CN116410330A - Wnt3a融合蛋白及其制法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了Wnt3a融合蛋白及其制法及应用。实验结果表明，所述融合蛋白能够显著与鼠抗Wnt3a抗体结合。本发明还提供了包含该融合蛋白的药物组合物，和制备该融合蛋白的方法。

Description

Wnt3a融合蛋白及其制法及应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及Wnt3a融合蛋白及其制法及应用。

背景技术

Wnt基因于1982年首次被发现，并在小鼠中被命名为Int基因。随后的一项研究报告称，果蝇中的Int基因和无翅基因是同源基因。因此，这两个基因都被公认为Wnt基因。Wnt家族包括19种人类蛋白质，包括Wnt1，Wnt2，Wnt2b(Wnt13)，Wnt3，Wnt3a，Wnt4，Wnt5a，Wnt5b，Wnt6，Wnt7a，Wnt7b，Wnt8a，Wnt8b，Wnt9a(Wnt14)，Wnt9b(Wnt14b)，Wnt10a，Wnt 10b，Wnt11和Wnt16。这些基因编码分泌的糖蛋白，富含半胱氨酸，它们具有27％-83％的氨基酸序列同源性以及23或24个半胱氨酸残基的保守序列。Wnts可以与细胞膜受体结合，这些受体在自分泌调节中起关键作用和/或通过与相邻细胞膜受体结合来参与旁分泌修饰。由Wnt基因介导的信号转导途径称为Wnt信号通路。在发育过程中，Wnt在控制细胞命运、增殖、迁移、极性和死亡方面扮演着不同的角色。在成人中，Wnt在维持体内稳态过程中起着重要功能，Wnt途径的异常激活与多种癌症有关。

Wnt配体通过Frizzled家族的7跨膜受体(人类基因组中有11个成员)以及最近发现的LRP5(脂蛋白受体相关蛋白-5)和LRP6(脂蛋白受体相关蛋白5)共受体传递信号。在结构上，Frizzled受体有一个胞外Wnt结合区、七个跨膜区域和一个胞内C末端尾巴。Frizzled序列所预示的二级结构以及Wnt信号通路蛋白质和GPCRs通路所特有的蛋白的参与表明，Frizzled蛋白也是GPCR家族成员。Wnt信号至少通过三条不同的细胞内通路进行传递，包括经典Wnt/Ctnn-Beta(catenin-Beta)信号通路、“非经典”的Wnt/Ca²⁺(钙)通路和Wnt/PCP(平面细胞极性)通路。Wnt/Ctnn-Beta通路主要调控发育过程中细胞的命运，而Wnt/极性通路的主要功能是调节细胞骨架组织。Wnt/Ca²⁺途径的生物学功能尚不清楚。

此外，在类器官培养用中，常常需要加入不同的添加物或细胞因子，因此本领域迫切需要开发新的可用于类器官培养用的重组蛋白因子。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的可用于类器官培养用的重组蛋白因子。

本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白具有式Ia或式Ib所述结构：

C-A-L-B-Z (Ia)，或

C-B-L-A-Z (Ib)

其中，

C为无或信号肽序列；

A为包括Wnt3a的蛋白元件，并且元件A的长度为至少300个氨基酸(如300-350个氨基酸，较佳地325-335个氨基酸，如334个氨基酸)；

B为AFM蛋白元件；

L为无或肽接头；

Z为无或纯化标签

“-”表示连接上述各元件的肽键。

在另一优选例中，所述元件A具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述元件B序列如SEQ ID NO:6所示。

在另一优选例中，所述融合蛋白选自下组：

(A)具有SEQ ID NO:1或3所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:1或3所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥85％的同源性；更优选地≥90％的同源性；最优选地，≥95％的同源性)的多肽；

(C)将SEQ ID NO:1或3中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的。

在另一优选例中，所述元件A衍生自哺乳动物(如人)的Wnt3a蛋白。

在另一优选例中，所述元件B衍生自哺乳动物(如人)的AFM蛋白。

在另一优选例中，所述的肽接头的长度为0-10氨基酸，较佳地为1-5个氨基酸。

在另一优选例中，所述融合蛋白还包括信号肽元件C。

在另一优选例中，所述融合蛋白具有选自下组的一个或多个特性：

(a)具有维持干细胞干性的生物学活性

(b)促进干细胞增殖，抑制干细胞分化的特性。

在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或3所示。

在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明第一方面所述的融合蛋白。

在另一优选例中，所述的多核苷酸的序列如SEQ ID No:2或4所示。

在本发明的第三方面，提供了一种载体，它含有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，它含有本发明第三方面所述的载体或基因组中整合有第二方面所述的多核苷酸。

在本发明的第五方面，提供了一种产生蛋白的方法，包括步骤：

在适合表达的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达出本发明第一方面所述的融合蛋白；和分离所述融合蛋白。

在本发明的第六方面，提供了本发明第一方面所述的融合蛋白的用途，它被用于制备类器官培养用的制剂，或

用于制备一药物，所述药物用于代谢类疾病的预防和治疗、用于肿瘤疾病的预防和治疗。

此外，本发明的融合蛋白还可用作类器官培养用的重组蛋白因子。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明一个载体图谱。

图2显示Wnt3a融合蛋白SDS-PAGE检测结果。

图3显示，在TCF/LEF LucP HEK293试验中，Wnt3a融合蛋白可以激活TCF/LEF因子转录。

图4显示了采用Wnt3a鼠单克隆抗体对重组的Wnt3a-AFM融合蛋白的ELISA检测。结果表明，Wnt3a单克隆抗体可有效识别Wnt3a-AFM融合蛋白。

图5显示了本发明融合蛋白的两种结构示意图，其中，Sp为信号肽，linker为连接肽。

图6显示了本发明一种融合蛋白的结构，该融合蛋白的结构为C-A-L-B-Z，其中N端包含信号肽，C端包含纯化标签。单下划线为Wnt3a序列；双下划线为AFM序列，在Wnt3a序列和AFM序列之间为连接肽。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，首次开发了一种结构新颖独特的Wnt3a融合蛋白，实验结果表明，所述融合蛋白有显著活性，能够与鼠抗Wnt3a抗体结合，以及改变TCF/LEF转录活性(TCF/LEF Luc2P HEK293报告细胞是经典的检测Wnt家族蛋白活性的常用细胞株，若Wnt蛋白具备维持干细胞干性的生物学活性，可以启动TCF/LEF的转录，检测到Luciferase荧光素酶的表达)。因此，本发明的融合蛋白可用作类器官培养用的重组蛋白因子，以提高类器官培养的效率和质量。在此基础上完成了本发明。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

Wnt3a蛋白

Wnt3a是Wnt家族的成员，由编码分泌信号蛋白的结构连接基因组成。这种蛋白质与肿瘤发生有关，也与胚胎发生过程中细胞命运和模式的调节有关。它在维持胚胎和成体组织的完整性方面起着关键作用。Wnt的翻译后糖基化和酰化对于其有效的分泌和生物学功能至关重要。

在本发明中，Wnt3a蛋白包括人和非人哺乳动物的wnt3a蛋白。人wnt3a蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:7所示。

SYPIWWSLAVGPQYSSLGSQPILCASIPGLVPKQLRFCRNYVEIMPSVAEGIKIGIQECQHQFRGRRWNCTTVHDSLAIFGPVLDKATRESAFVHAIASAGVAFAVTRSCAEGTAAICGCSSRHQGSPGKGWKWGGCSEDIEFGGMVSREFADARENRPDARSAMNRHNNEAGRQAIASHMHLKCKCHGLSGSCEVKTCWWSQPDFRAIGDFLKDKYDSASEMVVEKHRESRGWVETLRPRYTYFKVPTERDLVYYEASPNFCEPNPETGSFGTRDRTCNVSSHGIDGCDLLCCGRGHNARAERRREKCRCVFHWCCYVSCQECTRVYDVHTCK(SEQ ID No:7)

AFM蛋白

AFM(Afamin)是一种蛋白质编码基因。该基因是白蛋白基因家族的成员，该家族由四个以串联方式定位于4号染色体的基因组成。这四个基因编码结构相关的血清转运蛋白，已知这些蛋白在进化上是相关的。AFM基因的一个重要旁系同源物是AFP。该基因编码的蛋白质在发育过程中受到调控，在肝脏中表达并分泌到血液中。

人的AFM的氨基酸序列的UNIPROT登录号为P43652，核苷酸序列的Genbank登录号为NM_001133.2。代表性的AFM的氨基酸序列如SEQ ID No:11所示，核苷酸序列如SEQ IDNo:12所示。

LPTQPRDIENFNSTQKFIEDNIEYITIIAFAQYVQEATFEEMEKLVKDMVEYKDRCMADKTLPECSKLPNNVLQEKICAMEGLPQKHNFSHCCSKVDAQRRLCFFYNKKSDVGFLPPFPTLDPEEKCQAYESNRESLLNHFLYEVARRNPFVFAPTLLTVAVHFEEVAKSCCEEQNKVNCLQTRAIPVTQYLKAFSSYQKHVCGALLKFGTKVVHFIYIAILSQKFPKIEFKELISLVEDVSSNYDGCCEGDVVQCIRDTSKVMNHICSKQDSISSKIKECCEKKIPERGQCIINSNKDDRPKDLSLREGKFTDSENVCQERDADPDTFFAKFTFEYSRRHPDLSIPELLRIVQIYKDLLRNCCNTENPPGCYRYAEDKFNETTEKSLKMVQQECKHFQNLGKDGLKYHYLIRLTKIAPQLSTEELVSLGEKMVTAFTTCCTLSEEFACVDNLADLVFGELCGVNENRTINPAVDHCCKTNFAFRRPCFESLKADKTYVPPPFSQDLFTFHADMCQSQNEELQRKTDRFLVNLVKLKHELTDEELQSLFTNFANVVDKCCKAESPEVCFNEESPKIGN(SEQ ID No:11)

