CN116426021A - 一种靶向性含镓蛋白修饰sebs膜的制备方法及其应用 - Google Patents

一种靶向性含镓蛋白修饰sebs膜的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物材料技术领域，公开了一种靶向性含镓蛋白修饰SEBS膜的制备方法及其应用，制备方法包括以下步骤：步骤一、将SEBS粉末与二甲苯溶液混合后涂覆到玻璃板上，待二甲苯挥发后，将所述玻璃板浸泡在水中，直至将SEBS膜从所述玻璃板上取下；步骤二、将所述SEBS膜置于光引发剂中浸泡后，通过紫外接枝在其表面修饰羧基；步骤三、将蛋白均匀分散在NaCl溶液中后，加入含镓溶液，振荡；步骤四、将接枝后的SEBS膜活化后置于步骤三所得溶液中浸泡，得靶向性含镓蛋白修饰SEBS膜。本发明通过蛋白靶向细菌，将镓离子送入细菌体内，可以减少镓离子的损耗，实现高效杀菌的效果，同时通过反复负载镓离子可以实现多次杀菌。

Description

一种靶向性含镓蛋白修饰SEBS膜的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，特别涉及一种靶向性含镓蛋白修饰SEBS膜的制备方法及其应用。
背景技术
细菌作为地球上最古老的生物之一，数量丰富，分布广泛，对人类生活造成了巨大影响。它是许多疾病的病原体，可以通过各种方式（如接触、呼吸道和昆虫叮咬）在人体之间传播。细菌感染是由细菌引起的疾病之一，是外科手术中最常见的并发症之一。早期，人类使用抗生素暂时解决细菌感染问题。然而，不久之后，许多细菌种类逐渐对常见抗生素产生了耐药性。到目前为止，全球细菌耐药性情况非常严重，应该说所有细菌都已被发现具有耐药性，对抗菌药物完全敏感的细菌几乎不存在，甚至出现了超级耐药细菌，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐万古霉素金黄色葡萄球菌（VRSA）、耐多药铜绿假单胞菌（MDR-PA）。因此，控制细菌感染必须采取有效的不会诱导多重耐药性的策略。
液态金属镓（Ga）是一种新型抗菌材料。在室温下，镓呈液态，在其表面形成致密的氧化膜，防止进一步氧化。它具有许多其他显著的特点，如良好的生物相容性、低毒性、良好的导电性和导热性以及形状变形性。这一特性正好证实了镓可以应用于人体，同时它具有比其他金属基抗菌材料更有利的抗菌性能。镓（Ⅲ）可以在细菌的代谢循环中取代铁（Ⅲ）（这可以抑制细菌中的含铁酶，并增加氧化剂敏感性。)以抑制细菌的生长。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种靶向性含镓蛋白修饰SEBS膜的制备方法及其应用，通过紫外接枝在SEBS表面修饰上羧基，利用缩合反应将含镓蛋白连接到SEBS膜上，实现靶向性含镓蛋白修饰SEBS膜的制备。本发明通过蛋白靶向细菌，将镓离子送入细菌体内，可以减少镓离子的损耗，实现高效杀菌的效果，同时通过反复负载镓离子可以实现多次杀菌效果。
技术方案：本发明提供了一种靶向性含镓蛋白修饰SEBS膜的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将SEBS粉末加至二甲苯溶液中混合均匀，得混合溶液，将所述混合溶液涂覆到玻璃板表面，待所述混合溶液中的二甲苯完全挥发后得到SEBS膜，将具有所述SEBS膜的玻璃板浸泡在水中，直至将SEBS膜从所述玻璃板表面取下；
步骤二、将所述SEBS膜置于光引发剂中浸泡后取出、干燥，将接枝单体溶液滴加到干燥后的SEBS膜上，用石英片盖住，在紫外光下反应，然后清洗、干燥，得接枝后的SEBS膜；
步骤三、将蛋白均匀分散在NaCl溶液中后，加入含镓溶液，振荡；
