JP2002522031A - 真核細胞ベースの遺伝子相互作用クローニング - Google Patents
真核細胞ベースの遺伝子相互作用クローニングInfo
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、レセプターに結合するそれらの能力のための化合物をスクリーニングするための方法及び／又はリガンドの、レセプターに対する結合を阻害する化合物のスクリーニングのための方法に関する。本発明の目的は、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞のような、酵母細胞を除く真核細胞における、オーファンレセプター（好ましくは多量体型レセプター）のリガンド、既知のレセプター（好ましくは多量体型レセプター）の未知のリガンド、及びそれらのリガンドをコードする遺伝子についての、簡易かつ強力なスクリーニング方法を提供することである。
Description
【０００１】
本発明は、化合物のレセプターとの結合能力について、それらをスクリーニン
グする方法、及び／又はレセプターに対するリガンドの、結合をアンタゴニスト
化する化合物をスクリーニングする方法に関する。
グする方法、及び／又はレセプターに対するリガンドの、結合をアンタゴニスト
化する化合物をスクリーニングする方法に関する。
【０００２】
レセプターは、タンパク質の性質を持つ巨大分子であり、それらはしばしば細
胞膜上に位置しており、シグナル転移機能を果たしている。多くのレセプターは
、細胞外膜上に位置している。いくつかのレセプターは３つのドメイン、すなわ
ち細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを有する。細胞外ドメ
インは、通常「リガンド」と呼ばれる分子と特異的に結合することができる。シ
グナル転移は、例えば、レセプターの構造の構造的変化によって、２つ又はそれ
以上の独立した又は関連するレセプター型分子のクラスター形成によって、のよ
うに、リガンド結合に基づいて多様な方法で生じる。
胞膜上に位置しており、シグナル転移機能を果たしている。多くのレセプターは
、細胞外膜上に位置している。いくつかのレセプターは３つのドメイン、すなわ
ち細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを有する。細胞外ドメ
インは、通常「リガンド」と呼ばれる分子と特異的に結合することができる。シ
グナル転移は、例えば、レセプターの構造の構造的変化によって、２つ又はそれ
以上の独立した又は関連するレセプター型分子のクラスター形成によって、のよ
うに、リガンド結合に基づいて多様な方法で生じる。
【０００３】 多くのレセプターが同定されており科学的文献は、レセプターの組織分布、レ
セプターの核酸又はアミノ酸の類似性、レセプターのシグナル伝達のメカニズム
又はレセプターに結合するリガンドの型のような、共通する特徴に基づいてそれ
らを様々に、レセプターのグループ、スーパーファミリー、ファミリー、及び／
又はクラスに分類している。しかしながら、レセプターの分類又はグループ化の
唯一の体系というものは文献中では使われたことがない。
セプターの核酸又はアミノ酸の類似性、レセプターのシグナル伝達のメカニズム
又はレセプターに結合するリガンドの型のような、共通する特徴に基づいてそれ
らを様々に、レセプターのグループ、スーパーファミリー、ファミリー、及び／
又はクラスに分類している。しかしながら、レセプターの分類又はグループ化の
唯一の体系というものは文献中では使われたことがない。
【０００４】 ポリペプチドホルモンが、反応を示す細胞の表面上に発現されたレセプターに
結合することにより、それらの生物学的効果を誘発することは、非常に確立され
ている。少なくとも４種のポリペプチドホルモンレセプターは、１次配列、予想
される２次及び３次構造及び生化学的機能における類似性に基づいて特定できる
。ヘモポエチン／インターフェロンレセプターファミリー、レセプターキナーゼ
ファミリー、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）／神経成長因子及びＧタンパク結合レセプ
ターのファミリーがある。ヘモポエチン／インターフェロンファミリーレセプタ
ーは、固有の酵素活性を有しないが、それらの細胞外ドメイン中の「サイトカイ
ンレセプター類似性（ＣＲＨ）」部位に基づいて区別し得る。このＣＲＨ部位は
２つの保存されたシスイテイン架橋及びトリプトファン−セリン−Ｘ−トリプト
ファン−セリンモチーフを含む。ＴＮＦ−ＮＧＦレセプターファミリーのメンバ
ーを決定付ける特徴は、細胞外ドメイン及び６つのシステイン残基を含むドメイ
ンの中央に位置する。レセプターキナーゼファミリーは、レセプターの細胞質部
分の保存された触媒的キナーゼ部位であり；ファミリーは、それらの基質特異性
に基づいて、チロシンキナーゼとセリン／チロシンキナーゼレセプターに細分さ
れる。ヘモポエチン、ＴＮＦ／ＮＧＦ及びキナーゼファミリーのレセプターが単
一の膜貫通ドメインを含む一方、Ｇ−タンパク質結合レセプターは、膜を数回横
断する。Ｇ−タンパク質結合レセプターを除き、レセプターサブユニットのサイ
トカイン主導多量体化が、シグナル転移の最初のイベントであるらしい。ホモ−
又はヘテロ２量体化及び３量体化はヘモポエチン／インターフェロンレセプター
及びＴＮＦ／ＮＧＦレセプターの機能の中心であり、ホモ２量体化は、レセプタ
ーキナーゼ活性の好ましい方法であるらしい。
結合することにより、それらの生物学的効果を誘発することは、非常に確立され
ている。少なくとも４種のポリペプチドホルモンレセプターは、１次配列、予想
される２次及び３次構造及び生化学的機能における類似性に基づいて特定できる
。ヘモポエチン／インターフェロンレセプターファミリー、レセプターキナーゼ
ファミリー、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）／神経成長因子及びＧタンパク結合レセプ
ターのファミリーがある。ヘモポエチン／インターフェロンファミリーレセプタ
ーは、固有の酵素活性を有しないが、それらの細胞外ドメイン中の「サイトカイ
ンレセプター類似性（ＣＲＨ）」部位に基づいて区別し得る。このＣＲＨ部位は
２つの保存されたシスイテイン架橋及びトリプトファン−セリン−Ｘ−トリプト
ファン−セリンモチーフを含む。ＴＮＦ−ＮＧＦレセプターファミリーのメンバ
ーを決定付ける特徴は、細胞外ドメイン及び６つのシステイン残基を含むドメイ
ンの中央に位置する。レセプターキナーゼファミリーは、レセプターの細胞質部
分の保存された触媒的キナーゼ部位であり；ファミリーは、それらの基質特異性
に基づいて、チロシンキナーゼとセリン／チロシンキナーゼレセプターに細分さ
れる。ヘモポエチン、ＴＮＦ／ＮＧＦ及びキナーゼファミリーのレセプターが単
一の膜貫通ドメインを含む一方、Ｇ−タンパク質結合レセプターは、膜を数回横
断する。Ｇ−タンパク質結合レセプターを除き、レセプターサブユニットのサイ
トカイン主導多量体化が、シグナル転移の最初のイベントであるらしい。ホモ−
又はヘテロ２量体化及び３量体化はヘモポエチン／インターフェロンレセプター
及びＴＮＦ／ＮＧＦレセプターの機能の中心であり、ホモ２量体化は、レセプタ
ーキナーゼ活性の好ましい方法であるらしい。
【０００５】 特別なケースは、レセプター様タンパク質チロシンホスファターゼのそれであ
る。全てのメンバーが１つ又は２つの相同のタンパク質チロシンホスファターゼ
ドメインを含む細胞内部分、単一の膜スパニング部位及び潜在的リガンド結合能
力を有する種々の細胞外セグメントを有する。
る。全てのメンバーが１つ又は２つの相同のタンパク質チロシンホスファターゼ
ドメインを含む細胞内部分、単一の膜スパニング部位及び潜在的リガンド結合能
力を有する種々の細胞外セグメントを有する。
【０００６】 上述のように、サブユニット間のサイトカイン主導相互作用は、ヘモポエチン
／インターフェロンレセプターの最初のイベントであるらしい。リガンドの認識
は１つのレセプターサブユニットで始まる；このサブユニットはしばしばヘテロ
多量体レセプターの場合にはａ−サブユニットと呼ばれる。この最初のイベント
の後、１つ以上の付加的なレセプター分子の会合があり、これはシグナル転移の
開始には必須であり、そして、付加的な効果が、リガンド結合の親和性の増加に
導き得るのである。レセプターのクラスター形成は、キナーゼ機能の活性化に導
き得る。ヘモポエチン／インターフェロンレセプターは、チロシンキナーゼレセ
プターとは反対に、固有のキナーゼ活性を持たず、関連する「ジャヌスキナーゼ
（ＪＡＫｓ）」の助けを用いてチロシン残基をリン酸化する。ＪＡＫｓについて
あとに続く標的は、ＪＡＫ分子それ自体、レセプターの細胞質部位及び「シグナ
ル転移及び転写活性化」タンパク質（ＳＴＡＴ）である。この経路は「ＪＡＫ／
ＳＴＡＴ経路」と呼ばれる。Ｒａｓ−Ｒａｆ−マイトジェンにより活性化される
タンパク質キナーゼ経路のような付加的な経路も活性化され得る。
／インターフェロンレセプターの最初のイベントであるらしい。リガンドの認識
は１つのレセプターサブユニットで始まる；このサブユニットはしばしばヘテロ
多量体レセプターの場合にはａ−サブユニットと呼ばれる。この最初のイベント
の後、１つ以上の付加的なレセプター分子の会合があり、これはシグナル転移の
開始には必須であり、そして、付加的な効果が、リガンド結合の親和性の増加に
導き得るのである。レセプターのクラスター形成は、キナーゼ機能の活性化に導
き得る。ヘモポエチン／インターフェロンレセプターは、チロシンキナーゼレセ
プターとは反対に、固有のキナーゼ活性を持たず、関連する「ジャヌスキナーゼ
（ＪＡＫｓ）」の助けを用いてチロシン残基をリン酸化する。ＪＡＫｓについて
あとに続く標的は、ＪＡＫ分子それ自体、レセプターの細胞質部位及び「シグナ
ル転移及び転写活性化」タンパク質（ＳＴＡＴ）である。この経路は「ＪＡＫ／
ＳＴＡＴ経路」と呼ばれる。Ｒａｓ−Ｒａｆ−マイトジェンにより活性化される
タンパク質キナーゼ経路のような付加的な経路も活性化され得る。
【０００７】 ヘモポエチン／インターフェロンレセプターの例としては、とりわけ、インタ
ーロイキン−５（ＩＬ−５）レセプター、エリスロポエチンレセプター及びイン
ターフェロンレセプターファミリーである。
ーロイキン−５（ＩＬ−５）レセプター、エリスロポエチンレセプター及びイン
ターフェロンレセプターファミリーである。
【０００８】 ＩＬ−５レセプターは、２つのサブユニットからなるヘテロマーである。ＩＬ
−５レセプターα−鎖は、リガンド特異的であり、中間結合親和性は低い。ＩＬ
−３のような他のレセプター複合体と共通であるが、ＩＬ−５レセプターβ−鎖
とのかかわりは、高い親和性の結合複合体を生じる。両方のレセプターサブユニ
ットが、シグナル伝達に要求される。さらに、シグナル伝達は両方のレセプター
サブユニットの細胞質尾部を必要とする。
−５レセプターα−鎖は、リガンド特異的であり、中間結合親和性は低い。ＩＬ
−３のような他のレセプター複合体と共通であるが、ＩＬ−５レセプターβ−鎖
とのかかわりは、高い親和性の結合複合体を生じる。両方のレセプターサブユニ
ットが、シグナル伝達に要求される。さらに、シグナル伝達は両方のレセプター
サブユニットの細胞質尾部を必要とする。
【０００９】 インターフェロンは２つのクラスにクラス分けされる。Ｉ型インターフェロン
はＩＦＮαグループ、ＩＮＦβ、ＩＮＦω及びウシ胚形成、ＩＮＦτからなる。
ＩＮＦγは第二グループ（II型インターフェロン）に属する。Ｉ型インターフェ
ロンのレセプター複合体は、１つのＩＦＮａＲ１サブユニット及び１つのＩＦＮ
ａＲ２サブユニットからなる。後者のレセプター鎖は、３つのアイソフォームで
存在し、２者択一のスプライシングから生じる：ＩＦＮａＲ２−１及びＩＦＮａ
Ｒ２−２は膜結合であるが、細胞質ドメインの長さにおいて異なり、一方ＩＦＮ
ａＲ２−３は溶解型である。
はＩＦＮαグループ、ＩＮＦβ、ＩＮＦω及びウシ胚形成、ＩＮＦτからなる。
ＩＮＦγは第二グループ（II型インターフェロン）に属する。Ｉ型インターフェ
ロンのレセプター複合体は、１つのＩＦＮａＲ１サブユニット及び１つのＩＦＮ
ａＲ２サブユニットからなる。後者のレセプター鎖は、３つのアイソフォームで
存在し、２者択一のスプライシングから生じる：ＩＦＮａＲ２−１及びＩＦＮａ
Ｒ２−２は膜結合であるが、細胞質ドメインの長さにおいて異なり、一方ＩＦＮ
ａＲ２−３は溶解型である。
【００１０】 これらのレセプターのシグナル転移工程についての多くの情報が、２ｆＴＧＨ
細胞株（Pellegrini et al., 1989; Darnell et al., 1994）及び６−１６プロ
モーター（Porter et al., 1988）を用いた、遺伝学的相補性の研究から得られ
ている。ヒト２ｆＴＧＨ細胞株は、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルト
ランスフェラーゼを欠損しているが、Ｉ型ＩＦＮ誘導可能６−１６プロモーター
の制御下にある、E. coli のキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェ
ラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子を含んでいる。機能的インターフェロンＩ型レセプター
（ＩＦＮａＲ）を有する細胞株において、ＩＦＮα又はβを培地に添加すると、
６−１６プロモーターが誘導され、ｇｐｔ遺伝子が転写される。産生された酵素
、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）はＨ
ＧＰＲＴ欠損を補うことができる。このことは、陽性又は陰性選択を可能にする
。陽性選択（ＸＧＰＲＴ産生細胞の増殖）はヒポキサンチンアミノペプテリンチ
ミジン（ＨＡＴ）培地で行われ、陰性選択（ＸＧＰＲＴ産生細胞の死）は、６−
チオグアニン（６−ＴＧ）を含有するＤＭＥＭ培地上で行われる。
細胞株（Pellegrini et al., 1989; Darnell et al., 1994）及び６−１６プロ
モーター（Porter et al., 1988）を用いた、遺伝学的相補性の研究から得られ
ている。ヒト２ｆＴＧＨ細胞株は、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルト
ランスフェラーゼを欠損しているが、Ｉ型ＩＦＮ誘導可能６−１６プロモーター
の制御下にある、E. coli のキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェ
ラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子を含んでいる。機能的インターフェロンＩ型レセプター
（ＩＦＮａＲ）を有する細胞株において、ＩＦＮα又はβを培地に添加すると、
６−１６プロモーターが誘導され、ｇｐｔ遺伝子が転写される。産生された酵素
、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）はＨ
ＧＰＲＴ欠損を補うことができる。このことは、陽性又は陰性選択を可能にする