Afamin已被提出作为一般人群中代谢性疾病的临床相关标志物。大型人群研究的荟萃分析清楚地表明，afamin的血浆浓度与代谢综合征的患病率和发展密切相关。在超过20.000例个体中进行的汇总分析证实，afamin与胰岛素抵抗密切相关，可认为其是2型糖尿病(T2D)的独立强预测因子。

使用差异蛋白质组学方法，确定了血清糖蛋白afamin是卵巢癌潜在的新型生物标志物，并在免疫印迹和定量免疫分析初步研究中验证了这一发现。60例良性妇科疾病患者、26例卵巢癌患者和39例健康对照者相比，57例卵巢癌患者的afamin血清浓度在统计学上显著降低。

融合蛋白及其制备

在本发明中，“融合蛋白”、“重组蛋白”、“本发明蛋白”、“本发明融合蛋白”可互换使用，指具有式Ia或Ib所述结构，即含有包括Wnt3a的蛋白元件和AFM蛋白元件的融合蛋白。一个代表性的例子是Wnt3a融合蛋白。本发明蛋白可以是单体或由单体形成的多聚体(如二聚体)。此外，应理解，所述术语还包括融合蛋白的活性片段和衍生物。

C-A-L-B-Z (Ia)，或

C-B-L-A-Z (Ib)

代表性地，本发明的融合蛋白的结构如图5所示。

更具体地，本发明的一种式Ia的融合蛋白的结构如图6所示。

该蛋白的Wnt3a-linker-AFM的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示：

其中，第1－20位为信号肽，第965-975位为纯化标签。

该式Ia融合蛋白的编码序列如SEQ ID No:2所示：

ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGTAGCTACCCCATCTGGTGGAGCCTGGCCGTGGGCCCCCAGTACAGCAGCCTGGGCAGCCAGCCCATCCTGTGCGCCAGCATCCCCGGCCTGGTGCCCAAGCAGCTGCGCTTCTGCCGCAACTACGTGGAGATCATGCCCAGCGTGGCCGAGGGCATCAAGATCGGCATCCAGGAGTGCCAGCACCAGTTCCGCGGCCGCCGCTGGAACTGCACCACCGTGCACGACAGCCTGGCCATCTTCGGCCCCGTGCTGGACAAGGCCACCCGCGAGAGCGCCTTCGTGCACGCCATCGCCAGCGCCGGCGTGGCCTTCGCCGTGACCCGCAGCTGCGCCGAGGGCACCGCCGCCATCTGCGGCTGCAGCAGCCGCCACCAGGGCAGCCCCGGCAAGGGCTGGAAGTGGGGCGGCTGCAGCGAGGACATCGAGTTCGGCGGCATGGTGAGCCGCGAGTTCGCCGACGCCCGCGAGAACCGCCCCGACGCCCGCAGCGCCATGAACCGCCACAACAACGAGGCCGGCCGCCAGGCCATCGCCAGCCACATGCACCTGAAGTGCAAGTGCCACGGCCTGAGCGGCAGCTGCGAGGTGAAGACCTGCTGGTGGAGCCAGCCCGACTTCCGCGCCATCGGCGACTTCCTGAAGGACAAGTACGACAGCGCCAGCGAGATGGTGGTGGAGAAGCACCGCGAGAGCCGCGGCTGGGTGGAGACCCTGCGCCCCCGCTACACCTACTTCAAGGTGCCCACCGAGCGCGACCTGGTGTACTACGAGGCCAGCCCCAACTTCTGCGAGCCCAACCCCGAGACCGGCAGCTTCGGCACCCGCGACCGCACCTGCAACGTGAGCAGCCACGGCATCGACGGCTGCGACCTGCTGTGCTGCGGCCGCGGCCACAACGCCCGCGCCGAGCGCCGCCGCGAGAAGTGCCGCTGCGTGTTCCACTGGTGCTGCTACGTGAGCTGCCAGGAGTGCACCCGCGTGTACGACGTGCACACCTGCAAAggcggcggaggctccggaggaggcggcagcggaggcggaggctctTCCGGACTCCTGAGCCCCCTGGGCCTGTGGGCCggcggctctggaggctccCTGCCCACACAACCTCGGGATATAGAGAACTTCAATAGTACTCAAAAATTTATAGAAGATAATATTGAATACATCACCATCATTGCATTTGCTCAGTATGTTCAGGAAGCAACCTTTGAAGAAATGGAAAAGCTGGTGAAAGACATGGTAGAATACAAAGACAGATGTATGGCTGACAAGACGCTCCCAGAGTGTTCAAAATTACCTAATAATGTTTTACAGGAAAAAATATGTGCTATGGAGGGGCTGCCACAAAAGCATAATTTCTCACACTGCTGCAGTAAGGTTGATGCTCAAAGAAGACTCTGTTTCTTCTATAACAAGAAATCTGATGTGGGATTTCTGCCTCCTTTCCCTACCCTGGATCCCGAAGAGAAATGCCAGGCTTATGAAAGTAACAGAGAATCCCTTTTAAATCACTTTTTATATGAAGTTGCCAGAAGGAACCCATTTGTCTTCGCCCCTACACTTCTAACTGTTGCTGTTCATTTTGAGGAGGTGGCCAAATCATGTTGTGAAGAACAAAACAAAGTCAACTGCCTTCAAACAAGGGCAATACCTGTCACACAATATTTAAAAGCATTTTCTTCTTATCAAAAACATGTCTGTGGGGCACTTTTGAAATTTGGAACCAAAGTTGTACACTTTATATATATTGCGATACTCAGTCAAAAATTCCCCAAGATTGAATTTAAGGAGCTTATTTCTCTTGTAGAAGATGTTTCTTCCAACTATGATGGATGCTGTGAAGGGGATGTTGTGCAGTGCATCCGTGACACGAGCAAGGTTATGAACCATATTTGTTCAAAACAAGATTCTATCTCCAGCAAAATCAAAGAGTGCTGTGAAAAGAAAATACCAGAGCGCGGCCAGTGCATAATTAACTCAAACAAAGATGATAGACCAAAGGATTTATCTCTAAGAGAAGGAAAATTTACTGACAGTGAAAATGTGTGTCAAGAACGAGATGCTGACCCAGACACCTTCTTTGCGAAGTTTACTTTTGAATACTCAAGGAGACATCCAGACCTGTCTATACCAGAGCTTTTAAGAATTGTTCAAATATACAAAGATCTCCTGAGAAATTGCTGCAACACAGAAAACCCTCCAGGTTGTTACCGTTACGCGGAAGACAAATTCAATGAGACAACTGAGAAAAGCCTCAAGATGGTACAACAAGAATGTAAACATTTCCAGAATTTGGGGAAGGATGGTTTGAAATACCATTACCTCATCAGGCTCACGAAGATAGCTCCCCAACTCTCCACTGAAGAACTGGTGTCTCTTGGCGAGAAAATGGTGACAGCTTTCACTACTTGCTGTACGCTAAGTGAAGAGTTTGCCTGTGTTGATAATTTGGCAGATTTAGTTTTTGGAGAGTTATGTGGAGTAAATGAAAATCGAACTATCAACCCTGCTGTGGACCACTGCTGTAAAACAAACTTTGCCTTCAGAAGGCCCTGCTTTGAGAGTTTGAAAGCTGATAAAACATATGTGCCTCCACCTTTCTCTCAAGATTTATTTACCTTTCACGCAGACATGTGTCAATCTCAGAATGAGGAGCTTCAGAGGAAGACAGACAGGTTTCTTGTCAACTTAGTGAAGCTGAAGCATGAACTCACAGATGAAGAGCTGCAGTCTTTGTTTACAAATTTCGCAAATGTAGTGGATAAGTGCTGCAAAGCAGAGAGTCCTGAAGTCTGCTTTAATGAAGAGAGTCCAAAAATTGGCAACGGAGGATCTCATCATCACCACCACCATCATCAC(SEQ ID No:2)

