CN116425732A - 一种具有线粒体靶向功能的光可控释放no并开启光动力效果的光敏剂及其制备方法和应用 - Google Patents
一种具有线粒体靶向功能的光可控释放no并开启光动力效果的光敏剂及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种具有线粒体靶向功能的光可控释放NO并开启光动力效果的光敏剂及其制备方法和应用，其光敏剂的结构式如下，该光敏剂具有线粒体靶向能力、包括线粒体靶向能力及伴随的·O2 ‑原位产生用于PDT消融肿瘤细胞；释放的NO也可对肿瘤细胞产生杀伤作用，并可进一步克服PDT的氧依赖性；经此过程，NO和PDT联合用于抗肿瘤，极大提高了药物的抗肿瘤作用。线粒体靶向和PDT与NO的联合治疗为临床上荧光引导成像的联合用药抗肿瘤提供了新的见解。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种具有线粒体靶向功能的光可控释放NO并开启光动力效果的光敏剂及其制备方法和应用。
背景技术
动力疗法(PDT)是一种在光照的条件下，光敏剂(PSs)吸收光子发生光化学反应，产生高毒性活性氧(ROS)来破坏病变组织的疗法，其因具有非侵入性、微创性、精确易控治疗的优点而广受关注；临床研究表明，恶性肿瘤对光动力光敏剂表现出较低的耐药性，可以重复给药，因此，PDT在肿恶行瘤治疗方面具有巨大的潜力。
目前，有多种PSs已被临床批准并成功应用于皮肤癌、前列腺癌等癌症的治疗(如Photofrin、5-ALA和mTHPC)，但这些光敏剂均是通过Ⅱ型途径(PS将吸收的光能传递给周围氧气)产生高毒性的单线态氧(1O2)来消融肿瘤细胞，其不可避免地对氧气具有较大的依赖性，而肿瘤的缺氧微环境无疑会限制其应用；相比之下，Ⅰ型光敏剂是光敏剂吸收光能后与底物(如维生素C、核黄素、还原型辅酶等)相互作用，转化为自由基(或自由基离子)，后者进一步将电子转移到周围的氧气中，生成·O2 -，·O2 -可通过自发歧化或超氧化物歧化酶催化歧化进一步转化为H2O2。此外，积累的H2O2可以通过Haber-Weiss反应或Fenton反应有序地与·O2 -反应生成·OH，这些ROS也具有很强毒性，并且易于扩散。因此，Ⅰ型PS具有更好的抗缺氧效果，这大大拓宽了其在恶性肿瘤治疗中的应用。
一氧化氮(NO)在肿瘤的发生和发展中起到重要的作用，在低浓度下，NO靶向cGMP(1-30nM)，磷酸化Akt(30-100nM)，稳定缺氧诱导因子1α(100-300nM)，进而促进癌细胞的促生长和抗凋亡反应。当NO水平较高时，它可以诱导P53的磷酸化(>400nM)和亚硝化应激(>1μM)来破坏肿瘤细胞，包括抑制线粒体酶，启动dna损伤，以及上调p53以刺激细胞凋亡。但NO的易于扩散性不利于其在病灶部位持续发生作用，因此设计可控释放NO的药物按需释放NO来抑制肿瘤的生长具有重要的意义。目前，联合用药疗法在肿瘤的治疗中广泛应用，其中NO与PDT联合用于抗肿瘤受到广泛的关注，特别是图像引导的可控释放的NO与PDT的结合，NO可帮助克服PDT的氧依赖性，而PDT的高毒性又可为NO的抗肿瘤提供强力的帮助，二者相辅相成，将诊断与治疗融为一体，具有良好的发展前景。
但目前此类疗法多为NO与含金属配位原子的光敏剂结合用于抗肿瘤的研究，而含金属原子的光敏剂的高暗毒性和难以代谢性限制了其在临床中的应用。显然，目前迫切需要开发非金属有机小分子光敏剂与NO联用，并能够准确地区分正常组织和肿瘤组织，从而为临床提供准确的诊断和治疗。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种具有线粒体靶向功能的光可控释放NO并开启光动力效果的光敏剂PSQI-NO，具有线粒体靶向成像能力、NO释放以及伴随的·O2 -原位产生用于PDT，可用于选择区分癌细胞并且通过PDT诱导癌细胞消融。
本发明的另一目的是提供一种上述光敏剂PSQI-NO的制备方法。
本发明的第三个发明目的是提供上述光敏剂，具有靶向线粒体进行体内外荧光成像、发挥光动力治疗效果的医药用途。
本发明的技术方案如下：
一种具PSQI-NO，具体结构式如下所示：
亚硝基苯甲胺本身具有一种独特的性质，其对光不稳定，在光照作用下会逐渐分解释放出NO，NO在肿瘤细胞内进一步发生氧化应激反应，生成高毒性的过氧亚硝酸根(ONOO—)，对肿瘤细胞起到杀伤作用。动力疗法(PDT)是一种在光照的条件下，光敏剂(PSs)吸收光子发生光化学反应，产生高毒性活性氧(ROS)来破坏病变组织的疗法。但无论是I型还是Ⅱ型PDT均对氧具有依赖性，特别是Ⅱ型PDT对氧具有很大的依赖性，肿瘤的缺氧微环境限制了其应用。因此迫切需要一种方案来解决这个问题。
