CN116444649A - 乳源活性肽gitdplfkgm、gitdplfkg及其获得方法和应用 - Google Patents

乳源活性肽gitdplfkgm、gitdplfkg及其获得方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了乳源活性肽GITDPLFKGM、GITDPLFKG及其获得方法和应用。本发明首先提供一种乳源活性肽GITDPLFKGM，其包含如SEQ ID NO.1所示序列的肽；SEQ ID NO.1：Gly‑Ile‑Thr‑Asp‑Pro‑Leu‑Phe‑Lys‑Gly‑Met。本发明还提供一种乳源活性肽GITDPLFKG，其包含如SEQ ID NO.2所示序列的肽；SEQ ID NO.2：Gly‑Ile‑Thr‑Asp‑Pro‑Leu‑Phe‑Lys‑Gly。本发明提供的乳源活性肽具有较高的抗氧化能力及较好的免疫调节能力。

Description

乳源活性肽GITDPLFKGM、GITDPLFKG及其获得方法和应用
技术领域
本发明涉及活性肽领域，尤其是涉及乳源活性肽GITDPLFKGM、GITDPLFKG及其获得方法和应用。
背景技术
生物活性肽是指对生命体具有特定生理活性的肽，其中，乳蛋白是生物活性肽的重要来源之一。近年来，乳源活性肽已经成为人们耳熟能详的一个词语。一方面，乳源活性肽具有小片段、易吸收的特点；另一方面，其具有很多潜在的生物功能，所以引起人们越来越多的关注，成为科学研究的热点之一。很多乳源活性肽的有益效果也已经得到了很好的证明，包括抗菌、抗癌、降血压、降胆固醇、抗糖尿病、抗炎、抗抑郁等特性。当前最权威的乳源活性肽数据库BIOPEP-UMW中已报告了4000多个不同的乳源活性肽。但是具有抗氧化或免疫调节功能的不同于现有多肽的新的乳源活性肽仍然是目前需要进一步研究的方向。
生物活性肽的来源多种多样，最常见的来源是微生物发酵。乳杆菌是常见的作为益生菌所使用的菌种之一，也被公认为安全菌种，即GRAS(Generally Regarded as Safe)菌种。副干酪乳杆菌(Lactobacillus.paracasei)是乳杆菌的一种，为革兰氏阳性菌，往往进行异型发酵，具有兼性厌氧、不运动、无芽孢的特点，形态为杆菌或长杆菌，单个或成对出现，宽度为2.0～4.0μm，长度为0.8～1.0μm。已有研究证明了副干酪乳杆菌K56亚种(K56是CN107916236A的公开菌株)在抗细菌、抗肥胖、抗氧化、调节血压、调节肠道菌群、调节免疫系统等方面的功能。但关于副干酪乳杆菌生产多肽的研究较少。
目前，采用副干酪乳杆菌K56亚种生产具有抗氧化与免疫调节功能的乳源活性肽是增加乳源活性肽多样性以及扩大菌种功能性的重要研究方向。
发明内容
本发明的目的在于提供乳源活性肽GITDPLFKGM、GITDPLFKG及其获得方法和应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明第一方面，提供一种乳源活性肽GITDPLFKGM，其包含如SEQ ID NO.1所示序列的肽；
SEQ ID NO.1：Gly-Ile-Thr-Asp-Pro-Leu-Phe-Lys-Gly-Met(N端-C端)。
所述乳源活性肽片段自然存在于副干酪乳杆菌发酵产物中，经系统检索未被收录。具体均来源于血清淀粉样蛋白A(Serum amyloid A protein)，并且为Serum amyloid Aprotein蛋白第67～76位的氨基酸残基。Serum amyloid A protein蛋白氨基酸序列如SEQID NO.3所示。
SEQ ID NO.3：
(N端-C端)。
Serum amyloid A protein蛋白的氨基酸序列以及对应的核苷酸序列为既有技术，编码Serum amyloid A protein蛋白第67～76位氨基酸残基的核苷酸片段能编码成熟的乳源活性肽GITDPLFKGM。
本发明第二方面提供一种乳源活性肽GITDPLFKG，其包含如SEQ ID NO.2所示序列的肽；
SEQ ID NO.2：Gly-Ile-Thr-Asp-Pro-Leu-Phe-Lys-Gly(N端-C端)。
本发明第三方面提供一种制备所述乳源活性肽的方法，所述方法包括如下步骤：以牛乳浓缩蛋白为原料，使用副干酪乳杆菌发酵，然后采用超滤膜过滤，得到多肽混合物；优选超滤膜过滤后采用真空冷冻干燥技术或者低温喷雾干燥技术进行干燥；
对多肽混合物进行分析、筛选得到乳源活性肽GITDPLFKGM。
根据本发明的具体实施方案，所述方法还包括以下步骤：
1)将3～10％的乳浓缩蛋白与1～10％的乳糖溶于pH为7.0～8.0，温度为25～90℃的水溶液中，混匀，冷却至室温后得到乳浓缩蛋白溶液；
