CN116462720A - 一种二糖的晶体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种二糖的晶体,具体涉及一种HMO新晶型。属于酶催化反应液或微生物发酵液的分离纯化技术领域。本发明的技术方案是:一种LNB晶型A,其粉末X射线衍射图谱在衍射角(2θ±0.2°)为6.28、9.59、10.30和19.33处具有特征峰。本发明还提供了LNB晶型B,其粉末X射线衍射图谱在衍射角(2θ±0.2°)为6.25、9.58、19.31处具有特征峰。本发明所述LNB晶型性质稳定,解决了无定型粉末在存放过程中的稳定性问题。所述LNB晶型的制备方法,操作简单,适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种人乳寡糖的晶型,属于酶催化反应液或微生物发酵液的分离纯化技术领域。
背景技术
母乳是碳水化合物、脂肪、蛋白质、维生素和微量元素等组成的复杂混合物,是婴幼儿营养的黄金标准。其中,人乳寡糖(Human Milk Oligosaccharides,HMOs),或称为母乳低聚糖,被发现是母乳中除了乳糖和脂肪的第3大固体组分,其种类多达上百种,结构复杂。人乳寡糖都含有一个乳糖(Gal-β-1,4-Glc)在还原末端,并在这基础上以β-1,3或β-1,6键连接乳糖-N-二糖(Gal-β-1,3-N-GlcNAc,I型链结构)或者连接N-乙酰氨基乳糖(Gal-β-1,4-N-GlcNAc,II型链结构)延伸糖链,形成乳糖-N-四糖、乳糖-N-新四糖、乳糖-N-六糖等核心结构,在核心结构的基础上,糖链可以被不同数目的岩藻糖和唾液酸修饰形成多种多样的寡糖结构。HMOs已被证实其对于婴幼儿的健康发育起着十分重要的作用。
乳糖-N-二糖(Lacto-N-biose,简称LNB,CAS:50787-09-2,化学式如式I)是HMOs重要的核心构造之一,被发现是具有生物活性的益生元,可促进肠道中双歧杆菌增殖,抑制病原体定殖,对预防婴幼儿感染性腹泻、增强婴幼儿免疫力具有积极的作用;另一方面还对婴幼儿的大脑认知发育产生有益影响。目前,一般通过化学法或生物法制备LNB,所得反应液经分离纯化后可通过蒸发浓缩后过滤干燥、冷冻技术或喷雾干燥的方式获得其固体形式。
喷雾干燥法是较常用方法,但在喷雾过程中原料易粘在设备的内壁,喷雾过程存在物料损失,高温引发的一些原料的物理化学性质变化、所得到的无定型粉末吸湿性强等缺陷,给产品的贮存和使用增加了难度。CN110483652A记载了冷冻干燥法获得了无定型固体形式的人乳寡糖(HMOs)的技术,但获得的冻干粉在其保存、运输等过程也需要冷冻和/或低温,这给产品的保存和使用提升了成本和难度;且冻干过程存在设备投入大,冻干过程能耗巨大、生产效率低的缺陷。
稳定性实验发现,无定型固体形式的LNB在存放过程中存在含量下降和吸湿结块等稳定性问题。
中国专利CN113331429A记载了乳糖-N-二糖(LNB)热稳定性差的特点,通过将乳糖-N-二糖包埋在蛋白质/多糖纳米粒子中解决了热稳定性问题。
综上,亟需开发一种稳定的LNB固体,以解决存放过程中的稳定性问题。
发明内容
发明目的:提供一种稳定的LNB晶型及其制备方法,实现LNB分离纯化技术和固体产品形态的迭代,为工业化大规模生产提供成本较低且高效的可靠技术。
本发明的技术方案是:
具体地,本发明的第一方面,提供了一种LNB晶型A,其粉末X射线衍射图谱在衍射角(2θ±0.2°)为6.28、9.59、10.30和19.33处具有特征峰。
优选的,所述LNB晶型A,其粉末X射线衍射谱在衍射角(2θ±0.2°)为6.28、8.23、9.59、10.30、16.24、19.33、20.55、21.20、21.54和22.52处具有特征峰。