研究表明PDT与其它疗法结合可以起到联合用药提高抗肿瘤的作用。本发明将PDT与NO结合用于联合抗肿瘤。基于以上原理，本发明采用了亚硝基苯甲胺的结构作为NO供给部分，中间引入噻吩环增加整体电子云密度并且延长共轭，末尾部分利用线粒体靶向的强吸电子基喹啉盐的结构来增强推拉电子作用，并且引入碘重原子增加HUMO-LUMO的分离，促进释放NO后ROS的产生，设计合成了目标化合物PSQI-NO。本发明设计的PSQI-NO在经过光照后释放出NO，荧光产生淬灭，并且开启Ⅰ型光动力效果与NO联合抗肿瘤，对临床联合用药抗肿瘤具有重要理论和现实意义。
在本发明中，具有线粒体靶向功能的光可控释放NO并开启光动力效果的光敏剂PSQI-NO的制备方法，它包括以下步骤：
进一步地，具有线粒体靶向功能的光可控释放NO并开启光动力效果的光敏剂PSQI-NO的制备方法，它包括以下更详细的步骤：
(1)在PdCl2(dppf)和AcONa存在的条件下，4-溴苯甲胺和联硼酸频哪醇酯进行化学反应制备化合物1；
(2)在PdCl2(dppf)和K2CO3存在的条件下，化合物1与2-溴-5-噻吩甲醛进行化学反应制备化合物2；
(3)在哌啶存在的条件下，化合物2、4-甲基喹啉碘甲盐与无水乙醇混合均匀，加热至回流温度进行化学反应制备化合物PSQI；
(4)在冰醋酸存在的条件下，化合物PSQI与亚硝酸钠进行化学反应制备光敏剂PSQI-NO。
对于本发明而言，在步骤(1)中，反应温度为80～100℃，可以但不局限于80℃、85℃、90℃、95℃或100℃，为了获得更好的效果，反应温度为80℃。
对于本发明而言，在步骤(1)中，4-溴苯甲胺与联硼酸频哪醇酯的摩尔比为1:1.2～2.0，可以但不局限于1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.8、或1:2.0，为了获得更好的效果，4-溴苯甲胺与联硼酸频哪醇酯的摩尔比为1:1.5。
进一步地，4-溴苯甲胺与PdCl2(dppf)的摩尔比为1:0.05～0.1，可以但不局限于1:0.05、1:0.06、1:0.07、1:0.08、1:0.09或1:0.1，为了获得更好的效果，4-溴苯甲胺与PdCl2(dppf)的摩尔比为1:0.06。
进一步地，4-甲氨基苯硼酸频哪醇酯与AcONa的摩尔比为1:2.0～3.0，可以但不局限于1:2.0、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9或1:3.0，为了获得更好的效果，4-甲氨基苯硼酸频哪醇酯与K2CO3的摩尔比为1:2.5。
在步骤(2)中，反应温度为100～120℃，可以但不局限于100℃、105℃、110℃、115℃或120℃，为了获得更好的效果，反应温度为110℃。
在步骤(2)中，化合物1与5-溴-2-噻吩甲醛的摩尔比为1:1.0～1.5，可以但不局限于1:1.2、1:1.3、1:1.4或1:1.5，为了获得更好的效果，化合物1与5-溴-2-噻吩甲醛的摩尔比为1:1.2。
进一步地，化合物1与PdCl2(dppf)的摩尔比为1:0.05～0.12，可以但不局限于1:0.05、1:0.06、1:0.07、1:0.08、1:0.09、1:0.10、1:0.11或1:0.12，为了获得更好的效果，化合物1与PdCl2(dppf)的摩尔比为1:0.09。
进一步地，化合物1与K2CO3的摩尔比为1:2.0～3.0，可以但不局限于1:2.0、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9或1:3.0，为了获得更好的效果，化合物1与K2CO3的摩尔比为1:2.5。
在步骤(3)中，化合物2与4-甲基喹啉碘甲盐的摩尔比为1:0.8～1.5，可以但不局限于1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.2、1:1.3、1:1.4或1:1.5，为了获得更好的效果，化合物2与4-甲基喹啉碘甲盐的摩尔比为1:1.0。
在步骤(4)中，化合物PSQI与亚硝酸钠的摩尔比为1:3.0～4.0，可以但不局限于1:3.0、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9或1:4.0，为了获得更好的效果，化合物PSQI与亚硝酸钠的摩尔比为1:3.7。
本发明提供的光敏剂可用于制备靶向肿瘤细胞线粒体的荧光成像诊断药物，具有靶向肿瘤细胞线粒体的荧光特性，可实现体内外的肿瘤组织或细胞的荧光成像。
本发明提供的光敏剂可用于在制备具有光动力治疗肿瘤药物中，可实现体内外的肿瘤组织或细胞的荧光成像和/或治疗，在光照情况下，其可释放NO，对肿瘤细胞产生杀伤作用；并开启Ⅰ型光动力效果，产生高毒性的·O2 -杀伤肿瘤细胞。经此过程，PSQI-NO在光照后通过NO和·O2 -起到联合抗肿瘤的作用。
采用本发明的技术方案，优势如下:
本发明提供的光敏剂PSQI-NO是一种多功能的线粒体靶向探针，包括线粒体靶向能力及伴随的·O2 -原位产生用于PDT消融肿瘤细胞；释放的NO也可对肿瘤细胞产生杀伤作用，并可进一步克服PDT的氧依赖性；经此过程，NO和PDT联合用于抗肿瘤，极大提高了药物的抗肿瘤作用。线粒体靶向和PDT与NO的联合治疗为临床上荧光引导成像的联合用药抗肿瘤提供了新的见解。
