CN116481983A - 一种基于偏振照明的同轴干涉散射显微成像装置及方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于偏振照明的同轴干涉散射显微成像装置，包括连续激光器、多个透镜、空间滤波器、波片、一个偏振分束镜、功率计、物镜、样品台、和多个反射镜，连续激光器的激光经一组透镜扩束准直并空间滤波后进入1/2波片，进行偏振方向调节。调节后的偏振光进入偏振分束棱镜将激光分为P光与S光，S光经物镜后宽场照明样品，颗粒散射光与反射光经物镜收集后进入偏振分束棱镜，该S光在偏振分束棱镜出射口形成部分正交偏振。本发明还提供一种基于偏振照明的同轴干涉散射显微成像装置的成像方法。本发明通过S光偏振照明并结合正交偏振原理，有效抑制背景反射光，提高了信号对比度；同时，结合干涉散射显微成像信号增强的优势，实现对样品表面小尺寸颗粒极弱信号的高信噪比检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种纳米颗粒的光学检测与成像技术领域，尤其涉及一种基于偏振照明的同轴干涉散射显微成像装置及方法。
背景技术
纳米尺度下单分子与单颗粒等极弱信号获取对材料和生物医学研究具有重要作用。传统光学显微镜受衍射极限限制，检测能力不低于300nm。一些显微技术如扫描电子显微镜和原子力显微镜具有纳米尺度检测能力，然而，其检测效率低，且易对检测样品产生损伤。
现有单分子与单颗粒光学显微技术中，荧光显微探测具有抑制背景信号、成像效果好等优势，然而却受到光漂白、光饱和及光闪烁等影响，并且需要复杂的标记手段。基于颗粒瑞利散射的成像具有免标记、无毒性、无光漂白和拍摄时间不受限制等优势。暗场显微成像技术在暗黑背景下探测颗粒纯瑞利散射信号，具有低背景信号、高信噪比等优势。但是受限于瑞利散射极限，颗粒散射信号强度随着直径呈六次方减少，目前，暗场显微技术基本能够检测40nm以上的金颗粒。
干涉成像技术中，颗粒干涉散射信号与颗粒直径三次方成正比，能够进一步放大和检测极弱颗粒散射信号。基于此，干涉散射显微成像(iSCAT)通过样品内颗粒散射光与同路径的反射参考光在成像平面上产生干涉，提高了灵敏度与小尺寸颗粒检测能力。宽场照明结合反射式探测能够降低参考光强并获得更大的检测区域(几百微米)因而被广泛应用。然而，iSCAT技术中，背景光与信号一同被探测器接收，信号光对比度低，在检测小颗粒尺寸时，会出现信号被背景淹没情形。一种有效抑制干涉散射背景光，实现对纳米颗粒高对比度成像检测的技术是目前所没有的。
发明内容
为克服上述问题，本发明提供一种基于偏振照明的同轴干涉散射显微成像装置，基于照明光路与探测光路的共路正交偏振原理，实现对背景反射信号的抑制；同时，结合干涉散射增强的优势，实现对纳米颗粒的高对比度测量与检测。
本发明的第一个方面提供一种基于偏振照明的同轴干涉散射显微成像装置，包括偏振光源模块、照明光路、物镜(10)、样品台(11)、偏振分束镜(9)、成像模块以及调控和处理模块(16)；其中，偏振光源模块产生平行偏振连续激光，经过照明光路后在样品上产生宽场探测光斑，样品颗粒的散射光与基底反射光经过物镜(10)收集后通过成像模块进行干涉成像；调控和处理模块(16)采集与处理图像，得到颗粒干涉散射信号。
进一步，所述偏振光源模块包括依次设置的连续激光器(1)、准直透镜组第一透镜(2)、第一空间滤波器(3)、准直透镜组第二透镜(4)和半波片(5)；所述连续激光器(1)发射线偏振光，经过准直透镜组第一透镜(2)、第一空间滤波器(3)、准直透镜组第二透镜(4)后调整为平行偏振光；所述平行偏振光通过半波片(5)旋转偏振方向，旋转方向后的线偏振光入射至照明光路。
进一步，所述连续激光器(1)为保偏连续激光器，产生偏振连续激光。
进一步，所述照明光路包括依次设置的第一全反镜(6)、可变光阑(7)、照明透镜(8)；旋转方向后的线偏振光经过第一全反镜(6)反射后进入可变光阑(7)及照明透镜(8)后由偏振分束镜(9)分为两束，其中一束为反射S偏振光，另一束为透射P偏振光；透射P偏振光进入功率计(12)监测光强，通过调整半波片(5)使功率计(12)检测的透射P偏振光强最小；反射S偏振光汇聚于物镜(10)后焦面，经过物镜(10)后产生平行宽场光斑照射样品台(11)表面产生宽场照明光斑；样品台(11)上设有被检测样品颗粒，被检测样品颗粒的散射光与基底表面的反射光一起进入物镜(10)后，经过偏振分束镜(9)进行正交偏振抑制背景反射光后入射成像模块；