优选的,所述LNB晶型A,其粉末X射线衍射谱在衍射角(2θ±0.2°)为6.28、8.23、9.59、10.30、16.24、19.33、20.55、21.20、21.54、22.52、25.08、26.52、28.85、39.51和39.50处具有特征峰。
本发明的第二方面,本发明提供了一种LNB晶型B,其粉末X射线衍射图谱在衍射角(2θ±0.2°)为6.25、9.58、19.31处具有特征峰。
优选的,所述LNB晶型B,其粉末X射线衍射谱在在衍射角(2θ±0.2°)为6.25、9.58、19.31、20.55和23.40处具有特征峰。
优选的,所述LNB晶型B,其粉末X射线衍射谱在在衍射角(2θ±0.2°)为6.25、9.58、16.25、19.31、19.77、20.55、21.36、22.59、23.40、23.80和26.52处具有特征峰。
以上所述X射线衍射分析,根据《中国药典》(2020版)四部0451规定的X射线衍射法(第二法粉末X射线衍射法)进行。
本发明所述LNB晶型A与晶型B具有相同的熔点范围,为184-186℃范围。
本发明的第三方面,提供了LNB晶型的制备方法。
优选的,所述LNB晶型A的制备方法,为在含有LNB的丙酮水溶液中,分离LNB固体。
优选的,所述LNB晶型B的制备方法,为在含有LNB的乙醇水溶液中,分离LNB固体。
本发明所述LNB晶型A、或晶型B的制备方法,具体的,包括如下步骤:
步骤1.制备含LNB的溶液,备用。优选的,所述LNB溶液浓度在0.2-0.6g/mL;
步骤2.降温步骤1所得含LNB溶液,备用;
优选的,降温至25℃及或低于25℃的温度,更优选的,制备晶型A时,降温速率以0.8-2.0℃/min为宜,不宜过快;备用。降温速度高于2.0℃/min,会影响结晶晶型的纯度。
制备晶型B时,降温速率以0.4-0.6℃/min为宜,不宜过快;降温速度高于0.6℃/min,或低于0.4℃/min,会影响结晶晶型的纯度。
步骤3.搅拌下,向步骤2溶液中流加丙酮,获得晶型A。
搅拌下,向步骤2溶液中加入无水乙醇或乙醇水溶液,获得晶型B;或,搅拌下,向步骤2溶液中流加乙醇,获得晶型B。
优选的,所述丙酮的添加量等于或者大于水的体积,优选的,以水与丙酮的体积比为1:2-4.5为宜;更优选的为1:2.5-4,进一步优选的为1:3。当所用丙酮的体积低于水体积的2倍(体积)时,会影响LNB晶型A产品的纯度;当所用丙酮的用量高于水体积的4.5倍以上时,会影响LNB晶型A的收率。
优选的,搅拌下,流加丙酮,流加速率为0.6-1.9mL/min;流加结束后,搅拌下养晶;
优选的,所述丙酮的添加方式为:搅拌下,流加丙酮,流加速率为0.9-1.5mL/min;流加结束后,搅拌下养晶;流加速率低于0.6mL/min,影响生产效率;流加速率高于1.9mL/min,将影响结晶晶型的形成,甚至不能获得本发明所述晶型A。
优选的,所述无水乙醇或乙醇水溶液的添加量等于或者大于水的体积,优选的,以水与乙醇(以无水乙醇计)的体积比为1:2-5为宜;更优选的为1:3-4,进一步优选的为1:3.2-3.6。当所用乙醇的体积低于水体积的2倍(体积)时,会影响LNB晶型B产品纯度;当所用乙醇的用量高于水体积的5倍以上时,会影响LNB晶型B的收率。
优选的,所述无水乙醇或乙醇水溶液的添加方式为:搅拌下,流加乙醇或乙醇水溶液,流加速率为1.2-2.5mL/min;流加结束后,搅拌下养晶;流加速率低于1.2mL/min,影响生产效率;流加速率高于2.5mL/min,将影响晶型B的形成,甚至不能获得本发明所述晶型B。
本步骤工艺也可以添加晶种,所述晶种为晶型A或晶型B;
优选的,结晶过程的搅拌速率为100r/min以上。
优选的,丙酮或乙醇流加结束后,继续搅拌,养晶时间为不低于12小时为宜。