2)向步骤1)样品中加入菌种冻干粉，发酵后得到发酵液；
3)对发酵液进行离心处理，收集上清液，然后采用截留分子量为3KDa以下的膜进行超滤过滤，得到过滤后的发酵液；
4)将过滤后的发酵液进行杀菌、浓缩、干燥处理后得到多肽混合物；
5)分析、筛选，获得乳源活性肽GITDPLFKGM。
根据本发明的具体实施方案，步骤2)中所述发酵的温度为30～45℃，菌种的用量为：底物浓度1％～3％且菌数大于1.5×1011CFU/mL。
优选地，所述副干酪乳杆菌包括副干酪乳杆菌K56。采用副干酪乳杆菌K56菌株自然发酵生产乳源活性肽GITDPLFKGM的方法最大化提高了专利菌株产生的多肽浓度并降低了生产成本。
根据本发明的具体实施方案，所述分析、筛选包括以下步骤：
a.UPLC-MS分析：将所得多肽混合物进行UPLC-MS分析，并利用蛋白质谱分析软件进行氨基酸序列分析；
b.对a中所得结果与对照组进行对比，选取相同的氨基酸序列，再排除peptideranker中具有生物活性可能性评分较低的氨基酸序列及已公开的氨基酸序列，剩余的氨基酸序列即为新发现乳源活性肽片段。
本发明第四方面提供一种制备所述乳源活性肽GITDPLFKGM的方法，所述方法可以为通过基因工程的方法人工合成，或从酶解乳蛋白液分离纯化的方法直接获得，或直接通过化学合成制备。
根据本发明的具体实施方案，所述化学合成的步骤包括：
1)在固相载体上合成全保护的肽序列，得到肽树脂；
2)用切割液裂解肽树脂，得到生物活性肽；
3)色谱分析和质谱分析；
优选地，步骤2)中切割液包括如下比例的组分：三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3,异丙基硅烷:水＝95:2:2:1，v:v:v；
优选地，步骤3)中色谱分析的梯度条件：
A液：含有0.1％甲酸(v/v)的水，B液：含有0.1％甲酸(v/v)和80％乙腈(v/v)的水；
本发明第五方面提供一种制备所述乳源活性肽GITDPLFKG的方法，所述方法包括将权利要求1所述的乳源活性肽GITDPLFKGM通过体外模拟胃肠道消化实验得到核心片段GITDPLFKG。
本发明第六方面提供一种组合物，所述组合物包括所述乳源活性肽GITDPLFKGM、所述乳源活性肽GITDPLFKG、所述乳源活性肽GITDPLFKGM的衍生物和所述乳源活性肽GITDPLFKG的衍生物中的一种或两种以上的组合；
所述乳源活性肽GITDPLFKGM的衍生物，包括在乳源活性肽GITDPLFKGM的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化修饰，得到的多肽衍生物；
所述乳源活性肽GITDPLFKG的衍生物，包括在乳源活性肽GITDPLFKG的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化修饰，得到的多肽衍生物。
本发明第六方面提供所述的组合物在制备抗氧化食品、抗氧化保健食品、抗氧化药物或抗氧化化妆品中的应用；或
所述的组合物在制备免疫调节食品、免疫调节保健食品、免疫调节药物或免疫调节化妆品中的应用；或
所述的组合物在制备同时具有抗氧化功能和免疫调节功能的食品、同时具有抗氧化功能和免疫调节功能的保健食品或同时具有抗氧化功能和免疫调节功能的药物中的应用。
较优的，所述乳源活性肽具有抗氧化和免疫调节功能。
进一步地，本发明的乳源活性多肽GITDPLFKGM可以用于制备减少自由基对皮肤伤害的化妆品、制备具有抗氧化和/或免疫调节的药物。
本发明第七方面，提供了一种同时具有抗氧化功能和免疫调节功能的产品，包括所述乳源活性肽GITDPLFKGM或所述乳源活性肽GITDPLFKGM的衍生物；具有抗氧化功能和免疫调节功能的产品包括食品、保健品或药物；所述乳源活性肽GITDPLFKGM的衍生物，是指在乳源活性肽GITDPLFKGM的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的多肽衍生物。
本发明的有益效果：
本发明提供的乳源活性肽GITDPLFKGM一方面，具有较高的抗氧化能力；另一方面，具有较好的免疫调节活性。对提高生命的质量，对开发具有抗氧化功能、免疫调节功能的食品、保健食品和药物具有十分重要的意义。
附图说明
图1为本发明质荷比为539.7845的片段的一级质谱图(m/z＝539.7845)。
图2为本发明质荷比为539.7845的片段的二级质谱图和多肽az、by断裂情况。
图3为本发明质荷比为947.5219的片段的二级质谱图和多肽az、by断裂情况。
图4为本发明实施例中乳源活性肽GITDPLFKGM体外消化产物分析饼状图。