进一步，所述S偏振光照明的干涉光场点扩散函数(PSF)为四瓣分布。
进一步，所述偏振分束镜(9)利用正交偏振抑制样品基底反射S偏振光。
进一步，所述偏振分束镜(9)用于将入射线偏振光分束为S偏振光与P偏振光，其中，S偏振光用于照明样品台。
进一步，所述成像模块包括依次设置的第二全反镜(13)、筒镜(14)、CMOS相机(15)；经过偏振分束镜后的颗粒散射光与背景光一起经过第二全反镜(13)、反射后通过筒镜(14)汇聚于CMOS相机(15)像面上进行干涉成像。
进一步，所述调控和处理模块(16)用于控制样品台3维位移、CMOS相机(15)拍摄以及图像处理获得干涉信号。
本发明的第二个方面提供一种基于偏振照明的同轴干涉散射显微成像装置的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：发射线偏振光经过准直透镜组(2)、(4)以及第一空间滤波器(3)调整为平行偏振光，所述平行偏振光经过半波片(5)旋转偏振方向；
S2：将平行线偏振光由第一全反镜(6)反射进入可变光阑(7)及照明透镜(8)后进入偏振分束镜(9)，透射P偏振光进入功率计(12)显示光强，调整半波片(5)使功率计(12)检测P偏振光强最小；
S3：经过旋转偏振方向的平行偏振光经过偏振分束镜反射后的S偏振光汇聚于物镜(10)后焦面，经过物镜后产生平行宽场光斑照射样品台(11)表面；
S4：被检测样品颗粒的散射光与基底表面的反射光一起进入物镜(10)后，经过偏振分束镜(9)进行正交偏振抑制背景反射光；
S5：经过偏振分束镜(9)后的颗粒散射光与背景光一起经过第二全反镜(13)反射后通过筒镜(14)汇聚于CMOS相机(15)像面上进行干涉成像；
S6：通过控制和处理模块(16)实时调控样品三维位置，采集和处理图像，得到颗粒干涉散射信号。
本发明的有益效果是：
第一，通过引入共路同轴正交偏振技术，可实现对待测样品背景反射光的抑制，提升信号对比度；
第二，本发明装置简单，基于偏振宽场照明和干涉散射信号增强，具有高速、大测试范围、高灵敏度等优势。
附图说明
图1为实施例1基于偏振照明的同轴干涉散射显微成像装置的结构示意图；
图2为实施例2与实施例3基于偏振照明的同轴干涉散射显微成像装置的结构示意图；
图3为实施例4基于偏振照明的同轴干涉散射显微成像装置的结构示意图；
图4为本发明的偏振光源模块的局部结构示意图；
图5a、b为本发明的偏振分束镜的结构示意图和偏振工作调节示意图。其中，图5(a)是偏振分束镜的结构示意图，图5(b)是半波片结合偏振分束镜与光度计调节偏振方向的示意图。
图6为本发明对不同偏振方向的干涉散射显微成像PSF的仿真对比图；
图7为本发明对粒径300nm的SiO2进行S偏振光宽场照明的干涉散射显微成像(a)和传统圆偏振光宽场照明探测P偏振光的干涉散射显微成像(b)对比效果图；
图8为本发明对S偏振成像的图像强度与P偏振成像图像强度曲线对比图。
附图标记说明：1-连续激光器，2-准直透镜组第一透镜，3-第一空间滤波器，4-准直透镜组第二透镜，5-半波片，6-第一全反镜，7-可变光阑，8-照明透镜，9-偏振分束镜，10-物镜，11-样品台，12-功率计，13-第二全反镜，14-筒镜，15-CMOS相机，16-调控和处理模块，17-4f系统第一透镜，18-第二空间滤波器，19-4f系统第二透镜，20-第二物镜，21-第二偏振分束镜。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明专利的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要说明的是，如出现术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，如出现术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，如出现术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