优选的,本发明所述LNB晶型A或晶型B,可以是经脱色、除盐等方式纯化后的含LNB的发酵液添加丙酮或乙醇后冷却结晶获得;也可以是LNB固体制备为水溶液后,向其中添加丙酮或乙醇后冷却结晶获得。所述冷却结晶,指冷却至25℃以下的温度。
本发明所述乳糖-N-二糖(LNB)晶型A、或晶型B既可以作为合成其他糖或化合物的中间体,也可以作为乳制品或食品的营养补充剂。
本发明所述LNB的来源,可以是据现有技术制备的反应液,纯化后制备为固体形式,如经喷雾干燥或冷冻干燥技术获得LNB固体。
有益效果
本发明提供了LNB晶型A和晶型B,并提供其制备方法。所述LNB晶型A和晶型B性质稳定,克服了无定型粉末在存放过程中的稳定性问题。所述LNB晶型A和晶型B的制备方法,操作简单,适合工业化生产。
附图说明
图1.LNB晶型A的X射线粉末衍射图。
图2.LNB晶型B的X射线粉末衍射图。
图3.LNB无定型粉末和晶型A稳定性实验前的形态(左边为LNB无定型粉末,右边为本发明LNB晶型A)。
图4.LNB无定型粉末和晶型A稳定性实验后的形态(左边为LNB无定型粉末,右边为本发明LNB晶型A)。
图5.LNB无定型粉末和晶型B稳定性实验前的形态(左边为LNB晶型B,右边为LNB无定型粉末)
图6.LNB无定型粉末和晶型B稳定性实验后的形态(左边为LNB晶型B,右边为LNB无定型粉末)。
具体实施方式
应该指出,以下说明和实施例都是示例性的,旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明,但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法,通常按照常规条件进行。
实施例产品的LNB含量采用HPLC方法测定。检测条件为:色谱柱型号:Aminex HPX-87H(300×7.8mm),流动相为5mM H2SO4水溶液,柱温30℃,进样体积10μL,紫外检测器(日立Chromaster),波长210nm,流速0.5mL/min。
根据中国药典(2020版)附录0451规定的X射线衍射法(第二法粉末X射线衍射法)对实施例所得晶型进行X-射线衍射(XRD)检测。
根据GB/T21781-2008《化学品的熔点及熔融范围试验方法毛细管法》规定的方法,对实施例所得固体或晶型进行熔点检测。
实施例1.LNB反应液的制备及无定型粉末的获得
参考申请号为201911055516.5,名称为“一种合成乳-N-二糖的方法”的中国专利实施例3所记载的方法。
“在1mL反应体系中加入10mM半乳糖,5mM ATP,5mM乙酰磷酸,10mM GlcNAc,3mMMgCl2,100mM Tris-HCl,5U Galk,3U ACK,168U LNBP。37℃反应12h后,反应体系煮沸5min,离心取上清,过滤膜后,Biorad-HPX柱,得含有LNB的反应液。”
将如上反应体系放大为10L,得含有LNB的反应液,取其二分之一于50℃快速喷雾干燥,得固体粉末,为无定型固体粉末,HPLC法测得纯度为94.72%,熔点165.2℃。
实施例2.LNB晶型A的结晶研究
步骤1.取实施例1所得LNB固体粉末8g,加入20mL纯化水,50-60℃下轻轻搅拌至完全溶解。
步骤2.过滤步骤1所得溶液,滤液搅拌下降温至25℃,降温速率1.4℃/min,向其中加入60mL丙酮,流加速率为1.3mL/min,搅拌下,养晶48h。
步骤3.抽滤,用0-8℃预冷的丙酮洗涤,在真空度1Pa、温度-20℃条件下真空冷冻干燥得LNB晶体。HPLC测定LNB晶体的纯度,通过标曲计算所得LNB晶体纯度为98.56%。收率83%,熔点185.5℃,X射线粉末衍射图见图1,衍射峰及相关特征数据见表1,称该晶型为晶型A。
表1
实施例3.LNB晶型A的结晶研究