。陽性選択（ＸＧＰＲＴ産生細胞の増殖）はヒポキサンチンアミノペプテリンチ
ミジン（ＨＡＴ）培地で行われ、陰性選択（ＸＧＰＲＴ産生細胞の死）は、６−
チオグアニン（６−ＴＧ）を含有するＤＭＥＭ培地上で行われる。
【００１１】 レセプターリガンド相互作用の研究により、外部刺激に対して細胞がどのよう
に反応するかについて数多くの情報が明らかになっている。この知識は、数種の
治療的に重要な化合物の開発に導いた。しかしながら、細胞増殖及び発生を制御
する多くの分子は、いまだ発見されておらず、そのリガンドが知られていない「
オーファンレセプター」と呼ばれるものが存在する。
に反応するかについて数多くの情報が明らかになっている。この知識は、数種の
治療的に重要な化合物の開発に導いた。しかしながら、細胞増殖及び発生を制御
する多くの分子は、いまだ発見されておらず、そのリガンドが知られていない「
オーファンレセプター」と呼ばれるものが存在する。
【００１２】 オーファンレセプターのリガンドをスクリーニングするためのいくつかの方法
が提案されている。Kinoshita et al.(1995)は、レセプターチロシンキナーゼの
リガンドを同定するための、酵母における機能的スクリーニング法を開発した。
この方法は、酵母宿主においてレセプター遺伝子の機能的な発現を有することを
要することにより束縛される。別の酵母系がＷＯ／９８１３５１３に記載されて
いる。この系は、哺乳類Ｇ−タンパク質−結合済みレセプターを酵母Ｇ−タンパ
ク質の細胞内経路につなげるために、キメラＧαタンパク質を用いる。ここでも
また、この方法は酵母に限定され、酵母宿主内における哺乳類レセプター遺伝子
の機能的発現を要することによって束縛される。さらに、この方法はＧ−タンパ
ク質−結合済みレセプターに限定される。ＵＳ５５９７６９３は、哺乳動物細胞
におけるスクリーニング方法を記載しているが、それはステロイド／サイロイド
（甲状腺）スーパーファミリーに限定されており、サイトカインレセプターには
用いることができない。ＷＯ９５／２１９３０は、サイトカインレセプターにつ
いてのスクリーニング方法を記載している。この方法においては、リガンドは、
ある細胞株のランダム突然変異誘発後にスクリーニングされる。用いられた細胞
株において突然変異誘発によって発現が活性化されることができるリガンドだけ
が検出され得る。さらに、リガンドをコードしている遺伝子の単離は相当複雑で
ある。これは、該スクリーニング方法の有用性にとって厳しい制限である。ＷＯ
９６／０２６４３において、除神経筋キナーゼ（Denervated Muscle Kinase）（
ＤＭＫ）レセプター及びそのキメラ変異体のリガンドについてスクリーニングす
るための方法が記載されている。しかしながらこの方法の適用性は、相当に限ら
れており、リガンドをコードする遺伝的材料を単離するための直接的、迅速な方
法はない。
が提案されている。Kinoshita et al.(1995)は、レセプターチロシンキナーゼの
リガンドを同定するための、酵母における機能的スクリーニング法を開発した。
この方法は、酵母宿主においてレセプター遺伝子の機能的な発現を有することを
要することにより束縛される。別の酵母系がＷＯ／９８１３５１３に記載されて
いる。この系は、哺乳類Ｇ−タンパク質−結合済みレセプターを酵母Ｇ−タンパ
ク質の細胞内経路につなげるために、キメラＧαタンパク質を用いる。ここでも
また、この方法は酵母に限定され、酵母宿主内における哺乳類レセプター遺伝子
の機能的発現を要することによって束縛される。さらに、この方法はＧ−タンパ
ク質−結合済みレセプターに限定される。ＵＳ５５９７６９３は、哺乳動物細胞
におけるスクリーニング方法を記載しているが、それはステロイド／サイロイド
（甲状腺）スーパーファミリーに限定されており、サイトカインレセプターには
用いることができない。ＷＯ９５／２１９３０は、サイトカインレセプターにつ
いてのスクリーニング方法を記載している。この方法においては、リガンドは、
ある細胞株のランダム突然変異誘発後にスクリーニングされる。用いられた細胞
株において突然変異誘発によって発現が活性化されることができるリガンドだけ
が検出され得る。さらに、リガンドをコードしている遺伝子の単離は相当複雑で
ある。これは、該スクリーニング方法の有用性にとって厳しい制限である。ＷＯ
９６／０２６４３において、除神経筋キナーゼ（Denervated Muscle Kinase）（
ＤＭＫ）レセプター及びそのキメラ変異体のリガンドについてスクリーニングす
るための方法が記載されている。しかしながらこの方法の適用性は、相当に限ら
れており、リガンドをコードする遺伝的材料を単離するための直接的、迅速な方
法はない。
【００１３】
本発明の目的は、酵母菌細胞を除外した、昆虫細胞、植物細胞、又は哺乳動物
細胞のような真核細胞において、オーファンレセプターのリガンド、好ましくは
多量体性のレセプター型、既知のレセプターの未知のリガンド、好ましくは多量
体又は多量体化されたレセプター及びそれらのレセプターをコードする遺伝子に
ついての簡易かつ強力なスクリーニング方法を提供することである。これに関し
、１つのタンパク質に由来する細胞外ドメイン、好ましくはレセプターの細胞外
ドメイン、及びレセプターであるべきもう１つのタンパク質に由来する細胞質部
位を含むキメラレセプターを構築した；ここで、少なくとも１つのキメラレセプ
ターが、酵母菌ではない真核細胞中で発現している。この同じ真核細胞は、オー
トクリンループを形成する化合物をコードする組換え遺伝子、及び該オートクリ
ンループの形成において活性化されるレポーター系を含んでいる。好ましくは、
その発現がオートクリンループを形成する化合物は、キメラレセプターのリガン
ドである。このオートクリンループが閉じている場合には、好ましくは該リガン
ドの該レセプターへの結合の結果として活性化され得るプロモーターの使用によ
り、レポーター系のスイッチが入れられる。
細胞のような真核細胞において、オーファンレセプターのリガンド、好ましくは
多量体性のレセプター型、既知のレセプターの未知のリガンド、好ましくは多量
体又は多量体化されたレセプター及びそれらのレセプターをコードする遺伝子に
ついての簡易かつ強力なスクリーニング方法を提供することである。これに関し
、１つのタンパク質に由来する細胞外ドメイン、好ましくはレセプターの細胞外
ドメイン、及びレセプターであるべきもう１つのタンパク質に由来する細胞質部
位を含むキメラレセプターを構築した；ここで、少なくとも１つのキメラレセプ
ターが、酵母菌ではない真核細胞中で発現している。この同じ真核細胞は、オー
トクリンループを形成する化合物をコードする組換え遺伝子、及び該オートクリ
ンループの形成において活性化されるレポーター系を含んでいる。好ましくは、
その発現がオートクリンループを形成する化合物は、キメラレセプターのリガン
ドである。このオートクリンループが閉じている場合には、好ましくは該リガン
ドの該レセプターへの結合の結果として活性化され得るプロモーターの使用によ
り、レポーター系のスイッチが入れられる。
【００１４】
３つの要素（キメラレセプターをコードする最初の組換え遺伝子、該化合物を
コードする第２の組換え遺伝子、及びレポーター系）の全ては、真核細胞に安定
に形質転換され得るか、一時的に発現され得るかのどちらかである。文献に記載
された遺伝子導入方法は、これを得るために用いることができる。非限定的な例
は、カルシウム−リン酸遺伝子導入（Graham and Van der Eb, 1973）、リポフ
ェクション（Loeffner and Behr, 1993）及びレトロウイルス遺伝子移入（Kitam
ura et al., 1995）のような方法である。１つの細胞による数種の異なったｃＤ
ＮＡ産物の同時発現（それは、問題のｃＤＮＡの発現の減少という結果になり得
る）を回避するために、レトロウイルス遺伝子移入が好ましい、なぜなら、ウイ
ルス／細胞の割合に応じて、１細胞につき１ウイルスの平均感染率が得られるか
らである。
コードする第２の組換え遺伝子、及びレポーター系）の全ては、真核細胞に安定
に形質転換され得るか、一時的に発現され得るかのどちらかである。文献に記載
された遺伝子導入方法は、これを得るために用いることができる。非限定的な例
は、カルシウム−リン酸遺伝子導入（Graham and Van der Eb, 1973）、リポフ
ェクション（Loeffner and Behr, 1993）及びレトロウイルス遺伝子移入（Kitam
ura et al., 1995）のような方法である。１つの細胞による数種の異なったｃＤ
ＮＡ産物の同時発現（それは、問題のｃＤＮＡの発現の減少という結果になり得
る）を回避するために、レトロウイルス遺伝子移入が好ましい、なぜなら、ウイ
ルス／細胞の割合に応じて、１細胞につき１ウイルスの平均感染率が得られるか
らである。
【００１５】 さらに、その技術における熟練者にとっては、オートクリンループはさらに複
雑であり、１以上のループからなるであろうことは明らかである。非限定的な例
として、組換え遺伝子は、最初の（キメラ又は非キメラ）レセプターのリガンド
を発現し、それは活性化されると第２のレセプター（リガンドが結合するとレポ
ーター系を誘導する）のリガンドを発現する第２の遺伝子を活性化する。最初の
及び第２のレセプターが同じ細胞内に位置することもまた必須ではない：その技
術の熟練者にとっては、２つの細胞集団で働くことができる、すなわち第一のも
のが組換え遺伝子（第２の細胞に対する、リガンドが結合するとキメラレセプタ
ーのリガンドの産生を開始する、レセプターのリガンドを発現する）を担持し、
第１の細胞に位置することは明白である。キメラレセプターへの後者のリガンド
の結合は、レポーター系の発現という結果になる。
雑であり、１以上のループからなるであろうことは明らかである。非限定的な例
として、組換え遺伝子は、最初の（キメラ又は非キメラ）レセプターのリガンド
を発現し、それは活性化されると第２のレセプター（リガンドが結合するとレポ
ーター系を誘導する）のリガンドを発現する第２の遺伝子を活性化する。最初の
及び第２のレセプターが同じ細胞内に位置することもまた必須ではない：その技
術の熟練者にとっては、２つの細胞集団で働くことができる、すなわち第一のも
のが組換え遺伝子（第２の細胞に対する、リガンドが結合するとキメラレセプタ
ーのリガンドの産生を開始する、レセプターのリガンドを発現する）を担持し、
第１の細胞に位置することは明白である。キメラレセプターへの後者のリガンド
の結合は、レポーター系の発現という結果になる。
【００１６】 第１の実施態様においては、ｇｐｔ選択系をオーファンレセプターのスクリー
ニング及び／又は選択に適用することができる。これに関し、研究されたレセプ
ターの細胞外ドメインは、ＩＦＮａＲの細胞内ドメイン（単数又は複数）に融合
している。研究されたレセプターはオーファンレセプターであるか又は全てのリ
ガンドが知られているわけではないレセプターであり得る。ＩＦＮレセプター細
胞質尾部の使用は、研究されたレセプターの機能（恐らく未知である）から独立
して、レポーター活性化に必要なシグナル転移に十分なものである。リガンドは
、オートクリンループの作製により供給される：細胞はＤＮＡ発現ライブラリに
よって形質転換され、ここで、オーファンレセプターに対する可能性のあるリガ
ンドをコードする遺伝子は、好ましくは強力な、構造プロモーターの後ろに配置
される。しかしながら、その技術における熟練者にとっては、誘導し得るプロモ
ーター及びＩＦＮ誘導可能プロモーターのような他のプロモーターを用いること
ができることが知られている。同属のリガンドの産生は、ｇｐｔ遺伝子の転写を
誘導し、ＨＡＴ培地における陽性選択を可能にする。
ニング及び／又は選択に適用することができる。これに関し、研究されたレセプ
ターの細胞外ドメインは、ＩＦＮａＲの細胞内ドメイン（単数又は複数）に融合
している。研究されたレセプターはオーファンレセプターであるか又は全てのリ
ガンドが知られているわけではないレセプターであり得る。ＩＦＮレセプター細
胞質尾部の使用は、研究されたレセプターの機能（恐らく未知である）から独立
して、レポーター活性化に必要なシグナル転移に十分なものである。リガンドは
、オートクリンループの作製により供給される：細胞はＤＮＡ発現ライブラリに
よって形質転換され、ここで、オーファンレセプターに対する可能性のあるリガ
ンドをコードする遺伝子は、好ましくは強力な、構造プロモーターの後ろに配置
される。しかしながら、その技術における熟練者にとっては、誘導し得るプロモ
ーター及びＩＦＮ誘導可能プロモーターのような他のプロモーターを用いること
ができることが知られている。同属のリガンドの産生は、ｇｐｔ遺伝子の転写を
誘導し、ＨＡＴ培地における陽性選択を可能にする。
【００１７】 別の方法では、候補のリガンドを培地に添加することができる；ＨＡＴ培地に
おける細胞の生存はリガンドがオーファンレセプターを活性化することができる
場合にのみ検出することができる。
おける細胞の生存はリガンドがオーファンレセプターを活性化することができる
場合にのみ検出することができる。
【００１８】 第２の実施態様においては、分泌されたアルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）
がレポーター系として用いられる。レポーター系を発現している細胞は、ＣＳＰ
Ｄ（３−(４−メトキシスピロ−る−１，２−ジオキシエタン−３，２′−(５′
−クロロ)トリクロロ｛３．３．１．１（３、７）｝デカン−４−イル)フェニル
ホスフェート２ナトリウム）を発光基質として用いてＳＥＡＰ活性を測定するこ
とによって同定することができる。
がレポーター系として用いられる。レポーター系を発現している細胞は、ＣＳＰ
Ｄ（３−(４−メトキシスピロ−る−１，２−ジオキシエタン−３，２′−(５′
−クロロ)トリクロロ｛３．３．１．１（３、７）｝デカン−４−イル)フェニル
ホスフェート２ナトリウム）を発光基質として用いてＳＥＡＰ活性を測定するこ
とによって同定することができる。
【００１９】 本発明は、インターフェロンレセプターの細胞質尾部及びｇｐｔ選択系の使用
には限られず、その技術における熟練者に公知の他のレセプター系及び／又は他
の誘導し得るプロモーター及び／又は他のレポーター系及び／又は他の細胞株を
用いることができる。非限定的な例として、ＰＣ１２細胞（Greene et al.,1976
）を、レプチンレセプターを基にしたキメラレセプター（Tartagila et al., 19
95）及びすい炎関連タンパク質Ｉ遺伝子から誘導し得るプロモーターを用いるこ
とができる。レポーター系は、非限定的な例としてのグリーン蛍光タンパク（Ｇ
ＦＰ）の場合のように、誘導し得る遺伝子の遺伝子産物の検出に基づくことがで
き、また、Mitra et al.(1995)、Miyawaki et al.(1997)及びRomoser et al(199
7)によって記載された系のような、細胞中に既に存在するタンパク質の修飾（プ
ロテアーゼ分解、リン酸化、複合体形成…）に基づくこともできる。さらに、最
大レポーター活性のためには、レプチン−フォルスコリン系の場合のように、共
