CN116445305A - 一种利用木糖生产角鲨烯的海洋真菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株能高效利用木糖的类酵母菌株SD685（Pseudozyma sp.SD685），保藏于位于湖北省武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 20221416，保藏日期为2022年9月13日。所述类酵母菌SD685利用诱变结合实验室定向进化技术筛选获得，能够以木糖为碳源发酵生产角鲨烯，解决了农林废弃物综合利用中木糖难利用的问题，同时实现了高附加值产品角鲨烯的生产。此外，所述类酵母菌SD685也能够以葡萄糖为碳源发酵生产角鲨烯，能够实现对木质纤维素原料水解液中木糖和葡萄糖的充分利用。综上可知，本发明所述的类酵母菌SD685解决了木质纤维素综合利用特别是木糖利用的问题，实现了木质纤维素的高值化利用，具有重要的经济效益前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种能利用木糖的海洋真菌及其利用木糖生产角鲨烯的方法。
背景技术
天然木质纤维原料在世界范围拥有极高的产量，是储量丰富、廉价易得的可再生资源，因此，木质纤维素是转化生产天然绿色能源及功能物质的理想底物。木质纤维素生物质主要由纤维素、半纤维素和木质素构成，常见于农作物秸秆、杂草、木材废料及其它固体废弃物中，可用于工业生产醇类、微生物油脂和有机酸等化学品。但木质纤维降解后成分复杂，与纤维素降解生成的葡萄糖相比，半纤维素降解产生的木糖更难被微生物利用，例如：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)能很容易地利用纤维素水解生成的葡萄糖发酵产乙醇，但难以利用木糖，这极大地限制了木质纤维素资源的利用。
为了解决这一问题，研究人员针对木糖利用宿主菌的开发进行了研究。发明专利ZL201810541718.X公开了“发酵木糖生产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌及用途”。该专利提供了谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)Cev-18-5，能够在以木糖为唯一碳源的基本盐培养基快速生长，高效利用木糖，且厌氧条件下的琥珀酸产率也有明显提升。发明专利ZL201910299026.3公开了“利用木糖生产丁醇的工程菌株及其构建方法和应用”。该专利提供了一种构建重组菌的方法，所述的重组菌可以利用木糖为碳源生产丁醇，提高生物质的利用率，实现木质纤维素的有效利用。
角鲨烯(squalene)是一种开链三萜，具有增强机体免疫能力、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤等多种生理功能，是一种无毒性的具有防病治病作用的海洋生物活性物质，广泛应用于医药、美容、化妆品、食品等各个领域。目前角鲨烯的来源主要是鱼油，尤其是鲨鱼肝油。但随着渔业资源的日益枯竭及相关法规的日臻完善，促使人们努力寻找其它的角鲨烯来源。如从橄榄油、棕榈油进行提取，以及在来自谷类或源自苋属植物、种子、米糠或小麦胚芽的油中进行分离是可能的。然而，这种方法提取的角鲨烯量很小，按重量计大约从0.1％至0.7％，难以满足需要。基于这种情况，研究人员提出了采用微生物发酵的方法生产角鲨烯的技术方案。发明专利CN 102787074 A、CN 103748212 A公布了一株产角鲨烯的类酵母菌株，其干菌体中角鲨烯的质量百分含量为1％。发明专利CN 104560731B利用一株高产角鲨烯的类酵母菌株使角鲨烯产量提高到10g/L以上。发明专利CN 108866112 B以木质纤维素类农林废弃物为原料经过预处理、糖化、类酵母菌发酵过程实现了角鲨烯的高效制备。然而，这些能生产角鲨烯的高效菌株均采用葡萄糖为碳源，不能利用木糖作为生长的底物，不能解决农林废弃物综合利用特别是木糖利用的问题。
目前，尚未见能够以木糖为碳源发酵生产角鲨烯的菌株的相关报道。
发明内容
