乙烯磁珠复合磁珠中的任一种或者两种及以上。
10.根据根据权利要求8所述的试剂、试纸条、试剂盒或生物芯片,所述的凝集素选自下组:麦胚素(WGA)、刀豆凝集素(ConA)、花生凝集素(PNA)或其组合。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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