刺激を必要とすることもある。
には限られず、その技術における熟練者に公知の他のレセプター系及び／又は他
の誘導し得るプロモーター及び／又は他のレポーター系及び／又は他の細胞株を
用いることができる。非限定的な例として、ＰＣ１２細胞（Greene et al.,1976
）を、レプチンレセプターを基にしたキメラレセプター（Tartagila et al., 19
95）及びすい炎関連タンパク質Ｉ遺伝子から誘導し得るプロモーターを用いるこ
とができる。レポーター系は、非限定的な例としてのグリーン蛍光タンパク（Ｇ
ＦＰ）の場合のように、誘導し得る遺伝子の遺伝子産物の検出に基づくことがで
き、また、Mitra et al.(1995)、Miyawaki et al.(1997)及びRomoser et al(199
7)によって記載された系のような、細胞中に既に存在するタンパク質の修飾（プ
ロテアーゼ分解、リン酸化、複合体形成…）に基づくこともできる。さらに、最
大レポーター活性のためには、レプチン−フォルスコリン系の場合のように、共
刺激を必要とすることもある。
【００２０】 本発明の更なる側面は、リガンド−レセプター結合のアンタゴニストである化
合物のスクリーニングである。Ｄ−ＭＥＭ ＋ ６−ＴＧ培地においてｇｐｔ発
現の毒性についてスクリーニングされ得るという事実によって、キメラレセプタ
ーに対するリガンドの結合を阻害及び／又は競合する化合物についてのアンタゴ
ニストのスクリーニング系を設定することができる。これは、オートクリンルー
プと可能な阻害剤を培地に添加することによって実現できるが、この技術の熟練
者にとっては、代わりに、細胞が候補の阻害剤をコードする遺伝子で形質転換さ
れ得ることは明白である。阻害剤の発現は、抗オートクリンループをつくる恐れ
がある。この場合、リガンドは、オートクリンループによってか、又は培地に添
加されることにより産生され、そうでなければレセプターが、構造的にシグナル
伝達経路を開始する形態に、突然変異され及び／又は遺伝的に改変され得る。
合物のスクリーニングである。Ｄ−ＭＥＭ ＋ ６−ＴＧ培地においてｇｐｔ発
現の毒性についてスクリーニングされ得るという事実によって、キメラレセプタ
ーに対するリガンドの結合を阻害及び／又は競合する化合物についてのアンタゴ
ニストのスクリーニング系を設定することができる。これは、オートクリンルー
プと可能な阻害剤を培地に添加することによって実現できるが、この技術の熟練
者にとっては、代わりに、細胞が候補の阻害剤をコードする遺伝子で形質転換さ
れ得ることは明白である。阻害剤の発現は、抗オートクリンループをつくる恐れ
がある。この場合、リガンドは、オートクリンループによってか、又は培地に添
加されることにより産生され、そうでなければレセプターが、構造的にシグナル
伝達経路を開始する形態に、突然変異され及び／又は遺伝的に改変され得る。
【００２１】 本発明の更なる側面はシグナル伝達経路における化合物のスクリーニングであ
る：キメラレセプター、及び原則的に該キメラレセプターによって誘導され得る
、プロモーターの下流に位置付けられたそのリガンドのための遺伝子を担持する
宿主細胞（しかし、ここで該宿主細胞は、シグナル伝達経路の１つ以上の化合物
を欠いている）は、シグナル伝達経路を補足するため、発現ライブラリーによっ
て形質転換され得る。補足された細胞はレセプター系の活性化によって検出され
る。この方法は、未知のシグナル伝達経路を有するレセプターが、キメラレセプ
ターを活性化するオートクリンループの中、前又は後に位置している場合に非常
に有用である。
る：キメラレセプター、及び原則的に該キメラレセプターによって誘導され得る
、プロモーターの下流に位置付けられたそのリガンドのための遺伝子を担持する
宿主細胞（しかし、ここで該宿主細胞は、シグナル伝達経路の１つ以上の化合物
を欠いている）は、シグナル伝達経路を補足するため、発現ライブラリーによっ
て形質転換され得る。補足された細胞はレセプター系の活性化によって検出され
る。この方法は、未知のシグナル伝達経路を有するレセプターが、キメラレセプ
ターを活性化するオートクリンループの中、前又は後に位置している場合に非常
に有用である。
【００２２】 さらに本発明のもう１つの側面は、分泌経路に含まれる化合物のスクリーニン
グである：レセプターの活性化のため、キメラレセプターのリガンドは分泌され
る必要があるので、分泌を阻害する化合物、又は分泌経路における突然変異を補
足することができる化合物をスクリーニングすることができる。
グである：レセプターの活性化のため、キメラレセプターのリガンドは分泌され
る必要があるので、分泌を阻害する化合物、又は分泌経路における突然変異を補
足することができる化合物をスクリーニングすることができる。
【００２３】 定義 以下の定義は、ここで本発明を記載するために用いられる種々の用語の意味と
範囲を説明し定義するために記載されている。
範囲を説明し定義するために記載されている。
【００２４】 「多量体レセプター」：リガンドとの相互作用又は結合によってレセプター構
成要素の多量体化を生じるすべてのレセプター、及び／又はそのアミノ酸配列及
び／又はタンパク質構造に基づくレセプターのような、この技術における熟練者
によって同定され得るすべてのタンパク質をいう。相互作用は、大抵はレセプタ
ーへの結合であるが、しかし例えばレセプター複合体の１つの構成要素に対する
結合（それに引き続いて他のレセプター構成要素の該レセプター複合体の形成に
結び付く）でもあり得る。もう１つの例は、構造変化に導くか、又はシグナル転
移に導く特異的な酵素的修飾を起こさせる、リガンドとレセプター複合体との一
時的な相互作用である。
成要素の多量体化を生じるすべてのレセプター、及び／又はそのアミノ酸配列及
び／又はタンパク質構造に基づくレセプターのような、この技術における熟練者
によって同定され得るすべてのタンパク質をいう。相互作用は、大抵はレセプタ
ーへの結合であるが、しかし例えばレセプター複合体の１つの構成要素に対する
結合（それに引き続いて他のレセプター構成要素の該レセプター複合体の形成に
結び付く）でもあり得る。もう１つの例は、構造変化に導くか、又はシグナル転
移に導く特異的な酵素的修飾を起こさせる、リガンドとレセプター複合体との一
時的な相互作用である。
【００２５】 「多量体化」は、ホモ−又はヘテロ−２量体化であり得、ホモ−又はヘテロ−
から多数のタンパク質の複合体形成までであり得る。
から多数のタンパク質の複合体形成までであり得る。
【００２６】 「オーファンレセプター」：好ましくは多量体化レセプターであるか、又はそ
のレセプターと相互作用するか若しくは結合し、その結果としてシグナル伝達経
路を開始するか若しくは阻害するリガンドが未知である、既知のレセプター構成
要素を有するタンパク質である、全てのレセプターである。
のレセプターと相互作用するか若しくは結合し、その結果としてシグナル伝達経
路を開始するか若しくは阻害するリガンドが未知である、既知のレセプター構成
要素を有するタンパク質である、全てのレセプターである。
【００２７】 「リガンド」：好ましくは多量体化レセプターであるレセプターと相互作用又
は結合することができ、該レセプターとの相互作用又は結合によってシグナル伝
達経路を開始するか又は阻害する全ての化合物である。
は結合することができ、該レセプターとの相互作用又は結合によってシグナル伝
達経路を開始するか又は阻害する全ての化合物である。
【００２８】 「未知のリガンド」：好ましくは多量体化レセプターであるレセプターと相互
作用又は結合することができ、該レセプターとの相互作用又は結合によってシグ
ナル伝達経路を開始するか又は阻害するが、この相互作用又は結合が未だ照明さ
れていない、全ての化合物である。
作用又は結合することができ、該レセプターとの相互作用又は結合によってシグ
ナル伝達経路を開始するか又は阻害するが、この相互作用又は結合が未だ照明さ
れていない、全ての化合物である。
【００２９】 「化合物」：単一又は複合体の無機又は有機の、分子、ペプチド、擬ペプチド
、タンパク質、抗体、炭水化物、リン脂質、核酸又はそれらの誘導体を含む、あ
らゆる化学的又は生物学的化合物を意味する。
、タンパク質、抗体、炭水化物、リン脂質、核酸又はそれらの誘導体を含む、あ
らゆる化学的又は生物学的化合物を意味する。
【００３０】 「細胞外ドメイン」：レセプター及び／又はオーファンレセプター、又は未だ
既知及び／又は未知のリガンドと相互作用又は結合することができるという事実
により特徴づけられるそれらの機能的断片、又は未だ既知及び／又は未知のリガ
ンドと相互作用又は結合することができるという事実により特徴づけられる、他
のアミノ酸配列と融合したそれらの断片、又は既知及び／又は未知のリガンドと
相互作用又は結合することができる非レセプターのタンパク質を意味する。
既知及び／又は未知のリガンドと相互作用又は結合することができるという事実
により特徴づけられるそれらの機能的断片、又は未だ既知及び／又は未知のリガ
ンドと相互作用又は結合することができるという事実により特徴づけられる、他
のアミノ酸配列と融合したそれらの断片、又は既知及び／又は未知のリガンドと
相互作用又は結合することができる非レセプターのタンパク質を意味する。
【００３１】 「結合（している）」とは、直接の（化合物の、細胞外ドメインとの直接の相
互作用）又は間接の（化合物と１つ以上の独立の及び／又は非独立の化合物との
相互作用であって、その結果１つ以上の化合物が細胞外ドメインと相互作用する
ことができる、相互作用）あらゆる相互作用であって、その結果キメラレセプタ
ーのシグナル伝達経路の開始又は阻害をするものを意味する。
互作用）又は間接の（化合物と１つ以上の独立の及び／又は非独立の化合物との
相互作用であって、その結果１つ以上の化合物が細胞外ドメインと相互作用する
ことができる、相互作用）あらゆる相互作用であって、その結果キメラレセプタ
ーのシグナル伝達経路の開始又は阻害をするものを意味する。
【００３２】 「細胞質ドメイン」：レセプターの細胞質部分、又はその機能的断片、又は他
のアミノ酸配列と融合しているその断片であって、該レセプターのシグナル伝達
経路を開始することができ、レポーター系を誘導することができるものを意味す
る。
のアミノ酸配列と融合しているその断片であって、該レセプターのシグナル伝達
経路を開始することができ、レポーター系を誘導することができるものを意味す
る。
【００３３】 「キメラレセプター」：１つのレセプターの細胞外ドメイン及びもう１つのレ
セプターの細胞質ドメインを含む機能的レセプターである。
セプターの細胞質ドメインを含む機能的レセプターである。
【００３４】 「レポーター系」：合成及び／又は修飾及び／又は複合体形成を検出及び／又
はスクリーニング及び／若しくは選択系において使用することができる、あらゆ
る化合物である。レポーター系は、非限定的な例として、酵素の活性をコードす
る遺伝子産物、着色された化合物、表面化合物又は蛍光化合物であり得る。
はスクリーニング及び／若しくは選択系において使用することができる、あらゆ
る化合物である。レポーター系は、非限定的な例として、酵素の活性をコードす
る遺伝子産物、着色された化合物、表面化合物又は蛍光化合物であり得る。
【００３５】 「オートクリンループ」：それにより、レセプターを担持する細胞の、直接的
又は間接的に該レセプターの活性化を誘導する既知又は未知の化合物の産生が可
能となる、あらゆる一連の出来事をいう。
又は間接的に該レセプターの活性化を誘導する既知又は未知の化合物の産生が可
能となる、あらゆる一連の出来事をいう。
【００３６】 「抗オートクリンループ」：それにより、レセプターを担持する細胞の、直接
的又は間接的に該レセプターへのリガンド及び／又は未知のリガンドの結合を阻
害する既知又は未知の化合物の産生が可能となる、あらゆる一連の出来事をいう
。
的又は間接的に該レセプターへのリガンド及び／又は未知のリガンドの結合を阻
害する既知又は未知の化合物の産生が可能となる、あらゆる一連の出来事をいう
。
【００３７】 「シグナル伝達経路」：天然に生じるか又はキメラレセプターの細胞外ドメイ
ンへの、リガンド及び／又は未知のリガンドの結合（ここで、該結合は遺伝子の
セットの誘導及び／又は抑制を生じることができる）の後の、あらゆる一連の出
来事を意味する。
ンへの、リガンド及び／又は未知のリガンドの結合（ここで、該結合は遺伝子の
セットの誘導及び／又は抑制を生じることができる）の後の、あらゆる一連の出
来事を意味する。
【００３８】 「選択」：その中でレポーター系が活性化される細胞の単離及び／又は同定、
あるいはその中でレポーター系が活性化されない細胞の単離及び／又は同定を意
味する。
あるいはその中でレポーター系が活性化されない細胞の単離及び／又は同定を意
味する。
【００３９】
Ｉ．キメラレセプターの構築 Ｉ．１．ＩＬ−５／ＩＦＮａＲキメラレセプターの構築 Ｉ．１．１ ｐｃＤＮＡ３ベクターにおける構築 全てのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、拡張高精度ＰＣＲシステムキット
（Expand High Fidelity PCR system kit, Boehringer Mannheim）を用いて行っ
た。このキットは、熱安定性ＴａｑＤＮＡ及びＰｗｏＤＮＡポリメラーゼを含む
酵素混合液と共に供給される（Barnes et al, 1994）。ＩＬ−５Ｒα細胞外ドメ
イン配列（アミノ酸１〜３４１位、最後の３４２位のＴｒｐ残基は含まない）を
ＫｐｎＩ部位を含む順方向プライマーＭＢＵ−Ｏ−３７及び逆方向プライマーＭ
ＢＵ−Ｏ−３８（表１）を用いたＰＣＲで増幅した。βｃ細胞外ドメインを含む
配列（アミノ酸１〜４３８位、最後の４３９位のＶａｌ残基は含まない）は、こ
れもＫｐｎＩ部位を含む順方向プライマーＭＢＵ−Ｏ−３９及び逆方向プライマ
ーＭＢＵ−Ｏ−４０を用いてＰＣＲ増幅した。順方向プライマーＭＢＵ−Ｏ−４
１は、ＸｈｏＩ部位を含む逆方向プライマーＭＢＵ−Ｏ−４２と一緒に用いて、
ＩＦＮａＲ１膜貫通（ＴＭ）及び細胞内（ＩＣ）ドメイン（アミノ酸４３６〜５
５７位、細胞外ドメインの最後の残基、４３６位のＬｙｓを含む）をコードする
配列を増幅した。順方向プライマーＭＢＵ−Ｏ−４３を用いて、ＩＦＮａＲ２−
１膜貫通及び細胞内ドメイン（アミノ酸２４３〜３３１位、細胞外ドメインの最
後の残基、２４３位のＬｙｓを含む）及びＩＦＮａＲ２−２ＴＭおよびＩＣドメ
イン（アミノ酸２４３〜５１５位、細胞外ドメインの最後の残基、２４３位のＬ
ｙｓを含む）をコードする配列を、それぞれＸｈｏＩ部位を含む逆方向プライマ
ーＭＢＵ−Ｏ−４４及びＭＢＵ−Ｏ−４５と組合わせて、増幅した。ゲル精製、
リン酸化の後、一方でＥＣをコードするＰＣＲ断片と、他方ＴＭ＋ＩＣドメイン
をコードするＰＣＲ断片の６つの組み合わせをライゲートし、続いて第２のＰＣ
Ｒ反応におけるインプットＤＮＡとして用いた、すなわち： １）ＭＢＵ−Ｏ−３７及びＭＢＵ−Ｏ−４２をそれぞれ順方向及び逆方向プライ
マーとして使用した、ＩＬ−５ＲαのＥＣドメイン断片＋ＩＦＮａＲ１のＩＣ及
びＴＭドメイン断片。 ２）ＭＢＵ−Ｏ−３７及びＭＢＵ−Ｏ−４４をそれぞれ順方向及び逆方向プライ
マーとして使用した、ＩＬ−５ＲαのＥＣドメイン断片＋ＩＦＮａＲ２−１のＩ