图5为本发明实施例中乳源活性肽GITDPLFKG体外消化产物分析饼状图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
在进一步描述本发明具体实施方案之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
本实施例提供活性肽GITDPLFKGM的获得方法。
1.乳浓缩蛋白溶液的制备
将10％的乳蛋白浓缩物、10％的乳糖、0.5％的NaCl(均为质量分数)溶于pH为7.0～8.0，温度为25℃的水溶液中。95℃杀菌10min，冰水浴冷却至37℃。
2.发酵液的制备
加入副干酪乳杆菌K56(该菌种已在中国发明专利CN107916236A中公开)冻干粉，使添加量达到1％乳浓缩蛋白浓度(即1.5×1011CFU/L)，混匀后，置入温度为37℃培养箱静置发酵4h后得到发酵液。
3.多肽的提取
将发酵液经过95℃水浴加热10min灭活，使用冰水浴冷却后进行低温离心，离心条件为：8000rcf、4℃，离心10min，弃去底部沉淀，取上清液。取上清液之后将其移至超滤管内管中进行超滤，选用截留分子量为3KDa的超滤膜，超滤离心条件为4800rcf、4℃、30min。收集底部超滤液，将所得过滤后的发酵液在4℃条件下低温保存。
4.多肽粉末的制备
将步骤3得到的过滤后的发酵液喷雾干燥得到所述的多肽混合物粉末，喷雾干燥的条件为：进风温度180℃，出风温度90℃，流速25mL/min。
5.活性肽GITDPLFKGM的筛选
1)UPLC分析
UPLC条件如下：
仪器：Waters ACQUITY UPLC超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱仪；
色谱柱规格：BEH C18色谱柱；
流速：0.4mL/min；
温度：50℃；
紫外检测波长：210nm；
进样量：2μL；
梯度条件：A液：含有0.1％甲酸(v/v)的水，B液：含有0.1％甲酸(v/v)和80％乙腈(v/v)的水；
2)质谱分析
质谱条件如下：
离子方式：ES+；
质量范围(m/z)：100-1000；
毛细管电压(Capillary)(kV)：3.0；
采样锥(V)：35.0；
离子源温度(℃)：115；
去溶剂温度(℃)：350；
去溶剂气流(L/hr)：700.0；
碰撞能量(eV)：4.0；
扫描时间(sec)：0.25；
内扫描时间(sec)：0.02。
根据以上分析方法，利用超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱，对牛乳浓缩蛋白肽进行色谱分析和质谱分析，得到发酵液中全部多肽的氨基酸序列。
选取平行对照组中相同的氨基酸序列，再将peptide ranker中具有生物活性可能性评分较低的氨基酸序列与已公开的氨基酸序列排除，得到活性肽GITDPLFKGM的序列。
实施例2
本实施例提供活性肽GITDPLFKGM的人工合成方法。
一、生物活性肽的合成
1.称取RINK树脂3g(取代度0.3mmol/g)于150ml的反应器中，用50ml的二氯甲烷(DCM)浸泡。
2.2小时后，用3倍树脂体积的氮-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干后待用。
3.向反应器中加入50mL的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，然后抽干。
4.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。
5.称取Fmoc-氨基酸(15mmol)和1-羟基-苯骈三唑(HOBT)(15mmol)于50ml的离心管中，加入20ml的DMF将其溶解，然后加入3ml的N,N二异丙基碳二亚胺(DIC)振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
6.2小时后，加入一定量的醋酸酐封头(醋酸酐:DIEA:DCM＝1:1:2,v:v:v)反应半小时，然后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，抽干待用。
7.向反应器中加入50mL的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4，v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干。
8.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。