附图说明
图1是化合物2的1H NMR图；
图2是化合物PSQI的1H NMR图；
图3是化合物PSQI-NO的1H NMR图；
图4是目标化合物PSQI-NO的13C NMR图；
图5是光敏剂PSQI-NO与化合物PSQI的紫外吸收光谱图；
图6是光敏剂PSQI-NO与化合物PSQI的荧光发射光谱图；
图7是PSQI-NO在光照后释放NO的荧光随光照时间的变化，λex＝480nm；λem＝620nm；其中，在图中曲线由上至下依次代表的时间为0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s、210s、240s、300s、360s、420s、480s、540s和600s；
图8是PSQI-NO在光照释放出NO后，NO指示剂DAN的荧光强度随时间的变化，λex＝365nm；λem＝395nm；其中，在图中曲线由下至上依次代表的时间为0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s、210s、240s、300s、360s、420s、480s、540s和600s；
图9是在PBS(pH 7.4，10mM，含0.5％ DMSO)中加入各种氧化还原物质前后，PSQI-NO(5μM)在620nm处的荧光强度；其中，1.H2O2、2.ClO-、3.GSH、4.维生素C(Vc)5.Fe2+、6.Fe3+、7.Cu+、8.Cu 2+、9.Light；
图10是在非光照的情况下，通过荧光光谱评价pH值对PSQI-NO稳定性的影响；λex＝480nm；λem＝620nm；
图11是DCFH-DA(10μM)与PSQI(5μM)和DCFH-DA(10μM)与RB(5μM)的混合溶液和在白光(100mW cm-2)照射下DCF的荧光发射光谱图；其中I0和I是DCF在529nm处的荧光强度；
图12是9,10-蒽二基-双(亚甲基)-二丙二酸(ABDA)和PSQI-NO溶液在白光(100mWcm-2)下的吸收光谱图；其中，在图中分别代表时间为0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s、240s、300s和360s的曲线基本重合，表明ABDA的吸光度在上述时间内无明显下降；
图13是9,10-蒽二基-双(亚甲基)-二丙二酸(ABDA)和PSQI溶液在白光(100mW cm-2)下的吸收光谱图；其中，在图中分别代表时间为0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s、240s、300s和360s的曲线基本重合，表明ABDA的吸光度在上述时间内无明显下降；
图14是9,10-蒽二基-双(亚甲基)-二丙二酸(ABDA)和Rose Bengal(RB)溶液在白光(100mW cm-2)下的吸收光谱图；其中，在图中曲线由上至下依次代表的时间为0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s、240s、300s和360s；
图15是DHR 123(10μM)与PSQI(5μM)和DHR 123(10μM)与PSQI(5μM)+维生素C(Vc：0.1mM)的混合溶液和在白光(100mW cm-2)照射下DHR 123的荧光发射光谱图；其中I0和I是DHR 123在536nm处的荧光强度；
图16是在不存在或存在白光照射的情况下，用不同浓度的PSQI-NO和PSQI孵育的MCF-7癌细胞的细胞活力；
图17是在不存在或存在白光照射的情况下，用不同浓度的PSQI-NO和PSQI孵育的HepG2细胞的细胞活力；
图18是在不存在或存在白光照射的情况下，用不同浓度的PSQI-NO和PSQI孵育的正常人脐静脉内皮细胞HUVEC细胞的细胞活力；
图19是用不同浓度的PSQI-NO和PSQI与MCF-7癌细胞、HepG2细胞和正常人脐静脉内皮细胞HUVEC细胞孵育后，在白光照射的情况下，各种细胞的细胞活力；
图20是PSQI-NO(5μM)在MCF-7细胞中的荧光图像随光照时间的变化图像(λex＝488nm,λem＝570-660nm)；
图21是PSQI-NO(5μM)在HepG2细胞中的荧光图像随光照时间的变化图像(λex＝488nm,λem＝580-650nm)；
图22是PSQI-NO(5μM)与DAF-FM(10μM)在MCF-7细胞中共孵育后DAF开启的荧光图像(λex＝488nm,λem＝500-550nm)；
图23是PSQI-NO(5μM)与DAF-FM(10μM)在HepG2细胞中共孵育后DAF开启的荧光图像(λex＝488nm,λem＝500-550nm)；