步骤四、将所述接枝后的SEBS膜浸泡在活化剂中进行活化处理，然后用PBS冲洗，接着将冲洗后的SEBS膜置于步骤三所得溶液中2-8 h后取出，清洗、干燥，得靶向性含镓蛋白修饰SEBS膜。
进一步地，步骤一中，所述SEBS粉末与二甲苯溶液质量体积比为1：6-1：9。
进一步地，步骤二中，所述光引发剂为二苯甲酮。
进一步地，步骤二中，所述接枝单体溶液中的接枝单体为甲基丙烯酸。
和/或，步骤二中，所述接枝单体溶液的浓度为1-2 M，接枝时间为1-10 min。
进一步地，步骤三中，所述含镓溶液为硝酸镓、氧化镓和氯化镓中的任一种。
和/或，步骤三中，所述含镓溶液的浓度为5-10 mM。
进一步地，步骤三中，所述蛋白为转铁蛋白、乳铁蛋白和铁蛋白中的任一种；
和/或，步骤三中，所述NaCl溶液的浓度为0.09％-0.9％。
进一步地，步骤四中，所述活化剂为1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺。
进一步地，所述1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为20-50％。
优选地，步骤三中，所述振荡具体条件如下：
振荡时间为8-12 h，振荡温度为20-40 ℃，振荡转速为70-150 rpm。
优选地，步骤二中，所述浸泡时间为10-30 mins；
和/或，步骤四中，所述浸泡时间为10-15 h。
本发明还提供了一种如上述任一项所述方法制备的靶向性含镓蛋白修饰SEBS膜的应用，所述靶向性含镓蛋白修饰SEBS膜使用后，置于紫外灯下灭菌处理，清洗、烘干，接着用硝酸镓溶液浸泡，振荡10-11 h，清洗、干燥，即可恢复其杀菌效果。
有益效果：与现有技术相比，本发明通过在SEBS基底上接枝羧基基团，使之可以与蛋白连接，随后利用摇床，将蛋白和含镓溶液振荡混合，再利用缩合反应将含镓蛋白连接到SEBS膜上，实现含镓蛋白修饰SEBS膜的制备；本发明利用紫外接枝技术在SEBS表面修饰羧基，利用缩合反应将含镓蛋白连接到SEBS膜上，制备了一种靶向性含镓蛋白修饰SEBS膜，该膜可通过蛋白的靶向细菌作用，将镓离子送入细菌体内，减少镓离子的消耗，利用镓离子的铁代谢阻断机理，破坏细菌的DNA合成，使其无法增殖，并破坏其体内抗氧化系统，诱导ROS的产生，同时通过反复负载镓离子可以实现多次杀菌效果。该方法简单易行，工艺简单，实现了靶向循环抗菌。
附图说明
图1是本发明制备靶向性含镓蛋白修饰SEBS膜对大肠杆菌抗菌效果图；
图2是本发明制备靶向性含镓蛋白修饰SEBS膜对金黄色葡萄球菌抗菌效果图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行详细的介绍。
实施方式1：
将3g SEBS粉末加入20 ml二甲苯溶液里搅拌，直至完全溶解且没有气泡，将混合溶液均匀涂覆在玻璃板上，待二甲苯完全挥发，将玻璃板浸泡在水中，直至SEBS膜可以从玻璃板上轻轻取下。将制备好的SEBS膜切成1×1 cm2的片状，分别用水和乙醇超声清洗，烘干后备用。
将0.15g 二苯甲酮（BP）加入到10 ml的乙醇中，搅拌混合均匀。将备用的SEBS膜浸泡在BP溶液中30 min，取出后干燥，全程避光处理。待干燥后，将100 μl甲基丙烯酸滴加到SEBS膜上，盖上石英片，在紫外光下照射6 min，去离子水冲掉残余溶液，烘箱干燥。将接枝好的SEBS膜浸泡在EDC/NHS混合溶液中12 h；将5 mg转铁蛋白加入1 ml 0.09％ NaCl溶液中，超声，使其均匀分散在NaCl溶液中，向混合溶液中加入1ml硝酸镓溶液，振荡12 h；PBS冲洗浸泡后的SEBS膜，并浸泡在硝酸镓和转铁蛋白的混合溶液中，5 h后取出，冲洗，干燥，实现镓-转铁蛋白修饰SEBS膜的制备。