本发明的式Ib的融合蛋白的结构如SEQ ID No:3所示。

METDTLLLWVLLLWVPGSTGLPTQPRDIENFNSTQKFIEDNIEYITIIAFAQYVQEATFEEMEKLVKDMVEYKDRCMADKTLPECSKLPNNVLQEKICAMEGLPQKHNFSHCCSKVDAQRRLCFFYNKKSDVGFLPPFPTLDPEEKCQAYESNRESLLNHFLYEVARRNPFVFAPTLLTVAVHFEEVAKSCCEEQNKVNCLQTRAIPVTQYLKAFSSYQKHVCGALLKFGTKVVHFIYIAILSQKFPKIEFKELISLVEDVSSNYDGCCEGDVVQCIRDTSKVMNHICSKQDSISSKIKECCEKKIPERGQCI INSNKDDRPKDLSLREGKFTDSENVCQERDADPDTFFAKFTFEYSRRHPDLSIPELLRIVQIYKDLLRNCCNTENPPGCYRYAEDKFNETTEKSLKMVQQECKHFQNLGKDGLKYHYLIRLTKIAPQLSTEELVSLGEKMVTAFTTCCTLSEEFACVDNLADLVFGELCGVNENRTINPAVDHCCKTNFAFRRPCFESLKADKTYVPPPFSQDLFTFHADMCQSQNEELQRKTDRFLVNLVKLKHELTDEELQSLFTNFANVVDKCCKAESPEVCFNEESPKIGNGGGGSGGGGSGGGGSSGLLSPLGLWAGGSGGSSYPIWWSLAVGPQYSSLGSQPILCASIPGLVPKQLRFCRNYVEIMPSVAEGIKIGIQECQHQFRGRRWNCTTVHDSLAIFGPVLDKATRESAFVHAIASAGVAFAVTRSCAEGTAAICGCSSRHQGSPGKGWKWGGCSEDIEFGGMVSREFADARENRPDARSAMNRHNNEAGRQAIASHMHLKCKCHGLSGSCEVKTCWWSQPDFRAIGDFLKDKYDSASEMVVEKHRESRGWVETLRPRYTYFKVPTERDLVYYEASPNFCEPNPETGSFGTRDRTCNVSSHGIDGCDLLCCGRGHNARAERRREKCRCVFHWCCYVSCQECTRVYDVHTCKGGSHHHHHHHH(SEQID No:3)

其中，第1－20位为信号肽，第965-975位为纯化标签。

该融合蛋白式Ib的编码序列如SEQ ID No:4所示：

ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGTCTGCCCACACAACCTCGGGATATAGAGAACTTCAATAGTACTCAAAAATTTATAGAAGATAATATTGAATACATCACCATCATTGCATTTGCTCAGTATGTTCAGGAAGCAACCTTTGAAGAAATGGAAAAGCTGGTGAAAGACATGGTAGAATACAAAGACAGATGTATGGCTGACAAGACGCTCCCAGAGTGTTCAAAATTACCTAATAATGTTTTACAGGAAAAAATATGTGCTATGGAGGGGCTGCCACAAAAGCATAATTTCTCACACTGCTGCAGTAAGGTTGATGCTCAAAGAAGACTCTGTTTCTTCTATAACAAGAAATCTGATGTGGGATTTCTGCCTCCTTTCCCTACCCTGGATCCCGAAGAGAAATGCCAGGCTTATGAAAGTAACAGAGAATCCCTTTTAAATCACTTTTTATATGAAGTTGCCAGAAGGAACCCATTTGTCTTCGCCCCTACACTTCTAACTGTTGCTGTTCATTTTGAGGAGGTGGCCAAATCATGTTGTGAAGAACAAAACAAAGTCAACTGCCTTCAAACAAGGGCAATACCTGTCACACAATATTTAAAAGCATTTTCTTCTTATCAAAAACATGTCTGTGGGGCACTTTTGAAATTTGGAACCAAAGTTGTACACTTTATATATATTGCGATACTCAGTCAAAAATTCCCCAAGATTGAATTTAAGGAGCTTATTTCTCTTGTAGAAGATGTTTCTTCCAACTATGATGGATGCTGTGAAGGGGATGTTGTGCAGTGCATCCGTGACACGAGCAAGGTTATGAACCATATTTGTTCAAAACAAGATTCTATCTCCAGCAAAATCAAAGAGTGCTGTGAAAAGAAAATACCAGAGCGCGGCCAGTGCATAATTAACTCAAACAAAGATGATAGACCAAAGGATTTATCTCTAAGAGAAGGAAAATTTACTGACAGTGAAAATGTGTGTCAAGAACGAGATGCTGACCCAGACACCTTCTTTGCGAAGTTTACTTTTGAATACTCAAGGAGACATCCAGACCTGTCTATACCAGAGCTTTTAAGAATTGTTCAAATATACAAAGATCTCCTGAGAAATTGCTGCAACACAGAAAACCCTCCAGGTTGTTACCGTTACGCGGAAGACAAATTCAATGAGACAACTGAGAAAAGCCTCAAGATGGTACAACAAGAATGTAAACATTTCCAGAATTTGGGGAAGGATGGTTTGAAATACCATTACCTCATCAGGCTCACGAAGATAGCTCCCCAACTCTCCACTGAAGAACTGGTGTCTCTTGGCGAGAAAATGGTGACAGCTTTCACTACTTGCTGTACGCTAAGTGAAGAGTTTGCCTGTGTTGATAATTTGGCAGATTTAGTTTTTGGAGAGTTATGTGGAGTAAATGAAAATCGAACTATCAACCCTGCTGTGGACCACTGCTGTAAAACAAACTTTGCCTTCAGAAGGCCCTGCTTTGAGAGTTTGAAAGCTGATAAAACATATGTGCCTCCACCTTTCTCTCAAGATTTATTTACCTTTCACGCAGACATGTGTCAATCTCAGAATGAGGAGCTTCAGAGGAAGACAGACAGGTTTCTTGTCAACTTAGTGAAGCTGAAGCATGAACTCACAGATGAAGAGCTGCAGTCTTTGTTTACAAATTTCGCAAATGTAGTGGATAAGTGCTGCAAAGCAGAGAGTCCTGAAGTCTGCTTTAATGAAGAGAGTCCAAAAATTGGCAACggcggcggaggctccggaggaggcggcagcggaggcggaggctctTCCGGACTCCTGAGCCCCCTGGGCCTGTGGGCCggcggctctggaggctcAGCTACCCCATCTGGTGGAGCCTGGCCGTGGGCCCCCAGTACAGCAGCCTGGGCAGCCAGCCCATCCTGTGCGCCAGCATCCCCGGCCTGGTGCCCAAGCAGCTGCGCTTCTGCCGCAACTACGTGGAGATCATGCCCAGCGTGGCCGAGGGCATCAAGATCGGCATCCAGGAGTGCCAGCACCAGTTCCGCGGCCGCCGCTGGAACTGCACCACCGTGCACGACAGCCTGGCCATCTTCGGCCCCGTGCTGGACAAGGCCACCCGCGAGAGCGCCTTCGTGCACGCCATCGCCAGCGCCGGCGTGGCCTTCGCCGTGACCCGCAGCTGCGCCGAGGGCACCGCCGCCATCTGCGGCTGCAGCAGCCGCCACCAGGGCAGCCCCGGCAAGGGCTGGAAGTGGGGCGGCTGCAGCGAGGACATCGAGTTCGGCGGCATGGTGAGCCGCGAGTTCGCCGACGCCCGCGAGAACCGCCCCGACGCCCGCAGCGCCATGAACCGCCACAACAACGAGGCCGGCCGCCAGGCCATCGCCAGCCACATGCACCTGAAGTGCAAGTGCCACGGCCTGAGCGGCAGCTGCGAGGTGAAGACCTGCTGGTGGAGCCAGCCCGACTTCCGCGCCATCGGCGACTTCCTGAAGGACAAGTACGACAGCGCCAGCGAGATGGTGGTGGAGAAGCACCGCGAGAGCCGCGGCTGGGTGGAGACCCTGCGCCCCCGCTACACCTACTTCAAGGTGCCCACCGAGCGCGACCTGGTGTACTACGAGGCCAGCCCCAACTTCTGCGAGCCCAACCCCGAGACCGGCAGCTTCGGCACCCGCGACCGCACCTGCAACGTGAGCAGCCACGGCATCGACGGCTGCGACCTGCTGTGCTGCGGCCGCGGCCACAACGCCCGCGCCGAGCGCCGCCGCGAGAAGTGCCGCTGCGTGTTCCACTGGTGCTGCTACGTGAGCTGCCAGGAGTGCACCCGCGTGTACGACGTGCACACCTGCAAAGGAGGATCTCATCATCACCACCACCATCATCAC(SEQ ID No:4)

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的融合蛋白”是指融合蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化融合蛋白。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。

如本文所用，术语“引物”指的是在与模板配对，在DNA聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3'端与模板互补的引物的5'端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。

本发明融合蛋白或其元件(如Wnt3a)的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白质的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组蛋白。一般来说有以下步骤：

(1)用本发明的编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

应理解，所述术语还包括本发明融合蛋白的衍生物，指本发明融合蛋白在经过1-3个氨基酸添加或替换、1-2个氨基酸缺失并仍具有肿瘤抑制活性的多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

一旦鉴定获得了相关的肽序列，就可以用重组法来大批量地获得相关肽序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到相关肽(融合蛋白)。

此外，还可用化学方法直接合成相关肽序列。

肽接头

本发明提供了一种融合蛋白，它可任选地含有肽接头。肽接头大小和复杂性可能会影响蛋白的活性。通常，肽接头应当具有足够的长度和柔韧性，以保证连接的两个蛋白在空间上有足够的自由度以发挥其功能。同时避免肽接头中形成α螺旋或β折叠等对融合蛋白的稳定性的影响。