9.称取后面第二个Fmoc-氨基酸(15mmol)和HOBT(15mmol)于50ml的离心管中，加入25ml的DMF将其溶解，然后加入2.5ml的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
10.1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，若树脂为无色，说明反应完全；若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应。
11.待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入50mL的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去。
12.按照步骤9-11依次接上氨基酸Met、Gly、Lys、Phe、Leu、Pro、Asp、Thr、Ile和Gly。
13.待接上最后一个氨基酸后，脱去保护，用DMF洗涤四次，然后用甲醇将树脂抽干。然后用95切割液(三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3，异丙基硅烷:水＝95:2:2:1，v:v:v)将生物活性肽从树脂上切割下来(每克树脂加10ml切割液)，并用冰乙醚(切割液：乙醚＝1:9,v:v)离心沉降四次。
至此，人工合成了生物活性肽GITDPLFKGM。
二、生物活性肽的确认
1)UPLC分析
UPLC条件如下：
仪器：Waters ACQUITY UPLC超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱仪；
色谱柱规格：BEH C18色谱柱；
流速：0.4mL/min；
温度：50℃；
紫外检测波长：210nm；
进样量：2μL；
梯度条件：A液：含有0.1％甲酸(v/v)的水；B液：含有0.1％甲酸(v/v)和80％乙腈(v/v)的水；
2)质谱分析
质谱条件如下：
离子方式：ES+；
质量范围(m/z)：100-1000；
毛细管电压(Capillary)(kV)：3.0；
采样锥(V)：35.0；
离子源温度(℃)：115；
去溶剂温度(℃)：350；
去溶剂气流(L/hr)：700.0；
碰撞能量(eV)：4.0；
扫描时间(sec)：0.25；
内扫描时间(sec)：0.02。
根据以上分析方法，利用超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱，对生物活性肽GITDPLFKGM进行色谱分析和质谱分析。
生物活性肽GITDPLFKGM一级质谱图如图1所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图2所示，可得此峰的生物活性肽质荷比为539.7845，保留时间是44.82min。
3)结果
由图2可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比539.7845的片段序列为Gly、Ile、Thr、Asp、Pro、Leu、Phe、Lys、Gly、Met(GITDPLFKGM)，记为SEQ ID NO.1。该片段与Serum amyloid A protein蛋白第67～76位的残基序列相对应，Serum amyloid A protein蛋白氨基酸序列的GenBank编号为NP_001068728.1，序列见SEQID NO.3。
SEQ ID NO.3：
实施例3
本实施例提供乳源活性肽的稳定性及核心片段验证实验。
一、乳源活性肽GITDPLFKGM的体外模拟胃肠道消化实验
1.乳源活性肽GITDPLFKGM冻干粉末体外消化
取1.5mg样品粉末溶于1.5mL ddH2O中，在样品(浓度为1mg/mL)中加入胃蛋白酶(酶：底物＝1:50，w/w)后，将pH调至2.0，37℃水浴90min。随后，将水解产物的pH调至7.5，加入胰酶(酶：底物＝1:25，w/w)，37℃水浴150min。最后，用95℃热水浴5min使酶失活终止反应。实验中设置对照组，除不加入胃蛋白酶和胰酶，在相同时间做相同的pH和温度处理。将对照组和样品组真空冷冻干燥成粉末后，存储于-80℃用于后续分析。
2.UPLC-MS分析
UPLC条件如下：
仪器：Waters ACQUITY UPLC超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱仪；
色谱柱规格：BEH C18色谱柱；
流速：0.4mL/min；
温度：50℃；