对样品进行抗菌测试，利用平板计数法，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌杀菌率均达90%以上，得到结果见表1。
实施方式2：
将2g SEBS粉末加入16 ml二甲苯溶液里搅拌，直至完全溶解且没有气泡，将混合溶液均匀涂覆在玻璃板上，待二甲苯完全挥发，将玻璃板浸泡在水中，直至SEBS膜可以从玻璃板上轻轻取下。将制备好的SEBS膜切成1×1 cm2的片状，分别用水和乙醇超声清洗，烘干后备用。
将0.15 g二苯甲酮（BP）加入到10 ml的乙醇中，搅拌混合均匀。将备用的SEBS膜浸泡在BP溶液中30 min，取出后干燥，全程避光处理。待干燥后，将100 μl甲基丙烯酸滴加到SEBS膜上，盖上石英片，在紫外光下照射6 min，去离子水冲掉残余溶液，烘箱干燥。将接枝好的SEBS膜浸泡在EDC/NHS混合溶液中12 h；将3 mg乳铁蛋白加入1 ml 0.09％ NaCl溶液中，超声，使其均匀分散在NaCl溶液中，向混合溶液中加入1 ml硝酸镓溶液，振荡10 h；PBS冲洗浸泡后的SEBS膜，并浸泡在硝酸镓和乳铁蛋白的混合溶液中，5 h后取出，冲洗，干燥，实现镓-乳铁蛋白修饰SEBS膜的制备。
对样品进行抗菌测试，利用平板计数法，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌杀菌率均达93%以上，得到结果见表1。
实施方式3：
将3g SEBS粉末加入23 ml二甲苯溶液里搅拌，直至完全溶解且没有气泡，将混合溶液均匀涂覆在玻璃板上，待二甲苯完全挥发，将玻璃板浸泡在水中，直至SEBS膜可以从玻璃板上轻轻取下。将制备好的SEBS膜切成1×1 cm2的片状，分别用水和乙醇超声清洗，烘干后备用。
将0.15g二苯甲酮（BP）加入到10 ml的乙醇中，搅拌混合均匀。将备用的SEBS膜浸泡在BP溶液中30 min，取出后干燥，全程避光处理。待干燥后，将100 μl甲基丙烯酸滴加到SEBS膜上，盖上石英片，在紫外光下照射6 min，去离子水冲掉残余溶液，烘箱干燥。将接枝好的SEBS膜浸泡在EDC/NHS混合溶液中12 h；将4 mg转铁蛋白加入1 ml 0.09％ NaCl溶液中，超声，使其均匀分散在NaCl溶液中，向混合溶液中加入2 ml硝酸镓溶液，振荡10 h；PBS冲洗浸泡后的SEBS膜，并浸泡在硝酸镓和转铁蛋白的混合溶液中，5 h后取出，冲洗，干燥，实现镓-铁蛋白修饰SEBS膜的制备。
对样品进行抗菌测试，测试完成后在紫外灯下灭菌处理12 h且用去离子水超声清洗，烘干后，将其浸泡在2 ml硝酸镓溶液中，振荡10 h，冲洗，干燥，对样品再次进行抗菌测试，利用平板计数法，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌杀菌率均达95%以上，得到结果见表1。
对比例1：
将3gSEBS粉末加入20ml二甲苯溶液里搅拌，直至完全溶解且没有气泡，将混合溶液均匀涂覆在玻璃板上，待二甲苯完全挥发，将玻璃板浸泡在水中，直至SEBS膜可以从玻璃板上轻轻取下。将制备好的SEBS膜切成1×1 cm2的片状，分别用水和乙醇超声清洗，烘干后备用。
将0.15g 二苯甲酮（BP）加入到10ml的乙醇中，搅拌混合均匀。将备用的SEBS膜浸泡在BP溶液中30 min，取出后干燥，全程避光处理。待干燥后，将100 μl丙烯酰胺滴加到SEBS膜上，盖上石英片，在紫外光下照射6 min，去离子水冲掉残余溶液，烘箱干燥。将接枝好的SEBS膜浸泡在EDC/NHS混合溶液中12 h；将5 mg转铁蛋白加入1 ml 0.09％ NaCl溶液中，超声，使其均匀分散在NaCl溶液中，向混合溶液中加入1 ml硝酸镓溶液，振荡12 h；PBS冲洗浸泡后的SEBS膜，并浸泡在硝酸镓和转铁蛋白的混合溶液中，5 h后取出，冲洗，干燥，实现镓-转铁蛋白修饰SEBS膜的制备。
