CN116479169A - 一种用于检测中枢神经系统感染多种病毒的微滴数字pcr检测试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测中枢神经系统感染多种病毒的微滴数字PCR检测试剂盒及应用，属于涉及试剂盒技术领域。设计并合成EV、HPeV、HSV1、HSV2、VZV、CMV、HHV6和EBV这8种病毒的特异性引物和检测探针，并对检测方法进行优化。该方法对EV、HPeV、HSV1、HSV2的最低检出限分别为每反应5、10、5和10拷贝，最低定量限分别为每反应10、10、50和10拷贝。对VZV、CMV、HHV6、EBV的最低检出限均为每反应5拷贝，最低定量限均为每反应50拷贝。两组在每反应2‑2000拷贝数范围内呈现线性；对另外14种CNSI常见病原体进行检测，未发现交叉反应，特异性良好。
Description
技术领域
本发明涉及试剂盒技术领域，具体涉及一种用于检测中枢神经系统感染多种病毒的微滴数字PCR检测试剂盒及应用。
背景技术
中枢神经系统感染(central nervous system infection,CNSI)的病原体主要有细菌、病毒、真菌、螺旋体及原虫等，病原体进入中枢神经系统，可引起脑膜炎、脑炎和脊髓炎等，临床症状包括发热、头痛、喷射性呕吐、意识障碍、抽搐等。其中，病毒引起的中枢神经系统感染已经是世界各国儿童神经系统感染和死亡的主要原因之一，能够引起中枢神经系统感染的病毒主要有肠道病毒(enterovirus,EV)、人副肠孤病毒(human parechovirus,HPeV)、单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus 1,HSV1)、单纯疱疹病毒2型(herpessimplex virus 2,HSV2)、水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)、巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)、人疱疹病毒6(human herpesvirus 6,HHV6)和EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)，不同病毒引起的临床表现并无大的区别，明确病毒类型对进一步的确诊和治疗至关重要。
目前临床实验室主要采用酶联免疫吸附试验(ELISA)或免疫荧光法来检测针对病毒产生的特异性抗体。该方法操作简单、成本低、时间短，可以大规模筛查人群中的抗体产生情况，但存在敏感性低，有交叉反应，易产生假阳性等问题。单份的IgG不能代表现症感染，有些病毒感染后IgM可持续一年阳性，有些患者在病毒感染后不产生IgM抗体或抗体滴度很低，不易检测。
病毒培养是病毒性CNSI诊断的传统金标准，其方法是将样本加入特定细胞系中，观察细胞病变效应。由于病毒培养周期长且一些病毒难以培养，目前临床实验室已很少开展。
实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR,qPCR)是目前应用最广泛的方法，目前国内获批并应用于临床中枢神经系统感染的仅有肠道病毒、单纯疱疹病毒的荧光PCR单检试剂，存在最低检出限不够、病毒检出率偏低的问题，能够检测其他中枢神经系统感染病毒的试剂仅限于科研，商品化获批的试剂盒几乎没有。
基于现有技术的上述不足，急需提供一种具有高敏感性、高特异性，并且能够同时针对多个中枢神经系统感染病毒进行检测的方法。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种用于检测中枢神经系统感染多种病毒的微滴数字PCR检测试剂盒，用于中枢神经系统感染(central nervous systeminfection,CNSI)病毒的检测，可同时实现多种病毒的检测，具有检测灵敏度高和特异性强的优点。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
本申请提供一种用于检测中枢神经系统感染多种病毒的微滴数字PCR检测试剂盒，包括引物混合物I和探针混合物I；
所述引物混合物I包括HSV1检测引物、HSV2检测引物、EV检测引物、HPeV检测引物；
其中，HSV1检测引物包括SEQ ID No.2所示正向引物和SEQ ID No.3所示反向引物；HSV2检测引物包括SEQ ID No.5所示正向引物和SEQ ID No.6所示反向引物；EV检测引物包括SEQ ID No.14所示正向引物和SEQ ID No.15所示反向引物；HPeV检测引物包括SEQID No.17所示正向引物和SEQ ID No.18所示反向引物；