紫外检测波长：210nm；
进样量：2μL；
梯度条件：A液：含有0.1％甲酸(v/v)的水，B液：含有0.1％甲酸(v/v)和80％乙腈(v/v)的水；
2)质谱分析
质谱条件如下：
离子方式：ES+；
质量范围(m/z)：100-1000；
毛细管电压(Capillary)(kV)：3.0；
采样锥(V)：35.0；
离子源温度(℃)：115；
去溶剂温度(℃)：350；
去溶剂气流(L/hr)：700.0；
碰撞能量(eV)：4.0；
扫描时间(sec)：0.25；
内扫描时间(sec)：0.02。
根据以上分析方法，利用超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱，对乳源活性肽GITDPLFKGM体外消化产物进行色谱分析和质谱分析。对比对照组与实验组中所存在多肽的多肽序列，以检测乳源活性肽的稳定性。
3.实验结果及分析
图4为乳源活性肽GITDPLFKGM体外消化产物分析饼状图。图4中，A为对照组，B为实验组，图例按含量多少排列。
如图4所示，对照组中乳源活性肽GITDPLFKGM原始序列所占比例在90％左右，而实验组中GITDPLFKG占比仅为56.67％，说明GITDPLFGM被胃蛋白酶与胰酶水解，并被切除一个甲硫氨酸。实验证明乳源活性肽GITDPLFKGM在胃肠道中可以被进一步消化。
二、乳源活性肽GITDPLFKG的体外模拟胃肠道消化实验
1.实验步骤
合成制备多肽GITDPLFKG，对GITDPLFKG进行如上实验操作及分析。
实验结果及分析
图5为乳源活性肽GITDPLFKG体外消化产物分析饼状图。图5中，A为对照组，B为实验组，图例按含量多少排列。
如上图所示，实验组与对照组中乳源活性肽GITDPLFKG原始序列所占比例均在99％以上，说明胃蛋白酶与胰酶没有将其水解，体内酸性环境也无法将其水解。实验证明乳源活性肽GITDPLFKG在胃肠道消化过程中具有稳定性，是乳源活性肽GITDPLFKGM的核心片段。
三.乳源活性肽GITDPLFKG的确认
根据实施例2中的分析方法，利用超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱，对生物活性肽GITDPLFKG进行色谱分析和质谱分析。生物活性肽GITDPLFKG一级质谱图如图1所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图3所示，可得此峰的生物活性肽质荷比为947.5219，保留时间是54.38min。
3)结果
由图3可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比947.5219的片段序列为Gly、Ile、Thr、Asp、Pro、Leu、Phe、Lys、Gly(GITDPLFKG)，记为SEQ IDNO：1。该片段与Serum amyloid A protein蛋白第67～75位的残基序列相对应，Serumamyloid A protein蛋白氨基酸序列的GenBank编号为NP_001068728.1，序列见SEQ IDNO.3。
实施例4
本实施例提供测定乳源活性肽GITDPLFKGM、GITDPLFKG的体外抗氧化活性的实验。
一、FARP法测定乳源活性肽GITDPLFKGM的体外抗氧化能力
1.实验试剂和仪器
牛乳浓缩蛋白(MPC)粉，恒天然商贸(上海)有限公司；副干酪乳杆菌(K56)，生合生物科技股份有限公司；中性蛋白酶(酶活力1.1×106u/g)，夏盛(上海)生物科技有限公司；乳糖，国药集团化学试剂有限公司；氯化钠，上海凌峰化学试剂有限公司；胃蛋白胨Peptone，BBI生命科学有限公司；总抗氧化能力检测试剂盒(Ferric Reducing Ability ofPlasma FRAP)，上海碧云天生物科技公司。
电子天平，Sartorius德国；恒温水浴箱，上海一恒科技有限公司；3KDa超滤管，Millipore公司；DR-200Bc酶标仪，长沙市德科仪器设备有限公司；JB-VS-1300U超净工作台，上海屹明净化设备有限公司；LRH-250F生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；GI36T高压灭菌锅，厦门致微仪器有限公司；Froma 700低温冰箱，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；96孔细胞培养板，美国Millipore公司；RO15纯水系统，力康生物医疗科技控股有限公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司。