针对现有技术中微生物发酵生产角鲨烯所存在的问题，本发明提供了一株能高效利用木糖的类酵母菌株SD685，并通过高密度发酵技术实现了角鲨烯的生产。所述的菌株利用诱变结合实验室定向进化技术筛选获得，解决了木质纤维素综合利用特别是木糖利用的问题，实现了木质纤维素的高值化利用。
本发明的技术方案：一株发酵木糖生产角鲨烯的类酵母菌，分类命名为类酵母菌SD685(Pseudozyma sp.SD685)，保藏于位于湖北省武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 20221416，保藏日期为2022年9月13日。所述类酵母菌SD685能够以木糖为碳源发酵生产角鲨烯，解决了农林废弃物综合利用中木糖难利用的问题，同时实现了高附加值产品角鲨烯的生产。此外，所述类酵母菌SD685也能够以葡萄糖为碳源发酵生产角鲨烯，能够实现对木质纤维素原料水解液中木糖和葡萄糖的充分利用。
所述的类酵母菌SD685在以木糖为碳源发酵生产角鲨烯中的应用。其中，所述的碳源为纯木糖、木糖-葡萄糖混合物或木质纤维素原料水解液。
一种采用木糖为碳源发酵生产角鲨烯的方法，以所述的类酵母菌SD685为出发菌株，利用含有木糖或木质纤维素原料水解液的培养基进行发酵培养，即可获得含有角鲨烯的类酵母菌培养物。具体步骤为：
(1)将类酵母菌菌株SD685接种于含低浓度木糖的种子培养基中，然后在30-37℃的温度条件，200-250rpm转速条件下培养24-48h，获得种子液；所述的低浓度为20-30g/L。
(2)将步骤(1)得到的种子液按照体积比5-10％(v/v)的接种量，接入含木糖或木质纤维素原料水解液的发酵培养基中，在30-37℃、通气量1-2vvm、搅拌转速400-1000rpm下发酵120 -144h，得到高含量角鲨烯的发酵类酵母菌培养物；所述发酵培养基中木糖的浓含量不高于120g/L。
其中，所述的木质纤维素原料水解液采用下述方法处理得到：(a)氨水处理：将粉碎的木质纤维素原料和氨水按一定的重量体积比装入密闭装置中，在110-120℃的温度条件下处理100-150min；反应结束后，去除溶解有木质素的氨水黑液，保留固体渣。其中，所述木质纤维素原料和氨水的重量体积比为1:5-1:10(kg：L)，所述的氨水是浓度为25％的市售氨水。所述的木质纤维原料为玉米秸秆、麦秆或稻杆等。(b)酶解：将步骤(1)得到的固体渣转移至厌氧装置中，添加适量纤维素酶和半纤维素酶，然后在pH5.5，温度50℃的条件下反应时间12h，即得到木质纤维素原料水解液。所述纤维素酶的添加量为5-10FPU，所述半纤维素酶的添加量为2-5FPU。
优选的是，步骤(2)所述发酵培养基中木糖的含量为50-100g/L。
一种获得所述的类酵母菌SD685的方法，包括以下步骤：
(1)重离子诱变：使用含有10g/L海水晶的YPD培养基培养野生型类酵母菌(Pseudozymasp.)WT至对数生长期，然后进行重离子束12C6+辐射诱变；其中，离子束能量为80Mev/u，辐射强度为280Gy；
(2)定向进化：将重离子诱变后的细胞接种到木糖浓度为10g/L的种子培养基中；当细胞生长进入稳定期，将体积比2％(v/v)培养物重新接种到新鲜的前述种子培养基中，重复5轮；然后将体积比2％(v/v)的培养物接种到木糖浓度为30g/L的种子培养基中，重复5轮；如此反复直至木糖浓度达到110g/L，得到高效利用木糖的类酵母菌SD685。
本发明的有益效果：
(1)本发明利用诱变结合实验室定向进化技术进行筛选，获得一种能利用木糖发酵生产角鲨烯的类酵母菌株SD685，填补了现有技术的空白。
(2)本申请所述的类酵母菌菌株SD685不但能够利用木糖，也能够利用葡萄糖获得高角鲨烯含量的类酵母菌培养物，显著增加了该菌株的实际应用前景。
(3)本申请所述的类酵母菌菌株SD685实现了木质纤维原料水解液中糖(木糖和葡萄糖)的充分利用，不但解决了农林废弃物综合利用中木糖难利用的问题，而且实现了高附加值产品角鲨烯的生产，具有重要的经济效益前景。
附图说明
附图1为采用高浓度木糖培养类酵母SD685时发酵体系中木糖浓度的变化；批次发酵培养方式，不进行补料。
附图2为采用高浓度木糖培养类酵母SD685时发酵体系中木糖浓度的变化；批次补料发酵培养方式，补料。