所述探针混合物I包括HSV1检测探针HSV1-FAM、HSV2检测探针HSV2-FAM和HSV2-VIC、EV检测探针EV-FAM、HPeV检测探针HPeV-FAM和HPeV-VIC；
其中，HSV1-FAM具有SEQ ID No.1所示序列，5’端采用FAM基因标记；HSV2-FAM和HSV2-VIC具有SEQ ID No.4所示序列，5’端分别采用FAM和VIC基因标记；EV-FAM具有SEQ IDNo.13所示序列，5’端采用FAM基因标记；HPeV-FAM和HPeV-VIC具有SEQ ID No.16所示序列，5’端分别采用FAM和VIC基因标记。
本发明上述技术方案中，通过设计出针对HSV1、HSV2、EV和HPeV的特异性检测引物对和探针，引物和探针序列的设计直接关系到ddPCR检测的特异性和灵敏度，本发明的上述特异性引物和探针序列用于中枢神经系统感染的病毒检测，引物之间和探针之间无干扰，不同病毒检测无交叉反应，对引起中枢神经系统感染的其他病原体无阳性反应，具有检测特异性强和灵敏度高的优点。
进一步地，所述引物混合物I中各引物的浓度为300～500nM；优选地，所述引物混合物中各引物的浓度为400nM。
进一步地，所述探针混合物I中各探针的浓度为50～500nM。
进一步地，探针混合物I中EV-FAM浓度为200nM；HSV2-FAM浓度为100nM；HSV2-VIC浓度为100nM；HPeV-FAM浓度为50nM；HPeV-VIC浓度为150nM；HSV1-VIC浓度为400nM。
进一步地，本申请提供的试剂盒，包括引物混合物II和探针混合物II；
所述引物混合物II包括CMV检测引物、EBV检测引物、VZV检测引物和HHV6检测引物；
其中，CMV检测引物包括SEQ ID No.8所示正向引物和SEQ ID No.9所示反向引物；EBV检测引物包括SEQ ID No.11所示正向引物和SEQ ID No.12所示反向引物；VZV检测引物包括SEQ ID No.20所示正向引物和SEQ ID No.21所示反向引物；HHV6检测引物包括SEQ IDNo.23所示正向引物和SEQ ID No.24所示反向引物；
所述探针混合物II包括CMV检测探针CMV-FAM和CMV-VIC、EBV检测探针EBV-FAM、VZV检测探针VZV-FAM、HHV6检测探针HHV6-FAM和HHV6-VIC；
其中，CMV-FAM和CMV-VIC具有SEQ ID No.7所示序列，5’端分别采用FAM和VIC基因标记；EBV-FAM具有SEQ ID No.10所示序列，5’端采用FAM基因标记；VZV-FAM具有SEQ IDNo.22所示序列，5’端采用FAM基因标记；HHV6-FAM和HHV6-VIC具有SEQ ID No.25所示序列，5’端分别采用FAM和VIC基因标记。
本发明的方法中，通过将病毒进行分组，HSV1、HSV2、EV和HPeV作为组一；CMV、EBV、VZV和HHV6作为组二。上述引物混合物II和探针混合物II为针对CMV、EBV、VZV和HHV6的特异性检测引物和探针。通过制备上述含有引物混合物I、探针混合物I、引物混合物II、探针混合物II，可实现EV、HPeV、HSV1、HSV2、VZV、CMV、HHV6和EBV8种引起中枢神经系统感染的常见病毒的检测，将该方法在临床脑脊液样本中进行应用，为病毒性CNSI的早期病原学筛查提供一种更为准确和敏感的检测方法。
进一步地，探针混合物II中，VZV-FAM浓度为400nM；CMV-FAM浓度为150nM；CMV-VIC浓度为50nM；HHV6-FAM浓度为50nM；HHV6-VIC浓度为150nM；EBV-VIC浓度为200nM。
进一步地，所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：
1)提取待测样品核酸(对于DNA病毒，则提取DNA进行步骤2)，对于RNA病毒，步骤2)前还需要对提取的RNA进行逆转录)；
2)配制四重ddPCR扩增体系，所述扩增体系引物混合物和探针混合物；
3)制备微滴：将配制好的PCR反应液转移至微滴发生卡sample孔中，再加入微滴发生油至oil孔中，套上胶垫后将卡置于QX200TM微滴生成仪中制备反应微滴；
4)PCR扩增：将每个样品的微滴分别转移至96孔PCR反应板中对应的反应孔中，热封后在PCR仪上进行扩增；
5)进行微滴检测和数据分析。
进一步地，所述待测样品为脑脊液。
进一步地，步骤4)所述PCR扩增的扩增程序为：96℃预变性10min；98℃变性30s，55℃退火1min，共40个循环；55℃2min。