图24是共聚焦共定位图像，将MCF-7细胞与PSQI-NO(5μM)和Mito Tracker Green(100nM)孵育30分钟；其中，图24中(A)为红色通道(λex＝488nm,λem＝580-650nm)；图24中(B)为绿色通道(λex＝488nm,λem＝500-550nm)；图24中(C)为红色和绿色图像的合并图像；图24中(D)为Mito Tracker Green和PSQI-NO强度的相关图，皮尔逊系数Rr＝0.88；
图25是共聚焦共定位图像，将HepG2细胞与PSQI-NO(5μM)和Mito Tracker Green(100nM)孵育30分钟；图25中(A)为红色通道(λex＝488nm,λem＝580-650nm)；图25中(B)为绿色通道(λex＝488nm,λem＝500-550nm)；图25中(C)为红色和绿色图像的合并图像；图25中(D)为Mito Tracker Green和PSQI-NO强度的相关图，皮尔逊系数Rr＝0.90；
图26是激光共聚焦下观察到的在常氧状态下5μM PSQI处理的光照不同时间的MCF-7细胞内的总ROS成像，其中DCFH-DA用作总ROS的指示剂(绿色通道)；
图27是激光共聚焦下观察到的在常氧状态下5μM PSQI处理的光照不同时间的HepG2细胞内的总ROS成像，其中DCFH-DA用作总ROS的指示剂(绿色通道)；
图28是激光共聚焦下观察到的在常氧状态下5μM PSQI处理的MCF-7细胞内的·O2 -成像，其中DHE用作·O2 -的指示剂(红色通道)；
图29是激光共聚焦下观察到的在常氧状态下5μM PSQI处理的HepG2细胞内的·O2 -成像，其中DHE用作·O2 -的指示剂(红色通道)；
图30是激光共聚焦下观察到的在常氧或缺氧状态下5μM PSQI处理的光照不同时间的MCF-7细胞内总ROS成像，其中DCFH-DA用作总ROS的指示剂(绿色通道)；其中，图30中(A)为常氧状态下总ROS的成像；图30中(B)为缺氧状态下总ROS的成像；图30中(C)为两种状态下DCF在细胞内相对开启荧光强度示意图；
图31是激光共聚焦下观察到的在常氧或缺氧状态下5μM PSQI处理的光照不同时间的HepG2细胞内总ROS成像，其中DCFH-DA用作总ROS的指示剂(绿色通道)；其中，图31中(A)为常氧状态下总ROS的成像；图31中(B)为缺氧状态下总ROS的成像；图31中(C)为两种状态下DCF在细胞内相对开启荧光强度示意图；
图32是激光共聚焦下观察到的在常氧或缺氧状态下5μM PSQI处理的光照不同时间的MCF-7细胞内·O2 -成像，其中DHE用作·O2 -的指示剂(红色通道)；图32中(A)为常氧状态下·O2 -的成像；图32中(B)为缺氧状态下·O2 -的成像；图32中(C)为两种状态下DHE在细胞内相对开启荧光强度示意图；
图33是激光共聚焦下观察到的在常氧或缺氧状态下5μM PSQI处理的光照不同时间的MCF-7细胞内·O2 -成像，其中DHE用作·O2 -的指示剂(红色通道)；图33中(A)为常氧状态下·O2 —的成像；图33中(B)为缺氧状态下·O2 -的成像；图32中(C)为两种状态下DHE在细胞内相对开启荧光强度示意图；
图34是MCF-7细胞的活/死染色；其中，图34中(A-C)为PSQI(5μM)处理无光照组、图34中(D-F)为PSQI(5μM)处理光照组、图34中(G-I)为PSQI-NO(10μM)处理无光照组和图34中(J-L)为PSQI-NO(5μM)处理光照组；(光照组光照15分钟)，活细胞被AM染色(绿色)，而死细胞被PI染色(红色)；
图35是HepG2细胞的活/死染色；图35中(A-C)为PSQI(5μM)处理无光照组、图35中(D-F)为PSQI(5μM)处理光照组、图35中(G-I)为PSQI-NO(10μM)处理无光照组和图35中(J-L)为PSQI-NO(5μM)处理光照组；(光照组光照15分钟)，活细胞被AM染色(绿色)，而死细胞被PI染色(红色)。
具体实施方式
通过以下实施例并结合附图对本发明的光敏剂作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。
一、实施方法
除非另有说明，使用的所有分析级化学品和溶剂均购自商业供应商。有机溶剂为分析纯。9,10-蒽二基-双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)、DHR 123、DCFH-DA、DAF-FM、DAN购自Sigma-Aldrich并按原样使用。磷酸盐缓冲盐水(PBS)购自Hyclone。胎牛血清(PBS)、青霉素、链霉素和Dulbecco's Modified Eagle培养基(DMEM)均购自Gibco。Mito-TrackerGreen购自Invitrogen。Cell Counting Kit-8(CCK-8)购自Dojindo Laboratories。生物成像实验在Leica Microsystems的Leica系统上进行，分析软件为LAS X。1H NMR(400MHz)和13C NMR(100MHz)在JNM-ECZR 400MHz光谱仪上记录，DMSO-d6或CDCl3作为溶剂和TMS作为内标。使用maXisTM 4G UHR-TOF光谱仪(安捷伦)记录质谱。UV-vis光谱是通过UV-6100分光光度计获得的。
