CN116429756A - 一种碱性磷酸酶的酶促化学发光底物液 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种碱性磷酸酶的酶促化学发光底物液，属于免疫技术检测领域。以水为溶剂，包括有8％～15％体积占比的二乙醇胺，0.08～0.15g/L的AMPPD，0.01～0.03g/L的荧光素化合物，0.5～2mmol/L的硫酸镁，0.1～0.3g/L的阳离子表面活性剂，0.05％～0.1％体积占比的防腐剂。本发明的有益效果在于，与现有技术相比：首先，本酶促化学发光底物液灵敏度高，具有良好的稳定性，能达到临床检测的要求；其次，本酶促化学发光底物液的各个组分的化学生产工艺均成熟，易于获取，无需额外添加发光增强剂，大大降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明属于免疫技术检测领域，涉及一种碱性磷酸酶的酶促化学发光底物液。
背景技术
化学发光是指在一个反应体系中通过化学反应生成一种激发态的产物在其回到基态的过程中，释放出的能量转变成光子，从而产生发光现象。
化学发光免疫分析是继酶免技术、放免技术、荧光免疫技术之后发展起来的一种超高灵敏度的微量检测技术，具备灵敏度高、检测范围宽、操作简便快速、无污染等优点，因此成为世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析技术，是目前临床免疫检测中使用最广泛的一种方法。
在化学发光免疫分析中，常用发光物质包括鲁米诺、异鲁米诺、吖啶酯、AMPPD。其中异鲁米诺和吖啶酯作为示踪分子直接标记，属于闪光型化学发光反应。鲁米诺和AMPPD依靠酶作为示踪分子标记，属于酶促辉光型化学发光反应。AMPPD在碱性条件下，被碱性磷酸酶解生成相当稳定的AMP-D阴离子，其有2～30min的分解半衰期，发出波长为470nm的持续性光，其发光的速度取决于碱性磷酸酶的浓度，最终可通过仪器捕获的光信号，推算出待测物质的浓度。
然而碱性磷酸酶催化AMPPD的化学反应，虽然具有较长的平台期，但是其发光强度较低，因此国内外的生产厂家均在底物液中添加一些发光增强剂，如：5-(十四酰氨基)荧光素、聚乙烯基苄基三甲氯化铵，但这些发光增强剂往往化学合成复杂，存在成本高、难以获取的问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的首要目的在于提供一种碱性磷酸酶的酶促化学发光底物液，灵敏度高，具有良好的热稳定性及实时稳定性，能达到临床检测的要求。
本发明的又一个目的在于提供一种碱性磷酸酶的酶促化学发光底物液，原料易于获取，无需额外添加发光增强剂，大大降低了生产成本。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下。
本发明提供一种碱性磷酸酶的酶促化学发光底物液，以水为溶剂，包括有8％～15％体积占比的二乙醇胺，0.08～0.15g/L的AMPPD，0.01～0.03g/L的荧光素化合物，0.5～2mmol/L的硫酸镁，0.1～0.3g/L的阳离子表面活性剂，0.05％～0.1％体积占比的防腐剂。
进一步地，所述酶促化学发光底物液还包括有盐酸，盐酸的加入量限定为：将酶促化学发光底物液的pH值调至9.6～10.0。
进一步地，所述防腐剂为ProClin300或氟化钠。
进一步地，所述荧光素化合物包括有荧光素钠、荧光素二钾、荧光素。
进一步地，所述阳离子表面活性剂包括有十六烷基三甲基卤化铵，可以促进激发态裂解产物到荧光素化合物之间的能量转移，大幅度提高化学发光效率。所述十六烷基三甲基卤化铵采用十六烷基三甲基氯化铵或十六烷基三甲基溴化铵。
本发明的有益效果在于，与现有技术相比：
首先，本酶促化学发光底物液灵敏度高，具有良好的热稳定性及实时稳定性，能达到临床检测的要求；
其次，本酶促化学发光底物液的各个组分的化学生产工艺均成熟，易于获取，无需额外添加发光增强剂，大大降低了生产成本。
附图说明
图1是本实施例中Access Substrate、APS-1的线性关系。