实施例1
如图1所示，本实施例提供一种基于偏振照明的同轴干涉散射显微成像，包括偏振光源模块、照明光路、物镜10、样品台11、偏振分束镜9、成像模块和调控与处理模块16，所述偏振光源模块按光路方向依次连接连续激光器1、准直透镜组第一透镜2、第一空间滤波器3、准直透镜组第二透镜4、半波片5，所述照明光路按光路方向依次连接第一全反镜6、可变光阑7、照明透镜8，偏振分束镜9透射光端设置有功率计12，所述成像模块按光路方向依次连接第二全反镜13、筒镜14、CMOS相机15。
本实施例中，连续激光器1发射线偏振光，经过准直透镜组第一透镜2、第一空间滤波器3、准直透镜组第二透镜4后调整为平行偏振光。平行偏振光通过半波片5旋转偏振方向。旋转方向后的线偏振光经过第一全反镜6反射后进入可变光阑7及照明透镜8后由偏振分束镜9分为两束，一束为反射S偏振光，另一束为透射P偏振光。透射P偏振光进入功率计12监测光强，通过调整半波片使功率计12检测的透射P偏振光强最小。反射S偏振光汇聚于物镜10后焦面，经过物镜10后产生平行宽场光斑照射样品台11表面。经样品台11上样品颗粒的散射光与基底表面的反射光一起通过物镜10收集后，经过偏振分束镜9抑制样品表面反射背景杂散光后经过第二全反镜13反射后通过筒镜14汇聚于CMOS相机15像面上进行干涉成像。调控和处理模块16实施调控样品三维位置，采集和处理图像，得到颗粒干涉散射信号。
本实施例中，如图4所示，连续激光器1输出的连续激光束中心波长为445nm，偏振态为线偏振，由扩束准直透镜组第一透镜2、第一空间滤波器3、准直透镜组第二透镜4扩束准直为平行偏振光。通过半波片5调整平行偏振光偏振方向。偏振光源模块的输出光束直径、光强和偏振方向均可调节。
本实施例中，如图5(a)所示，偏振分束镜9将入射任意方向线偏振光按照偏振方向分为两束，一束为反射S偏振光，另一束为透射P偏振光。如图5(b)所示，偏振光源模块发射的任意方向线偏振光通过旋转半波片5调整为S偏振光，使得功率计12检测的透射P偏振光强为0。其中，S偏振光作为照明光经过偏振分束镜9向上反射到样品台。
本实施例中，利用干涉散射场PSF对偏振方向的选择性原理，选择S偏振光照明的干涉散射光场PSF为区别于传统圆形的四瓣状分布。如图6所示，对干涉散射显微成像系统进行了PSF仿真，照明激光波长为455nm，物镜数值孔径为1.4，放大倍率为100。P偏振光分量产生圆形PSF，中心及旁瓣为圆；而S偏振光分量产生四瓣形状PSF，中心及旁瓣具有四瓣型分布。
本实施例中，利用照明光路与探测光路的部分共路设计并结合偏振分束镜9这一器件，在偏振照明条件下实现对样品颗粒的背景反射光抑制。在照明光为S偏振条件下，来自被检测样品基底表面反射背景光为S偏振光，此时，探测光路中偏振分束镜9的透射端进行正交偏振过滤，实现对背景反射光的抑制。偏振分束镜9的透射端偏振分束比为P：S＝95：5，抑制后的背景反射S偏振光与散射光在像面上干涉成像，保证小尺寸颗粒散射信号的高对比度图像获取。
本实施例中，调控和处理模块16用于控制样品台3维方向的位移、CMOS相机的拍摄触发以及处理得到干涉散射信号，实现集成式测试与图像获取。
在上述实施例的基础上，如图7(a)所示，以粒径300nm的SiO2的宽场照明干涉散射显微成像为例，激光波长为445nm。进行线偏振宽场照明。利用S线偏振光作为照明光，经过偏振分束镜9探测背景抑制后的S偏振背景光与信号干涉光，300nmSiO2的干涉散射图像经过成像模块后被CMOS相机18采集。
在上述实施例的基础上，如图7(b)所示，以粒径300nm的SiO2的宽场照明干涉散射显微成像为例，激光波长为445nm，将一个1/4波片置于偏振分束镜9与物镜10之间，进行圆偏振光照明。利用偏振分束镜9反射端的S偏振光经过1/4波片形成圆偏振光照射样品面，通过偏振分束镜9探测无背景抑制的P偏振背景光与信号干涉光，经过成像模块，300nmSiO2的干涉散射图像被CMOS相机18采集。