2.实验方法
根据总抗氧化能力检测试剂盒，将三吡啶三吖嗪(Tripyridyltriazine TPTZ)7.5mL稀释液、TPTZ 750μL溶液、检测缓冲液750μL混合均匀，并在37℃水浴中孵育，2h内用完。
在96孔板每孔中先加入180μLFRAP工作液，按浓度梯度加入5μL FeSO4标准曲线溶液，轻轻混匀，37℃孵育3-5min后，用酶标仪在593nm处测定吸光值。
在96孔板每孔中先加入180μLFRAP工作液，空白对照孔中加入5μL ddH2O，样品检测孔内加入5μL待测样品、空白对照、阳性对照，轻轻混匀，37℃孵育3-5min后，用酶标仪在593nm处测定吸光值。总抗氧化能力表示方式以FeSO4标准溶液的浓度来表示。
3.实验结果及分析
表1乳源活性肽GITDPLFKGM的总抗氧化能力
实验分组 总抗氧化能力(mmol/g)
阳性对照组植酸1mg/ml 0.0025±0.0006
GITDPLFKGM 1mg/ml 0.0049±0.0009**
GITDPLFKGM 0.5mg/ml 0.0036±0.0006*
GITDPLFKGM 0.1mg/ml 0.0017±0.0003
注：**，与阴性对照组比较，有极显著性差异(P＜0.01)；*，与阴性对照组比较，有显著性差异(P＜0.05)。
实验结果如表1所示，通过FARP法对多肽GITDPLFKGM的体外总抗氧化活性进行了测定，发现加入乳源活性肽GITDPLFKGM的实验组相比阳性对照组其吸光值有一定程度的降低，具有较好的还原氧化物质的能力。由表1可知，发现乳源活性肽GITDPLFKGM的总抗氧化能力随着多肽浓度的升高而升高，在浓度为1mg/mL情况下，乳源活性肽GITDPLFKGM的总抗氧化水平最佳。因此，可认定发明的乳源活性多肽GITDPLFKGM具有显著的抗氧化能力。
二、FARP法测定乳源活性肽GITDPLFKG的体外抗氧化能力
1.实验试剂、仪器及方法
所需试剂、仪器如上。
合成制备多肽GITDPLFKG，对GITDPLFKG进行如上实验操作及分析。
2.实验结果及分析
表2乳源活性肽GITDPLFKG的总抗氧化能力
实验分组 总抗氧化能力(mmol/g)
阳性对照组植酸1mg/ml 0.0024±0.0009
GITDPLFKG 1mg/ml 0.0053±0.0011**
GITDPLFKG 0.5mg/ml 0.0039±0.0012*
GITDPLFKG 0.1mg/ml 0.0016±0.0007
注：**，与阴性对照组比较，有极显著性差异(P＜0.01)；*，与阴性对照组比较，有显著性差异(P＜0.05)。
实验结果如表2所示，通过FARP法对多肽GITDPLFKG的体外总抗氧化活性进行了测定，发现加入乳源活性肽GITDPLFKG的实验组相比阳性对照组其吸光值有一定程度的降低，具有较好的还原氧化物质的能力。由表2可知，发现乳源活性肽GITDPLFKG的总抗氧化能力随着多肽浓度的升高而升高，在浓度为1mg/mL情况下，乳源活性肽GITDPLFKG的总抗氧化水平最佳。因此，可认定发明的乳源活性多肽GITDPLFKG具有显著的抗氧化能力。
实施例4
本实施例提供测定乳源活性肽GITDPLFKGM、GITDPLFKG的免疫调节活性实验。
一、乳源活性肽GITDPLFKG对体外巨噬细胞增殖率的测定
1.实验试剂和仪器
PBS，南京凯基生物科技有限公司；DMEM不完全高糖培养液；南京凯基生物科技有限公司；胎牛血清，GIBCO有限公司；巨噬细胞RAW264.7，上海中国科学院细胞所；脂多糖(LPS，E.Coli O111:B4)，Sigma有限公司；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，Amresco公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，Genebase公司。
Centrifuge 5414 D小型高速离心机，Eppendorf有限公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；电子天平Sartorius，德国；恒温水浴箱，上海一恒科技有限公司；DR-200Bc酶标仪，长沙市德科仪器设备有限公司；JB-VS-1300U超净工作台，上海屹明净化设备有限公司。
2.实验方法