对样品进行抗菌测试，利用平板计数法，发现对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌无明显杀菌效果，得到结果见表1。
对比例2：
将3g SEBS粉末加入20 ml二甲苯溶液里搅拌，直至完全溶解且没有气泡，将混合溶液均匀涂覆在玻璃板上，待二甲苯完全挥发，将玻璃板浸泡在水中，直至SEBS膜可以从玻璃板上轻轻取下。将制备好的SEBS膜切成1×1 cm2的片状，分别用水和乙醇超声清洗，烘干后备用。
将0.15 g二苯甲酮（BP）加入到10 ml的乙醇中，搅拌混合均匀。将备用的SEBS膜浸泡在BP溶液中30min，取出后干燥，全程避光处理。待干燥后，将100 μl丙烯酰胺滴加到SEBS膜上，盖上石英片，在紫外光下照射6 min，去离子水冲掉残余溶液，烘箱干燥。将接枝好的SEBS膜浸泡在EDC/NHS混合溶液中12 h；将3 mg乳铁蛋白加入1ml 0.09％ NaCl溶液中，超声，使其均匀分散在NaCl溶液中，向混合溶液中加入2 ml硝酸镓溶液，振荡12 h；PBS冲洗浸泡后的SEBS膜，并浸泡在硝酸镓和乳铁蛋白的混合溶液中，5 h后取出，冲洗，干燥，实现镓-乳铁蛋白修饰SEBS膜的制备。
对样品进行抗菌测试，利用平板计数法，发现对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌无明显杀菌效果，得到结果见表1。
对比例3：
将3g SEBS粉末加入23.3 ml二甲苯溶液里搅拌，直至完全溶解且没有气泡，将混合溶液均匀涂覆在玻璃板上，待二甲苯完全挥发，将玻璃板浸泡在水中，直至SEBS膜可以从玻璃板上轻轻取下。将制备好的SEBS膜切成1×1 cm2的片状，分别用水和乙醇超声清洗，烘干后备用。
将0.15 g安息香加入到10 ml的乙醇中，搅拌混合均匀。将备用的SEBS膜浸泡在BP溶液中30 min，取出后干燥，全程避光处理。待干燥后，将100 μl甲基丙烯酸滴加到SEBS膜上，盖上石英片，在紫外光下照射6 min，去离子水冲掉残余溶液，烘箱干燥。将接枝好的SEBS膜浸泡在EDC/NHS混合溶液中12 h；将3 mg乳铁蛋白加入1ml 0.09％ NaCl溶液中，超声，使其均匀分散在NaCl溶液中，向混合溶液中加入1 ml氯化镓溶液，振荡12 h；PBS冲洗浸泡后的SEBS膜，并浸泡在氯化镓和乳铁蛋白的混合溶液中，4 h后取出，冲洗，干燥，实现镓-乳铁蛋白修饰SEBS膜的制备。
对样品进行抗菌测试，利用平板计数法，发现对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌无明显杀菌效果，得到结果见表1。
对比例4：
将3g SEBS粉末加入23.3 ml二甲苯溶液里搅拌，直至完全溶解且没有气泡，将混合溶液均匀涂覆在玻璃板上，待二甲苯完全挥发，将玻璃板浸泡在水中，直至SEBS膜可以从玻璃板上轻轻取下。将制备好的SEBS膜切成1×1 cm2的片状，分别用水和乙醇超声清洗，烘干后备用。