Ｃ及びＴＭドメイン断片。 ３）ＭＢＵ−Ｏ−３７及びＭＢＵ−Ｏ−４５をそれぞれ順方向及び逆方向プライ
マーとして使用した、ＩＬ−５ＲαのＥＣドメイン断片＋ＩＦＮａＲ２−２のＩ
Ｃ及びＴＭドメイン断片。 ４）ＭＢＵ−Ｏ−３９及びＭＢＵ−Ｏ−４２をそれぞれ順方向及び逆方向プライ
マーとして使用した、βｃのＥＣドメイン断片＋ＩＦＮａＲ１のＩＣ及びＴＭド
メイン断片。 ５）ＭＢＵ−Ｏ−３９及びＭＢＵ−Ｏ−４４をそれぞれ順方向及び逆方向プライ
マーとして使用した、βｃのＥＣドメイン断片＋ＩＦＮａＲ２−１のＩＣ及びＴ
Ｍドメイン断片。 ６）ＭＢＵ−Ｏ−３９及びＭＢＵ−Ｏ−４５をそれぞれ順方向及び逆方向プライ
マーとして使用した、βｃのＥＣドメイン断片＋ＩＦＮａＲ２−２のＩＣ及びＴ
Ｍドメイン断片。
（Expand High Fidelity PCR system kit, Boehringer Mannheim）を用いて行っ
た。このキットは、熱安定性ＴａｑＤＮＡ及びＰｗｏＤＮＡポリメラーゼを含む
酵素混合液と共に供給される（Barnes et al, 1994）。ＩＬ−５Ｒα細胞外ドメ
イン配列（アミノ酸１〜３４１位、最後の３４２位のＴｒｐ残基は含まない）を
ＫｐｎＩ部位を含む順方向プライマーＭＢＵ−Ｏ−３７及び逆方向プライマーＭ
ＢＵ−Ｏ−３８（表１）を用いたＰＣＲで増幅した。βｃ細胞外ドメインを含む
配列（アミノ酸１〜４３８位、最後の４３９位のＶａｌ残基は含まない）は、こ
れもＫｐｎＩ部位を含む順方向プライマーＭＢＵ−Ｏ−３９及び逆方向プライマ
ーＭＢＵ−Ｏ−４０を用いてＰＣＲ増幅した。順方向プライマーＭＢＵ−Ｏ−４
１は、ＸｈｏＩ部位を含む逆方向プライマーＭＢＵ−Ｏ−４２と一緒に用いて、
ＩＦＮａＲ１膜貫通（ＴＭ）及び細胞内（ＩＣ）ドメイン（アミノ酸４３６〜５
５７位、細胞外ドメインの最後の残基、４３６位のＬｙｓを含む）をコードする
配列を増幅した。順方向プライマーＭＢＵ−Ｏ−４３を用いて、ＩＦＮａＲ２−
１膜貫通及び細胞内ドメイン（アミノ酸２４３〜３３１位、細胞外ドメインの最
後の残基、２４３位のＬｙｓを含む）及びＩＦＮａＲ２−２ＴＭおよびＩＣドメ
イン（アミノ酸２４３〜５１５位、細胞外ドメインの最後の残基、２４３位のＬ
ｙｓを含む）をコードする配列を、それぞれＸｈｏＩ部位を含む逆方向プライマ
ーＭＢＵ−Ｏ−４４及びＭＢＵ−Ｏ−４５と組合わせて、増幅した。ゲル精製、
リン酸化の後、一方でＥＣをコードするＰＣＲ断片と、他方ＴＭ＋ＩＣドメイン
をコードするＰＣＲ断片の６つの組み合わせをライゲートし、続いて第２のＰＣ
Ｒ反応におけるインプットＤＮＡとして用いた、すなわち： １）ＭＢＵ−Ｏ−３７及びＭＢＵ−Ｏ−４２をそれぞれ順方向及び逆方向プライ
マーとして使用した、ＩＬ−５ＲαのＥＣドメイン断片＋ＩＦＮａＲ１のＩＣ及
びＴＭドメイン断片。 ２）ＭＢＵ−Ｏ−３７及びＭＢＵ−Ｏ−４４をそれぞれ順方向及び逆方向プライ
マーとして使用した、ＩＬ−５ＲαのＥＣドメイン断片＋ＩＦＮａＲ２−１のＩ
Ｃ及びＴＭドメイン断片。 ３）ＭＢＵ−Ｏ−３７及びＭＢＵ−Ｏ−４５をそれぞれ順方向及び逆方向プライ
マーとして使用した、ＩＬ−５ＲαのＥＣドメイン断片＋ＩＦＮａＲ２−２のＩ
Ｃ及びＴＭドメイン断片。 ４）ＭＢＵ−Ｏ−３９及びＭＢＵ−Ｏ−４２をそれぞれ順方向及び逆方向プライ
マーとして使用した、βｃのＥＣドメイン断片＋ＩＦＮａＲ１のＩＣ及びＴＭド
メイン断片。 ５）ＭＢＵ−Ｏ−３９及びＭＢＵ−Ｏ−４４をそれぞれ順方向及び逆方向プライ
マーとして使用した、βｃのＥＣドメイン断片＋ＩＦＮａＲ２−１のＩＣ及びＴ
Ｍドメイン断片。 ６）ＭＢＵ−Ｏ−３９及びＭＢＵ−Ｏ−４５をそれぞれ順方向及び逆方向プライ
マーとして使用した、βｃのＥＣドメイン断片＋ＩＦＮａＲ２−２のＩＣ及びＴ
Ｍドメイン断片。
【００４０】 ハイブリットレセプターをコードする、生成平滑ＰＣＲ断片は、アガロースゲ
ル電気泳動で単離し、ＫｐｎＩ−ＸｈｏＩで消化してＫｐｎＩ−ＸｈｏＩで開環
したｐｃＤＮＡ３ベクター（Invitrogen）にライゲートした。
ル電気泳動で単離し、ＫｐｎＩ−ＸｈｏＩで消化してＫｐｎＩ−ＸｈｏＩで開環
したｐｃＤＮＡ３ベクター（Invitrogen）にライゲートした。
【００４１】 構築物をＤＮＡシークエンス解析で検証し、以下のように名付けた、すなわち
：ｐｃＤＮＡ３−ＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ１、ｐｃＤＮＡ３−ＩＬ−５Ｒα／
ＩＦＮａＲ２−１、ｐｃＤＮＡ３−ＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ２−２、ｐｃＤＮ
Ａ３−βｃ／ＩＦＮａＲ１、ｐｃＤＮＡ３−βｃ／ＩＦＮａＲ２−１、及びｐｃ
ＤＮＡ３−βｃ／ＩＦＮａＲ２−２である。
：ｐｃＤＮＡ３−ＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ１、ｐｃＤＮＡ３−ＩＬ−５Ｒα／
ＩＦＮａＲ２−１、ｐｃＤＮＡ３−ＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ２−２、ｐｃＤＮ
Ａ３−βｃ／ＩＦＮａＲ１、ｐｃＤＮＡ３−βｃ／ＩＦＮａＲ２−１、及びｐｃ
ＤＮＡ３−βｃ／ＩＦＮａＲ２−２である。
【００４２】
【表１】
【００４３】 Ｉ．１．２．ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴベクターにおける構築及びＰａｃＩ部位の挿入 別法として、我々はｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ発現ベクター（Life Technologies）
においてキメラレセプターのテストも行った。このベクターは、通常はｐｃＤＮ
Ａ３プラスミドのＣＭＶプロモーターに比べて弱い、ＳＶ４０初期プロモーター
を含む。
においてキメラレセプターのテストも行った。このベクターは、通常はｐｃＤＮ
Ａ３プラスミドのＣＭＶプロモーターに比べて弱い、ＳＶ４０初期プロモーター
を含む。
【００４４】 ｐｃＤＮＡ３−ＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ２−２及びｐｃＤＮＡ３−βｃ／Ｉ
ＦＮａＲ１におけるキメラレセプターの遺伝子はＡｓｐ７１８及びＸｈｏＩ消化
及びアガロースゲル電気泳動によって単離し、続いてＡｓｐ７１８−ＳａｌＩ開
環したｐＳＶ−ＳＰＯＲＴベクターに挿入した。生成した構築物は、シークエン
ス解析で確認し、ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ２−２及びｐ
ＳＶ−ＳＰＯＲＴ−βｃ／ＩＦＮａＲ１と名付けた。
ＦＮａＲ１におけるキメラレセプターの遺伝子はＡｓｐ７１８及びＸｈｏＩ消化
及びアガロースゲル電気泳動によって単離し、続いてＡｓｐ７１８−ＳａｌＩ開
環したｐＳＶ−ＳＰＯＲＴベクターに挿入した。生成した構築物は、シークエン
ス解析で確認し、ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ２−２及びｐ
ＳＶ−ＳＰＯＲＴ−βｃ／ＩＦＮａＲ１と名付けた。
【００４５】 加えて我々は、それぞれの細胞外ドメインの最後のアミノ酸コドン（ＩＬ−５
Ｒα及びβｃについてそれぞれ３４１位のＴｒｐ及び４３８位のＶａｌ）の直前
に、唯一のＰａｃＩ制限部位を挿入した。これにより、我々は、ＩＬ−５Ｒ細胞
外ドメインと他のレセプターの細胞外ドメインを即座に交換することができるよ
うになった。挿入突然変異誘発は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位直接的突然変異
誘発キット（Stratagene）で、オリゴヌクレオチドＭＢＵ−Ｏ−２７８（センス
）及びＭＢＵ−Ｏ−２７９（アンチセンス）をＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ２−２
に対して、及びＭＢＵ−Ｏ−２８０（センス）及びＭＢＵ−Ｏ−２８１（アンチ
センス）をβｃ／ＩＦＮａＲ１に用いて（表１）、行った。結果として、２つの
アミノ酸（Ｌｅｕ−Ｉｌｅ）が、レセプター機能と干渉しない、細胞外ドメイン
の膜基部近傍の部位に挿入された。生成したプラスミドを、ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ
−ＩＬ５ＲαＰ／ＩＦＮａＲ２−２及びｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−βｃＰ／ＩＦＮａ
Ｒ１と名付けた。
Ｒα及びβｃについてそれぞれ３４１位のＴｒｐ及び４３８位のＶａｌ）の直前
に、唯一のＰａｃＩ制限部位を挿入した。これにより、我々は、ＩＬ−５Ｒ細胞
外ドメインと他のレセプターの細胞外ドメインを即座に交換することができるよ
うになった。挿入突然変異誘発は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位直接的突然変異
誘発キット（Stratagene）で、オリゴヌクレオチドＭＢＵ−Ｏ−２７８（センス
）及びＭＢＵ−Ｏ−２７９（アンチセンス）をＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ２−２
に対して、及びＭＢＵ−Ｏ−２８０（センス）及びＭＢＵ−Ｏ−２８１（アンチ
センス）をβｃ／ＩＦＮａＲ１に用いて（表１）、行った。結果として、２つの
アミノ酸（Ｌｅｕ−Ｉｌｅ）が、レセプター機能と干渉しない、細胞外ドメイン
の膜基部近傍の部位に挿入された。生成したプラスミドを、ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ
−ＩＬ５ＲαＰ／ＩＦＮａＲ２−２及びｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−βｃＰ／ＩＦＮａ
Ｒ１と名付けた。
【００４６】 Ｉ．２．ＥＰＯ−Ｒ／ＩＦＮａＲキメラレセプター ＲＮｅａｓｙキット（Qiagen）の手順に従って、５×１０6個のＴＦ−１細胞
からＲＮＡを調整して、５０μlの水に溶解し、そこから１０μlをＲＴ−ＰＣＲ
に用いた。それらに、２μl（２μg）のオリゴｄＴ（１２−１８mer；Pharmacia
）を添加し、７０℃で１０分間インキュベートした。氷上で１分間冷却した後、
４μlのＲＴバッファー（１０×；Life Sciences）、１μlのｄＮＴＰ（２０mM
；Pharmacia）、２μlのＤＴＴ（０．１M）及び１μlのＭＭＬＶ逆転写酵素（２
００U；特級；Life Technologies）を、全量が２０μlになるように加えること
により、ｃＤＮＡを調製した。インキュベーションを、連続的に、室温で１０分
間、４２℃で５０分間、９０℃で５分間、及び０℃で１０分間行った。これの後
、０．５μlのＲＮアーゼＨ（２u；Life Technologies）を添加し、混合液を３
７℃で２０分間インキュベートし、続いて氷上で冷却した。ＤＮＡのＰＣＴ増幅
のため、この混合液５μlを１７μlの水に希釈し、続いて１μlのｄＮＴＰ（２
０mM）、５μlのＰｆｕバッファー（１０×；Stratagene）及び１０μl（１００
ng）の、ＥＰＯ−Ｒに対する順方向及び逆方向プライマー（それぞれＭＢＵ−Ｏ
−１６７及びＭＢＵ−Ｏ−３０８、表１参照）を添加した。ＰＣＲは、９４℃で
２分間から開始し、その間に２μlのＰｆｕ酵素（５U；Stratagene）を添加し（
ホットスタート）、そして続いて９２℃（１分）で変性、５５〜５９℃（１分：
４０サイクルの間に４℃に渡る温度勾配を増加しながら）でハイブリダイゼーシ
ョンし、７２℃（３分；最後の２５サイクルのみ、毎回のサイクルで０．０５分
の時間延長を増加しながら）でポリメラーゼ伸長反応をする４０サイクルで行っ
た。仕上げのため、反応を７２℃に１２分間維持し、４℃に冷却した。正しいサ
イズのバンドをアガロースゲルから単離して、ＤＮＡをＰａｃＩ及びＫｐｎＩで
消化して、ＰａｃＩ−ＫｐｎＩで開環したｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＩＬ−５ＲαＰ
／ＩＦＮａＲ２−２又はｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−βｃＰ／ＩＦＮａＲ１ベクターに
挿入した。生成したベクターを、それぞれｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＥＰＯ−Ｒ／Ｉ
ＦＮａＲ２−２及びＥＰＯ−Ｒ／ＩＦＮａＲ１と名付けた。
からＲＮＡを調整して、５０μlの水に溶解し、そこから１０μlをＲＴ−ＰＣＲ
に用いた。それらに、２μl（２μg）のオリゴｄＴ（１２−１８mer；Pharmacia
）を添加し、７０℃で１０分間インキュベートした。氷上で１分間冷却した後、
４μlのＲＴバッファー（１０×；Life Sciences）、１μlのｄＮＴＰ（２０mM
；Pharmacia）、２μlのＤＴＴ（０．１M）及び１μlのＭＭＬＶ逆転写酵素（２
００U；特級；Life Technologies）を、全量が２０μlになるように加えること
により、ｃＤＮＡを調製した。インキュベーションを、連続的に、室温で１０分
間、４２℃で５０分間、９０℃で５分間、及び０℃で１０分間行った。これの後
、０．５μlのＲＮアーゼＨ（２u；Life Technologies）を添加し、混合液を３
７℃で２０分間インキュベートし、続いて氷上で冷却した。ＤＮＡのＰＣＴ増幅
のため、この混合液５μlを１７μlの水に希釈し、続いて１μlのｄＮＴＰ（２
０mM）、５μlのＰｆｕバッファー（１０×；Stratagene）及び１０μl（１００
ng）の、ＥＰＯ−Ｒに対する順方向及び逆方向プライマー（それぞれＭＢＵ−Ｏ
−１６７及びＭＢＵ−Ｏ−３０８、表１参照）を添加した。ＰＣＲは、９４℃で
２分間から開始し、その間に２μlのＰｆｕ酵素（５U；Stratagene）を添加し（
ホットスタート）、そして続いて９２℃（１分）で変性、５５〜５９℃（１分：
４０サイクルの間に４℃に渡る温度勾配を増加しながら）でハイブリダイゼーシ
ョンし、７２℃（３分；最後の２５サイクルのみ、毎回のサイクルで０．０５分
の時間延長を増加しながら）でポリメラーゼ伸長反応をする４０サイクルで行っ
た。仕上げのため、反応を７２℃に１２分間維持し、４℃に冷却した。正しいサ
イズのバンドをアガロースゲルから単離して、ＤＮＡをＰａｃＩ及びＫｐｎＩで
消化して、ＰａｃＩ−ＫｐｎＩで開環したｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＩＬ−５ＲαＰ
／ＩＦＮａＲ２−２又はｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−βｃＰ／ＩＦＮａＲ１ベクターに
挿入した。生成したベクターを、それぞれｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＥＰＯ−Ｒ／Ｉ
ＦＮａＲ２−２及びＥＰＯ−Ｒ／ＩＦＮａＲ１と名付けた。
【００４７】 II.キメラレセプターの機能性 II．１．ＩＬ−５は、ＩＬ−５Ｒ／ＩＦＮａＲキメラレセプターを介して６−１