细胞培养及传代方法：配制含10％胎牛血清的DMEM不完全培养基(其中含青霉素80U/mL；链霉素0.08g/L)，用该培养基将RAW264.7细胞配成2×105/m L的浓度，将细胞悬液接种在25cm2一次性培养瓶或96孔板中。在温度为37℃、CO2浓度为5％的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养。24h后更换培养基。用倒置显微镜观察培养瓶中细胞基本长满瓶底时，进行传代。传代时，小心吸出旧培养液，加入1.5ml胰蛋白酶消化液，放置在37℃培养箱中准确消化2min，加入培养基2ml终止反应。反复轻柔吹打细胞，使底部贴壁生长的细胞吹落散开。800g离心2min，收集管底细胞，加入培养基重悬至2×105浓度，进行培养。
实验前期：RAW264.7细胞(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)在含有0g/L、0.1g/L、0.5g/L、1.0g/L浓度的乳源活性肽GITDPLFKGM的DMEM培养基中培养24h，在第24h时每个培养瓶中加入终浓度为100μg/L的LPS溶液，继续培养2h后，小心弃去细胞培养液，用PBS清洗孔底，加入5％ MTT 20μL反应48小时，而后加入100μL的溶解液以终止培养，隔夜溶解后在波长570nm下用酶标仪测定吸光度值(OD570)，BSA组为阴性对照，按照下式计算生长指数(GI：Growth Indices)。
GI＝(乳源活性肽组OD值-空白培养液OD值)/(空白对照组OD值-空白培养液OD值)。
3.实验结果及分析
表3乳源活性肽GITDPLFKGM对LPS刺激后巨噬细胞增殖的影响
实验分组 实验结果(OD570) 生长指数(GI)
细胞空白组 0.323±0.015 0
GITDPLFKGM 0mg/ml 0.588±0.008 1
GITDPLFKGM 1mg/ml 0.580±0.011 0.9698
GITDPLFKGM 0.5mg/ml 0.563±0.007* 0.9057
GITDPLFKGM 0.1mg/ml 0.579±0.004 0.9660
注：**，与阴性对照组比较，有极显著性差异(P＜0.01)；*，与阴性对照组比较，有显著性差异(P＜0.05)。
当机体受到外界的LPS刺激时，包括巨噬细胞在内的免疫细胞会增殖，增强巨噬细胞的吞噬功能，促进细胞因子的分泌，从而提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率，但可能会产生炎症危害机体稳态。实验结果如表3所示，通过对LPS刺激后巨噬细胞增殖率的测定的对多肽GITDPLFKGM的体外免疫调节活性进行了测定，发现加入乳源活性肽GITDPLFKGM的实验组相比空白组其巨噬细胞增殖率有一定程度的降低，表明巨噬细胞炎症情况下细胞增殖水平有所降低，炎症对机体造成的损伤从而降低。由表3可知，乳源活性肽GITDPLFKGM的免疫调节能力在浓度为0.5mg/mL情况下显著高于空白组，其免疫调节能力最佳。因此，可认定发明的乳源活性多肽GITDPLFKGM具有显著的免疫调节能力。
二、乳源活性肽GITDPLFKG对体外巨噬细胞增殖率的测定
1.实验试剂、仪器及方法
所需试剂、仪器如上。
合成制备多肽GITDPLFKG，对GITDPLFKG进行如上实验操作及分析。
2.实验结果及分析
表4乳源活性肽GITDPLFKG对LPS刺激后巨噬细胞增殖的影响
实验分组 实验结果(OD570) 生长指数(GI)
细胞空白组 0.323±0.015 0
GITDPLFKG 0mg/ml 0.593±0.006 1
GITDPLFKG 1mg/ml 0.578±0.013 0.9444
GITDPLFKG 0.5mg/ml 0.549±0.006* 0.8370
GITDPLFKG 0.1mg/ml 0.576±0.014 0.9370
注：**，与阴性对照组比较，有极显著性差异(P＜0.01)；*，与阴性对照组比较，有显著性差异(P＜0.05)。
当机体受到外界的LPS刺激时，包括巨噬细胞在内的免疫细胞会增殖，增强巨噬细胞的吞噬功能，促进细胞因子的分泌，从而提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率，但可能会产生炎症危害机体稳态。实验结果如表4所示，通过对LPS刺激后巨噬细胞增殖率的测定的对多肽GITDPLFKG的体外免疫调节活性进行了测定，发现加入乳源活性肽GITDPLFKG的实验组相比空白组其巨噬细胞增殖率有一定程度的降低，表明巨噬细胞炎症情况下细胞增殖水平有所降低，炎症对机体造成的损伤从而降低。由表4可知，乳源活性肽GITDPLFKG的免疫调节能力在浓度为0.5mg/mL情况下显著高于空白组，其免疫调节能力最佳。因此，可认定发明的乳源活性多肽GITDPLFKG具有显著的免疫调节能力。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种乳源活性肽GITDPLFKGM，其包含如SEQ ID NO.1所示序列的肽；