步骤1.取实施例1所得LNB固体粉末5g,加入25mL纯化水,50-60℃下轻轻搅拌至完全溶解。
步骤2.过滤步骤1所得溶液,滤液搅拌下降温至20℃,降温速率2.0℃/min,向其中加入丙酮50mL,流加速率为0.6mL/min,搅拌下,养晶48h。
步骤3.抽滤,用0-8℃预冷的丙酮洗涤,在真空度1Pa、温度-20℃条件下真空冷冻干燥得LNB晶体。
HPLC测定LNB晶体的纯度,通过标曲计算所得LNB晶体纯度为98.12%。收率80.6%;其X射线粉末衍射图谱同实施例2所得晶型A;熔点184.3℃。
实施例4.LNB晶型A的结晶研究。
步骤1.取实施例1所得LNB固体粉末15g,加入25mL纯化水,50-60℃下轻轻搅拌至完全溶解。
步骤2.过滤步骤1所得溶液,滤液搅拌下降温至20℃,降温速率0.8℃/min,向其中加入丙酮112.5mL,流加速率为1.9mL/min,搅拌下,养晶40h。
步骤3.抽滤,用0-8℃预冷的丙酮洗涤,在真空度1Pa、温度-20℃条件下真空冷冻干燥得LNB晶体。
HPLC测定LNB晶体的纯度,通过标曲计算所得LNB晶体纯度为98.87%。收率78.6%,其X射线粉末衍射图谱同实施例2所得晶型A,熔点185.6℃。
实施例5.LNB晶型A的结晶研究。
将实施例1所得含有LNB的纯化后反应液,进行如下处理。
步骤1.将如上含有LNB的纯化后反应液,在50℃下旋蒸浓缩,得LNB浓缩液(LNB浓度为400-600g/L)。
步骤2.取10mL步骤1所得浓缩液,过滤,滤液搅拌下降温至25℃,降温速率1.5℃/min,向其中加入0.06g晶种引晶,加入丙酮30mL,搅拌下,流加速率为1.5mL/min,静止养晶48h。
步骤3.抽滤,用0-8℃预冷的丙酮洗涤,在真空度1Pa、温度-20℃条件下真空冷冻干燥得LNB晶体。
HPLC测定LNB晶体的纯度,通过标曲计算所得LNB晶体纯度为99.06%。收率81.4%,熔点185.8℃,其X射线粉末衍射图谱同实施例2所得晶型A。
对照例1.降温速率及丙酮流加速度对LNB的结晶影响研究。
步骤1.取实施例1所得LNB固体粉末5g,加入25mL纯化水,50-60℃下轻轻搅拌至完全溶解。
步骤2.过滤步骤1所得溶液,滤液搅拌下降温至10℃,降温速率2.5℃/min,向其中加入丙酮50mL,流加速率为2.5mL/min,搅拌下,养晶40h。
步骤3.抽滤,用0-8℃预冷的丙酮洗涤,在真空度1Pa、温度-20℃条件下真空冷冻干燥得LNB晶体。
HPLC测定LNB晶体的纯度,通过标曲计算所得LNB晶体纯度为93.36%。收率75.5%,熔点170.4℃。
对照例2.降温速率、丙酮加量及流加速度对LNB的结晶影响研究。
步骤1.取实施例1所得LNB固体粉末5g,加入25mL纯化水,50-60℃下轻轻搅拌至完全溶解。
步骤2.过滤步骤1所得溶液,滤液搅拌下降温至10℃,降温速率0.4℃/min,向其中加入丙酮130mL,流加速率为3.0mL/min,搅拌下,养晶40h。
步骤3.抽滤,用0-8℃预冷的丙酮洗涤,在真空度1Pa、温度-20℃条件下真空冷冻干燥得LNB晶体。
HPLC测定LNB晶体的纯度,通过标曲计算所得LNB晶体纯度为95.82%。收率62.5%,熔点173.4℃。
实施例6.LNB晶型B的结晶研究。
步骤1.取实施例1所得LNB固体粉末8g,加入20mL纯化水,50-60℃下轻轻搅拌至完全溶解。
步骤2.过滤步骤1所得溶液,滤液搅拌下降温至25℃,降温速率0.5℃/min,向其中加入无水乙醇68mL,流加速率为1.8mL/min,搅拌下,养晶40h。
步骤3.抽滤,用0-8℃预冷的无水乙醇洗涤,在真空度1Pa、温度-20℃条件下真空冷冻干燥得LNB晶体。