６プロモーターを活性化することができる II．１．１．６−１６ｇｐｔの活性化は安定なコロニーの選択を可能とすること
ができる 以下の９つのプラスミドの組合わせが２ｆＴＧＨ細胞に導入された、すなわち
： １．ｐｃＤＮＡ３−ＩＬ−５α／ＩＦＮａＲ１＋ｐｃＤＮＡ３−βｃ／ＩＦＮａ
Ｒ１ ２．ｐｃＤＮＡ３−ＩＬ−５α／ＩＦＮａＲ１＋ｐｃＤＮＡ３−βｃ／ＩＦＮａ
Ｒ２−１ ３．ｐｃＤＮＡ３−ＩＬ−５α／ＩＦＮａＲ１＋ｐｃＤＮＡ３−βｃ／ＩＦＮａ
Ｒ２−２ ４．ｐｃＤＮＡ３−ＩＬ−５α／ＩＦＮａＲ２−１＋ｐｃＤＮＡ３−βｃ／ＩＦ
ＮａＲ１ ５．ｐｃＤＮＡ３−ＩＬ−５α／ＩＦＮａＲ２−１＋ｐｃＤＮＡ３−βｃ／ＩＦ
ＮａＲ２−１ ６．ｐｃＤＮＡ３−ＩＬ−５α／ＩＦＮａＲ２−１＋ｐｃＤＮＡ３−βｃ／ＩＦ
ＮａＲ２−２ ７．ｐｃＤＮＡ３−ＩＬ−５α／ＩＦＮａＲ２−２＋ｐｃＤＮＡ３−βｃ／ＩＦ
ＮａＲ１ ８．ｐｃＤＮＡ３−ＩＬ−５α／ＩＦＮａＲ２−２＋ｐｃＤＮＡ３−βｃ／ＩＦ
ＮａＲ２−１ ９．ｐｃＤＮＡ３−ＩＬ−５α／ＩＦＮａＲ２−２＋ｐｃＤＮＡ３−βｃ／ＩＦ
ＮａＲ２−２ ｐｃＤＮＡ３単独が、模擬トランスフェクションに用いられた。
６プロモーターを活性化することができる II．１．１．６−１６ｇｐｔの活性化は安定なコロニーの選択を可能とすること
ができる 以下の９つのプラスミドの組合わせが２ｆＴＧＨ細胞に導入された、すなわち
： １．ｐｃＤＮＡ３−ＩＬ−５α／ＩＦＮａＲ１＋ｐｃＤＮＡ３−βｃ／ＩＦＮａ
Ｒ１ ２．ｐｃＤＮＡ３−ＩＬ−５α／ＩＦＮａＲ１＋ｐｃＤＮＡ３−βｃ／ＩＦＮａ
Ｒ２−１ ３．ｐｃＤＮＡ３−ＩＬ−５α／ＩＦＮａＲ１＋ｐｃＤＮＡ３−βｃ／ＩＦＮａ
Ｒ２−２ ４．ｐｃＤＮＡ３−ＩＬ−５α／ＩＦＮａＲ２−１＋ｐｃＤＮＡ３−βｃ／ＩＦ
ＮａＲ１ ５．ｐｃＤＮＡ３−ＩＬ−５α／ＩＦＮａＲ２−１＋ｐｃＤＮＡ３−βｃ／ＩＦ
ＮａＲ２−１ ６．ｐｃＤＮＡ３−ＩＬ−５α／ＩＦＮａＲ２−１＋ｐｃＤＮＡ３−βｃ／ＩＦ
ＮａＲ２−２ ７．ｐｃＤＮＡ３−ＩＬ−５α／ＩＦＮａＲ２−２＋ｐｃＤＮＡ３−βｃ／ＩＦ
ＮａＲ１ ８．ｐｃＤＮＡ３−ＩＬ−５α／ＩＦＮａＲ２−２＋ｐｃＤＮＡ３−βｃ／ＩＦ
ＮａＲ２−１ ９．ｐｃＤＮＡ３−ＩＬ−５α／ＩＦＮａＲ２−２＋ｐｃＤＮＡ３−βｃ／ＩＦ
ＮａＲ２−２ ｐｃＤＮＡ３単独が、模擬トランスフェクションに用いられた。
【００４８】 遺伝子導入はリン酸カルシウム法（Graham and van der Eb (1973)）にしたが
って行った。各々のプラスミドについて、ＤＮＡ１０μg（模擬トランスフェク
ションにはｐｃＤＮＡ３を２０μg）を用いた。沈殿を１ml中に作製し、細胞上
に一晩放置した（５×１０5個細胞／トランスフェクション／ぺトリ皿）。皿を
ダルベッコのＰＢＳ（Life Technologies）で２回洗浄し、細胞をＤＭＥＭ（Lif
e Technologies）中に放置した。４８時間後、ＤＭＥＭ培地＋Ｇ４１８（Calbio
cem；４００μg）を添加した。３日後、全てのトランスフェクションを５mlの０
．０５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡ溶液（Life Technologies）でトリプ
シン化して、６−ウェルマイクロタイタープレートの３つのウェルに播種した。
１日後、１）ＨＡＴ培地（Life Technologies）単独＋Ｇ４１８、２）ＨＡＴ培
地＋Ｇ４１８＋５００Ｕ／mlのＩＦＮα２ｂ（Peprotech,Inc）又は３）ＨＡＴ
培地＋Ｇ４１８＋１ng／mlのＩＬ−５（Ｓｆ９細胞中で、公開された方法を用い
て調製された）を添加した。６日後、小さなコロニーが、ＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮ
ａＲ１＋βｃ／ＩＦＮａＲ２−２及びＩＬ−５α／ＩＦＮａＲ２−２＋βｃ／Ｉ
ＦＮａＲ１トランスフェクションのみにおいて、細胞をＨＡＴ＋Ｇ４１８＋ＩＬ
−５と一緒にインキュベートした場合に現れ、このことはＩＬ−５Ｒ／ＩＦＮａ
Ｒキメラレセプターが、それらが６−１６プロモーターを活性化するシグナルを
伝達したことにおいて機能的であったことを示している。どのトランスフェクシ
ョンにおいても、ＨＡＴ培地のみでの増殖は、明確なコロニー形成という結果に
なったものはなく、一方５００U／mlのＩＦＮαと一緒にインキュベートしたす
べてのトランスフェクションにおいては、５０〜１００個のコロニーが結果とし
て生じた（表２参照）。
って行った。各々のプラスミドについて、ＤＮＡ１０μg（模擬トランスフェク
ションにはｐｃＤＮＡ３を２０μg）を用いた。沈殿を１ml中に作製し、細胞上
に一晩放置した（５×１０5個細胞／トランスフェクション／ぺトリ皿）。皿を
ダルベッコのＰＢＳ（Life Technologies）で２回洗浄し、細胞をＤＭＥＭ（Lif
e Technologies）中に放置した。４８時間後、ＤＭＥＭ培地＋Ｇ４１８（Calbio
cem；４００μg）を添加した。３日後、全てのトランスフェクションを５mlの０
．０５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡ溶液（Life Technologies）でトリプ
シン化して、６−ウェルマイクロタイタープレートの３つのウェルに播種した。
１日後、１）ＨＡＴ培地（Life Technologies）単独＋Ｇ４１８、２）ＨＡＴ培
地＋Ｇ４１８＋５００Ｕ／mlのＩＦＮα２ｂ（Peprotech,Inc）又は３）ＨＡＴ
培地＋Ｇ４１８＋１ng／mlのＩＬ−５（Ｓｆ９細胞中で、公開された方法を用い
て調製された）を添加した。６日後、小さなコロニーが、ＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮ
ａＲ１＋βｃ／ＩＦＮａＲ２−２及びＩＬ−５α／ＩＦＮａＲ２−２＋βｃ／Ｉ
ＦＮａＲ１トランスフェクションのみにおいて、細胞をＨＡＴ＋Ｇ４１８＋ＩＬ
−５と一緒にインキュベートした場合に現れ、このことはＩＬ−５Ｒ／ＩＦＮａ
Ｒキメラレセプターが、それらが６−１６プロモーターを活性化するシグナルを
伝達したことにおいて機能的であったことを示している。どのトランスフェクシ
ョンにおいても、ＨＡＴ培地のみでの増殖は、明確なコロニー形成という結果に
なったものはなく、一方５００U／mlのＩＦＮαと一緒にインキュベートしたす
べてのトランスフェクションにおいては、５０〜１００個のコロニーが結果とし
て生じた（表２参照）。
【００４９】
【表２】
【００５０】 実験を、補給剤を添加する時間、培地を変える時間、及びインキュベーション
時間について、手順に多少の改変を加えながら２回繰り返したが、同様の結果が
得られた。
時間について、手順に多少の改変を加えながら２回繰り返したが、同様の結果が
得られた。
【００５１】 単一クローンを単離するために、ｐｃＤＮＡ３−ＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ１
＋ｐｃＤＮＡ３−βｃ／ＩＦＮａＲ２−２又はｐｃＤＮＡ３−ＩＬ−５Ｒα／Ｉ
ＦＮａＲ２−２＋ｐｃＤＮＡ３−βｃ／ＩＦＮａＲ１の組合わせで遺伝子導入し
た安定な細胞をＤＭＥＭ培地＋ＨＴ補足中でさらに２日間培養した。単一細胞を
、９６−ウェルマイクロタイタープレート中での有限希釈によって単離し、その
結果生じたコロニーをＤＭＥＭ中でさらに２週間増殖してｇｐｔを減少させ、保
存した。各々のトランスフェクションの６コロニーをさらにＨＡＴ培地単独、Ｈ
ＡＴ培地＋ＩＬ−５、又はＤＭＥＭ培地中でのそれらの増殖様態を解析すること
により、それらのＩＬ−５反応性について試験した。反転式顕微鏡を用いて、２
週間の間細胞の生存を視覚的に追い、最適のクローンの選択を１）ＤＭＥＭ中で
の急速増殖に関係するＨＡＴ＋ＩＬ−５中での急速増殖、及び２）ＨＡＴ単独中
での著しい細胞死、を基にして行った。それぞれの組合わせについて１つのクロ
ーンを選択した、すなわち：ＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ１＋βｃ／ＩＦＮａＲ２
−２クローンＢ及びＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ２−２＋βｃ／ＩＦＮａＲ１クロ
ーンＣ。
＋ｐｃＤＮＡ３−βｃ／ＩＦＮａＲ２−２又はｐｃＤＮＡ３−ＩＬ−５Ｒα／Ｉ
ＦＮａＲ２−２＋ｐｃＤＮＡ３−βｃ／ＩＦＮａＲ１の組合わせで遺伝子導入し
た安定な細胞をＤＭＥＭ培地＋ＨＴ補足中でさらに２日間培養した。単一細胞を
、９６−ウェルマイクロタイタープレート中での有限希釈によって単離し、その
結果生じたコロニーをＤＭＥＭ中でさらに２週間増殖してｇｐｔを減少させ、保
存した。各々のトランスフェクションの６コロニーをさらにＨＡＴ培地単独、Ｈ
ＡＴ培地＋ＩＬ−５、又はＤＭＥＭ培地中でのそれらの増殖様態を解析すること
により、それらのＩＬ−５反応性について試験した。反転式顕微鏡を用いて、２
週間の間細胞の生存を視覚的に追い、最適のクローンの選択を１）ＤＭＥＭ中で
の急速増殖に関係するＨＡＴ＋ＩＬ−５中での急速増殖、及び２）ＨＡＴ単独中
での著しい細胞死、を基にして行った。それぞれの組合わせについて１つのクロ
ーンを選択した、すなわち：ＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ１＋βｃ／ＩＦＮａＲ２
−２クローンＢ及びＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ２−２＋βｃ／ＩＦＮａＲ１クロ
ーンＣ。
【００５２】 ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ ＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ２−２＋ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ
βｃ／ＩＦＮａＲ１ベクターで安定に遺伝子導入された２ｆｔＧＨ細胞を、Ｇ４
１８培地における選択を省略した以外は本質的に同一の方法で単離した。それぞ
れのプラスミドに対して、１０μgのＤＮＡを用いた（模擬の遺伝子導入につい
ては２０μgのｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ）。沈殿を１ml中に作製し、細胞上に一晩放
置した（５×１０5個細胞／トランスフェクション／ぺトリ皿）。皿をダルベッ
コのＰＢＳ（Life Technologies）で２回洗浄し、細胞をＤＭＥＭ（Life Techno
logies）中に放置した。２４時間後、ＤＭＥＭ培地＋Ｇ４１８（Calbiocem；４
００μg）を添加した。３日後、全てのトランスフェクションを５mlの０．０５
％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡ溶液（Life Technologies）でトリプシン化
して、６−ウェルマイクロタイタープレートの３つのウェルに播種した。１日後
、５００U／mlのＩＦＮα又は１ng／mlのＩＬ−５を添加するか、又は細胞を刺
激しないまま、２４時間後に培地を除去し同じ刺激又は刺激なしのＨＡＴ培地に
置換した。細胞をＨＡＴ＋ＩＬ−５でインキュベートすると、約１４日後、小さ
なコロニーが現れた。ＨＡＴ培地単独中での増殖の結果明確なコロニー形成をし
たトランスフェクションはなかったが、一方全てのトランスフェクションにおい
て、５００U／mlのＩＦＮαでのインキュベーションは、融合した単一層を生じ
る結果となった。単一コロニーの単離は、上述したのと本質的に同じ方法で行っ
た。ＩＬ−５に対する単一コロニーの反応性の程度を、ＨＡＴ培地単独中での細
胞死に対する、ＩＬ−５で補足したＨＡＴ培地中での増殖を試験することによっ
て測定した。別法として、ＩＬ−５で補足された培地を含む６−チオグアニン（
６−ＴＧ）中の細胞死に対する、６−ＴＧを含む培地中における細胞増殖も測定
した。反転式顕微鏡を用いて、２週間の期間、生存又は死を視覚的に測定した。
ＩＬ−５に対する最良の反応をするクローンを、２ｆＴＧＨ ＩＬ−５Ｒα／Ｒ
２−２＋βｃ／Ｒ１クローンＥとした。
βｃ／ＩＦＮａＲ１ベクターで安定に遺伝子導入された２ｆｔＧＨ細胞を、Ｇ４
１８培地における選択を省略した以外は本質的に同一の方法で単離した。それぞ
れのプラスミドに対して、１０μgのＤＮＡを用いた（模擬の遺伝子導入につい
ては２０μgのｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ）。沈殿を１ml中に作製し、細胞上に一晩放
置した（５×１０5個細胞／トランスフェクション／ぺトリ皿）。皿をダルベッ
コのＰＢＳ（Life Technologies）で２回洗浄し、細胞をＤＭＥＭ（Life Techno
logies）中に放置した。２４時間後、ＤＭＥＭ培地＋Ｇ４１８（Calbiocem；４
００μg）を添加した。３日後、全てのトランスフェクションを５mlの０．０５
％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡ溶液（Life Technologies）でトリプシン化
して、６−ウェルマイクロタイタープレートの３つのウェルに播種した。１日後
、５００U／mlのＩＦＮα又は１ng／mlのＩＬ−５を添加するか、又は細胞を刺
激しないまま、２４時間後に培地を除去し同じ刺激又は刺激なしのＨＡＴ培地に
置換した。細胞をＨＡＴ＋ＩＬ−５でインキュベートすると、約１４日後、小さ
なコロニーが現れた。ＨＡＴ培地単独中での増殖の結果明確なコロニー形成をし
たトランスフェクションはなかったが、一方全てのトランスフェクションにおい
て、５００U／mlのＩＦＮαでのインキュベーションは、融合した単一層を生じ
る結果となった。単一コロニーの単離は、上述したのと本質的に同じ方法で行っ
た。ＩＬ−５に対する単一コロニーの反応性の程度を、ＨＡＴ培地単独中での細
胞死に対する、ＩＬ−５で補足したＨＡＴ培地中での増殖を試験することによっ
て測定した。別法として、ＩＬ−５で補足された培地を含む６−チオグアニン（
６−ＴＧ）中の細胞死に対する、６−ＴＧを含む培地中における細胞増殖も測定
した。反転式顕微鏡を用いて、２週間の期間、生存又は死を視覚的に測定した。
ＩＬ−５に対する最良の反応をするクローンを、２ｆＴＧＨ ＩＬ−５Ｒα／Ｒ
２−２＋βｃ／Ｒ１クローンＥとした。
【００５３】 この段階で開発された細胞は、外因的に添加されたリガンドの評価のためのア
ッセイシステムとしてすでに提供され得る。
ッセイシステムとしてすでに提供され得る。
【００５４】 II．１．２．ｐ６−１６ＳＥＡＰの構築及び２ｆＴＧＨ−６−１６ＳＥＡＰ安定
細胞株の開発 安定なコロニーの形成はキメラレセプターの活性化を試験するための信頼でき
そして再現可能なアッセイであるが、非常に時間を費やし、レセプター機能の定
量には用いることができないという欠点が悩みである。それゆえ、我々は、６−
１６プロモーターが、ｐＳＥＡＰベクター（Tropix）の分泌アルカリホスファタ
ーゼ（ＳＥＡＰ）をコードするレポーター遺伝子の上流にクローン化されたプラ
スミドを構築した。６−１６プロモーター全体を含むＨｉｎｄIII断片をプラス