水溶液中NO释放检测
DAN被用作评估在白光照射(100mW/cm2)下溶液中的NO生成的指标。DAN(5×10-5M)溶液与PSQI-NO(10×10-6M)在水中混合，然后暴露于白光照射(100mW/cm2)。在不同的照射时间记录DAN在395nm处的荧光增强。
NO释放的条件选择性
在PSQI-NO(5μM)的PBS(pH 7.4，10mM，含0.1％ DMSO)溶液中加入各种氧化还原物质前后，记录其荧光强度，并与光照处理组的荧光强度对比，以此评价其释放NO的条件选择性(1.Control、2.H2O2、3.ClO-、4.GSH、5.维生素C(Vc)6.Fe2+、7.Fe3+、8.Cu+、9.Cu 2+、10.Light)；
PSQI-NO在不同PH下的稳定性
将PSQI-NO(5μM)溶解在不同PH的PBS溶液中，在非光照的情况下，记录其荧光强度，以此评价PSQI-NO在不同PH条件下是否稳定。
水溶液中单线态氧生成检测
ABDA(9,10-蒽二基-双(亚甲基)-二丙二酸)被用作评估在白光照射(100mW/cm2)下溶液中的1O2生成的指标。ABDA(5×10-5M)溶液与PSQI(5×10-6M)在水中混合，然后暴露于白光照射(100mW/cm2)。在不同的照射时间记录ABDA在378nm处的吸光度降低。
水溶液中总ROS生成检测
DCFH-DA被用作评估在白光照射(100mW/cm2)下溶液中的总ROS生成的指标。DCFH-DA(1×10-5M)溶液与PSQI(5×10-6M)在水中混合，然后暴露于白光照射(100mW/cm2)。在不同的照射时间记录DCFH-DA在529nm处的荧光强度增加。
水溶液中·O2 -生成检测
DHR123被用作评估在白光照射(100mW/cm2)下溶液中的·O2 -生成的指标。DHR123(1×10-5M)溶液与PSQI(5×10-6M)在水中混合，然后暴露于白光照射(100mW/cm2)。在不同的照射时间记录DHR 123在536nm处的荧光强度增加。
细胞培养和成像
MCF-7或HepG2细胞在补充有10％(v/v)胎牛血清的DMEM(高糖)中在37℃、5％CO2中培养。MCF-7细胞预先铺在35毫米激光共聚焦皿中。然后，将细胞与5μMPSQI-NO在37℃下孵育30分钟。用1×PBS洗涤大量材料和染料后，通过共聚焦显微镜捕获样品。
细胞毒性
MCF-7或HepG2细胞和HUVEC细胞分别预先接种于96孔板中。然后，将细胞与含有10％ FBS(v/v)、0、0.5、1、2.5、5、10、15μM的DMEM在37℃下分别孵育30分钟。随后，将样品用或不用100mW/cm2白光照射30分钟。然后，将丰富的材料置于新鲜培养基中，并将样品在37℃下孵育24小时。根据提案通过CCK-8检测细胞活力，并通过GraphPad Prism 5分析结果。
荧光共定位
为了与MitoTracker Green共染色，首先将MCF-7或HepG2细胞与PSQI-NO和Mito-Tracker Green在37℃下孵育30分钟。然后除去培养基，用PBS冲洗细胞3次，然后在共聚焦显微镜下成像。对于PSQI-NO，激发光为488nm，接收发射光信号为600-650nm；对于MitoTracker Green，激发光为488nm，接收发射光信号为500-550nm。
细胞内释放NO的成像
为了测试NO在细胞内的释放，首先将MCF-7或HepG2细胞与PSQI-NO和DAF-FM在37℃下孵育30分钟。然后除去培养基，用PBS冲洗细胞3次，然后光照后在共聚焦显微镜下成像。对于DAF-FM，激发光为488nm，接收发射光信号为500-550nm。
细胞内不同ROS的成像
为了测试ROS在细胞内的生成，首先将MCF-7或HepG2细胞与PSQI(5μM)和DCFH-DA(10μM)或DHE(10μM)在37℃下孵育30分钟。然后除去培养基，用PBS冲洗细胞3次，然后光照后在共聚焦显微镜下成像。对于DCFH-DA，激发光为488nm，接收发射光信号为500-550nm；对于DHE，激发光为514nm，接收发射光信号为580-650nm；
二、实施例
本发明提供的具有线粒体靶向功能的光可控释放NO并开启光动力效果的光敏剂PSQI-NO的合成路线如下：
化合物1：将4-溴苯甲胺(1.85g，10.0mmol)、联硼酸频哪醇酯(3.81g，15.0mmol)、PdCl2(dppf)(438.6mg，0.60mmol)、AcONa(2.05g，25.0mmol)均匀混合在60mL的二氧六环中，所得混合物在氩气气氛下于90℃的温度下搅拌反应8小时。反应结束后，冷却至室温，所得反应液先经硅藻土过滤后，用乙酸乙酯萃取3次(3×100mL)，再用水洗涤。收集所得有机层用Na2SO4干燥并真空浓缩，所得产物不须纯化直接用作下一步反应的原料。