本发明还提供所述的试剂盒在制备病毒性中枢神经系统感染检测产品中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1)设计并合成EV、HPeV、HSV1、HSV2、VZV、CMV、HHV6和EBV这8种病毒的特异性引物和检测探针，并对检测方法进行优化。该方法对EV、HPeV、HSV1、HSV2的最低检出限分别为每反应5、10、5和10拷贝(copies/reaction)，最低定量限分别为每反应10、10、50和10拷贝。对VZV、CMV、HHV6、EBV的最低检出限均为每反应5拷贝，最低定量限均为每反应50拷贝。两组在每反应2-2000拷贝数范围内呈现线性；对另外14种CNSI常见病原体(溶血葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、鲍曼不动杆菌、化脓性链球菌、大肠埃希菌、人葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、流感病毒、呼吸道合胞病毒、轮状病毒、腺病毒)进行检测，未发现交叉反应，特异性良好。
2)本发明提供了一种检测CNSI常见病毒的两组四重ddPCR方法，为病毒性CNSI的病原诊断提供了一种新手段，从而实现对CNSI患者的早期精准诊断和治疗，改善患者预后。其绝对定量、高敏感性、高特异性的优点使之具有良好的临床应用前景。
附图说明
图1为实施例1中组一四种质粒混合物的dd PCR检测结果二维图；
图2为实施例1中组二四种质粒混合物的dd PCR检测结果二维图；
图3为实施例2中组一线性试验试验结果二维图；
图4为实施例2中组二线性试验试验结果二维图；
图5为实施例3中组一特异性试验结果二维图；
图6为实施例3中组二特异性试验结果二维图；
图7为实施例4组一灵敏度试验浓度50拷贝/反应结果二维图；
图8为实施例4组一灵敏度试验浓度10拷贝/反应结果二维图；
图9为实施例4组一灵敏度试验浓度5拷贝/反应结果二维图；
图10为实施例4组二灵敏度试验浓度50拷贝/反应结果二维图；
图11为实施例4组二灵敏度试验浓度10拷贝/反应结果二维图；
图12为实施例4组二灵敏度试验浓度5拷贝/反应结果二维图；
图13为实施例5组一空白检出限结果二维图；
图14为实施例5组二空白检出限结果二维图；
图15为实施例6组一探针浓度第一次试验结果二维图；
图16为实施例6组一探针浓度第二次试验结果二维图；
图17为实施例6组二探针浓度第一次试验结果二维图；
图18为实施例6组二探针浓度第二次试验结果二维图；
图19为实施例6组二探针浓度第三次试验结果二维图；
图20为实施例7临床试验样品结果二维图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
所述方法如无特别说明均为常规方法，所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
实施例1
1)引物、探针和质粒的设计与合成
根据HPeV的5’UTR序列、HSV1的glycoprotein D序列、HSV2的envelopeglycoprotein G序列、CMV的UL55序列、EBV的EBNA-1序列、EV的5’UTR序列、VZV的ORF28序列、HHV6的U57序列，分别借助引物设计软件Primer Express3.0.1，设计得到分别针对HPeV、HSV1、HSV2、CMV、EBV、EV、VZV、HHV6的引物和探针序列，将设计好的引物和探针序列通过BLAST在线比对功能进行比对来初步验证其特异性。比对结果应该是每对引物探针与其相应病毒在数据库中所有序列完全互补或基本互补，不存在与其他物种序列交叉的情况。所有的引物探针送至上海生工合成。
根据引物设计时下载的各个病毒的保守序列，选取包含目的片段的序列作为目的基因插入至PUC57载体中，合成上述8种病毒的质粒，所有质粒均在上海生工合成。
上述设计的引物、探针的序列信息如下1表所示，质粒的序列信息如表2所示：
表1引物、探针的序列信息
表2质粒的序列信息
2)ddPCR反应体系
配置20μl的ddPCR反应体系如表3所示：
表3两组四重ddPCR扩增体系
其中，探针混合物的浓度如下表4所示：
表4探针混合物浓度
3)制备微滴
采用伯乐公司的QX200液滴数字PCR平台和ddPCR预混液试剂盒。将微滴发生卡(DG8 cartridge)固定在发生卡底座中，将配制好的20μl PCR反应液转移至微滴发生卡sample孔中，再加入70μl微滴发生油(droplet generation oil)至oil孔中，套上胶垫后将卡置于QX200TM微滴生成仪中制备反应微滴。每个微滴发生卡一次可同时完成8个样品的微滴制备，用时约2.5min，每孔约生成20000个油包水样的微滴，当微滴生成数<10000时，不符合泊松分布的原理，应当重新生成。