连接肽的长度一般为0-10个氨基酸，较佳地1-5个氨基酸

本发明的主要优点如下：

(1)本发明的方法制备出的Wnt3a融合蛋白稳定性较强。

(2)本发明的方法制备出的Wnt3a融合蛋白，不需要依赖CHAPS。

(3)本发明的方法制备出的Wnt3a融合蛋白活性较强。

下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1分子克隆构建

基因合成方法合成SP-Wnt3a基因模板和AFM基因模板；

以SP-Wnt3a基因为模板，以Wnt3a-F/Wnt3a-R为引物，扩增SP-Wnt3a基因片段，扩增条件：94℃，5min；(94℃，30s；58℃，30s；72℃，1min)x30；72℃，5min。扩增体系：10Xbuffer(含Mg²⁺)，5μL；2.5mM dNTP，2μL；10μM上游引物，1μL；10μM下游引物，1μL；模板，2μL；Taq，0.5μL；ddH2O，38.5μL；

以AFM基因为模板，以AM-F2/AFM-R为引物，扩增AFM-1片段，扩增条件：94℃，5min；(94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min)x30；72℃，5min。扩增体系：10X buffer(含Mg²⁺)，5μL；2.5mM dNTP，2μl；10μM上游引物，1μL；10μM下游引物，1μL；模板，2μL；Taq，0.5μL；ddH2O，38.5μL。再以扩增后AFM-1片段为模板，以AM-F1/AFM-R为引物，扩增AFM-2融合片段，扩增条件：94℃，5min；(94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min)x30；72℃，5min。扩增体系：10X buffer(含Mg²⁺)，5μL；2.5mM dNTP，2μL；10μM上游引物，1μL；10μM下游引物，1μL；模板，2μL；Taq，0.5μL；ddH2O，38.5μL；

用HindI II/EcoRI酶切PCDNA3.1质粒载体并利用胶回收试剂盒回收大片段，胶回收试剂盒购自天根生化，货号：DP209-03，操作步骤参见说明书，同样用胶回收试剂盒回收上述PCR产物。用基因重组试剂盒(ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit，Vazyme#C115)，将三片段进行重组(PCDNA3.1质粒酶切产物，SP-Wnt3a和AFM-2PCR产物)，反应条件为：50℃反应5-15min，进行重组；

重组产物直接转化感受态细胞，将克隆用的化学感受态细胞置于冰上解冻(Fast-T1 Competent Cell，Vazyme#C505)。取5-10μL重组产物加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上静置30min。42℃水浴热激45s后，立即置于冰上冷却2-3min。加入900μL LB液体培养基(不添加抗生素)，37℃摇菌1h(转速200rpm)。将氨苄抗性的LB固体培养基平板在37℃培养箱中预热。5,000rpm(2,500×g)离心5min，弃掉900μL上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀。37℃培养箱中倒置培养12-16h。挑取单克隆进行测序鉴定，保存正确质粒克隆。用无内毒素质粒提取试剂盒提取大肠杆菌TOP10中的重组质粒，命名为：pCDNA3.1-Wnt3a-AFM。质粒图谱如图1所示。

为了构建pCDNA3.1-Wnt3a-AFM质粒，使用的合成引物如下：

>Wnt3a-F

CACTATAGGGAGACCCAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTG(SEQ ID No:7)

>Wnt3a-r

TTTGCAGGTGTGCACGTCGTACACG(SEQ ID No:8)

>W3AM-F1

ACGACGTGCACACCTGCAAAggcggcggaggctccggaggaggcggcagcggaggcggaggctctTCCGGACTCCTGAGCCCCCTGGGC(SEQ ID No:9)

>W3AM-F2

GGACTCCTGAGCCCCCTGGGCCTGTGGGCCggcggctctggaggctccCTGCCCACACAAC CTCGGGA(SEQ ID No:10)

>AFM-R

CTGGATATCTGCAGAATTCATTAGTGATGATGGTGGTGGTGATGATGAGATCCTCCGTTGCCAATTTTTGGACTCTCTTC(SEQ ID No:11)

实施例2蛋白表达

培养293F细胞，当细胞密度达到2×10⁶–3×10⁶细胞/毫升时，采用pCDNA3.1-Wnt3a-AFM质粒进行转染(转染试剂：Thermo，货号：A14525)。

转染后培养7天，收集上清，高速离心，通过镍柱(层析填料：中科森辉，货号：11-0030-06)纯化融合蛋白。通过SDS-PAGE方法检测上述纯化得到的融合蛋白的分子量。

结果如图2所示，成功构建表达融合蛋白Wnt3a-AFM的重组表达载体，并实现了在宿主细胞中表达和纯化融合蛋白Wnt3a-AFM。融合蛋白的分子量为110KD，与预测值相符。

此外，同时纯化的蛋白中可在linker处进行断裂，产生的单独AFM蛋白。

实施例3重组蛋白检测ELISA检测

为了验证表达的重组蛋白是否包含Wnt3a分子，通过其与Wnt3a的抗体结合实验进行验证。

试剂配制：

①包被液：0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)

0.75g碳酸钠,1.46g碳酸氢钠,加去离子水定容至500ml。

②0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)

0.2g磷酸二氢钾，2.90g磷酸氢二钠，8g氯化钠，加去离子水定容到1000ml。

③抗体稀释液：0.02mol/L PBS(pH7.4)+0.2％BSA

0.2gBSA加配好的0.02mol/L磷酸盐缓冲液溶解定量至100g。

④封闭液：0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)+2.0％BSA

2.0gBSA加配好的0.05mol/L碳酸盐缓冲液溶解定量至100g。

⑤洗涤液：0.02mol/L PBS(pH7.4)+0.05％Tween-20

将50ulTween-20溶入100ml0.02mol/L磷酸盐缓冲液中，震荡混匀。

⑥显色液：TMB-过氧化氢尿素溶液

A液(3，3'，5，5'-四甲基联苯胺，TMB):称取TMB20mg溶于10ml无水乙醇中，完全溶解后，加双蒸水至100ml。

B液(0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲液，pH5.0-5.4):称取Na2HPO4·12H2O14.34g，柠檬酸1.87g溶于180ml双蒸水，加0.75％过氧化氢尿素1.28ml，定容至200ml，调pH至5.0-5.4。

将A液和B液按1：l混合后即成TMB-过氧化氢尿素应用液。

⑦终止液：2mol/L H2SO4溶液

10ml98％浓硫酸加入60ml双蒸水中，定容至100ml，室温保存。

⑧酶标二抗：HRP标记的羊抗鼠IgG，应用时用抗体稀释液稀释3000倍。

实验方法：

抗原包被

用包被液(0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，pH9.6)把抗原Wnt3a-AFM稀释为0.01mg/ml，将稀释好的抗原液于每个酶标板孔中加入100μl。把酶标板置入湿盒内，于4℃包被过夜。

(2)洗板

弃去包被液，用洗涤液加满所有酶标孔，用纱布和卫生纸包住扣干。1次，末次将水扣干。

(3)封闭

在酶联板上每孔加入250μl封闭液(pH9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液含2.0％BSA)，将酶联板置于湿盒内，4℃孵育过夜。也可37℃孵育2h。

(4)弃去封闭液，洗涤1次同上。

(5)加一抗(市售的鼠抗Wnt3a抗体)

最高浓度设为10ug/ml，按照3倍梯度进行稀释，共计11个浓度和一个0浓度点，每孔加入100ul，加完后将酶连板放在湿盒内37℃孵育1h。

(6)洗涤同上。

(7)加酶标二抗

各孔加入稀释倍数为1:10000的酶标二抗(羊抗鼠)100μl，37℃湿盒内孵育1h。

(8)洗涤同上

(9)显色

每孔各加A，B液50μl后将酶联板放入湿盒内避光3min左右，当阴性对照孔显蓝绿色时终止。终止时每孔加入50μl的2mol/L浓硫酸。

(10)检测

终止后迅速用酶标仪测酶联板各孔A450的值。

实验结果如图3所示，本发明的Wnt3a-AMF融合蛋白可显著与鼠抗Wnt3a抗体结合。这表明，本发明的Wnt3a-AFM重组蛋白具备完整的空间构象。

实施例4重组蛋白的活性检测

在本实施例中，采用荧光素酶报告系统来检测本发明重组的Wnt3a-AMF融合蛋白的活性。

TCF/LEF LucP HEK293荧光素酶报告基因细胞系是一种稳定转染的HEK293细胞系，其在TCF/LEF反应元件的控制下表达海肾荧光素酶报告基因。该细胞系旨在监测TCF/LEF的转录活性，可用于研究Wnt信号通路以及筛选影响TCF/LEF转录活性的激活剂或抑制剂。

1.收获TCF/LEF luc2p–HEK293细胞，将细胞以5x10⁴个细胞/孔接种至100μl生长培养基中的白色固体底96孔微孔板中。

2.37℃，CO₂培养箱孵育细胞过夜。

3.第二天，用各种浓度的Wnt3a-AFM融合蛋白刺激细胞。

4.在CO₂培养箱中37℃孵育16小时。

5.将板平衡至室温10min。

6.每孔加入50μl荧光素酶检测试剂(Bright-Lite Luciferase Assay System，Vazyme#D1204)。

7.1-5分钟读板，用微孔板光度计测量发光。

结果如图4所示。随着Wnt3a-AMF融合蛋白的用量增加，荧光也相应增加，这表明，本发明的Wnt3a-AMF融合蛋白具有Wnt3a的生物学功能。

此外，在该体系中不含去污剂CHAPS，这提示，本发明的Wnt3a-AMF融合蛋白具有高稳定性。

讨论

Wnt3a信号通路在体外培养人体器官干细胞研究中至关重要，需要制备高生物血活性的Wnt3a蛋白因子用于相关干细胞的培养。然而，自然条件下Wnt3a分子需要进行棕榈酰化修饰才能获得活性，这导致Wnt3a蛋白其疏水性增强稳定性较差。