ミド６−１６luci（Sandra Pellegrini, Institut Pasteur, Parisの好意による
）から単離し、ＨｉｎｄIIIで開環したｐＳＥＡＰベクターに、６−１６プロモ
ーターがＳＥＡＰ遺伝子の前方になるように挿入した。生成したプラスミドをｐ
６−１６ＳＥＡＰと名付けた。
細胞株の開発 安定なコロニーの形成はキメラレセプターの活性化を試験するための信頼でき
そして再現可能なアッセイであるが、非常に時間を費やし、レセプター機能の定
量には用いることができないという欠点が悩みである。それゆえ、我々は、６−
１６プロモーターが、ｐＳＥＡＰベクター（Tropix）の分泌アルカリホスファタ
ーゼ（ＳＥＡＰ）をコードするレポーター遺伝子の上流にクローン化されたプラ
スミドを構築した。６−１６プロモーター全体を含むＨｉｎｄIII断片をプラス
ミド６−１６luci（Sandra Pellegrini, Institut Pasteur, Parisの好意による
）から単離し、ＨｉｎｄIIIで開環したｐＳＥＡＰベクターに、６−１６プロモ
ーターがＳＥＡＰ遺伝子の前方になるように挿入した。生成したプラスミドをｐ
６−１６ＳＥＡＰと名付けた。
【００５５】 ６−１６ＳＥＡＰをトランスフェクトした安定な２ｆＴＧＨ細胞株を、２ｆＴ
ＧＨ細胞において、２０μgのｐ６−１６ＳＥＡＰと２μgのｐＢＳｐａｃ／ｄｅ
ｌｔａｐ（Belgian Coodinated Collections of Microooganisms, BCCMより入手
した）との共トランスフェクションによって得た。後者のプラスミドは、構造的
ＳＶ４０初期プロモーターの制御下にあるピューロマイシン耐性のための遺伝子
を有する。ピューロマイシンでの選択は、この技術に記載された方法を基礎とし
て行った。ピューロマイシン耐性細胞株の選択のための最適濃度として、我々は
３μgピューロマイシン／mlを選んだ。
ＧＨ細胞において、２０μgのｐ６−１６ＳＥＡＰと２μgのｐＢＳｐａｃ／ｄｅ
ｌｔａｐ（Belgian Coodinated Collections of Microooganisms, BCCMより入手
した）との共トランスフェクションによって得た。後者のプラスミドは、構造的
ＳＶ４０初期プロモーターの制御下にあるピューロマイシン耐性のための遺伝子
を有する。ピューロマイシンでの選択は、この技術に記載された方法を基礎とし
て行った。ピューロマイシン耐性細胞株の選択のための最適濃度として、我々は
３μgピューロマイシン／mlを選んだ。
【００５６】 単一コロニーを、９６−ウェルマイクロタイタープレート中での有限希釈によ
って単離し、ＩＦＮα又はβで処理した後、無刺激のものに対してＳＥＡＰ産生
について試験した。最適刺激範囲に基づいて、２ｆＴＧＨ−６−１６ＳＥＡＰク
ローン２及び２ｆｔＧＨ−６−１６ＳＥＡＰクローン５を選択した。
って単離し、ＩＦＮα又はβで処理した後、無刺激のものに対してＳＥＡＰ産生
について試験した。最適刺激範囲に基づいて、２ｆＴＧＨ−６−１６ＳＥＡＰク
ローン２及び２ｆｔＧＨ−６−１６ＳＥＡＰクローン５を選択した。
【００５７】 II．１．３ 一時的遺伝子導入アッセイにおけるＩＬ−５による６−１６ＳＥＡ
Ｐレポーターの活性化 １０μgのｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ２−２及び１０μg
のｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−βｃ／ＩＦＮａＲ１を２ｆｔＧＨ細胞中に、１０μgの
プラスミドｐ６−１６ＳＥＡＰと一緒に共トランスフェクトした。トランスフェ
クションは、リン酸カルシウム法（Graham and Van der Eb, 1973）によって行
った。沈殿を１ml中に作製し、６−ウェルのマイクロタイタープレート中の４つ
のウェルに等量に分配して（１６５μl／１０5細胞／ウェル）、細胞上に一晩残
した。翌日、細胞を２回洗浄し（２×ダルベッコのＰＢＳ）、そしてさらにＤＭ
ＥＭ培地中で２４時間増殖した。１日後、無刺激の、ＩＦＮβ（５００U／ml；
ＩＦＮｂ１ａ、P. Hochman, Biogen, Cambridgeの好意による）又はＩＬ−５（
１及び２ng／ml）を添加して、細胞をさらに２４時間放置した。最後に、それぞ
れのウェルからの培地のサンプルを採取し、ＳＥＡＰ活性についてのアッセイを
Phospha-Light kit（Tropix）で、ＣＳＰＤを発光基質として用いて行ない、光
産生をTopcountルミノメーター（Canberra-Packard）で測定した。未処理の細胞
との比較により、細胞をＩＦＮβで処理したときには未処理の細胞に比べて２．
５倍ＳＥＡＰ活性が増加しており、１又は２ng／mlのＩＬ−５で刺激したときに
はそれぞれ５又は６倍増加したことが示された（図１）。
Ｐレポーターの活性化 １０μgのｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ２−２及び１０μg
のｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−βｃ／ＩＦＮａＲ１を２ｆｔＧＨ細胞中に、１０μgの
プラスミドｐ６−１６ＳＥＡＰと一緒に共トランスフェクトした。トランスフェ
クションは、リン酸カルシウム法（Graham and Van der Eb, 1973）によって行
った。沈殿を１ml中に作製し、６−ウェルのマイクロタイタープレート中の４つ
のウェルに等量に分配して（１６５μl／１０5細胞／ウェル）、細胞上に一晩残
した。翌日、細胞を２回洗浄し（２×ダルベッコのＰＢＳ）、そしてさらにＤＭ
ＥＭ培地中で２４時間増殖した。１日後、無刺激の、ＩＦＮβ（５００U／ml；
ＩＦＮｂ１ａ、P. Hochman, Biogen, Cambridgeの好意による）又はＩＬ−５（
１及び２ng／ml）を添加して、細胞をさらに２４時間放置した。最後に、それぞ
れのウェルからの培地のサンプルを採取し、ＳＥＡＰ活性についてのアッセイを
Phospha-Light kit（Tropix）で、ＣＳＰＤを発光基質として用いて行ない、光
産生をTopcountルミノメーター（Canberra-Packard）で測定した。未処理の細胞
との比較により、細胞をＩＦＮβで処理したときには未処理の細胞に比べて２．
５倍ＳＥＡＰ活性が増加しており、１又は２ng／mlのＩＬ−５で刺激したときに
はそれぞれ５又は６倍増加したことが示された（図１）。
【００５８】 II．２ エリスロポエチンは、Ｅｐｏ−Ｒ／ＩＦＮａＲキメラレセプターを介し
て６−１６プロモーターを活性化することができる II．２．１ 一時的トランスフェクションアッセイにおける６−１６ＳＥＡＰの
活性化 ２０μgのｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＥＰＯ−Ｒ／ＩＦＮａＲ２−２単独、２０μg
のｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＥＰＯ−Ｒ／ＩＦＮＲ１単独、１０μgのｐＳＶ−ＳＰ
ＯＲＴ−ＥＰＯ−Ｒ／ＩＦＮＲ１＋１０μgのｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＥＰＯ−Ｒ
／ＩＦＮａＲ２−２又は２０μgのｐＵＣ１８単独（模擬；Pharmacia）を２ｆｔ
ＧＨ−６−１６ＳＥＡＰクローン２の細胞に、リン酸カルシウム法（Graham and
Van der Eb, 1973）を用いてトランスフェクトした。沈殿を１ml中に作製し、
細胞上に６時間放置した（５×１０5細胞／トランスフェクション／ぺトリ皿）
。皿をダルベッコのＰＢＳで２回洗浄し、細胞をさらにＤＭＥＭ中で増殖した。
２４時間後、各々のトランスフェクションからの細胞を５mlの０．０５％トリプ
シン／０．０２％ＥＤＴＡ溶液（Life Technologies）でトリプシン化して、６
−ウェルマイクロタイタープレートの３つのウェルに播種した。１日後、無刺激
で、ＩＦＮα（５００U／ml）又はエリスロポエチン（ＥＰＯ、０．５U／ml、R&
D Systems）を添加して、細胞をさらに２４時間放置した。最後に、それぞれの
ウェルからの培地のサンプルを採取し、ＳＥＡＰ活性についてのアッセイをPhos
pha-Light kit（Tropix）で、ＣＳＰＤを発光基質として用いて行ない、光産生
をTopcountルミノメーター（Canberra-Packard）で測定した。未処理の細胞との
比較により、ＩＦＮβ又はＩＦＮαで処理したときにはＳＥＡＰ活性が４倍増加
していることが示された。ＥＰＯ−Ｒ／ＩＦＮａＲ１キメラ単独でトランスフェ
クトされた細胞においてはＥＰＯによるＳＥＡＰの誘導はみられなかった。しか
しながら、ＥＰＯ−Ｒ／ＩＦＮＲ１＋ＥＰＯ−Ｒ／ＩＦＮａＲ２−２構築物又は
ＥＰＯ−Ｒ／ＩＦＮａＲ２−２構築物単独（図２）でトランスフェクトした細胞
ではＥＰＯによる８〜９倍のＳＥＡＰ活性の誘導が観察され、このことは少なく
ともＥＰＯ−Ｒ／ＩＦＮａＲ２−２はＥＰＯによって活性化され、シグナルを伝
達し、その結果６−１６プロモーターの活性化が起こることを示唆している。
て６−１６プロモーターを活性化することができる II．２．１ 一時的トランスフェクションアッセイにおける６−１６ＳＥＡＰの
活性化 ２０μgのｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＥＰＯ−Ｒ／ＩＦＮａＲ２−２単独、２０μg
のｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＥＰＯ−Ｒ／ＩＦＮＲ１単独、１０μgのｐＳＶ−ＳＰ
ＯＲＴ−ＥＰＯ−Ｒ／ＩＦＮＲ１＋１０μgのｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＥＰＯ−Ｒ
／ＩＦＮａＲ２−２又は２０μgのｐＵＣ１８単独（模擬；Pharmacia）を２ｆｔ
ＧＨ−６−１６ＳＥＡＰクローン２の細胞に、リン酸カルシウム法（Graham and
Van der Eb, 1973）を用いてトランスフェクトした。沈殿を１ml中に作製し、
細胞上に６時間放置した（５×１０5細胞／トランスフェクション／ぺトリ皿）
。皿をダルベッコのＰＢＳで２回洗浄し、細胞をさらにＤＭＥＭ中で増殖した。
２４時間後、各々のトランスフェクションからの細胞を５mlの０．０５％トリプ
シン／０．０２％ＥＤＴＡ溶液（Life Technologies）でトリプシン化して、６
−ウェルマイクロタイタープレートの３つのウェルに播種した。１日後、無刺激
で、ＩＦＮα（５００U／ml）又はエリスロポエチン（ＥＰＯ、０．５U／ml、R&
D Systems）を添加して、細胞をさらに２４時間放置した。最後に、それぞれの
ウェルからの培地のサンプルを採取し、ＳＥＡＰ活性についてのアッセイをPhos
pha-Light kit（Tropix）で、ＣＳＰＤを発光基質として用いて行ない、光産生
をTopcountルミノメーター（Canberra-Packard）で測定した。未処理の細胞との
比較により、ＩＦＮβ又はＩＦＮαで処理したときにはＳＥＡＰ活性が４倍増加
していることが示された。ＥＰＯ−Ｒ／ＩＦＮａＲ１キメラ単独でトランスフェ
クトされた細胞においてはＥＰＯによるＳＥＡＰの誘導はみられなかった。しか
しながら、ＥＰＯ−Ｒ／ＩＦＮＲ１＋ＥＰＯ−Ｒ／ＩＦＮａＲ２−２構築物又は
ＥＰＯ−Ｒ／ＩＦＮａＲ２−２構築物単独（図２）でトランスフェクトした細胞
ではＥＰＯによる８〜９倍のＳＥＡＰ活性の誘導が観察され、このことは少なく
ともＥＰＯ−Ｒ／ＩＦＮａＲ２−２はＥＰＯによって活性化され、シグナルを伝
達し、その結果６−１６プロモーターの活性化が起こることを示唆している。
【００５９】 II．２．２．ＥｐｏＲ／ＩＦＮａＲ２−２キメラを安定に発現する２ｆＴＧＨ細
胞の開発 ２ｆＴＧＨ−６−１６ＳＥＡＰクローン５の細胞を、２０μgのｐＳＶ−ＳＰ
ＯＲＴ−ＥｐｏＲ／Ｒ２−２及び２μgのｐｃＤＮＡ１／Ｎｅｏでトランスフェ
クトした。リン酸カルシウム沈殿を Graham and Van der Eb(1973)の方法に従っ
て１mlに作製し、細胞上に一晩放置した（８×１０5細胞／トランスフェクショ
ン／ぺトリ皿）。その後、皿をＰＢＳで２回洗浄し、細胞をＤＭＥＭに入れた。
４８時間後、ＤＭＥＭ培地＋Ｇ４１８（４００μg／ml）を添加し、１４日まで
の期間、３〜４日毎に新しものにした。個々の細胞は９６ウェルのマイクロタイ
タープレート中での有限希釈によって単離した。Ｅｐｏに対する単一コロニーの
反応性の度合いをＥｐｏで補足したＨＡＴ培地中での増殖を調べることによって
測定した。別法として、Ｅｐｏで補足された培地を含む６−チオグアニン（６−
ＴＧ）中の細胞死に対する、６−ＴＧを含む培地中における細胞増殖も測定した
。反転式顕微鏡を用いて、２週間の期間、生存又は死を視覚的に測定した。さら
に、２ｆＴＧＨ６−１６ＳＥＡＰクローン５の細胞は、安定にトランスフェクト
された６−１６ＳＥＡＰ構築物を有し、ＳＥＡＰ誘導の測定による、Ｅｐｏ反応
性の迅速な測定を可能としている。３つのアッセイに基づいて、２ｆＴＧＨ−６
−１６ＳＥＡＰＥｐｏＲ／２−２クローン４は、Ｅｐｏに対して最高の反応性を
示し、更なる解析のために選択した。
胞の開発 ２ｆＴＧＨ−６−１６ＳＥＡＰクローン５の細胞を、２０μgのｐＳＶ−ＳＰ
ＯＲＴ−ＥｐｏＲ／Ｒ２−２及び２μgのｐｃＤＮＡ１／Ｎｅｏでトランスフェ
クトした。リン酸カルシウム沈殿を Graham and Van der Eb(1973)の方法に従っ
て１mlに作製し、細胞上に一晩放置した（８×１０5細胞／トランスフェクショ
ン／ぺトリ皿）。その後、皿をＰＢＳで２回洗浄し、細胞をＤＭＥＭに入れた。
４８時間後、ＤＭＥＭ培地＋Ｇ４１８（４００μg／ml）を添加し、１４日まで
の期間、３〜４日毎に新しものにした。個々の細胞は９６ウェルのマイクロタイ
タープレート中での有限希釈によって単離した。Ｅｐｏに対する単一コロニーの
反応性の度合いをＥｐｏで補足したＨＡＴ培地中での増殖を調べることによって
測定した。別法として、Ｅｐｏで補足された培地を含む６−チオグアニン（６−
ＴＧ）中の細胞死に対する、６−ＴＧを含む培地中における細胞増殖も測定した
。反転式顕微鏡を用いて、２週間の期間、生存又は死を視覚的に測定した。さら
に、２ｆＴＧＨ６−１６ＳＥＡＰクローン５の細胞は、安定にトランスフェクト
された６−１６ＳＥＡＰ構築物を有し、ＳＥＡＰ誘導の測定による、Ｅｐｏ反応
性の迅速な測定を可能としている。３つのアッセイに基づいて、２ｆＴＧＨ−６
−１６ＳＥＡＰＥｐｏＲ／２−２クローン４は、Ｅｐｏに対して最高の反応性を
示し、更なる解析のために選択した。
【００６０】 III．内因的に産生されたリガンドによるキメラレセプターの活性化 III．１．ＩＬ−５の真核構造的発現のためのベクターｐＥＦＢｏｓ−ｈＩＬ−
５ｓｙｎ及びｐＭＥＴ７−ｈＩＬ−５ｓｙｎの構築 ｈＩＬ−５ｓｙｎの遺伝子をｐＧＥＭ１−ｈＩＬ−５ｓｙｎベクター（Traver
nier et al. 1989）から、ＳａｌＩ消化及びアガロースゲル電気泳動によって単
離した。フラグメントをＳａｌＩで開環したｐＥＦＢＯＳベクター（Nagata, S.