4)PCR扩增
将每个样品的微滴分别转移至96孔PCR反应板中对应的反应孔中，在96孔板上盖上铝膜，在PX1TMPCR热封仪中进行热封(180℃，5sec)后，于Bio-Rad T100 PCR仪上进行扩增。扩增程序见下表5所示：
表5 ddPCR扩增程序
5)微滴检测和数据分析
将PCR扩增后的96孔板放入QX200TM微滴分析仪中，在QuantaSoft软件的设置面板上设置好样本信息、试剂信息等，点击“run”按钮，仪器自动分析每个样品的每个微滴中荧光信号，然后，由QuantaSoft完成对数据的自动处理，获得靶序列在PCR反应体系中的拷贝数浓度(单位：copies/μl)。
分别以组一和组二4种质粒混合物为模板采用上述ddPCR方法进行检测，结果见图1～2所示，图1为组一四种质粒混合物的dd PCR检测结果二维图，其中图1中A群为EV阳性微滴群，B群为HSV2微滴群，C群为HPeV微滴群，D群为HSV1微滴群。图2为组二四种质粒混合物的dd PCR检测结果二维图；其中，A群为VZV阳性微滴群，B群为CMV微滴群，C群为HHV6微滴群，D群为EBV微滴群。
根据微滴群的位置即可判断病毒种类。
实施例2：线性度试验
配制参考品：每组4种质粒，使质粒参考品拷贝数分别2000、200、20、2拷贝，每个梯度重复3次。做线性回归曲线，R2值到达0.98以上，视为在线性范围内。配置参考品用的质粒浓度以单重ddPCR定量为准，再以此浓度进行梯度稀释至所需浓度，组一线性度试验结果二维图见图3，组二线性度试验结果二维图见图4。其中，X轴为理论浓度，Y轴为测量浓度，2-2000 4个浓度梯度，每个梯度3次重复。单位：拷贝数/反应。
从图3～4可以看出，两组在每反应2～2000拷贝范围内均呈现线性，对理论浓度与检测浓度进行线性回归，其R2分别为EV：0.9991，HPeV：0.9996，HSV1：0.9995，HSV2：1，CMV：0.9997，VZV：0.9997，HHV6：1，EBV：0.9999。
实施例3：特异性试验
按照实施例1中的ddPCR检测方法，利用以下14种病原体进行交叉反应验证：溶血葡萄球菌、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌(ATCC49619)、鲍曼不动杆菌、化脓性链球菌、大肠埃希菌(ATCC25922)、人葡萄球菌、铜绿假单胞菌(ATCC27853)、肺炎克雷伯菌、流感病毒、呼吸道合胞病毒、轮状病毒、腺病毒。结果见图5～6所示，图5为组一特异性试验结果二维图，图6为组二特异性试验结果二维图。
从图5～6可以看出，本申请提供的ddPCR检测方法对以上14种病原体均为阴性，无交叉反应，证明本申请的检测方法特异性良好。
实施例4：灵敏度试验
按照实施例1中的ddPCR检测方法，将实施例中8种质粒梯度稀释混合作为阳性模板混合物，确定该方法的最低检出限(limit of detection,LOD)、最低定量限(limit ofquantification,LOQ)。配制参考品，同组内4种质粒参考品梯度分别为：50拷贝、10拷贝、5拷贝、2拷贝。在每组20次重复试验中，至少19次检测为阳性，最低浓度则为该检测体系的灵敏度。把20个定量结果的CV值≤25％的最低浓度梯度定为最低定量限(limit ofquantification,LOQ)。配置参考品用的质粒浓度以单重ddPCR定量为准，再以此浓度进行梯度稀释至所需浓度。
灵敏度试验结果见表6～7和图7～12所示，其中图7为组一灵敏度试验浓度50拷贝/反应结果二维图示例；图8为组一灵敏度试验浓度10拷贝/反应结果二维图示例；图9为组一灵敏度试验浓度5拷贝/反应结果二维图；图10为组二灵敏度试验浓度50拷贝/反应结果二维图；图11为组二灵敏度试验浓度10拷贝/反应结果二维图；图12为组二灵敏度试验浓度5拷贝/反应结果二维图；以上图7～12中二维图均为20次重复中的一次。
表6组一病毒的LOQ和LOD
a：20次重复试验结果的均值，单位：拷贝数/反应；b：理论浓度
表7组二病毒的LOQ和LOD
从上表6～7和图7～12的结果可以看出，本申请的ddPCR方法检测灵敏度较好。
实施例5：空白检出限确定
取阴性的脑脊液样本10例，确认无8种病毒感染，确保提取过程、逆转录过程和环境中无病毒混入。将这10例脑脊液样本进行两组四重ddPCR反应，根据检测结果阳性微滴的个数，确定临床判读的空白检出限(limit of blank,LOB)。结果见图13～14，图13为组一空白检出限结果二维图；图14为组二空白检出限结果二维图；从图13可以看出，10例阴性脑脊液的检测结果，某些样本出现一个阳性微滴。从图14可以看出，10例阴性脑脊液的检测结果均为阴性。