SEQ ID NO.1：Gly-Ile-Thr-Asp-Pro-Leu-Phe-Lys-Gly-Met(N端-C端)。
2.一种乳源活性肽GITDPLFKG，其包含如SEQ ID NO.2所示序列的肽；
SEQ ID NO.2：Gly-Ile-Thr-Asp-Pro-Leu-Phe-Lys-Gly(N端-C端)。
3.一种制备权利要求1所述的乳源活性肽的方法，所述方法包括如下步骤：以牛乳浓缩蛋白为原料，使用副干酪乳杆菌发酵，然后采用超滤膜过滤，得到多肽混合物；
对多肽混合物进行分析、筛选得到乳源活性肽GITDPLFKGM。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
1)将3～10％的乳浓缩蛋白与1～10％的乳糖溶于pH为7.0～8.0，温度为25～90℃的水溶液中，混匀、杀菌，冷却至室温后得到乳浓缩蛋白溶液；
2)向步骤1)样品中加入菌种冻干粉，发酵后得到发酵液；
3)对发酵液进行离心处理，收集上清液，然后采用截留分子量为3KDa以下的膜进行超滤过滤，得到过滤后的发酵液；
4)将过滤后的发酵液进行杀菌、浓缩、干燥处理后得到多肽混合物；
5)分析、筛选，获得乳源活性肽GITDPLFKGM。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤2)中所述发酵的温度为30～45℃，菌种的用量为：底物浓度1％～3％且菌数大于1.5×1011CFU/mL。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的方法，其中，所述副干酪乳杆菌包括副干酪乳杆菌K56。
7.根据权利要求3-6中任一项所述的方法，其中，所述分析、筛选包括以下步骤：
a.UPLC-MS分析：将所得KDa多肽混合物进行UPLC-MS分析，并利用蛋白质谱分析软件进行氨基酸序列分析；
b.对a中所得结果与对照组进行对比，选取相同的氨基酸序列，再排除peptide ranker中具有生物活性可能性评分较低的氨基酸序列及已公开的氨基酸序列，剩余的氨基酸序列即为新发现乳源活性肽片段。
8.一种制备权利要求1所述的乳源活性肽的方法，所述方法可以为通过基因工程的方法人工合成，或从酶解乳蛋白液分离纯化的方法直接获得，或直接通过化学合成制备。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述化学合成的步骤包括：
1)在固相载体上合成全保护的肽序列，得到肽树脂；
2)用切割液裂解肽树脂，得到生物活性肽；
3)色谱分析和质谱分析；
优选地，步骤2)中切割液包括如下比例的组分：三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3,异丙基硅烷:水＝95:2:2:1，v:v:v；
优选地，步骤3)中色谱分析的梯度条件：
A液：含有0.1％甲酸(v/v)的水，B液：含有0.1％甲酸(v/v)和80％乙腈(v/v)的水；
10.一种制备权利要求2所述的乳源活性肽的方法，所述方法包括将权利要求1所述的乳源活性肽GITDPLFKGM通过体外模拟胃肠道消化实验得到核心片段GITDPLFKG。
11.一种组合物，所述组合物包括权利要求1所述乳源活性肽GITDPLFKGM、权利要求2所述乳源活性肽GITDPLFKG、权利要求1所述乳源活性肽GITDPLFKGM的衍生物和权利要求2所述乳源活性肽GITDPLFKG的衍生物中的一种或两种以上的组合；
所述乳源活性肽GITDPLFKGM的衍生物，包括在乳源活性肽GITDPLFKGM的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化修饰，得到的多肽衍生物；
所述乳源活性肽GITDPLFKG的衍生物，包括在乳源活性肽GITDPLFKG的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化修饰，得到的多肽衍生物。
12.权利要求11所述的组合物在制备抗氧化食品、抗氧化保健食品、抗氧化药物或抗氧化化妆品中的应用；或
权利要求11所述的组合物在制备免疫调节食品、免疫调节保健食品、免疫调节药物或免疫调节化妆品中的应用；或
权利要求11所述的组合物在制备同时具有抗氧化功能和免疫调节功能的食品、同时具有抗氧化功能和免疫调节功能的保健食品或同时具有抗氧化功能和免疫调节功能的药物中的应用。
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