目前。在本领域中，为了制备wnt3a，会在溶液中加入去污剂CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐)来稳定Wnt3a蛋白，然而使用时纯化的Wnt3a重组蛋白在在细胞培养基中稀释时，去污剂CHAPS浓度降至维持Wnt溶解度所需的水平以下。这导致蛋白快速聚集和活性丧失，尤其是在不存在血清的情况下。如何制备高稳定性不依赖CHAPS的高生物学活性Wnt3a重组蛋白具有重要意义。

本发明的融合蛋白不仅具有Wnt3a的功能，而且具有出乎意料的高稳定性。具体地，在不存在去污剂CHAPS的情况下，本发明的重组蛋白仍具有高生物学活性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 思格（苏州）生物科技有限公司

<120> Wnt3a融合蛋白及其制法及应用

<130> P2021-3288

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 975

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 信号肽-Wnt3a-接头-AFM-纯化标签 氨基酸序列

<400> 1

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Ser Tyr Pro Ile Trp Trp Ser Leu Ala Val Gly Pro

20 25 30

Gln Tyr Ser Ser Leu Gly Ser Gln Pro Ile Leu Cys Ala Ser Ile Pro

35 40 45

Gly Leu Val Pro Lys Gln Leu Arg Phe Cys Arg Asn Tyr Val Glu Ile

50 55 60

Met Pro Ser Val Ala Glu Gly Ile Lys Ile Gly Ile Gln Glu Cys Gln

65 70 75 80

His Gln Phe Arg Gly Arg Arg Trp Asn Cys Thr Thr Val His Asp Ser

85 90 95

Leu Ala Ile Phe Gly Pro Val Leu Asp Lys Ala Thr Arg Glu Ser Ala

100 105 110

Phe Val His Ala Ile Ala Ser Ala Gly Val Ala Phe Ala Val Thr Arg

115 120 125

Ser Cys Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ile Cys Gly Cys Ser Ser Arg His

130 135 140

Gln Gly Ser Pro Gly Lys Gly Trp Lys Trp Gly Gly Cys Ser Glu Asp

145 150 155 160

Ile Glu Phe Gly Gly Met Val Ser Arg Glu Phe Ala Asp Ala Arg Glu

165 170 175

Asn Arg Pro Asp Ala Arg Ser Ala Met Asn Arg His Asn Asn Glu Ala

180 185 190

Gly Arg Gln Ala Ile Ala Ser His Met His Leu Lys Cys Lys Cys His

195 200 205

Gly Leu Ser Gly Ser Cys Glu Val Lys Thr Cys Trp Trp Ser Gln Pro

210 215 220

Asp Phe Arg Ala Ile Gly Asp Phe Leu Lys Asp Lys Tyr Asp Ser Ala

225 230 235 240

Ser Glu Met Val Val Glu Lys His Arg Glu Ser Arg Gly Trp Val Glu

245 250 255

Thr Leu Arg Pro Arg Tyr Thr Tyr Phe Lys Val Pro Thr Glu Arg Asp

260 265 270

Leu Val Tyr Tyr Glu Ala Ser Pro Asn Phe Cys Glu Pro Asn Pro Glu

275 280 285

Thr Gly Ser Phe Gly Thr Arg Asp Arg Thr Cys Asn Val Ser Ser His

290 295 300

Gly Ile Asp Gly Cys Asp Leu Leu Cys Cys Gly Arg Gly His Asn Ala

305 310 315 320

Arg Ala Glu Arg Arg Arg Glu Lys Cys Arg Cys Val Phe His Trp Cys

325 330 335

Cys Tyr Val Ser Cys Gln Glu Cys Thr Arg Val Tyr Asp Val His Thr

340 345 350

Cys Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

355 360 365

Ser Ser Gly Leu Leu Ser Pro Leu Gly Leu Trp Ala Gly Gly Ser Gly

370 375 380

Gly Ser Leu Pro Thr Gln Pro Arg Asp Ile Glu Asn Phe Asn Ser Thr

385 390 395 400

Gln Lys Phe Ile Glu Asp Asn Ile Glu Tyr Ile Thr Ile Ile Ala Phe

405 410 415

Ala Gln Tyr Val Gln Glu Ala Thr Phe Glu Glu Met Glu Lys Leu Val

420 425 430

Lys Asp Met Val Glu Tyr Lys Asp Arg Cys Met Ala Asp Lys Thr Leu

435 440 445

Pro Glu Cys Ser Lys Leu Pro Asn Asn Val Leu Gln Glu Lys Ile Cys

450 455 460

Ala Met Glu Gly Leu Pro Gln Lys His Asn Phe Ser His Cys Cys Ser

465 470 475 480

Lys Val Asp Ala Gln Arg Arg Leu Cys Phe Phe Tyr Asn Lys Lys Ser

485 490 495

Asp Val Gly Phe Leu Pro Pro Phe Pro Thr Leu Asp Pro Glu Glu Lys

500 505 510

Cys Gln Ala Tyr Glu Ser Asn Arg Glu Ser Leu Leu Asn His Phe Leu

515 520 525

Tyr Glu Val Ala Arg Arg Asn Pro Phe Val Phe Ala Pro Thr Leu Leu

530 535 540

Thr Val Ala Val His Phe Glu Glu Val Ala Lys Ser Cys Cys Glu Glu

545 550 555 560

Gln Asn Lys Val Asn Cys Leu Gln Thr Arg Ala Ile Pro Val Thr Gln

565 570 575

Tyr Leu Lys Ala Phe Ser Ser Tyr Gln Lys His Val Cys Gly Ala Leu

580 585 590

Leu Lys Phe Gly Thr Lys Val Val His Phe Ile Tyr Ile Ala Ile Leu

595 600 605

Ser Gln Lys Phe Pro Lys Ile Glu Phe Lys Glu Leu Ile Ser Leu Val

610 615 620

Glu Asp Val Ser Ser Asn Tyr Asp Gly Cys Cys Glu Gly Asp Val Val

625 630 635 640

Gln Cys Ile Arg Asp Thr Ser Lys Val Met Asn His Ile Cys Ser Lys

645 650 655

Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Ile Lys Glu Cys Cys Glu Lys Lys Ile

660 665 670

Pro Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile Asn Ser Asn Lys Asp Asp Arg Pro

675 680 685

Lys Asp Leu Ser Leu Arg Glu Gly Lys Phe Thr Asp Ser Glu Asn Val

690 695 700

Cys Gln Glu Arg Asp Ala Asp Pro Asp Thr Phe Phe Ala Lys Phe Thr

705 710 715 720

Phe Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Asp Leu Ser Ile Pro Glu Leu Leu

725 730 735

Arg Ile Val Gln Ile Tyr Lys Asp Leu Leu Arg Asn Cys Cys Asn Thr

740 745 750

Glu Asn Pro Pro Gly Cys Tyr Arg Tyr Ala Glu Asp Lys Phe Asn Glu

755 760 765

Thr Thr Glu Lys Ser Leu Lys Met Val Gln Gln Glu Cys Lys His Phe

770 775 780

Gln Asn Leu Gly Lys Asp Gly Leu Lys Tyr His Tyr Leu Ile Arg Leu

785 790 795 800

Thr Lys Ile Ala Pro Gln Leu Ser Thr Glu Glu Leu Val Ser Leu Gly

805 810 815

Glu Lys Met Val Thr Ala Phe Thr Thr Cys Cys Thr Leu Ser Glu Glu

820 825 830

Phe Ala Cys Val Asp Asn Leu Ala Asp Leu Val Phe Gly Glu Leu Cys

835 840 845

Gly Val Asn Glu Asn Arg Thr Ile Asn Pro Ala Val Asp His Cys Cys

850 855 860

Lys Thr Asn Phe Ala Phe Arg Arg Pro Cys Phe Glu Ser Leu Lys Ala

865 870 875 880

Asp Lys Thr Tyr Val Pro Pro Pro Phe Ser Gln Asp Leu Phe Thr Phe

885 890 895

His Ala Asp Met Cys Gln Ser Gln Asn Glu Glu Leu Gln Arg Lys Thr

900 905 910

Asp Arg Phe Leu Val Asn Leu Val Lys Leu Lys His Glu Leu Thr Asp

915 920 925

Glu Glu Leu Gln Ser Leu Phe Thr Asn Phe Ala Asn Val Val Asp Lys

930 935 940

Cys Cys Lys Ala Glu Ser Pro Glu Val Cys Phe Asn Glu Glu Ser Pro

945 950 955 960

Lys Ile Gly Asn Gly Gly Ser His His His His His His His His

965 970 975

<210> 2

<211> 2925

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 信号肽-Wnt3a-接头-AFM-纯化标签 核苷酸序列