以图7用虚线圈出的单个颗粒做光强曲线，如图8所示，相比于传统圆偏振光照明并对P偏振光进行干涉散射成像的技术，本发明提供的基于偏振宽场照明的干涉散射成像系统及测量方法通过S线偏振光照明并结合正交偏振抑制背景光显著提高了信号对比度，形成了四瓣形状PSF区别于传统圆形PSF。同时具备大视场、高灵敏度、装置简单易兼容等优势。
实施例2
见图2，一种基于偏振照明的同轴干涉散射显微成像装置包括偏振光源模块、物镜10、样品台11、偏振分束镜9、成像模块和调控与处理模块16，所述偏振光源模块按光路方向依次连接连续激光器1、准直透镜组第一透镜2、第一空间滤波器3、准直透镜组第二透镜4、半波片5，所述照明光路按光路方向依次连接第一全反镜6、可变光阑7、照明透镜8，偏振分束镜9透射光端设置有功率计12，所述成像模块按光路方向依次连接第二全反镜13、筒镜14、4f调制模块、CMOS相机15，所述4f调制模块按光路方向依次连接4f系统第一透镜17、第二空间滤波器18、4f系统第二透镜19。
本实施例中，4f调制模块用于对干涉散射光场进行调制。经过筒镜14的颗粒散射光与背景反射光通过4f系统第一透镜17汇聚于频谱面，在频谱面利用第二空间滤波器18调制干涉光场，进一步抑制背景反射光，提高图像对比度，调制后的光场通过4f系统第二透镜19成像于CMOS相机15探测面。其中，第二空间滤波器18为在透明石英上镀有金属膜，滤波器透射率具有一定分布，中心为低透射率，四周为高透射率，获得高比例散射光和低比例背景反射光。空间调制效果可以通过空间滤波器中金属膜的空间分布、形状、材料及厚度等进行灵活设计。
实施例3
与实施例2相比，本实施例中，将照明透镜8从照明光路中移除，使偏振光源模块发出的平行偏振光经过第一全反镜6反射、可变光阑7、偏振分束镜9部分反射后由物镜10汇聚到样品台11的样品上，实现聚焦式点照明。
实施例4
见图3，一种基于偏振照明的同轴干涉散射显微成像装置包括偏振光源模块、照明光路、物镜10、第二物镜20、样品台11、偏振分束镜9、第二偏振分束镜21、成像模块和调控与处理模块16，所述偏振光源模块按光路方向依次连接连续激光器1、准直透镜组第一透镜2、第一空间滤波器3、准直透镜组第二透镜4、半波片5，所述照明光路按光路方向依次连接第一全反镜6、可变光阑7、照明透镜8，偏振分束镜9透射光端设置有功率计12，所述成像模块按光路方向连接第二物镜20、第二偏振分束镜21、第二全反镜13、筒镜14、4f调制模块、CMOS相机15，所述4f调制模块按光路方向依次连接4f系统第一透镜17、第二空间滤波器18、4f系统第二透镜19。
本实施例中，连续激光器1发射线偏振光，经过准直透镜组第一透镜2、第一空间滤波器3、准直透镜组第二透镜4后调整为平行偏振光。平行偏振光通过半波片5旋转偏振方向。旋转方向后的线偏振光经过第一全反镜6反射后进入可变光阑7及照明透镜8后由偏振分束镜9分为两束，一束为反射S偏振光，另一束为透射P偏振光。透射P偏振光进入功率计12监测光强，通过调整半波片使功率计12检测的透射P偏振光强最小。反射S偏振光汇聚于物镜10后焦面，经过物镜10后产生平行偏振宽场光斑照射样品台11表面。经样品台11上样品颗粒的散射光与背景透射光一起通过第二物镜20收集后，经过第二偏振分束镜21抑制样品表面反射背景杂散光后经过第二全反镜13反射后通过筒镜14汇聚于4f系统前焦面，依次通过4f系统调制模块中4f系统第一透镜17、第二空间滤波器18、4f系统第二透镜19对干涉光场进行调制，调制后的光汇聚于CMOS相机15像面上进行干涉成像。调控和处理模块16实时调控样品三维位置，采集和处理图像，得到颗粒干涉散射信号。
本说明书实施例所述的内容仅仅是对发明构思的实现形式的列举，本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式，本发明的保护范围也及于本领域技术人员根据本发明构思所能够想到的等同技术手段。
Claims (10)