化合物2：将化合物1(1.40g，6.0mmol)、2-溴-5-噻吩甲醛(1.37g，7.2mmol)、PdCl2(dppf)(394.7mg，0.54mmol)、K2CO3(2.07g，15.0mmol)均匀混合在由50mL二氧六环和10mL甲醇组成的混合溶液中，所得混合物在氩气气氛下于110℃的温度下搅拌反应12小时。反应结束后，冷却至室温，所得反应液用乙酸乙酯萃取3次(3×100mL)，再用水洗涤。然后收集所得有机层用Na2SO4干燥并真空浓缩，通过硅胶色谱法纯化，用乙酸乙酯/石油醚(v/v,1/10)作为洗脱液纯化粗产物，得到化合物2，为黄色固体(846.3mg)，产率约为65％。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.81(s,1H),7.67(d,J＝4.1Hz,1H),7.53-7.50(m,2H),7.23(d,J＝4.1Hz,1H),6.69 -6.56(m,2H),4.59(s,1H),2.88(s,3H).具体如图1所示。
PSQI：将化合物2(217.1mg，1.0mmol)、4-甲基喹啉碘甲盐(285.0mg，1.0mmol)和500μL哌啶在10mL无水乙醇中混合，将所得混合物加热至回流反应2.5h。反应结束后，冷却至室温，加入50mL乙酸乙酯后过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤并进一步真空干燥，得到PSQI-NO粗产物，经硅胶色谱柱纯化，用甲醇/二氯甲烷(v/v,1/20)作为洗脱液纯化粗产物，得到化合物PSQI-NO，为黑色固体(353.3mg)，产率约为73％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.26(d,J＝6.7Hz,1H),8.91(d,J＝8.6Hz,1H),8.45-8.31(m,3H),8.27-8.14(m,1H),8.08-7.90(m,1H),7.84(d,J＝15.4Hz,1H),7.69(d,J＝3.8Hz,1H),7.57(d,J＝8.5Hz,2H),7.47(d,J＝3.9Hz,1H),6.82(s,2H),4.46(s,3H),2.73(s,3H).具体如图2所示。13C NMR(100MHz,DMSO-D6)δ152.95,148.98,147.78,142.92,141.54,139.87,136.63,136.09,134.95,132.85,130.38,127.77,127.37,127.10,120.90,120.49,119.48,116.85,45.70,32.36.C23H21N2S+[M]+的HRMS m/z计算值357.1420，实测值357.1433。
PSQI-NO：在0℃下，将化合物PSQI(121.0mg，0.25mmol)溶于5mL无水二氯中，搅拌15min后，加入0.5mL冰醋酸，继续搅拌15min，再加入亚硝酸钠(64.0mg，0.93mmol)，所得混合物在0℃下搅拌反应6h，加水淬灭反应，用饱和碳酸氢钠溶液调pH至中性后，用二氯甲烷萃取3次(3×20mL)，再用水洗涤。然后收集有机层用Na2SO4干燥并真空浓缩，通过硅胶色谱法纯化，用甲醇/二氯甲烷(v/v，1/10)作为洗脱液纯化粗产物，得到终产物PSQI-NO，为棕黑色固体(64.0mg)，产率约为50％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.30(d,J＝6.4Hz,1H),8.95(d,J＝8.6Hz,1H),8.49-8.33(m,3H),8.29-8.16(m,1H),8.07-7.97(m,2H),7.89(d,J＝8.4Hz,2H),7.84-7.68(m,4H),4.49(s,3H),3.44(s,3H).13C NMR(100MHz，DMSO-D6)：δ152.95,148.98,147.78,142.92,141.54,139.87,136.63,136.09,134.95,132.85,130.38,127.77,127.37,127.10,120.90,120.49,119.48,116.85,45.70,32.36.C23H21N3OS+[M]+的HRMS m/z计算值386.1322，实测值386.1322。具体如图3和4所示。
三、效果验证
光敏剂PSQI-NO本身具有橙红色的荧光发射，在光照后可释放NO，荧光逐渐减弱。如图5和6所示，PSQI-NO在480nm处显示出最大吸收并且在620nm处有强烈的荧光发射，140nm的斯托克斯位移，有助于避免自吸收和激发光干扰。而完释放了NO后，其产物PSQI在540nm处显示出最大吸收，荧光发射消失。
在图7中，在没有光照的情况下，PSQI-NO在溶液状态下有强烈的荧光。而在光照一段时间后，在8min内，光敏剂PSQI-NO表现出缓慢的荧光强度减弱至无荧光。为了进一步验证光敏剂PSQI-NO光照后释放NO，在图8中，用商业检测NO的探针DAN为指示剂来证实NO的释放，在420nm处随光照时间逐渐增加的荧光光谱证实了其释放了NO。