然后通过HPLC测定LNB晶体的纯度,通过标曲计算所得LNB晶体纯度为98.56%,熔点185.9℃,收率81%,X射线粉末衍射图见图2,衍射峰及相关特征数据见表2,称该晶型为晶型B。
表2
实施例7.LNB晶型B的结晶研究。
步骤1.取实施例1所得LNB固体粉末5g,加入25mL纯化水,50-60℃下轻轻搅拌至完全溶解。
步骤2.过滤步骤1所得溶液,滤液搅拌下降温至20℃,降温速率0.4℃/min,向其中加入无水乙醇50mL,流加速率为1.2mL/min,搅拌下,养晶48h。
步骤3.抽滤,用0-8℃预冷的无水乙醇洗涤,在真空度1Pa、温度-20℃条件下真空冷冻干燥得LNB晶体。
然后通过HPLC测定LNB晶体的纯度,通过标曲计算所得LNB晶体纯度为98.16%,收率80.6%,熔点184.2℃,其X射线粉末衍射图谱同实施例6所得晶型B。
实施例8.LNB晶型B的结晶研究。
步骤1.取实施例1所得LNB固体粉末15g,加入25mL纯化水,50-60℃下轻轻搅拌至完全溶解。
步骤2.过滤步骤1所得溶液,滤液搅拌下降温至20℃,降温速率0.6℃/min,向其中加入无水乙醇125mL,流加速率为2.5mL/min,搅拌下,养晶40h。
步骤3.抽滤,用0-8℃预冷的无水乙醇洗涤,在真空度1Pa、温度-20℃条件下真空冷冻干燥得LNB晶体。
然后通过HPLC测定LNB晶体的纯度,通过标曲计算所得LNB晶体纯度为98.5%,收率78.5%,其X射线粉末衍射图谱同实施例6所得晶型B,熔点185.6℃。
实施例9.LNB晶型B的结晶研究。
将实施例1所得含有LNB的反应液,进行如下处理。
步骤1.将如上LNB纯化液,在50℃下旋蒸浓缩,得LNB浓缩液(LNB浓度为400 -600g/L)。
步骤2.取步骤1所得浓缩液10mL,过滤,滤液搅拌下降温至25℃,降温速率0.5℃/min,向其中加入0.06g晶种引晶,加入无水乙醇35mL,搅拌下,流加速率为1.8mL/min,静止养晶48h。
步骤3.抽滤,用0-8℃预冷的无水乙醇洗涤,在真空度1Pa、温度-20℃条件下真空冷冻干燥得LNB晶体。
然后通过HPLC测定LNB晶体的纯度,通过标曲计算所得LNB晶体纯度为99.02%,收率78%,其X射线粉末衍射图谱同实施例6所得晶型B,熔点185.7℃。
对照例3.降温速率、乙醇添加量及流加速度对LNB的结晶影响研究。
步骤1.取实施例1所得LNB固体粉末15g,加入25mL纯化水,50-60℃下轻轻搅拌至完全溶解。
步骤2.过滤步骤1所得溶液,滤液搅拌下降温至10℃,降温速率0.8℃/min,向其中加入无水乙醇40mL,流加速率为3.5mL/min,搅拌下,养晶40h。
步骤3.抽滤,用0-8℃预冷的无水乙醇洗涤,在真空度1Pa、温度-20℃条件下真空冷冻干燥得LNB固体。
然后通过HPLC测定LNB晶体的纯度。通过标曲计算所得LNB晶体纯度为94.32%,收率78.5%,熔点175.4℃。
对照例4.降温速率、乙醇添加量及流加速度对LNB的结晶研究。
步骤1.取实施例1所得LNB固体粉末10g,加入25mL纯化水,50-60℃下轻轻搅拌至完全溶解。
步骤2.过滤步骤1所得溶液,滤液搅拌下降温至10℃,降温速率0.2℃/min,向其中加入无水乙醇150mL,流加速率为3.5mL/min,搅拌下,养晶40h。
步骤3.抽滤,用0-8℃预冷的无水乙醇洗涤,在真空度1Pa、温度-20℃条件下真空冷冻干燥得LNB晶体。
然后通过HPLC测定LNB晶体的纯度。通过标曲计算所得LNB晶体纯度为94.54%,收率58.5%,熔点170.8℃。
实施例10.稳定性研究
分别称取实施例1所得喷雾干燥LNB固体粉末、实施例2-9所得LNB晶体各5g(准确至0.0001g),装在聚乙烯塑料袋内,密封。置于温度:40℃±2℃,相对湿度:75%±5%的恒温恒湿箱中,放置7天,分别取出称重,计算增重;并检测LNB含量和熔点;观察外观变化。结果记录于表3-6。