1.一种基于偏振照明的同轴干涉散射显微成像装置，其特征在于：包括偏振光源模块、照明光路、物镜(10)、样品台(11)、偏振分束镜(9)、成像模块以及调控和处理模块(16)；其中，偏振光源模块产生平行偏振连续激光，经过照明光路后在样品上产生宽场探测光斑，样品颗粒的散射光与基底反射光经过物镜(10)收集后通过成像模块进行干涉成像；调控和处理模块(16)采集与处理图像，得到颗粒干涉散射信号。
2.如权利要求1所述的一种基于偏振照明的同轴干涉散射显微成像装置，其特征在于：所述偏振光源模块包括依次设置的连续激光器(1)、准直透镜组第一透镜(2)、第一空间滤波器(3)、准直透镜组第二透镜(4)和半波片(5)；所述连续激光器(1)发射线偏振光，经过准直透镜组第一透镜(2)、第一空间滤波器(3)、准直透镜组第二透镜(4)后调整为平行偏振光；所述平行偏振光通过半波片(5)旋转偏振方向，旋转方向后的线偏振光入射至照明光路。
3.如权利要求2所述的一种基于偏振照明的同轴干涉散射显微成像装置，其特征在于：所述连续激光器(1)为保偏连续激光器，产生偏振连续激光。
4.如权利要求2所述的一种基于偏振照明的同轴干涉散射显微成像装置，其特征在于：所述照明光路包括依次设置的第一全反镜(6)、可变光阑(7)、照明透镜(8)；旋转方向后的线偏振光经过第一全反镜(6)反射后进入可变光阑(7)及照明透镜(8)后由偏振分束镜(9)分为两束，其中一束为反射S偏振光，另一束为透射P偏振光；透射P偏振光进入功率计(12)监测光强，通过调整半波片(5)使功率计(12)检测的透射P偏振光强最小；反射S偏振光汇聚于物镜(10)后焦面，经过物镜(10)后产生平行宽场光斑照射样品台(11)表面产生宽场照明光斑；样品台(11)上设有被检测样品颗粒，被检测样品颗粒的散射光与基底表面的反射光一起进入物镜(10)后，经过偏振分束镜(9)进行正交偏振抑制背景反射光后入射成像模块。
5.如权利要求4所述的一种基于偏振照明的同轴干涉散射显微成像装置，其特征在于：所述S偏振光照明的干涉光场点扩散函数(PSF)为四瓣分布。
6.如权利要求4所述的一种基于偏振照明的同轴干涉散射显微成像装置，其特征在于：所述偏振分束镜(9)利用正交偏振抑制样品基底反射S偏振光。
7.如权利要求4所述的一种基于偏振照明的同轴干涉散射显微成像装置，其特征在于：所述偏振分束镜(9)用于将入射线偏振光分束为S偏振光与P偏振光，其中，S偏振光用于照明样品台。
8.如权利要求4所述的一种基于偏振照明的同轴干涉散射显微成像装置，其特征在于：所述成像模块包括依次设置的第二全反镜(13)、筒镜(14)、CMOS相机(15)；经过偏振分束镜后的颗粒散射光与背景光一起经过第二全反镜(13)、反射后通过筒镜(14)汇聚于CMOS相机(15)像面上进行干涉成像。
9.如权利要求8所述的一种基于偏振照明的同轴干涉散射显微成像装置，其特征在于：所述调控和处理模块(16)用于控制样品台3维位移、CMOS相机(15)拍摄以及图像处理获得干涉信号。
10.如权利要求9所述的一种基于偏振照明的同轴干涉散射显微成像装置的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：发射线偏振光经过准直透镜组(2)、(4)以及第一空间滤波器(3)调整为平行偏振光，所述平行偏振光经过半波片(5)旋转偏振方向；
S2：将平行线偏振光由第一全反镜(6)反射进入可变光阑(7)及照明透镜(8)后进入偏振分束镜(9)，透射P偏振光进入功率计(12)显示光强，调整半波片(5)使功率计(12)检测P偏振光强最小；
S3：经过旋转偏振方向的平行偏振光经过偏振分束镜反射后的S偏振光汇聚于物镜(10)后焦面，经过物镜后产生平行宽场光斑照射样品台(11)表面；
S4：被检测样品颗粒的散射光与基底表面的反射光一起进入物镜(10)后，经过偏振分束镜(9)进行正交偏振抑制背景反射光；
S5：经过偏振分束镜(9)后的颗粒散射光与背景光一起经过第二全反镜(13)反射后通过筒镜(14)汇聚于CMOS相机(15)像面上进行干涉成像；
S6：通过控制和处理模块(16)实时调控样品三维位置，采集和处理图像，得到颗粒干涉散射信号。
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