图2是本实施例中Access Substrate、APS-2的线性关系。
图3是本实施例中Access Substrate、APS-3的线性关系。
图4是本实施例中Access Substrate、APS-4的线性关系。
图5是本实施例中Access Substrate、APS-5的线性关系。
图6是本实施例中Access Substrate、APS-6的线性关系。
图7是本实施例中Access Substrate、APS-7的线性关系。
图8是本实施例中Access Substrate、APS-8的线性关系。
图9是本实施例中Access Substrate、APS-9的线性关系。
图10是本实施例中Access Substrate、APS-10的线性关系。
图11是本实施例中Access Substrate、APS-11的线性关系。
图12是本实施例中Access Substrate、APS-12的线性关系。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下。
以超纯水为溶剂，按以下配比制备本申请的酶促化学发光底物液的实施例：APS-1、APS-2、APS-3、APS-4、APS-5、APS-6、APS-7、APS-8、APS-9、APS-10、APS-11、APS-12。
APS-1：在超纯水中加入：8％体积占比的二乙醇胺，0.08g/L的AMPPD，0.01g/L的荧光素钠，0.5mmol/L的硫酸镁，0.1g/L的十六烷基三甲基氯化铵，0.05％体积占比的Proclin300，加盐酸将PH调制9.6。
APS-2：在超纯水中加入：8％体积占比的二乙醇胺，0.08g/L的AMPPD，0.01g/L的荧光素，0.5mmol/L的硫酸镁，0.1g/L的十六烷基三甲基氯化铵，0.05％体积占比的Proclin300，加盐酸将PH调制9.6。
APS-3：在超纯水中加入：8％体积占比的二乙醇胺，0.08g/L的AMPPD，0.01g/L的荧光素钠，0.5mmol/L的硫酸镁，0.1g/L的十六烷基三甲基氯化铵，0.05％体积占比的Proclin300，加盐酸将PH调制9.6。
APS-4：在超纯水中加入：8％体积占比的二乙醇胺，0.08g/L的AMPPD，0.01g/L的荧光素钠，0.5mmol/L的硫酸镁，0.1g/L的十六烷基三甲基溴化铵，0.05％体积占比的Proclin300，加盐酸将PH调制9.6。
APS-5：在超纯水中加入：8％体积占比的二乙醇胺，0.08g/L的AMPPD，0.01g/L的荧光素二钾，0.5mmol/L的硫酸镁，0.1g/L的十六烷基三甲基溴化铵，0.05％体积占比的Proclin 300，加盐酸将PH调制9.6。
APS-6：在超纯水中加入：8％体积占比的二乙醇胺，0.08g/L的AMPPD，0.01g/L的荧光素，0.5mmol/L的硫酸镁，0.1g/L的十六烷基三甲基溴化铵，0.05％体积占比的Proclin300，加盐酸将PH调制9.6。
APS-7：在超纯水中加入：15％体积占比的二乙醇胺，0.15g/L的AMPPD，0.03g/L的荧光素钠，2.0mmol/L的硫酸镁，0.3g/L的十六烷基三甲基氯化铵，0.1％体积占比的Proclin 300，加盐酸将PH调制10.0。
APS-8：在超纯水中加入：15％体积占比的二乙醇胺，0.15g/L的AMPPD，0.03g/L的荧光素二钾，2.0mmol/L的硫酸镁，0.3g/L的十六烷基三甲基氯化铵，0.1％体积占比的Proclin 300，加盐酸将PH调制10.0。
APS-9：在超纯水中加入：15％体积占比的二乙醇胺，0.15g/L的AMPPD，0.03g/L的荧光素，2.0mmol/L的硫酸镁，0.3g/L的十六烷基三甲基氯化铵，0.1％体积占比的Proclin300，加盐酸将PH调制10.0。
APS-10：在超纯水中加入：15％体积占比的二乙醇胺，0.15g/L的AMPPD，0.03g/L的荧光素钠，2.0mmol/L的硫酸镁，0.3g/L的十六烷基三甲基溴化铵，0.1％体积占比的Proclin 300，加盐酸将PH调制10.0。