将0.15g二苯甲酮（BP）加入到10ml的乙醇中，搅拌混合均匀。将备用的SEBS膜浸泡在BP溶液中30 min，取出后干燥，全程避光处理。待干燥后，将100 μl丙烯酰胺滴加到SEBS膜上，盖上石英片，在紫外光下照射6 min，去离子水冲掉残余溶液，烘箱干燥。将接枝好的SEBS膜浸泡在EDC/NHS混合溶液中12 h；将5 mg铁蛋白加入1ml 0.09％ NaCl溶液中，超声，使其均匀分散在NaCl溶液中，向混合溶液中加入1 ml氯化镓溶液，振荡12 h；PBS冲洗浸泡后的SEBS膜，并浸泡在氯化镓和铁蛋白的混合溶液中，5 h后取出，冲洗，干燥，实现镓-铁蛋白修饰SEBS膜的制备。
对样品进行抗菌测试，利用平板计数法，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌杀菌率无明显杀菌效果，得到结果见表1。
对比例5：
将3g SEBS粉末加入23.3 ml二甲苯溶液里搅拌，直至完全溶解且没有气泡，将混合溶液均匀涂覆在玻璃板上，待二甲苯完全挥发，将玻璃板浸泡在水中，直至SEBS膜可以从玻璃板上轻轻取下。将制备好的SEBS膜切成1×1 cm2的片状，分别用水和乙醇超声清洗，烘干后备用。
将0.15 g安息香加入到10ml的乙醇中，搅拌混合均匀。将备用的SEBS膜浸泡在BP溶液中30 min，取出后干燥，全程避光处理。待干燥后，将100 μl丙烯酰胺滴加到SEBS膜上，盖上石英片，在紫外光下照射6 min，去离子水冲掉残余溶液，烘箱干燥。将接枝好的SEBS膜浸泡在EDC/NHS混合溶液中12 h；将5 mg铁蛋白加入1 ml 0.09％ NaCl溶液中，超声，使其均匀分散在NaCl溶液中，向混合溶液中加入1 ml硝酸镓溶液，振荡10 h；PBS冲洗浸泡后的SEBS膜，并浸泡在硝酸镓和铁蛋白的混合溶液中，5 h后取出，冲洗，干燥，实现镓-铁蛋白修饰SEBS膜的制备。
对样品进行抗菌测试，利用平板计数法，发现对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌无明显杀菌效果，得到结果见表1。
对比例6：
将3 g SEBS粉末加入23.3 ml二甲苯溶液里搅拌，直至完全溶解且没有气泡，将混合溶液均匀涂覆在玻璃板上，待二甲苯完全挥发，将玻璃板浸泡在水中，直至SEBS膜可以从玻璃板上轻轻取下。将制备好的SEBS膜切成1×1 cm2的片状，分别用水和乙醇超声清洗，烘干后备用。
将0.15 g安息香加入到10 ml的乙醇中，搅拌混合均匀。将备用的SEBS膜浸泡在BP溶液中30 min，取出后干燥，全程避光处理。待干燥后，将100 μl甲基丙烯酸滴加到SEBS膜上，盖上石英片，在紫外光下照射6 min，去离子水冲掉残余溶液，烘箱干燥。将接枝好的SEBS膜浸泡在EDC/NHS混合溶液中12 h；将3 mg铁蛋白加入1 ml 0.09％ NaCl溶液中，超声，使其均匀分散在NaCl溶液中，向混合溶液中加入2 ml氧化镓溶液，振荡10 h；PBS冲洗浸泡后的SEBS膜，并浸泡在氧化镓和铁蛋白的混合溶液中，5 h后取出，冲洗，干燥，实现镓-铁蛋白修饰SEBS膜的制备。
对样品进行抗菌测试，利用平板计数法，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌杀菌率无明显杀菌效果，得到结果见表1。
表1本发明对比例1-6及实施方式1-3得到的功能表面杀菌测试结果
杀菌率 实施方式1 实施方式2 实施方式3 对比例1 对比例2 对比例3 对比例4 对比例5 对比例6
大肠杆菌 90% 93% 96% 5% 8% 3% 3% 6% 0
金黄色葡萄球菌 91.5% 94.4% 95% 5% 3% 2% 5% 8% 0
通过对比例1-6与实施方式1-3杀菌测试结果对照可知，本发明制备得到的靶向性含镓蛋白修饰的SEBS膜可以有效的杀死周围细菌并且实现反复负载镓离子多次杀菌效果。