肿瘤的生理条件极其复杂，因此必须考虑一些影响NO释放的生理因素，如肿瘤细胞内PH值和一些高水平的活性物质对NO释放的影响。因此，我们探究了NO释放条件的选择性。将各种氧化还原物质加入到PSQI-NO(5μM)溶液中，混合均匀，在37℃孵育30min，用荧光分光光度计测量荧光光谱。结果如图9所示。所有分析物都不会导致PSQI-NO的荧光强度降低。光照8min后，荧光强度减弱至消失。此外，我们还测定了PSQI-NO在不同pH的PBS缓冲液下的稳定性。如图10所示，在pH为4-9的范围内，NO释放剂PSQI-NO的荧光强度均无明显变化，证明其稳定性良好。
光敏剂在光照射下的高效ROS生成能力是一个重要标准。因此，我们首先通过测量DCFH的荧光开启程度来评价PSQI在PBS中总ROS的生成能力，如图11所示，在PSQI和DCFH-DA共存的PBS溶液中，随着光照时间的增加，DCF的荧光强度逐渐增加，表明PSQI在PBS中生成了ROS，且产氧能力与RB相当；接下来我们对PSQI产生活性氧的类型进行测试，用9,10-蒽二基-双(亚甲基)-二丙二酸(ABDA)的光降解率来评估PSQI在PBS中的1O2生成能力。如图12-14所示，当PSQI和ABDA的溶液暴露在光线(400-800nm)下时，ABDA的吸收没有减弱，表明没有生成1O2；我们猜测，PSQI产生ROS的途径不是Ⅱ型途径，而是通过Ⅰ型途径产生ROS。于是我们用DHR 123评估了PSQI在PBS溶液中产生·O2 -的能力，如图15所示，随着光照时间的增加，DHR 123的荧光开启程度逐渐增加，证实了其通过Ⅰ型产生了·O2 -。
通过CCK8测定对MCF-7和HepG2癌细胞进行定量毒性评估，剂量依赖性细胞毒性研究表明，PSQI-NO和PSQI在黑暗条件下都表现出相对较低的细胞毒性，表明它们具有可接受的生物相容性。如图16～19所示，相比之下，在白光照射下，两种细胞活力逐渐迅速下降，5μM PSQI-NO和15μM的PSQI可导致几乎完全细胞死亡。这些结果表明，光照后PSQI-NO通过释放NO和PDT途径对癌细胞消融具有相当强的作用。此外，为了研究PSQI-NO和PSQI相对于正常细胞杀死癌细胞的选择性，使用HUVEC正常细胞作为模型进行了剂量依赖性细胞毒性实验。在白光不存在和存在的情况下，HUVEC细胞的存活率明显高于MCF-7和HepG2细胞，表明这些PSQI-NO和PSQI在正常细胞中的积累效率很低。这些结果证明PSQI-NO具有杀死MCF-7和HepG2细胞的出色能力，在癌症光动力联合NO治疗中非常有前途。
PSQI-NO的优越性能促使我们进一步评估PSQI-NO可以在MCF-7和HepG2细胞中释放NO可能性。如图20-21所示，共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)图像显示MCF-7和HepG2细胞被PSQI-NO染色显示出红色发射。当施加光照处理后，细胞内红色荧光逐渐减弱。接下来我们用商业检测NO的探针DAF-FM作指示剂来监测细胞内释放的NO，如图22-23所示，将PSQI-NO和DAF-FM在MCF-7和HepG2细胞共培养30min后，施加光照，观测到细胞内绿色荧光信号开启。所有这些数据都证实了PSQI-NO在MCF-7和HepG2细胞中可以释放NO。
阳离子基团对膜负电位较高的线粒体具有较高的选择性。因此，我们进一步检查了PSQI-NO的细胞器定位，并使用Mito Tracker green进行了共定位研究。如图24-25所示，PSQI-NO的荧光信号与Mito Tracker green的荧光很好地重叠以及相关图的强度显示高Pearson系数(R＝0.88和R＝0.90)，证实PSQI-NO特异位于活MCF-7和HepG2细胞的线粒体中。
为了测试ROS在细胞内的生成，首先将MCF-7或HepG2细胞与PSQI和DCFH-DA或DHE在37℃下孵育30分钟。如图26-33所示，在无光照的条件下没有观察到绿色荧光(DCFH)或红色荧光(DHE)，在光照5min后，明显观察到强烈的绿色荧光或红色荧光的开启；之后我们又用Na2S2O3诱导细胞细胞缺氧，再将MCF-7或HepG2细胞与PSQI和DCFH-DA或DHE在37℃下孵育30分钟，加光照处理后同样观察到绿色或红色荧光信号，但荧光强度稍弱于常氧状态下；以上实验说明PSQI是无论是在常氧还是缺氧状态下均能产生ROS，且产氧类型为·O2 -。
为了进一步研究PDT与NO联合杀死癌细胞的效果，进行了PSQI-NO和PSQI用AM和PI杀死MCF-7和HepG2细胞的活/死染色。在没有光照的情况下，MCF-7和HepG2细胞检测到明显的绿色荧光，表明PSQI和PSQI-NO在黑暗中具有极好的生物相容性(如图34-35)。相反，光照射20分钟后，死细胞的数量显着增加。PSQI处理组细胞超过半数已死亡，而PSQI-NO处理组细胞基本全部死亡，说明PSQI-NO释放的NO和PDT联合能大大提高对癌细胞的杀伤作用