结果：组一EV、HPeV、HSV1、HSV24种病毒的空白检出限(LOB)为1个阳性微滴，当阳性微滴数>1时，判为阳性，否则为阴性。组二VZV、CMV、HHV6、EBV 4种病毒的空白检出限(LOB)为0，阳性微滴数≥1即为阳性。
实施例6：优化试验
1)组一探针浓度优化
组一探针浓度第一次：200nM的EV-FAM探针、150nM的HSV2-FAM和50nM的VIC探针(FAM：VIC＝3:1)、50nM的HPeV-FAM探针和150nM的VIC探针(FAM：VIC＝1:3)、200nM的HSV1-VIC探针，图15所示为组一探针浓度第一次试验结果二维图。
组一探针浓度第二次：200nM的EV-FAM探针、100nM的HSV2-FAM和100nM的VIC探针(FAM：VIC＝1:1)、50nM的HPeV-FAM探针和150nM的VIC探针(FAM：VIC＝1:3)、400nM的HSV1-VIC探针，图16所示为组一探针浓度第二次试验结果二维图。
从图15和图16显示的微滴群的分布情况，最终选择第二次的探针浓度作为本申请的组一探针浓度。
2)组二探针浓度优化
组二探针浓度第一次：200nM的VZV-FAM探针、150nM的CMV-FAM和50nM的VIC探针(FAM：VIC＝3:1)、50nM的HHV6-FAM探针和150nM的VIC探针(FAM：VIC＝1:3)、200nM的EBV-VIC探针，图17所示为组二探针浓度第一次试验结果二维图。
组二探针浓度第二次：200nM的VZV-FAM探针、150nM的CMV-FAM和50nM的CMV-VIC探针(FAM：VIC＝3:1)、100nM的HHV6-FAM探针和100nM的HHV6-VIC探针(FAM：VIC＝1:1)、200nM的EBV-VIC探针，图18所示为组二探针浓度第二次试验结果二维图。
组二探针浓度第三次：400nM的VZV-FAM探针、150nM的CMV-FAM和50nM的VIC探针(FAM：VIC＝3:1)、50nM的HHV6-FAM探针和150nM的VIC探针(FAM：VIC＝1:3)、200nM的EBV-VIC探针，图19所示为组二探针浓度第三次试验结果二维图。
从图15～19显示的微滴群的分布情况，最终选择第三次的探针浓度作为本申请的组二探针浓度。
实施例7：临床样本检测
按照实施例1中的ddPCR检测方法对100例疑似病毒性CNSI患者的脑脊液进行了两组四重ddPCR检测。同时选中病毒阳性样本孔与阳性对照孔，样本孔阳性微滴群与对照重合，确保结果判读的准确性。图20为VZV+HHV6混合感染试验结果二维图(检测示例)。
检测结果显示，本申请的ddPCR检测结果与现有其他临床检测方法结果一致，说明本申请的ddPCR检测方法可以很好地用于临床样本的CNSI常见病毒病原体的检测。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本申请的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本申请进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本申请的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换，其均应涵盖在本申请请求保护的技术方案范围当中。
Claims (10)
1.一种用于检测中枢神经系统感染多种病毒的微滴数字PCR检测试剂盒，其特征在于，包括引物混合物I和探针混合物I；
所述引物混合物I包括HSV1检测引物、HSV2检测引物、EV检测引物、HPeV检测引物；
其中，HSV1检测引物包括SEQ ID No.2所示正向引物和SEQ ID No.3所示反向引物；HSV2检测引物包括SEQ ID No.5所示正向引物和SEQ ID No.6所示反向引物；EV检测引物包括SEQ ID No.14所示正向引物和SEQ ID No.15所示反向引物；HPeV检测引物包括SEQ IDNo.17所示正向引物和SEQ ID No.18所示反向引物；
所述探针混合物I包括HSV1检测探针HSV1-FAM、HSV2检测探针HSV2-FAM和HSV2-VIC、EV检测探针EV-FAM、HPeV检测探针HPeV-FAM和HPeV-VIC；