附图3为高浓度玉米秸秆水解液培养类酵母SD685时发酵体系中总糖浓度的变化；批次补料发酵培养方式，补料。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1：利用木糖培养野生型类酵母菌WT(批次发酵培养方式：不进行补料)
将从温州乐清湾红树林采集的样品中分离得到的野生型类酵母菌(Pseudozymasp.)WT菌株接入接入装有50ml种子培养基的250ml摇瓶中，在37℃的摇床中，以250rpm的转速，培养120h。每天取样1mL检测培养体系中残余木糖的含量。
其中，种子培养基为30g/L木糖，20g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L海水晶。
木糖检测方法：采用色谱柱为ZORBAX碳水化合物分析柱，柱温30℃，流动相为乙腈：水＝80：20(V/V)，流速1.2mL/min，示差折光检测器检测，使用木糖标准品测定在该色谱条件下木糖保留时间为6.482min。
表1.培养体系中残余木糖浓度随时间的变化
| 发酵时间(小时) | 0 | 24 | 48 | 72 | 96 | 120 |
| 残余木糖浓度(g/L) | 29.8 | 29.6 | 29.6 | 29.5 | 29.7 | 29.6 |
由表1可知：随着培养时间延长，培养体系中残余木糖浓度几乎没有发生改变；这说明野生型类酵母菌WT菌株不能利用木糖进行生长及角鲨烯的合成。
实施例2：高效利用木糖的类酵母菌的定向选育
(1)重离子诱变：使用含有10g/L海水晶的YPD培养基培养实施例1所述的野生型类酵母菌WT至对数生长期，然后进行重离子束12C6+辐射诱变；其中，离子束能量为80Mev/u，辐射强度为280Gy。
(2)定向进化：将重离子诱变后的细胞接种到木糖浓度为10g/L的种子培养基中；当细胞生长进入稳定期，将体积比2％(v/v)培养物重新接种到新鲜的前述种子培养基中，重复5轮；然后将体积比2％(v/v)的培养物接种到木糖浓度为30g/L的种子培养基中，重复5轮。如此反复直至木糖浓度达到110g/L，实验进化进行了大约30轮循环，持续大约100天，得到高效利用木糖的类酵母菌SD685，保存于甘油管中。种子培养基为前述特定浓度的木糖，20g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L海水晶。
将所述的类酵母菌SD685(Pseudozyma sp.SD685)进行保藏，保藏于位于湖北省武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 20221416，保藏日期为2022年9月13日。
实施例3：利用木糖培养类酵母菌SD685生产角鲨烯(批次发酵培养方式：不进行补料)
将保存在甘油管的类酵母菌SD685菌株接入接入装有500ml种子培养基的3000ml摇瓶中，在37℃的摇床中，以250rpm的转速，培养48h，获得种子液。向10L生物反应器中加入5L发酵培养基，接入前述步骤获得的种子液(10％，v/v)。发酵过程中，通气量2vvm，搅拌转速400rpm，罐温37℃，发酵至木糖消耗完毕。整个发酵过程不流加补料液。
其中，种子培养基为30g/L木糖，20g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L海水晶。
发酵培养基中包含如下组分：木糖100g/L，酵母提取物30g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾10g/L，硫酸镁5g/L，海水晶10g/L。
木糖检测方法同实施例1。
生物量计算：取发酵液20mL，6000g离心5min，收集菌体，冷冻干燥后称取其干菌体质量，并折算成生物产量，以克每升发酵液计(g/L)。
角鲨烯检测方法：采用Agilent 7890B气相色谱，色谱柱型号为HP-5柱(30m×0.25mm×0.25μm)；载气为高纯氮气，恒流模式，流速1.0mL/min；进样体积为1μL，检测器为氢离子火焰检测器。升温程序为：初温100℃保持1min，以15℃/min升至300℃，保持6min。
发酵结束后，获得类酵母的产量为45.8g/L，角鲨烯产量为3.37g/L。由图1可知，采用高浓度木糖培养类酵母SD685(批次发酵培养方式：不进行补料)时，发酵体系中木糖浓度随着发酵时间的增加而显著降低。当发酵时间为63h时，发酵体系中的木糖浓度接近于零。说明，所述的类酵母菌SD685能够高效利用木糖发酵生产角鲨烯。