<400> 2

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccaccggt 60

agctacccca tctggtggag cctggccgtg ggcccccagt acagcagcct gggcagccag 120

cccatcctgt gcgccagcat ccccggcctg gtgcccaagc agctgcgctt ctgccgcaac 180

tacgtggaga tcatgcccag cgtggccgag ggcatcaaga tcggcatcca ggagtgccag 240

caccagttcc gcggccgccg ctggaactgc accaccgtgc acgacagcct ggccatcttc 300

ggccccgtgc tggacaaggc cacccgcgag agcgccttcg tgcacgccat cgccagcgcc 360

ggcgtggcct tcgccgtgac ccgcagctgc gccgagggca ccgccgccat ctgcggctgc 420

agcagccgcc accagggcag ccccggcaag ggctggaagt ggggcggctg cagcgaggac 480

atcgagttcg gcggcatggt gagccgcgag ttcgccgacg cccgcgagaa ccgccccgac 540

gcccgcagcg ccatgaaccg ccacaacaac gaggccggcc gccaggccat cgccagccac 600

atgcacctga agtgcaagtg ccacggcctg agcggcagct gcgaggtgaa gacctgctgg 660

tggagccagc ccgacttccg cgccatcggc gacttcctga aggacaagta cgacagcgcc 720

agcgagatgg tggtggagaa gcaccgcgag agccgcggct gggtggagac cctgcgcccc 780

cgctacacct acttcaaggt gcccaccgag cgcgacctgg tgtactacga ggccagcccc 840

aacttctgcg agcccaaccc cgagaccggc agcttcggca cccgcgaccg cacctgcaac 900

gtgagcagcc acggcatcga cggctgcgac ctgctgtgct gcggccgcgg ccacaacgcc 960

cgcgccgagc gccgccgcga gaagtgccgc tgcgtgttcc actggtgctg ctacgtgagc 1020

tgccaggagt gcacccgcgt gtacgacgtg cacacctgca aaggcggcgg aggctccgga 1080

ggaggcggca gcggaggcgg aggctcttcc ggactcctga gccccctggg cctgtgggcc 1140

ggcggctctg gaggctccct gcccacacaa cctcgggata tagagaactt caatagtact 1200

caaaaattta tagaagataa tattgaatac atcaccatca ttgcatttgc tcagtatgtt 1260

caggaagcaa cctttgaaga aatggaaaag ctggtgaaag acatggtaga atacaaagac 1320

agatgtatgg ctgacaagac gctcccagag tgttcaaaat tacctaataa tgttttacag 1380

gaaaaaatat gtgctatgga ggggctgcca caaaagcata atttctcaca ctgctgcagt 1440

aaggttgatg ctcaaagaag actctgtttc ttctataaca agaaatctga tgtgggattt 1500

ctgcctcctt tccctaccct ggatcccgaa gagaaatgcc aggcttatga aagtaacaga 1560

gaatcccttt taaatcactt tttatatgaa gttgccagaa ggaacccatt tgtcttcgcc 1620

cctacacttc taactgttgc tgttcatttt gaggaggtgg ccaaatcatg ttgtgaagaa 1680

caaaacaaag tcaactgcct tcaaacaagg gcaatacctg tcacacaata tttaaaagca 1740

ttttcttctt atcaaaaaca tgtctgtggg gcacttttga aatttggaac caaagttgta 1800

cactttatat atattgcgat actcagtcaa aaattcccca agattgaatt taaggagctt 1860

atttctcttg tagaagatgt ttcttccaac tatgatggat gctgtgaagg ggatgttgtg 1920

cagtgcatcc gtgacacgag caaggttatg aaccatattt gttcaaaaca agattctatc 1980

tccagcaaaa tcaaagagtg ctgtgaaaag aaaataccag agcgcggcca gtgcataatt 2040

aactcaaaca aagatgatag accaaaggat ttatctctaa gagaaggaaa atttactgac 2100

agtgaaaatg tgtgtcaaga acgagatgct gacccagaca ccttctttgc gaagtttact 2160

tttgaatact caaggagaca tccagacctg tctataccag agcttttaag aattgttcaa 2220

atatacaaag atctcctgag aaattgctgc aacacagaaa accctccagg ttgttaccgt 2280

tacgcggaag acaaattcaa tgagacaact gagaaaagcc tcaagatggt acaacaagaa 2340

tgtaaacatt tccagaattt ggggaaggat ggtttgaaat accattacct catcaggctc 2400

acgaagatag ctccccaact ctccactgaa gaactggtgt ctcttggcga gaaaatggtg 2460

acagctttca ctacttgctg tacgctaagt gaagagtttg cctgtgttga taatttggca 2520

gatttagttt ttggagagtt atgtggagta aatgaaaatc gaactatcaa ccctgctgtg 2580

gaccactgct gtaaaacaaa ctttgccttc agaaggccct gctttgagag tttgaaagct 2640

gataaaacat atgtgcctcc acctttctct caagatttat ttacctttca cgcagacatg 2700

tgtcaatctc agaatgagga gcttcagagg aagacagaca ggtttcttgt caacttagtg 2760

aagctgaagc atgaactcac agatgaagag ctgcagtctt tgtttacaaa tttcgcaaat 2820

gtagtggata agtgctgcaa agcagagagt cctgaagtct gctttaatga agagagtcca 2880

aaaattggca acggaggatc tcatcatcac caccaccatc atcac 2925

<210> 3

<211> 975

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 信号肽-AFM-接头-Wnt3a-纯化标签 氨基酸序列

<400> 3

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Leu Pro Thr Gln Pro Arg Asp Ile Glu Asn Phe Asn

20 25 30

Ser Thr Gln Lys Phe Ile Glu Asp Asn Ile Glu Tyr Ile Thr Ile Ile

35 40 45

Ala Phe Ala Gln Tyr Val Gln Glu Ala Thr Phe Glu Glu Met Glu Lys

50 55 60

Leu Val Lys Asp Met Val Glu Tyr Lys Asp Arg Cys Met Ala Asp Lys

65 70 75 80

Thr Leu Pro Glu Cys Ser Lys Leu Pro Asn Asn Val Leu Gln Glu Lys

85 90 95

Ile Cys Ala Met Glu Gly Leu Pro Gln Lys His Asn Phe Ser His Cys

100 105 110

Cys Ser Lys Val Asp Ala Gln Arg Arg Leu Cys Phe Phe Tyr Asn Lys

115 120 125

Lys Ser Asp Val Gly Phe Leu Pro Pro Phe Pro Thr Leu Asp Pro Glu

130 135 140

Glu Lys Cys Gln Ala Tyr Glu Ser Asn Arg Glu Ser Leu Leu Asn His

145 150 155 160

Phe Leu Tyr Glu Val Ala Arg Arg Asn Pro Phe Val Phe Ala Pro Thr

165 170 175

Leu Leu Thr Val Ala Val His Phe Glu Glu Val Ala Lys Ser Cys Cys

180 185 190

Glu Glu Gln Asn Lys Val Asn Cys Leu Gln Thr Arg Ala Ile Pro Val

195 200 205

Thr Gln Tyr Leu Lys Ala Phe Ser Ser Tyr Gln Lys His Val Cys Gly

210 215 220

Ala Leu Leu Lys Phe Gly Thr Lys Val Val His Phe Ile Tyr Ile Ala

225 230 235 240

Ile Leu Ser Gln Lys Phe Pro Lys Ile Glu Phe Lys Glu Leu Ile Ser

245 250 255

Leu Val Glu Asp Val Ser Ser Asn Tyr Asp Gly Cys Cys Glu Gly Asp

260 265 270

Val Val Gln Cys Ile Arg Asp Thr Ser Lys Val Met Asn His Ile Cys

275 280 285

Ser Lys Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Ile Lys Glu Cys Cys Glu Lys

290 295 300

Lys Ile Pro Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile Asn Ser Asn Lys Asp Asp

305 310 315 320

Arg Pro Lys Asp Leu Ser Leu Arg Glu Gly Lys Phe Thr Asp Ser Glu

325 330 335

Asn Val Cys Gln Glu Arg Asp Ala Asp Pro Asp Thr Phe Phe Ala Lys

340 345 350

Phe Thr Phe Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Asp Leu Ser Ile Pro Glu

355 360 365

Leu Leu Arg Ile Val Gln Ile Tyr Lys Asp Leu Leu Arg Asn Cys Cys

370 375 380

Asn Thr Glu Asn Pro Pro Gly Cys Tyr Arg Tyr Ala Glu Asp Lys Phe

385 390 395 400

Asn Glu Thr Thr Glu Lys Ser Leu Lys Met Val Gln Gln Glu Cys Lys

405 410 415

His Phe Gln Asn Leu Gly Lys Asp Gly Leu Lys Tyr His Tyr Leu Ile

420 425 430

Arg Leu Thr Lys Ile Ala Pro Gln Leu Ser Thr Glu Glu Leu Val Ser

435 440 445

Leu Gly Glu Lys Met Val Thr Ala Phe Thr Thr Cys Cys Thr Leu Ser

450 455 460

Glu Glu Phe Ala Cys Val Asp Asn Leu Ala Asp Leu Val Phe Gly Glu

465 470 475 480

Leu Cys Gly Val Asn Glu Asn Arg Thr Ile Asn Pro Ala Val Asp His

485 490 495

Cys Cys Lys Thr Asn Phe Ala Phe Arg Arg Pro Cys Phe Glu Ser Leu

500 505 510

Lys Ala Asp Lys Thr Tyr Val Pro Pro Pro Phe Ser Gln Asp Leu Phe

515 520 525

Thr Phe His Ala Asp Met Cys Gln Ser Gln Asn Glu Glu Leu Gln Arg

530 535 540

Lys Thr Asp Arg Phe Leu Val Asn Leu Val Lys Leu Lys His Glu Leu

545 550 555 560

Thr Asp Glu Glu Leu Gln Ser Leu Phe Thr Asn Phe Ala Asn Val Val

565 570 575

Asp Lys Cys Cys Lys Ala Glu Ser Pro Glu Val Cys Phe Asn Glu Glu

580 585 590

Ser Pro Lys Ile Gly Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

595 600 605

Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Leu Leu Ser Pro Leu Gly Leu Trp Ala