表3.晶型A稳定性实验0天样品质量研究
表4.晶型A稳定性实验第7天样品的质量研究
表5.晶型B稳定性实验0天样品的质量研究
样品 | LNB,% | 熔点,℃ | 外观 |
实施例1无定型粉末 | 94.72 | 165.2 | 类白色均匀粉末 |
实施例6晶型B | 98.56 | 185.9 | 类白色均匀晶体 |
实施例7晶型B | 98.16 | 184.2 | 类白色均匀晶体 |
实施例8晶型B | 98.54 | 185.6 | 类白色均匀晶体 |
实施例9晶型B | 99.02 | 185.7 | 类白色均匀晶体 |
表6.晶型B稳定性实验第7天样品的质量研究
稳定性试验说明:
实施例1喷雾方法所得无定型粉末,在稳定性实验后,其颜色变深(附图3-6),有较大团结颗粒,且LNB含量降低。本发明所得晶型A、晶型B在稳定性实验后,其颜色、含量均没有明显变化。
如上说明:本发明所得LNB晶型A、晶型B,具有理想的稳定性,有利于产品的贮存,解决了无定型LNB的稳定性问题。
应注意的是,以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明,但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种LNB晶型A,其特征在于,其粉末X射线衍射图谱在衍射角(2θ±0.2°)为6.28、
9.59、10.30和19.33处具有特征峰。
2.如权利要求1所述LNB晶型A,其特征在于,其粉末X射线衍射谱在衍射角(2θ±0.2°)为6.28、8.23、9.59、10.30、16.24、19.33、20.55、21.20、21.54和22.52处具有特征峰。
3.如权利要求1所述LNB晶型A,其特征在于,其粉末X射线衍射谱在衍射角(2θ±0.2°)为6.28、8.23、9.59、10.30、16.24、19.33、20.55、21.20、21.54、22.52、25.08、26.52、
28.85、39.51和39.50处具有特征峰。
4.一种LNB晶型B,其特征在于,其粉末X射线衍射图谱在衍射角(2θ±0.2°)为6.25、
9.58、19.31处具有特征峰。
5.如权利要求4所述LNB晶型B,其特征在于,其粉末X射线衍射谱在衍射角(2θ±0.2°)为6.25、9.58、19.31、20.55和23.40处具有特征峰。
6.如权利要求4所述LNB晶型B,其特征在于,其粉末X射线衍射谱在衍射角(2θ±0.2°)为6.25、9.58、16.25、19.31、19.77、20.55、21.36、22.59、23.40、23.80和26.52处具有特征峰。
7.如权利要求1-3任一项所述LNB晶型A,或权利要求4-6任一项所述LNB晶型B,其特征在于,其熔点在184-186℃范围。
8.如权利要求1-3任一项所述LNB晶型A的制备方法,其特征在于,在含有LNB的丙酮水溶液中分离LNB固体。
9.如权利要求4-6任一项所述LNB晶型B的制备方法,其特征在于,在含有LNB的乙醇水溶液中分离LNB固体。
10.如权利要求8所述LNB晶型A、或权利要求9所述LNB晶型B制备方法,其特征在于,所述LNB晶型的制备方法,包括如下步骤:
步骤1.制备LNB水溶液,备用;
步骤2.降温步骤1所得含LNB溶液至25℃或低于25℃,备用;
步骤3.搅拌下,向步骤2溶液中流加丙酮或乙醇;
步骤4.分离、洗涤,干燥步骤3所得晶型。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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