上述实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种靶向性含镓蛋白修饰SEBS膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将SEBS粉末加至二甲苯溶液中混合均匀，得混合溶液，将所述混合溶液涂覆到玻璃板表面，待所述混合溶液中的二甲苯完全挥发后得到SEBS膜，将具有所述SEBS膜的玻璃板浸泡在水中，直至将SEBS膜从所述玻璃板表面取下；
步骤二、将所述SEBS膜置于光引发剂中浸泡后取出、干燥，将接枝单体溶液滴加到干燥后的SEBS膜上，用石英片盖住，在紫外光下反应，然后清洗、干燥，得接枝后的SEBS膜；
步骤三、将蛋白均匀分散在NaCl溶液中后，加入含镓溶液，振荡；
步骤四、将所述接枝后的SEBS膜浸泡在活化剂中进行活化处理，然后用PBS冲洗，接着将冲洗后的SEBS膜置于步骤三所得溶液中2-8h后取出，清洗、干燥，得靶向性含镓蛋白修饰SEBS膜。
2.根据权利要求1所述的靶向性含镓蛋白修饰SEBS膜的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述SEBS粉末与二甲苯溶液质量体积比为1：6-1：9。
3.根据权利要求1所述的靶向性含镓蛋白修饰SEBS膜的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述光引发剂为二苯甲酮；
和/或，步骤二中，所述接枝单体溶液中的接枝单体为甲基丙烯酸；
和/或，步骤二中，所述接枝单体溶液的浓度为1-2 M，接枝时间为1-10 min。
4.根据权利要求1所述的靶向性含镓蛋白修饰SEBS膜的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述含镓溶液为硝酸镓、氧化镓和氯化镓中的任一种；
和/或，步骤三中，所述含镓溶液的浓度为5-10 mM。
5.根据权利要求1所述的靶向性含镓蛋白修饰SEBS膜的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述蛋白为转铁蛋白、乳铁蛋白和铁蛋白中的任一种；
和/或，步骤三中，所述NaCl溶液的浓度为0.09％-0.9％。
6.根据权利要求1所述的靶向性含镓蛋白修饰SEBS膜的制备方法，其特征在于，步骤四中，所述活化剂为1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺。
7.根据权利要求6所述的靶向性含镓蛋白修饰SEBS膜的制备方法，其特征在于，所述1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为20-50％。
8.根据权利要求1所述的靶向性含镓蛋白修饰SEBS膜的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述振荡具体条件如下：
振荡时间为8-12 h，振荡温度为20-40 ℃，振荡转速为70-150 rpm。
9. 根据权利要求1所述的靶向性含镓蛋白修饰SEBS膜的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述浸泡时间为10-30 mins；
和/或，步骤四中，所述浸泡时间为10-15 h。
10. 一种如权利要求1-9中任一项所述方法制备的靶向性含镓蛋白修饰SEBS膜的应用，其特征在于，所述靶向性含镓蛋白修饰SEBS膜使用后，置于紫外灯下灭菌处理，清洗、烘干，接着用硝酸镓溶液浸泡，振荡10-11 h，清洗、干燥，即可恢复其杀菌效果。
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