实施例4：利用木糖培养类酵母菌生产角鲨烯(批次补料发酵培养方式)
将保存在甘油管的类酵母菌SD685菌株接入接入装有500ml种子培养基的3000ml摇瓶中，在37℃的摇床中，以250rpm的转速，培养48h，获得种子液；向10L生物反应器中加入5L发酵培养基，接入前述步骤获得的种子液(10％，v/v)。发酵过程中，通气量2vvm，搅拌转速400rpm，罐温37℃，发酵时间120小时。每次当木糖浓度降至10g/L左右时，流加补料液，使木糖浓度恢复到20g/L左右。
其中，种子培养基为30g/L木糖，20g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L海水晶。
发酵培养基中包含如下组分：木糖100g/L，酵母提取物30g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾10g/L，硫酸镁5g/L，海水晶10g/L。
补料液组分为：木糖350g/L，酵母提取物20g/L。
木糖检测方法同实施例1。
生物量计算和角鲨烯检测方法同实施例3。
发酵结束后，获得类酵母的产量为182.5g/L，角鲨烯产量为10.95g/L。由图2可知，采用高浓度木糖培养类酵母SD685(批次补料发酵培养方式)时，发酵体系中木糖浓度随着发酵时间的增加而显著降低。当发酵时间为44h时，发酵体系中的木糖浓度已不足10g/L，进行补料并使木糖保持在20g/L左右。当发酵反应至111h时，停止补料。由此可知，采用批次补料发酵培养方式时，所述的类酵母SD685菌株的产量是不补料(实施例2)的4倍，角鲨烯的产量是不补料的3.2倍。这说明，采用批次补料发酵培养方式可以显著提升类酵母SD685菌株和角鲨烯的产量，对于产业应用具有重要的意义。
实施例5：玉米秸秆原料水解液培养类酵母菌
玉米秸秆原料水解液制备：
(1)氨水处理：将300kg粉碎的玉米秸秆原料装入蒸球中，向蒸球中注入25％浓度的氨水3000L。向蒸球内通入热蒸汽，使温度在120℃维持150min。反应结束后，去除溶解有木质素的氨水黑液，保留固体渣。
(2)酶解：将氨水预处理后的固体渣转移至厌氧罐中，纤维素酶添加量为10FPU，半纤维素酶的添加量为5FPU，pH5.5，温度50℃，反应时间12h，得到以玉米秸秆原料水解液，用高效液相色谱测定的葡萄糖浓度达到124g/L，木糖浓度达到65g/L。
类酵母菌的培养：
将保存在甘油管的菌株接入装有500ml种子培养基的3000ml摇瓶中，在37℃的摇床中，以250rpm的转速，培养24h，获得种子液。向20L生物反应器中加入10L发酵培养基，接入前述步骤获得的种子液(5％，v/v)。发酵过程中，通气量1vvm，搅拌转速1000rpm，罐温37℃，发酵时间144小时。流加补料液，使总糖浓度维持到20-30g/L左右。
其中，种子培养基为20g/L木糖，20g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L海水晶。
发酵培养基中包含如下组分：玉米秸秆原料水解液(葡萄糖124g/L，木糖65g/L)，酵母提取物30g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾10g/L，硫酸镁5g/L，海水晶10g/L。
补料液组分为：浓缩玉米秸秆原料水解液(葡萄糖500g/L，木糖250g/L)，酵母提取物20g/L。
木糖检测方法同实施例1。
生物量计算和角鲨烯检测方法同实施例3。发酵结束后，获得类酵母的产量为176.8g/L，角鲨烯产量为10.8g/L。由图3可知，采用含木质纤维原料水解液的培养基培养类酵母SD685(批次补料发酵培养方式)时，发酵体系中葡萄糖和木糖的浓度均随着发酵时间的增加而显著降低。补料使体系中总糖保持在20-30g/L。当发酵反应至134h时，停止补料。由此可知，采用木质纤维原料水解液替代木糖，同样可以发酵培养类酵母SD685菌株生产角鲨烯。
实施例6：麦秆原料水解液培养类酵母菌
麦秆原料水解液制备：