APS-11：在超纯水中加入：15％体积占比的二乙醇胺，0.15g/L的AMPPD，0.03g/L的荧光素二钾，2.0mmol/L的硫酸镁，0.3g/L的十六烷基三甲基溴化铵，0.1％体积占比的Proclin 300，加盐酸将PH调制10.0。
APS-12：在超纯水中加入：15％体积占比的二乙醇胺，0.15g/L的AMPPD，0.03g/L的荧光素，2.0mmol/L的硫酸镁，0.3g/L的十六烷基三甲基溴化铵，0.1％体积占比的Proclin300，加盐酸将PH调制10.0。
以上材料：二乙醇胺、荧光素钠、荧光素二钾、荧光素、硫酸镁、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、Proclin 300、盐酸均为上海麦克林生化科技有限公司售，分析纯；AMPPD为南京都莱生物技术有限公司售，化学纯。
对比例：市售的美国贝克曼全自动免疫检验系统用底物液(Access Substrate)。
实施例APS1-12与对比例在对不同浓度梯度血清测量结果的相对偏差的结果见表1。贝克曼的产品是市面上灵敏度较高的产品，与之误差小，可以说明我们的产品灵敏度也高，可以媲美贝克曼的产品。
表1：实施例APS1-12与对比例(Access Substrate)测定结果的相对偏差：
实施例APS1-12与对比例在对不同浓度梯度血清测量结果的相对偏差的测定结果的线性关系见图1-12。通过图1-12可知，本申请的APS1-12与对比产品的相关性好。
实施例APS1-12与对比例测定甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)定量检测试剂盒(磁微粒化学发光法)，在贝克曼的机型为Access2的全自动化学发光分析仪上测定不同浓度梯度血清的检测值，测定结果见：表2。
表2：Access Substrate、APS的测定结果
由表2的测量值可知，本发明的酶促化学发光底物液APS1-12，与市售的贝克曼Access Substrate测定结果接近，相对偏差在±10％范围内；由图1～12可知，APS与AccessSubstrate具有较好的线性关系。
对APS1-12分别在37℃和2～8℃进行热稳定性和实时稳定性研究，结果见表3-4。
表3：APS1-12的热稳定性
表4：APS1-12的实时稳定性
由表3和表4的相对信号数据可知，37℃保存7天后，信号仍达到初始的95％以上；2～8℃保存12月，信号仍达到93％以上。本发明的酶促化学发光底物液(APS1-12)热稳定性和实时稳定性良好。
以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。
Claims (5)
1.一种碱性磷酸酶的酶促化学发光底物液，其特征在于，以水为溶剂，包括有8％～15％体积占比的二乙醇胺，0.08～0.15g/L的AMPPD，0.01～0.03g/L的荧光素化合物，0.5～2mmol/L的硫酸镁，0.1～0.3g/L的阳离子表面活性剂，0.05％～0.1％体积占比的防腐剂。
2.如权利要求1所述的一种碱性磷酸酶的酶促化学发光底物液，其特征在于，所述酶促化学发光底物液还包括有盐酸，盐酸的加入量限定为：将酶促化学发光底物液的pH值调至9.6～10.0。
3.如权利要求1所述的一种碱性磷酸酶的酶促化学发光底物液，其特征在于，所述防腐剂为ProClin300或氟化钠。
4.如权利要求1所述的一种碱性磷酸酶的酶促化学发光底物液，其特征在于，所述荧光素化合物包括有荧光素钠、荧光素二钾、荧光素。
5.如权利要求1所述的一种碱性磷酸酶的酶促化学发光底物液，其特征在于，所述阳离子表面活性剂包括有十六烷基三甲基卤化铵，所述十六烷基三甲基卤化铵采用十六烷基三甲基氯化铵或十六烷基三甲基溴化铵。
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