, Osaka Bioscience Institute, Japanの好意による）にクローン化した。その
結果、ｈＩＬ−５ｓｙｎ遺伝子は、ヒト成長因子１ａ（ＨＥＦ１ａ、Mizushima
et al., 1990）のプロモーターの下流にクローン化され、生じたプラスミドをｐ
ＥＦＢｏｓ−ｈＩＬ−５ｓｙｎと名付けた。加えて、該ＳａｌＩフラグメントを
ｐＭＥＴ７ＭＣＳベクターにもクローン化した。このベクターは、プラスミドｐ
ＭＥＴ７−Ｌｒｌｏ（L. Tartaglia, Millenium, Cambridgeの好意による）にお
けるレプチンレセプターロングフォーム（Ｌｒｌｏ）をコードするＤＮＡを、オ
リゴヌクレオチドＭＢＵ−Ｏ−１８７及びＭＢＵ−Ｏ−１８８（表１）のハイブ
リダイゼーションによって形成される、マルチクローニングサイト（ＳａｌＩ−
ＢｇｌII−ＥｃｏＲＶ−ＢｓｔＥII−ＡｇｅＩ−ＸｈｏＩ−ＸｂａＩ）をコード
するＤＮＡで置換した。ここで、ｈＩＬ−５ｓｙｎ遺伝子はハイブリッドＳＲα
プロモーター（Takebe et al）の下流にクローン化し、そのプラスミドをｐＭＥ
Ｔ７−ｈＩＬ−５ｓｙｎと名付けた。
５ｓｙｎ及びｐＭＥＴ７−ｈＩＬ−５ｓｙｎの構築 ｈＩＬ−５ｓｙｎの遺伝子をｐＧＥＭ１−ｈＩＬ−５ｓｙｎベクター（Traver
nier et al. 1989）から、ＳａｌＩ消化及びアガロースゲル電気泳動によって単
離した。フラグメントをＳａｌＩで開環したｐＥＦＢＯＳベクター（Nagata, S.
, Osaka Bioscience Institute, Japanの好意による）にクローン化した。その
結果、ｈＩＬ−５ｓｙｎ遺伝子は、ヒト成長因子１ａ（ＨＥＦ１ａ、Mizushima
et al., 1990）のプロモーターの下流にクローン化され、生じたプラスミドをｐ
ＥＦＢｏｓ−ｈＩＬ−５ｓｙｎと名付けた。加えて、該ＳａｌＩフラグメントを
ｐＭＥＴ７ＭＣＳベクターにもクローン化した。このベクターは、プラスミドｐ
ＭＥＴ７−Ｌｒｌｏ（L. Tartaglia, Millenium, Cambridgeの好意による）にお
けるレプチンレセプターロングフォーム（Ｌｒｌｏ）をコードするＤＮＡを、オ
リゴヌクレオチドＭＢＵ−Ｏ−１８７及びＭＢＵ−Ｏ−１８８（表１）のハイブ
リダイゼーションによって形成される、マルチクローニングサイト（ＳａｌＩ−
ＢｇｌII−ＥｃｏＲＶ−ＢｓｔＥII−ＡｇｅＩ−ＸｈｏＩ−ＸｂａＩ）をコード
するＤＮＡで置換した。ここで、ｈＩＬ−５ｓｙｎ遺伝子はハイブリッドＳＲα
プロモーター（Takebe et al）の下流にクローン化し、そのプラスミドをｐＭＥ
Ｔ７−ｈＩＬ−５ｓｙｎと名付けた。
【００６１】 III．サルＥｐｏの真核構造的発現のための、ｐＭＥＴ−ｍｏＥｐｏの構築 プラスミドｐＭＦＥｐｏ２（Dr. C. Laker, Heinrich-Pette-institutの好意
による）を、コザック配列及びＥｃｏＲＩ部位を含む順方向プライマー（GGAATT
CGCCAGGCGCCACCATGGGGGTGCACGAATGTCCTG）及びＸｈｏＩ部位を含む逆方向プライ
マー（GCCTCGAGTCATCTGTCCCCTCTCCTGCAG）を用いたサルＥｐｏのｃＤＮＡのＰＣ
Ｒ増幅のインプットとして用いた。ＰＣＲは、Ｐｆｕポリメラーゼ（Stratagene
）で行ない、得られた±６００ｂｐをゲル切り出しで精製し、ＥｃｏＲＩ−Ｘｈ
ｏＩで消化した。このフラグメントを、ｐＭＥＴ７ｍβｃ／ＳＥＡＰベクターに
挿入した。このプラスミドは、ＳＲαプロモーター下流にキメラタンパク質（マ
ウスＩＬ−５β共通（ｍβｃ）鎖のＣ末端に融合されたアルカリホスファターゼ
）をコードする。このｍβｃ／ＳＥＡＰ遺伝子をＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ消化によ
って除去し、ｍｏＥｐｏフラグメントの、開環されたｐＭＥＴ７ベクターへのラ
イゲーションを可能とした。生成したプラスミドをｐＭＥＴ７−ｍｏＥｐｏと名
付けた。
による）を、コザック配列及びＥｃｏＲＩ部位を含む順方向プライマー（GGAATT
CGCCAGGCGCCACCATGGGGGTGCACGAATGTCCTG）及びＸｈｏＩ部位を含む逆方向プライ
マー（GCCTCGAGTCATCTGTCCCCTCTCCTGCAG）を用いたサルＥｐｏのｃＤＮＡのＰＣ
Ｒ増幅のインプットとして用いた。ＰＣＲは、Ｐｆｕポリメラーゼ（Stratagene
）で行ない、得られた±６００ｂｐをゲル切り出しで精製し、ＥｃｏＲＩ−Ｘｈ
ｏＩで消化した。このフラグメントを、ｐＭＥＴ７ｍβｃ／ＳＥＡＰベクターに
挿入した。このプラスミドは、ＳＲαプロモーター下流にキメラタンパク質（マ
ウスＩＬ−５β共通（ｍβｃ）鎖のＣ末端に融合されたアルカリホスファターゼ
）をコードする。このｍβｃ／ＳＥＡＰ遺伝子をＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ消化によ
って除去し、ｍｏＥｐｏフラグメントの、開環されたｐＭＥＴ７ベクターへのラ
イゲーションを可能とした。生成したプラスミドをｐＭＥＴ７−ｍｏＥｐｏと名
付けた。
【００６２】 III．３．キメラレセプターは、内因的に産生されたリガンドに基づく生存選択
を可能とする プラスミドｐＥＦＢＯＳ−ｈＩＬ−５ｓｙｎ又はｐＵＣ１８ベクター（模擬）
を、ＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ２−２＋βｃ／ＩＦＮａＲ１キメラを安定に発言
する２ｆｔＧＨ細胞（２ｆｔＧＨクローンＣ細胞）のトランスフェクションに用
いた。トランスフェクションは、リン酸カルシウム法（Graham and Van der Eb,
1973）によって一晩行った。沈殿を１mlに作製し細胞上に一晩放置した（５×
１０5細胞／トランスフェクション／ぺトリ皿）。翌日、細胞をダルベッコのＰ
ＢＳで２回洗浄した。２日後、細胞をＨＡＴ培地単独上でインキュベートし、そ
の後、細胞の生存を反転式顕微鏡を用いて視覚的に追った。３日後、ｐＥＦＢＯ
Ｓ−ｈＩＬ−５ｓｙｎ及び模擬トランスフェクションした細胞の間で、細胞融合
の明らかな差異が見られた。ｐＥＦＢＯＳ−ｈＩＬ−５ｓｙｎでトランスフェク
ションした細胞をトリプシン化して有限希釈を９６−ウェルマイクロタイタープ
レート中で行った。ＩＬ−５補足なしのＨＡＴ培地中で生き残った６つのコロニ
ーを単離することができたことは、これらの細胞が、ＩＬ−５を産生し、オート
クリン様式でキメラレセプターを刺激したことを示している。
を可能とする プラスミドｐＥＦＢＯＳ−ｈＩＬ−５ｓｙｎ又はｐＵＣ１８ベクター（模擬）
を、ＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ２−２＋βｃ／ＩＦＮａＲ１キメラを安定に発言
する２ｆｔＧＨ細胞（２ｆｔＧＨクローンＣ細胞）のトランスフェクションに用
いた。トランスフェクションは、リン酸カルシウム法（Graham and Van der Eb,
1973）によって一晩行った。沈殿を１mlに作製し細胞上に一晩放置した（５×
１０5細胞／トランスフェクション／ぺトリ皿）。翌日、細胞をダルベッコのＰ
ＢＳで２回洗浄した。２日後、細胞をＨＡＴ培地単独上でインキュベートし、そ
の後、細胞の生存を反転式顕微鏡を用いて視覚的に追った。３日後、ｐＥＦＢＯ
Ｓ−ｈＩＬ−５ｓｙｎ及び模擬トランスフェクションした細胞の間で、細胞融合
の明らかな差異が見られた。ｐＥＦＢＯＳ−ｈＩＬ−５ｓｙｎでトランスフェク
ションした細胞をトリプシン化して有限希釈を９６−ウェルマイクロタイタープ
レート中で行った。ＩＬ−５補足なしのＨＡＴ培地中で生き残った６つのコロニ
ーを単離することができたことは、これらの細胞が、ＩＬ−５を産生し、オート
クリン様式でキメラレセプターを刺激したことを示している。
【００６３】 III．４．ＩＬ−５オートクリンループを生み出すために要求される、ｐＥＦＢ
ＯＳ−ｈＩＬ−５ｓｙｎＤＮＡの最小量の測定 ｃＤＮＡライブラリ中の無関係なｃＤＮＡのプールにおける、関係するｃＤＮ
Ａの発見は、無関係なベクター中のｈＩＬ−５に対する遺伝子を含む発現ベクタ
ーの連続的な希釈を作製することによって模倣した。無関係なＤＮＡ（ｐｃＤＮ
Ａ．３）中の１：１０希釈のｐＥＦＢＯＳ−ｈＩＬ−５ｓｙｎＤＮＡを準備した
：１．５（１／１０）、０．１５（１／１００）、０．０１５（１／１０００）
、及び０．００１５（１／１００００）μgのｐＥＦＢＯＳ−ｈＩＬ−５ｓｙｎ
ＤＮＡを、１５μgのｐｃＤＮＡ３のＤＮＡに添加し、ＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａ
Ｒ２−２＋βｃ／ＩＦＮａＲ１クローンＣ細胞にトランスフェクションした。陽
性及び陰性対照を、それぞれ１５μgのｐＥＦＢＯＳ−ｈＩＬ−５ｓｙｎ及び１
５μgのｐｃＤＮＡ３とした。トランスフェクションは、リン酸カルシウム法（G
raham and Van der Eb, 1973）に従った。沈殿を１ml中に作製し、細胞上に一晩
放置した（５×１０5細胞／トランスフェクション／ぺトリ皿）。皿を（ダルベ
ッコのＰＢＳで２回）洗浄し、ＤＭＥＭ培地を添加し、２４時間の後ＨＡＴ培地
に変更した。細胞を、反転式顕微鏡を用いて視覚的に追い、トランスフェクショ
ン後１５日後に、全てのペトリ皿について典型的な領域を写真撮影した。全ての
ペトリ皿はｐＥＦＢＯＳ−ｈＩＬ−５ｓｙｎ希釈物の１つでトランスフェクショ
ンされた細胞を含んでおり、陰性対照と比較して細胞数において著しい増加を示
した（図３）したがって、１５μgの全ＤＮＡ中の１．５ngのｐＥＦＢＯＳ−ｈ
ＩＬ−５ｓｙｎ（１：１０4希釈）程度のトランスフェクションは、ＨＡＴ倍地
中での細胞の生存を可能とするオートクリンループを生じるのに十分である。
ＯＳ−ｈＩＬ−５ｓｙｎＤＮＡの最小量の測定 ｃＤＮＡライブラリ中の無関係なｃＤＮＡのプールにおける、関係するｃＤＮ
Ａの発見は、無関係なベクター中のｈＩＬ−５に対する遺伝子を含む発現ベクタ
ーの連続的な希釈を作製することによって模倣した。無関係なＤＮＡ（ｐｃＤＮ
Ａ．３）中の１：１０希釈のｐＥＦＢＯＳ−ｈＩＬ−５ｓｙｎＤＮＡを準備した
：１．５（１／１０）、０．１５（１／１００）、０．０１５（１／１０００）
、及び０．００１５（１／１００００）μgのｐＥＦＢＯＳ−ｈＩＬ−５ｓｙｎ
ＤＮＡを、１５μgのｐｃＤＮＡ３のＤＮＡに添加し、ＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａ
Ｒ２−２＋βｃ／ＩＦＮａＲ１クローンＣ細胞にトランスフェクションした。陽
性及び陰性対照を、それぞれ１５μgのｐＥＦＢＯＳ−ｈＩＬ−５ｓｙｎ及び１
５μgのｐｃＤＮＡ３とした。トランスフェクションは、リン酸カルシウム法（G
raham and Van der Eb, 1973）に従った。沈殿を１ml中に作製し、細胞上に一晩
放置した（５×１０5細胞／トランスフェクション／ぺトリ皿）。皿を（ダルベ
ッコのＰＢＳで２回）洗浄し、ＤＭＥＭ培地を添加し、２４時間の後ＨＡＴ培地
に変更した。細胞を、反転式顕微鏡を用いて視覚的に追い、トランスフェクショ
ン後１５日後に、全てのペトリ皿について典型的な領域を写真撮影した。全ての
ペトリ皿はｐＥＦＢＯＳ−ｈＩＬ−５ｓｙｎ希釈物の１つでトランスフェクショ
ンされた細胞を含んでおり、陰性対照と比較して細胞数において著しい増加を示
した（図３）したがって、１５μgの全ＤＮＡ中の１．５ngのｐＥＦＢＯＳ−ｈ
ＩＬ−５ｓｙｎ（１：１０4希釈）程度のトランスフェクションは、ＨＡＴ倍地
中での細胞の生存を可能とするオートクリンループを生じるのに十分である。
【００６４】 III．５．ＩＬ−５オートクリンループの発生に必要なｐＭＥＴ７−ｈｉＬ−５
ｓｙｎＤＮＡの最少量の決定 ｐＭＥＴ７−ｈｉＬ−５ｓｙｎＤＮＡの無関係ＤＮＡ（ｐＣＤＮＡ３）中の希
釈系列を準備した：４ng（１／１０4）、４００pg（１／１０5）、及び４０pg（
１／１０6）のｐＭＥＴ７−ｈｉＬ−５ｓｙｎＤＮＡを、４０ngのｐＣＤＮＡ３
ＤＮＡに添加して、２ｆｔＧＨＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ２−２＋βｃ／ＩＦＮ
ａＲ１クローンＥ細胞（ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ２−２