(1)氨水处理：将280kg粉碎的小麦秸秆原料装入蒸球中，向蒸球中注入25％浓度的氨水1400L。向蒸球内通入热蒸汽，使温度在110℃维持100min。反应结束后，去除溶解有木质素的氨水黑液，保留固体渣。
(2)酶解：将氨水预处理后的固体渣转移至厌氧罐中，纤维素酶添加量为5FPU，半纤维素酶的添加量为4FPU，pH5.5，温度50℃，反应时间12h，得到以麦秆原料水解液，用高效液相色谱测定的葡萄糖浓度达到131g/L，木糖浓度达到79g/L。
类酵母菌的培养：
将保存在甘油管的菌株接入装有500ml种子培养基的3000ml摇瓶中，在37℃的摇床中，以250rpm的转速，培养48h，获得种子液。向10L生物反应器中加入5L发酵培养基，接入前述步骤获得的种子液(10％，v/v)。发酵过程中，通气量2vvm，搅拌转速1000rpm，罐温37℃，发酵时间144小时。流加补料液，使总糖浓度维持到20-30g/L左右。
其中，种子培养基为30g/L木糖，20g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L海水晶。
发酵培养基中包含如下组分：麦秆原料水解液(葡萄糖131g/L，木糖79g/L)，酵母提取物30g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾10g/L，硫酸镁5g/L，海水晶10g/L。
补料液组分为：浓缩麦秆原料水解液(葡萄糖400g/L，木糖240g/L)，酵母提取物20g/L。
木糖检测方法同实施例1。
生物量计算和角鲨烯检测方法同实施例3。发酵结束后，获得类酵母的产量为185.3g/L，角鲨烯产量为11.3g/L。
实施例7：稻秆原料水解液培养类酵母菌
稻秆原料水解液制备：
(1)氨水处理：将200kg粉碎的稻秆原料装入蒸球中，向蒸球中注入25％浓度的氨水1000L。向蒸球内通入热蒸汽，使温度在115℃维持120min。反应结束后，去除溶解有木质素的氨水黑液，保留固体渣。
(2)酶解：将氨水预处理后的固体渣转移至厌氧罐中，纤维素酶添加量为7FPU，半纤维素酶的添加量为2FPU，pH5.5，温度50℃，反应时间12h，得到以稻杆原料水解液，用高效液相色谱测定的葡萄糖浓度达到81g/L，木糖浓度达到50g/L。
类酵母菌的培养：
将保存在甘油管的菌株接入装有500ml种子培养基的3000ml摇瓶中，在30℃的摇床中，以250rpm的转速，培养48h，获得种子液。向10L生物反应器中加入5L发酵培养基，接入前述步骤获得的种子液(10％，v/v)。发酵过程中，通气量2vvm，搅拌转速800rpm，罐温30℃，发酵时间144小时。流加补料液，使总糖浓度维持到20-30g/L左右。
其中，种子培养基为20g/L木糖，20g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L海水晶。
发酵培养基中包含如下组分：稻秆原料水解液(葡萄糖81g/L，木糖50g/L)，酵母提取物30g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾10g/L，硫酸镁5g/L，海水晶10g/L。
补料液组分为：浓缩稻秆原料水解液(葡萄糖400g/L，木糖250g/L)，酵母提取物20g/L。
木糖检测方法同实施例1。
生物量计算和角鲨烯检测方法同实施例3。发酵结束后，获得类酵母的产量为162.4g/L，角鲨烯产量为9.7g/L。
根据实施例5-7的结果可知，本申请所述的类酵母SD685菌株，不但可以利用木糖为碳源，也可以利用木质纤维原料水解液替代木糖发酵生产角鲨烯。
表2.实施例4-7发酵生产角鲨烯采用的碳源浓度及发酵结果
由表2可知，实施例5-7中木质纤维原料水解液中，虽然总糖浓度分别为189g/L、210g/L和131g/L，均高于实施例4中纯木糖的浓度，但类酵母SD685菌株和角鲨烯的产量与实施例3相比，实施例4略有降低，实施例5略有增加，实施例6降低较多。这说明：(1)该菌株可同时高效利用葡萄糖和木糖生产角鲨烯；(2)该菌株利用木糖生产角鲨烯的产量要高于葡萄糖；(3)在木糖和葡萄糖比例相近的前提下，总糖浓度越高，角鲨烯产量越高。