610 615 620

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Pro Ile Trp Trp Ser Leu Ala Val

625 630 635 640

Gly Pro Gln Tyr Ser Ser Leu Gly Ser Gln Pro Ile Leu Cys Ala Ser

645 650 655

Ile Pro Gly Leu Val Pro Lys Gln Leu Arg Phe Cys Arg Asn Tyr Val

660 665 670

Glu Ile Met Pro Ser Val Ala Glu Gly Ile Lys Ile Gly Ile Gln Glu

675 680 685

Cys Gln His Gln Phe Arg Gly Arg Arg Trp Asn Cys Thr Thr Val His

690 695 700

Asp Ser Leu Ala Ile Phe Gly Pro Val Leu Asp Lys Ala Thr Arg Glu

705 710 715 720

Ser Ala Phe Val His Ala Ile Ala Ser Ala Gly Val Ala Phe Ala Val

725 730 735

Thr Arg Ser Cys Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ile Cys Gly Cys Ser Ser

740 745 750

Arg His Gln Gly Ser Pro Gly Lys Gly Trp Lys Trp Gly Gly Cys Ser

755 760 765

Glu Asp Ile Glu Phe Gly Gly Met Val Ser Arg Glu Phe Ala Asp Ala

770 775 780

Arg Glu Asn Arg Pro Asp Ala Arg Ser Ala Met Asn Arg His Asn Asn

785 790 795 800

Glu Ala Gly Arg Gln Ala Ile Ala Ser His Met His Leu Lys Cys Lys

805 810 815

Cys His Gly Leu Ser Gly Ser Cys Glu Val Lys Thr Cys Trp Trp Ser

820 825 830

Gln Pro Asp Phe Arg Ala Ile Gly Asp Phe Leu Lys Asp Lys Tyr Asp

835 840 845

Ser Ala Ser Glu Met Val Val Glu Lys His Arg Glu Ser Arg Gly Trp

850 855 860

Val Glu Thr Leu Arg Pro Arg Tyr Thr Tyr Phe Lys Val Pro Thr Glu

865 870 875 880

Arg Asp Leu Val Tyr Tyr Glu Ala Ser Pro Asn Phe Cys Glu Pro Asn

885 890 895

Pro Glu Thr Gly Ser Phe Gly Thr Arg Asp Arg Thr Cys Asn Val Ser

900 905 910

Ser His Gly Ile Asp Gly Cys Asp Leu Leu Cys Cys Gly Arg Gly His

915 920 925

Asn Ala Arg Ala Glu Arg Arg Arg Glu Lys Cys Arg Cys Val Phe His

930 935 940

Trp Cys Cys Tyr Val Ser Cys Gln Glu Cys Thr Arg Val Tyr Asp Val

945 950 955 960

His Thr Cys Lys Gly Gly Ser His His His His His His His His

965 970 975

<210> 4

<211> 2924

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 信号肽-AFM-接头-Wnt3a-纯化标签 核苷酸序列