综上所述，本发明中的光敏剂可以通过肿瘤微环境更准确地指导光动力与释放NO联合抗肿瘤。光敏剂PSQI-NO是一种多功能的线粒体靶向探针，光敏剂PSQI-NO是一种多功能的线粒体靶向探针，包括线粒体靶向能力及伴随的·O2 -原位产生用于PDT消融肿瘤细胞；释放的NO也可对肿瘤细胞产生杀伤作用，并可进一步克服PDT的氧依赖性；经此过程，NO和PDT联合用于抗肿瘤，极大提高了药物的抗肿瘤作用。线粒体靶向和PDT与NO的联合治疗为临床上荧光引导成像的联合用药抗肿瘤提供了新的见解。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种具有线粒体靶向功能的光可控释放NO并开启光动力效果的光敏剂，具体结构式如下所示：
2.权利要求1所述的具有线粒体靶向功能的光可控释放NO并开启光动力效果的光敏剂的制备方法，它包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的具有线粒体靶向功能的光可控释放NO并开启光动力效果的光敏剂的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
(1)在PdCl2(dppf)和AcONa存在的条件下，4-溴苯甲胺和联硼酸频哪醇酯进行化学反应制备化合物1；
(2)在PdCl2(dppf)和K2CO3存在的条件下，化合物1与2-溴-5-噻吩甲醛进行化学反应制备化合物2；
(3)在哌啶存在的条件下，化合物2、4-甲基喹啉碘甲盐与无水乙醇混合均匀，加热至回流温度进行化学反应制备化合物PSQI；
(4)在冰醋酸存在的条件下，化合物PSQI与亚硝酸钠进行化学反应制备光敏剂PSQI-NO。
4.根据权利要求3所述的具有线粒体靶向功能的光可控释放NO并开启光动力效果的光敏剂的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，反应温度为80～100℃，优选为90℃；
4-溴苯甲胺与联硼酸频哪醇酯的摩尔比为1:1.2～2.0，优选为1:1.5；所述4-溴苯甲胺与PdCl2(dppf)的摩尔比为1:0.05～0.1，优选为1:0.06；所述4-溴苯甲胺与AcONa的摩尔比为1:2.0～3.0，优选为1:2.5。
5.根据权利要求3所述的具有线粒体靶向功能的光可控释放NO并开启光动力效果的光敏剂的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，反应温度为100～120℃，优选为110℃所述化合物1与5-溴-2-噻吩甲醛的摩尔比为1:1.0～1.5，优选为1:1.2；所述化合物1与PdCl2(dppf)的摩尔比为1:0.05～0.12，优选为1:0.09；所述化合物1与K2CO3的摩尔比为1:2.0～3.0，优选为1:2.5。
6.根据权利要求3所述的具有线粒体靶向功能的光可控释放NO并开启光动力效果的光敏剂的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述化合物2与4-甲基喹啉碘甲盐的摩尔比为1:0.8～1.5，优选为1:1.0；在步骤(4)中，反应温度为-5～5℃，优选为0℃；
所述化合物PSQI与亚硝酸钠的摩尔比为1:3.0～4.0，优选为1:3.7。
7.权利要求1所述的具有线粒体靶向功能的光可控释放NO并开启光动力效果的光敏剂在制备靶向肿瘤细胞线粒体的荧光成像诊断药物中的应用。
8.权利要求1所述的具有线粒体靶向功能的光可控释放NO并开启光动力效果的光敏剂在制备具有光动力肿瘤治疗药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述光敏剂经过激发光照射后产生超氧阴离子杀伤肿瘤细胞。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述光敏剂经过激发光照射后产生一氧化氮杀伤肿瘤细胞。
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|---|---|---|---|---|
| CN111870601A (zh) * | 2020-08-28 | 2020-11-03 | 广东工业大学 | 一种6-二甲氨基喹啉芳香乙烯衍生物在制备抗耐药菌药物中的应用 |
| CN112920113A (zh) * | 2021-01-22 | 2021-06-08 | 华南理工大学 | 一种靶向β淀粉样蛋白的荧光探针及制备以及其在阿尔兹海默症中的应用 |
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| Title |
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