综上可知，本发明利用诱变结合实验室定向进化技术筛选，获得一种能高效利用木糖并生产角鲨烯的类酵母菌株SD685。所述类酵母菌SD685使用高浓度木糖培养基或含有高浓度木糖的木质纤维素原料水解液进行培养，能够获得高角鲨烯含量的类酵母菌培养物。根据实施例4-7可知，其生物量可达180g/L左右，角鲨烯产量10g/L左右。与野生型酵母菌WT不能利用木糖进行生长相比，所述类酵母菌株SD685不仅能够高效利用木糖，并能在含有高浓度木糖的木质纤维素原料水解液中正常生长，同时能积累大量角鲨烯。本申请填补了现有技术的空白，解决了木质纤维素降解产生的木糖难利用的问题，还同时实现了木质纤维素原料的高值化利用，具有重要的经济效益前景。
Claims (10)
1.一株发酵木糖生产角鲨烯的类酵母菌，其特征在于：所述类酵母菌分类命名为类酵母菌SD685(Pseudozyma sp.SD685)，保藏于位于湖北省武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 20221416，保藏日期为2022年9月13日。
2.如权利要求1所述的类酵母菌在以木糖为碳源发酵生产角鲨烯中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的碳源为纯木糖、木糖-葡萄糖混合物或木质纤维素原料水解液。
4.一种采用木糖为碳源发酵生产角鲨烯的方法，其特征在于：以权利要求1所述的类酵母菌为出发菌株，利用含有木糖或木质纤维素原料水解液的培养基进行发酵培养，即可获得含有角鲨烯的类酵母菌培养物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：具体为：(1)将类酵母菌菌株SD685接种于含低浓度木糖的种子培养基中，然后在30-37℃的温度条件，200-250rpm转速条件下培养24-48h，获得种子液；(2)将步骤(1)得到的种子液按照5-10％(v/v)的接种量，接入含高浓度木糖或木质纤维素原料的水解液中，在30-37℃、通气量1-2vvm、搅拌转速400-1000rpm下发酵120-144h，得到高含量角鲨烯的发酵类酵母菌培养物。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的低浓度木糖为20-30g/L；
步骤(2)所述的高浓度为50-100g/L。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的木质纤维素原料水解液采用下述方法处理得到：(a)氨水处理：将粉碎的木质纤维素原料和氨水按一定的重量体积比装入密闭装置中，在110-120℃的温度条件下处理100-150min；反应结束后，去除溶解有木质素的氨水黑液，保留固体渣；(b)酶解：将步骤(a)得到的固体渣转移至厌氧装置中，添加适量纤维素酶和半纤维素酶，然后在pH5.5，温度50℃的条件下反应时间12h，即得到木质纤维素原料水解液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤(a)中所述木质纤维素原料和氨水的重量体积比为1:5-1:10(Kg：L)；步骤(b)中所述纤维素酶的添加量为5-10FPU，所述半纤维素酶的添加量为2-5FPU。
9.一种获得权利要求1所述的类酵母菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)重离子诱变：使用含有10g/L海水晶的YPD培养基培养野生型类酵母菌WT至对数生长期，然后进行重离子束12C6+辐射诱变；其中，离子束能量为80Mev/u，辐射强度为280Gy；
(2)定向进化：将重离子诱变后的细胞接种到木糖浓度为10g/L的种子培养基中；当细胞生长进入稳定期，将2％(v/v)培养物重新接种到新鲜的前述种子培养基中，重复5轮；然后将2％(v/v)的培养物接种到木糖浓度为30g/L的种子培养基中，重复5轮；如此反复直至木糖浓度达到110g/L，得到高效利用木糖的类酵母菌SD685。
10.根据权利要求9所述的获得所述类酵母菌的方法，其特征在于：步骤(2)所述的种子培养基中还包括20g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨和10g/L海水晶。
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