<400> 4

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccaccggt 60

ctgcccacac aacctcggga tatagagaac ttcaatagta ctcaaaaatt tatagaagat 120

aatattgaat acatcaccat cattgcattt gctcagtatg ttcaggaagc aacctttgaa 180

gaaatggaaa agctggtgaa agacatggta gaatacaaag acagatgtat ggctgacaag 240

acgctcccag agtgttcaaa attacctaat aatgttttac aggaaaaaat atgtgctatg 300

gaggggctgc cacaaaagca taatttctca cactgctgca gtaaggttga tgctcaaaga 360

agactctgtt tcttctataa caagaaatct gatgtgggat ttctgcctcc tttccctacc 420

ctggatcccg aagagaaatg ccaggcttat gaaagtaaca gagaatccct tttaaatcac 480

tttttatatg aagttgccag aaggaaccca tttgtcttcg cccctacact tctaactgtt 540

gctgttcatt ttgaggaggt ggccaaatca tgttgtgaag aacaaaacaa agtcaactgc 600

cttcaaacaa gggcaatacc tgtcacacaa tatttaaaag cattttcttc ttatcaaaaa 660

catgtctgtg gggcactttt gaaatttgga accaaagttg tacactttat atatattgcg 720

atactcagtc aaaaattccc caagattgaa tttaaggagc ttatttctct tgtagaagat 780

gtttcttcca actatgatgg atgctgtgaa ggggatgttg tgcagtgcat ccgtgacacg 840

agcaaggtta tgaaccatat ttgttcaaaa caagattcta tctccagcaa aatcaaagag 900

tgctgtgaaa agaaaatacc agagcgcggc cagtgcataa ttaactcaaa caaagatgat 960

agaccaaagg atttatctct aagagaagga aaatttactg acagtgaaaa tgtgtgtcaa 1020

gaacgagatg ctgacccaga caccttcttt gcgaagttta cttttgaata ctcaaggaga 1080

catccagacc tgtctatacc agagctttta agaattgttc aaatatacaa agatctcctg 1140

agaaattgct gcaacacaga aaaccctcca ggttgttacc gttacgcgga agacaaattc 1200

aatgagacaa ctgagaaaag cctcaagatg gtacaacaag aatgtaaaca tttccagaat 1260

ttggggaagg atggtttgaa ataccattac ctcatcaggc tcacgaagat agctccccaa 1320

ctctccactg aagaactggt gtctcttggc gagaaaatgg tgacagcttt cactacttgc 1380

tgtacgctaa gtgaagagtt tgcctgtgtt gataatttgg cagatttagt ttttggagag 1440

ttatgtggag taaatgaaaa tcgaactatc aaccctgctg tggaccactg ctgtaaaaca 1500

aactttgcct tcagaaggcc ctgctttgag agtttgaaag ctgataaaac atatgtgcct 1560

ccacctttct ctcaagattt atttaccttt cacgcagaca tgtgtcaatc tcagaatgag 1620

gagcttcaga ggaagacaga caggtttctt gtcaacttag tgaagctgaa gcatgaactc 1680

acagatgaag agctgcagtc tttgtttaca aatttcgcaa atgtagtgga taagtgctgc 1740

aaagcagaga gtcctgaagt ctgctttaat gaagagagtc caaaaattgg caacggcggc 1800

ggaggctccg gaggaggcgg cagcggaggc ggaggctctt ccggactcct gagccccctg 1860

ggcctgtggg ccggcggctc tggaggctca gctaccccat ctggtggagc ctggccgtgg 1920

gcccccagta cagcagcctg ggcagccagc ccatcctgtg cgccagcatc cccggcctgg 1980

tgcccaagca gctgcgcttc tgccgcaact acgtggagat catgcccagc gtggccgagg 2040

gcatcaagat cggcatccag gagtgccagc accagttccg cggccgccgc tggaactgca 2100

ccaccgtgca cgacagcctg gccatcttcg gccccgtgct ggacaaggcc acccgcgaga 2160

gcgccttcgt gcacgccatc gccagcgccg gcgtggcctt cgccgtgacc cgcagctgcg 2220

ccgagggcac cgccgccatc tgcggctgca gcagccgcca ccagggcagc cccggcaagg 2280

gctggaagtg gggcggctgc agcgaggaca tcgagttcgg cggcatggtg agccgcgagt 2340

tcgccgacgc ccgcgagaac cgccccgacg cccgcagcgc catgaaccgc cacaacaacg 2400

aggccggccg ccaggccatc gccagccaca tgcacctgaa gtgcaagtgc cacggcctga 2460

gcggcagctg cgaggtgaag acctgctggt ggagccagcc cgacttccgc gccatcggcg 2520

acttcctgaa ggacaagtac gacagcgcca gcgagatggt ggtggagaag caccgcgaga 2580

gccgcggctg ggtggagacc ctgcgccccc gctacaccta cttcaaggtg cccaccgagc 2640

gcgacctggt gtactacgag gccagcccca acttctgcga gcccaacccc gagaccggca 2700

gcttcggcac ccgcgaccgc acctgcaacg tgagcagcca cggcatcgac ggctgcgacc 2760

tgctgtgctg cggccgcggc cacaacgccc gcgccgagcg ccgccgcgag aagtgccgct 2820

gcgtgttcca ctggtgctgc tacgtgagct gccaggagtg cacccgcgtg tacgacgtgc 2880

acacctgcaa aggaggatct catcatcacc accaccatca tcac 2924

<210> 5

<211> 334

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> Wnt3a 氨基酸序列

<400> 5

Ser Tyr Pro Ile Trp Trp Ser Leu Ala Val Gly Pro Gln Tyr Ser Ser

1 5 10 15

Leu Gly Ser Gln Pro Ile Leu Cys Ala Ser Ile Pro Gly Leu Val Pro

20 25 30

Lys Gln Leu Arg Phe Cys Arg Asn Tyr Val Glu Ile Met Pro Ser Val

35 40 45

Ala Glu Gly Ile Lys Ile Gly Ile Gln Glu Cys Gln His Gln Phe Arg

50 55 60

Gly Arg Arg Trp Asn Cys Thr Thr Val His Asp Ser Leu Ala Ile Phe

65 70 75 80

Gly Pro Val Leu Asp Lys Ala Thr Arg Glu Ser Ala Phe Val His Ala

85 90 95

Ile Ala Ser Ala Gly Val Ala Phe Ala Val Thr Arg Ser Cys Ala Glu

100 105 110

Gly Thr Ala Ala Ile Cys Gly Cys Ser Ser Arg His Gln Gly Ser Pro

115 120 125

Gly Lys Gly Trp Lys Trp Gly Gly Cys Ser Glu Asp Ile Glu Phe Gly

130 135 140

Gly Met Val Ser Arg Glu Phe Ala Asp Ala Arg Glu Asn Arg Pro Asp

145 150 155 160

Ala Arg Ser Ala Met Asn Arg His Asn Asn Glu Ala Gly Arg Gln Ala

165 170 175

Ile Ala Ser His Met His Leu Lys Cys Lys Cys His Gly Leu Ser Gly

180 185 190

Ser Cys Glu Val Lys Thr Cys Trp Trp Ser Gln Pro Asp Phe Arg Ala

195 200 205

Ile Gly Asp Phe Leu Lys Asp Lys Tyr Asp Ser Ala Ser Glu Met Val

210 215 220

Val Glu Lys His Arg Glu Ser Arg Gly Trp Val Glu Thr Leu Arg Pro

225 230 235 240

Arg Tyr Thr Tyr Phe Lys Val Pro Thr Glu Arg Asp Leu Val Tyr Tyr

245 250 255

Glu Ala Ser Pro Asn Phe Cys Glu Pro Asn Pro Glu Thr Gly Ser Phe

260 265 270

Gly Thr Arg Asp Arg Thr Cys Asn Val Ser Ser His Gly Ile Asp Gly

275 280 285

Cys Asp Leu Leu Cys Cys Gly Arg Gly His Asn Ala Arg Ala Glu Arg

290 295 300

Arg Arg Glu Lys Cys Arg Cys Val Phe His Trp Cys Cys Tyr Val Ser

305 310 315 320

Cys Gln Glu Cys Thr Arg Val Tyr Asp Val His Thr Cys Lys

325 330

<210> 6

<211> 578

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> AFM 氨基酸序列

<400> 6

Leu Pro Thr Gln Pro Arg Asp Ile Glu Asn Phe Asn Ser Thr Gln Lys

1 5 10 15

Phe Ile Glu Asp Asn Ile Glu Tyr Ile Thr Ile Ile Ala Phe Ala Gln

20 25 30

Tyr Val Gln Glu Ala Thr Phe Glu Glu Met Glu Lys Leu Val Lys Asp

35 40 45

Met Val Glu Tyr Lys Asp Arg Cys Met Ala Asp Lys Thr Leu Pro Glu

50 55 60

Cys Ser Lys Leu Pro Asn Asn Val Leu Gln Glu Lys Ile Cys Ala Met

65 70 75 80

Glu Gly Leu Pro Gln Lys His Asn Phe Ser His Cys Cys Ser Lys Val

85 90 95

Asp Ala Gln Arg Arg Leu Cys Phe Phe Tyr Asn Lys Lys Ser Asp Val

100 105 110

Gly Phe Leu Pro Pro Phe Pro Thr Leu Asp Pro Glu Glu Lys Cys Gln

115 120 125

Ala Tyr Glu Ser Asn Arg Glu Ser Leu Leu Asn His Phe Leu Tyr Glu

130 135 140

Val Ala Arg Arg Asn Pro Phe Val Phe Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val

145 150 155 160

Ala Val His Phe Glu Glu Val Ala Lys Ser Cys Cys Glu Glu Gln Asn

165 170 175

Lys Val Asn Cys Leu Gln Thr Arg Ala Ile Pro Val Thr Gln Tyr Leu

180 185 190

Lys Ala Phe Ser Ser Tyr Gln Lys His Val Cys Gly Ala Leu Leu Lys

195 200 205

Phe Gly Thr Lys Val Val His Phe Ile Tyr Ile Ala Ile Leu Ser Gln

210 215 220

Lys Phe Pro Lys Ile Glu Phe Lys Glu Leu Ile Ser Leu Val Glu Asp

225 230 235 240

Val Ser Ser Asn Tyr Asp Gly Cys Cys Glu Gly Asp Val Val Gln Cys

245 250 255

Ile Arg Asp Thr Ser Lys Val Met Asn His Ile Cys Ser Lys Gln Asp

260 265 270

Ser Ile Ser Ser Lys Ile Lys Glu Cys Cys Glu Lys Lys Ile Pro Glu

275 280 285

Arg Gly Gln Cys Ile Ile Asn Ser Asn Lys Asp Asp Arg Pro Lys Asp

290 295 300

Leu Ser Leu Arg Glu Gly Lys Phe Thr Asp Ser Glu Asn Val Cys Gln

305 310 315 320

Glu Arg Asp Ala Asp Pro Asp Thr Phe Phe Ala Lys Phe Thr Phe Glu

325 330 335

Tyr Ser Arg Arg His Pro Asp Leu Ser Ile Pro Glu Leu Leu Arg Ile

340 345 350

Val Gln Ile Tyr Lys Asp Leu Leu Arg Asn Cys Cys Asn Thr Glu Asn

355 360 365

Pro Pro Gly Cys Tyr Arg Tyr Ala Glu Asp Lys Phe Asn Glu Thr Thr

370 375 380

Glu Lys Ser Leu Lys Met Val Gln Gln Glu Cys Lys His Phe Gln Asn

385 390 395 400

Leu Gly Lys Asp Gly Leu Lys Tyr His Tyr Leu Ile Arg Leu Thr Lys

405 410 415

Ile Ala Pro Gln Leu Ser Thr Glu Glu Leu Val Ser Leu Gly Glu Lys

420 425 430

Met Val Thr Ala Phe Thr Thr Cys Cys Thr Leu Ser Glu Glu Phe Ala

435 440 445

Cys Val Asp Asn Leu Ala Asp Leu Val Phe Gly Glu Leu Cys Gly Val

450 455 460

Asn Glu Asn Arg Thr Ile Asn Pro Ala Val Asp His Cys Cys Lys Thr

465 470 475 480

Asn Phe Ala Phe Arg Arg Pro Cys Phe Glu Ser Leu Lys Ala Asp Lys

485 490 495

Thr Tyr Val Pro Pro Pro Phe Ser Gln Asp Leu Phe Thr Phe His Ala

500 505 510

Asp Met Cys Gln Ser Gln Asn Glu Glu Leu Gln Arg Lys Thr Asp Arg

515 520 525

Phe Leu Val Asn Leu Val Lys Leu Lys His Glu Leu Thr Asp Glu Glu

530 535 540

Leu Gln Ser Leu Phe Thr Asn Phe Ala Asn Val Val Asp Lys Cys Cys

545 550 555 560

Lys Ala Glu Ser Pro Glu Val Cys Phe Asn Glu Glu Ser Pro Lys Ile

565 570 575

Gly Asn

<210> 7

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> Wnt3a-F合成引物

<400> 7

cactataggg agacccaagc ttgccgccac catggagaca gacacactcc tg 52

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> Wnt3a-r合成引物

<400> 8

tttgcaggtg tgcacgtcgt acacg 25

<210> 9

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> W3AM-F1合成引物

<400> 9

acgacgtgca cacctgcaaa ggcggcggag gctccggagg aggcggcagc ggaggcggag 60

gctcttccgg actcctgagc cccctgggc 89

<210> 10

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> W3AM-F2合成引物

<400> 10

ggactcctga gccccctggg cctgtgggcc ggcggctctg gaggctccct gcccacacaa 60

cctcggga 68

<210> 11

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> AFM-R合成引物

<400> 11

ctggatatct gcagaattca ttagtgatga tggtggtggt gatgatgaga tcctccgttg 60

ccaatttttg gactctcttc 80

Claims (10)

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有式Ia或式Ib所述结构：

C-A-L-B-Z (Ia)，或

C-B-L-A-Z (Ib)

其中，

C为无或信号肽序列；

A为包括Wnt3a的蛋白元件，并且元件A的长度为至少300个氨基酸；

B为AFM蛋白元件；

L为无或肽接头；

Z为无或纯化标签

“-”表示连接上述各元件的肽键。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述元件A具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述元件B序列如SEQ ID NO:6所示。

4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白选自下组：

(A)具有SEQ ID NO:1或3所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:1或3所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥85％的同源性；更优选地≥90％的同源性；最优选地，≥95％的同源性)的多肽；

(C)将SEQ ID NO:1或3中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的。

5.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:1或3所示。

6.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的融合蛋白。

7.一种载体，其特征在于，它含有权利要求6所述的多核苷酸。

8.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求7所述的载体或基因组中整合有权利要求6所述的多核苷酸。

9.一种产生蛋白的方法，其特征在于，它包括步骤：

在适合表达的条件下，培养权利要求8所述的宿主细胞，从而表达出权利要求1所述的融合蛋白；和分离所述融合蛋白。

10.一种权利要求1所述的融合蛋白的用途，其特征在于，用于制备类器官培养用的制剂，或

用于制备一药物，所述药物用于代谢类疾病的预防和治疗、用于肿瘤疾病的预防和治疗。

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