其中，HSV1-FAM具有SEQ ID No.1所示序列，5’端采用FAM基因标记；HSV2-FAM和HSV2-VIC具有SEQ ID No.4所示序列，5’端分别采用FAM和VIC基因标记；EV-FAM具有SEQ IDNo.13所示序列，5’端采用FAM基因标记；HPeV-FAM和HPeV-VIC具有SEQ ID No.16所示序列，5’端分别采用FAM和VIC基因标记。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物混合物I中各引物的浓度为300～500nM；
优选地，所述引物混合物I中各引物的浓度为400nM。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述探针混合物I中各探针的浓度为50～500nM。
4.根据权利要求1或3所述的试剂盒，其特征在于，EV-FAM浓度为200nM；HSV2-FAM浓度为100nM；HSV2-VIC浓度为100nM；HPeV-FAM浓度为50nM；HPeV-VIC浓度为150nM；HSV1-VIC浓度为400nM。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括引物混合物II和探针混合物II；
所述引物混合物II包括CMV检测引物、EBV检测引物、VZV检测引物和HHV6检测引物；
其中，CMV检测引物包括SEQ ID No.8所示正向引物和SEQ ID No.9所示反向引物；EBV检测引物包括SEQ ID No.11所示正向引物和SEQ ID No.12所示反向引物；VZV检测引物包括SEQ ID No.20所示正向引物和SEQ ID No.21所示反向引物；HHV6检测引物包括SEQ IDNo.23所示正向引物和SEQ ID No.24所示反向引物；
所述探针混合物II包括CMV检测探针CMV-FAM和CMV-VIC、EBV检测探针EBV-FAM、VZV检测探针VZV-FAM、HHV6检测探针HHV6-FAM和HHV6-VIC；
其中，CMV-FAM和CMV-VIC具有SEQ ID No.7所示序列，5’端分别采用FAM和VIC基因标记；EBV-FAM具有SEQ ID No.10所示序列，5’端采用FAM基因标记；VZV-FAM具有SEQ IDNo.22所示序列，5’端采用FAM基因标记；HHV6-FAM和HHV6-VIC具有SEQ ID No.25所示序列，5’端分别采用FAM和VIC基因标记。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，VZV-FAM浓度为400nM；CMV-FAM浓度为150nM；CMV-VIC浓度为50nM；HHV6-FAM浓度为50nM；HHV6-VIC浓度为150nM；EBV-VIC浓度为200nM。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：
1)提取待测样品核酸；
2)配制四重ddPCR扩增体系，所述扩增体系包括引物混合物和探针混合物；
3)制备微滴：将配制好的PCR反应液转移至微滴发生卡sample孔中，再加入微滴发生油至oil孔中，套上胶垫后将卡置于QX200TM微滴生成仪中制备反应微滴；
4)PCR扩增：将每个样品的微滴分别转移至96孔PCR反应板中对应的反应孔中，热封后在PCR仪上进行扩增；
5)进行微滴检测和数据分析。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述待测样品为脑脊液。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，步骤4)所述PCR扩增的扩增程序为：96℃预变性10min；98℃变性30s，55℃退火1min，共40个循环；55℃2min。
10.如权利要求1～9任一项权利要求所述的试剂盒在制备病毒性中枢神经系统感染检测产品中的应用。
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| CN202211065929.3A CN116479169A (zh) | 2022-09-01 | 2022-09-01 | 一种用于检测中枢神经系统感染多种病毒的微滴数字pcr检测试剂盒及应用 |
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| CN202211065929.3A CN116479169A (zh) | 2022-09-01 | 2022-09-01 | 一种用于检测中枢神经系统感染多种病毒的微滴数字pcr检测试剂盒及应用 |
Publications (1)
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