＋ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−βｃ／ＩＦＮａＲ１で安定にトランスフェクションされ
た）にトランスフェクションした。陰性対照として、４０μgのｐＣＤＮＡ３単
独を用いた。１０μgのｐ６−１６ＳＥＡＰを、全てのサンプルに添加した。全
ての沈殿はリン酸カルシウム法（Graham and Van der Eb, 1973）によって１ｍ
ｌに調製し、そこから１６５μl（全ＤＮＡ６．８μg）を６−ウェルのマイクロ
タイタープレートのウェル中で１０5個の細胞上にもたらした。次に、沈殿を一
晩細胞上に放置し、その後ダルベッコのＰＢＳで２回洗浄した。細胞をさらにＤ
ＭＥＭ培地中で増殖した。２４時間後、培地サンプルをそれぞれのウェルから取
り出しホスファ−ライトアッセイ（Tropix）を用いてＳＥＡＰ活性を測定した。
発光をトップカウント発光測定器で測定した。６．８μgの全ＤＮＡ中の６８pg
のｐＭＥＴ７−ｈｉＬ−５ｓｙｎ（ｐＭＥＴ７−ｈｉＬ−５ｓｙｎＤＮＡの１／
１０5希釈）でのトランスフェクションであっても、陰性対照と比較して、まだ
明白なＳＥＡＰ産生を生じる結果となったことは、オートクリンループが形成さ
れたことを示している（図４）。
ｓｙｎＤＮＡの最少量の決定 ｐＭＥＴ７−ｈｉＬ−５ｓｙｎＤＮＡの無関係ＤＮＡ（ｐＣＤＮＡ３）中の希
釈系列を準備した：４ng（１／１０4）、４００pg（１／１０5）、及び４０pg（
１／１０6）のｐＭＥＴ７−ｈｉＬ−５ｓｙｎＤＮＡを、４０ngのｐＣＤＮＡ３
ＤＮＡに添加して、２ｆｔＧＨＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ２−２＋βｃ／ＩＦＮ
ａＲ１クローンＥ細胞（ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ２−２
＋ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−βｃ／ＩＦＮａＲ１で安定にトランスフェクションされ
た）にトランスフェクションした。陰性対照として、４０μgのｐＣＤＮＡ３単
独を用いた。１０μgのｐ６−１６ＳＥＡＰを、全てのサンプルに添加した。全
ての沈殿はリン酸カルシウム法（Graham and Van der Eb, 1973）によって１ｍ
ｌに調製し、そこから１６５μl（全ＤＮＡ６．８μg）を６−ウェルのマイクロ
タイタープレートのウェル中で１０5個の細胞上にもたらした。次に、沈殿を一
晩細胞上に放置し、その後ダルベッコのＰＢＳで２回洗浄した。細胞をさらにＤ
ＭＥＭ培地中で増殖した。２４時間後、培地サンプルをそれぞれのウェルから取
り出しホスファ−ライトアッセイ（Tropix）を用いてＳＥＡＰ活性を測定した。
発光をトップカウント発光測定器で測定した。６．８μgの全ＤＮＡ中の６８pg
のｐＭＥＴ７−ｈｉＬ−５ｓｙｎ（ｐＭＥＴ７−ｈｉＬ−５ｓｙｎＤＮＡの１／
１０5希釈）でのトランスフェクションであっても、陰性対照と比較して、まだ
明白なＳＥＡＰ産生を生じる結果となったことは、オートクリンループが形成さ
れたことを示している（図４）。
【００６５】 III．６．ｐＡＣＧＧＳ−ＥＬ４ｃＤＮＡライブラリーにおける希釈による、Ｉ
Ｌ−５オートクリンループの発生に必要とされるｐＭＥＴ７−ｈｉＬ−５ｓｙｎ
ＤＮＡの最少量の決定 無関係ｃＤＮＡの膨大なプール中での、関係するリガンドをコードするｃＤＮ
Ａの発生を光学的に模倣するため、我々はｃＤＮＡライブラリー中のｐＭＥＴ７
−ｈｉＬ−５ｓｙｎプラスミドを希釈した。このライブラリーは、マウスＥＬ４
リンパ腫細胞株から作られ、そしてｃＤＮＡｓは、ニワトリβアクチンプロモー
ターの制御下において、ベクターｐＡＣＧＧＳ中に挿入された。１２５ng（１／
１０2）、１２．５ng（1／１０3）、１．２５ng（１／１０4）、１２５pg(１／
１０5)、４２pg(１／３×１０5)及び１２．５pg（１／１０6）のｐＭＥＴ７−ｍ
ｏＥｐｏＤＮＡを、９．４μgのｐＡＣＧＧＳ−ＥＬ４ｃＤＮＡ及び３．１μgの
ｐ６−１６ＳＥＡＰに添加した。陰性コントロールとして、９．４μgのｐＡＣ
ＧＧＳ−ＥＬ４ｃＤＮＡ＋３．１μgのｐ６−１６ＳＥＡＰをトランスフェクシ
ョンした。全ての沈殿はリン酸カルシウム法（Graham and Van der Eb, 1973）
によって５００μlに調製し、そこから１６５μl（±４μgの全ＤＮＡ）を６−
ウェルのマイクロタイタープレートのウェル中で１０5個の２ｆＴＧＨ ６−１
６ＳＥＡＰ ＥｐｏＲ／ＩＦＮａＲ２−２クローン４の細胞上にもたらした。沈
殿を一晩細胞上に放置し、その後ダルベッコのＰＢＳで２回洗浄した。細胞をさ
らにＤＭＥＭ培地中で増殖した。１８時間後、培地サンプルをそれぞれのウェル
から取り出しホスファ−ライトアッセイ（Tropix）を用いてＳＥＡＰ活性を測定
した。発光をトップカウント発光測定器で測定した。４μgの全ＤＮＡ中の４０
０pgのｐＭＥＴ７−ｈｉＬ−５ｓｙｎ（１／１０4希釈）でのトランスフェクシ
ョンであっても、陰性対照と比較して、まだ明白なＳＥＡＰ産生を生じる結果と
なったことは、オートクリンループが形成されたことを示している（図５ａ）。
Ｌ−５オートクリンループの発生に必要とされるｐＭＥＴ７−ｈｉＬ−５ｓｙｎ
ＤＮＡの最少量の決定 無関係ｃＤＮＡの膨大なプール中での、関係するリガンドをコードするｃＤＮ
Ａの発生を光学的に模倣するため、我々はｃＤＮＡライブラリー中のｐＭＥＴ７
−ｈｉＬ−５ｓｙｎプラスミドを希釈した。このライブラリーは、マウスＥＬ４
リンパ腫細胞株から作られ、そしてｃＤＮＡｓは、ニワトリβアクチンプロモー
ターの制御下において、ベクターｐＡＣＧＧＳ中に挿入された。１２５ng（１／
１０2）、１２．５ng（1／１０3）、１．２５ng（１／１０4）、１２５pg(１／
１０5)、４２pg(１／３×１０5)及び１２．５pg（１／１０6）のｐＭＥＴ７−ｍ
ｏＥｐｏＤＮＡを、９．４μgのｐＡＣＧＧＳ−ＥＬ４ｃＤＮＡ及び３．１μgの
ｐ６−１６ＳＥＡＰに添加した。陰性コントロールとして、９．４μgのｐＡＣ
ＧＧＳ−ＥＬ４ｃＤＮＡ＋３．１μgのｐ６−１６ＳＥＡＰをトランスフェクシ
ョンした。全ての沈殿はリン酸カルシウム法（Graham and Van der Eb, 1973）
によって５００μlに調製し、そこから１６５μl（±４μgの全ＤＮＡ）を６−
ウェルのマイクロタイタープレートのウェル中で１０5個の２ｆＴＧＨ ６−１
６ＳＥＡＰ ＥｐｏＲ／ＩＦＮａＲ２−２クローン４の細胞上にもたらした。沈
殿を一晩細胞上に放置し、その後ダルベッコのＰＢＳで２回洗浄した。細胞をさ
らにＤＭＥＭ培地中で増殖した。１８時間後、培地サンプルをそれぞれのウェル
から取り出しホスファ−ライトアッセイ（Tropix）を用いてＳＥＡＰ活性を測定
した。発光をトップカウント発光測定器で測定した。４μgの全ＤＮＡ中の４０
０pgのｐＭＥＴ７−ｈｉＬ−５ｓｙｎ（１／１０4希釈）でのトランスフェクシ
ョンであっても、陰性対照と比較して、まだ明白なＳＥＡＰ産生を生じる結果と
なったことは、オートクリンループが形成されたことを示している（図５ａ）。
【００６６】 リポフェクション法（Loeffner and Behr, 1933）によるトランスフェクショ
ンのため、同じ希釈を準備した。ここで、２．５μgのＤＮＡ担体（Superfect;Q
iagen）と組合わせて、全量２μgを細胞（４×１０5細胞／ウェル）にトランス
フェクションした。トランスフェクションは、製造者の推奨に従った。混合物を
細胞上に２時間放置し、その後細胞を洗浄した。１８時間後、培地サンプルを各
々のウェルから取り出しＳＥＡＰ活性を上述のように測定した。ここでもまた、
２μgの全ＤＮＡ中の２００pgのｐＭＥＴ７−ｈｉＬ−５ｓｙｎ（１／１０4希釈
）でのトランスフェクションは、陰性対照と比較して、明白なＳＥＡＰ産生を生
じる結果となり、オートクリンループが形成されたことを示している（図５ｂ）
。
ンのため、同じ希釈を準備した。ここで、２．５μgのＤＮＡ担体（Superfect;Q
iagen）と組合わせて、全量２μgを細胞（４×１０5細胞／ウェル）にトランス
フェクションした。トランスフェクションは、製造者の推奨に従った。混合物を
細胞上に２時間放置し、その後細胞を洗浄した。１８時間後、培地サンプルを各
々のウェルから取り出しＳＥＡＰ活性を上述のように測定した。ここでもまた、
２μgの全ＤＮＡ中の２００pgのｐＭＥＴ７−ｈｉＬ−５ｓｙｎ（１／１０4希釈
）でのトランスフェクションは、陰性対照と比較して、明白なＳＥＡＰ産生を生
じる結果となり、オートクリンループが形成されたことを示している（図５ｂ）
。
【００６７】 III．７．ｐＡＣＧＧＳ−ＥＬ４ｃＤＮＡライブラリーにおける希釈による、Ｅ
ｐｏオートクリンループの発生に必要とされるｐＭＥＴ７−ｍｏＥｐｏＤＮＡの
最少量の決定 無関係ｃＤＮＡの膨大なプール中での、関係するリガンドをコードするｃＤＮ
Ａの発生を光学的に模倣するため、我々はｃＤＮＡライブラリー中のｐＭＥＴ７
−ｍｏＥｐｏプラスミドを希釈した。このライブラリーは、マウスＥＬ４リンパ
腫細胞株から作られ、そしてｃＤＮＡｓは、ニワトリβアクチンプロモーターの
制御下において、ベクターｐＡＣＧＧＳ中に挿入された。１．２５μg（１／１
０）、１２５ng（１／１０2）、１２．５ng（1／１０3）、１．２５ng（１／１
０4）、１２５pg(１／１０5)、４２pg(１／３×１０5)及び１２．５pg（１／１
０6）のｐＭＥＴ７−ｍｏＥｐｏＤＮＡを、９．４μgのｐＡＣＧＧＳ−ＥＬ４ｃ
ＤＮＡ及び３．１μgのｐ６−１６ＳＥＡＰに添加し、２ｆＴＧＨ６−１６ＳＥ
ＡＰ ＥｐｏＲ／ＩＦＮａＲ２−２クローン４細胞にトランスフェクションした
。原則として、これらの細胞中でのｐ６−１６ＳＥＡＰの安定な組込みにより必
要ではないが、トランスフェクション混合液へのｐ６−１６ＳＥＡＰの添加は、
このアッセイの感受性を高める。陽性及び陰性コントロールは、それぞれ９．４
μgのｐＡＣＧＧＳ−ＥＬ４ｃＤＮＡ＋３．１μgのｐ６−１６ＳＥＡＰ、及び９
．４μgのｐＭＥＴ７−ｍｏＥｐｏ＋３．１μgのｐ６−１６ＳＥＡＰであった。
全ての沈殿はリン酸カルシウム法（Graham and Van der Eb, 1973）によって５
００μlに調製し、１６５μl（±４μgの全ＤＮＡ）を６−ウェルのマイクロタ
イタープレートのウェル中で１０5個の細胞上にもたらした。沈殿を６時間細胞
上に放置し、その後ダルベッコのＰＢＳで２回洗浄した。細胞をさらにＤＭＥＭ
培地中で増殖した。１８時間後、培地サンプルをそれぞれのウェルから取り出し
ホスファ−ライトアッセイ（Tropix）を用いてＳＥＡＰ活性を測定した。発光を
トップカウント発光測定器で測定した。４μgの全ＤＮＡ中の４００pgのｐＭＥ
Ｔ７−ｈｉＬ−５ｓｙｎ（１／１０4希釈）でのトランスフェクションであって
も、陰性対照と比較して、まだ明白なＳＥＡＰ産生を生じる結果となったことは
、オートクリンループが形成されたことを示している（図６）。
ｐｏオートクリンループの発生に必要とされるｐＭＥＴ７−ｍｏＥｐｏＤＮＡの
最少量の決定 無関係ｃＤＮＡの膨大なプール中での、関係するリガンドをコードするｃＤＮ
Ａの発生を光学的に模倣するため、我々はｃＤＮＡライブラリー中のｐＭＥＴ７
−ｍｏＥｐｏプラスミドを希釈した。このライブラリーは、マウスＥＬ４リンパ
腫細胞株から作られ、そしてｃＤＮＡｓは、ニワトリβアクチンプロモーターの
制御下において、ベクターｐＡＣＧＧＳ中に挿入された。１．２５μg（１／１
０）、１２５ng（１／１０2）、１２．５ng（1／１０3）、１．２５ng（１／１
０4）、１２５pg(１／１０5)、４２pg(１／３×１０5)及び１２．５pg（１／１
０6）のｐＭＥＴ７−ｍｏＥｐｏＤＮＡを、９．４μgのｐＡＣＧＧＳ−ＥＬ４ｃ
ＤＮＡ及び３．１μgのｐ６−１６ＳＥＡＰに添加し、２ｆＴＧＨ６−１６ＳＥ
ＡＰ ＥｐｏＲ／ＩＦＮａＲ２−２クローン４細胞にトランスフェクションした
。原則として、これらの細胞中でのｐ６−１６ＳＥＡＰの安定な組込みにより必
要ではないが、トランスフェクション混合液へのｐ６−１６ＳＥＡＰの添加は、
このアッセイの感受性を高める。陽性及び陰性コントロールは、それぞれ９．４
μgのｐＡＣＧＧＳ−ＥＬ４ｃＤＮＡ＋３．１μgのｐ６−１６ＳＥＡＰ、及び９
．４μgのｐＭＥＴ７−ｍｏＥｐｏ＋３．１μgのｐ６−１６ＳＥＡＰであった。
全ての沈殿はリン酸カルシウム法（Graham and Van der Eb, 1973）によって５
００μlに調製し、１６５μl（±４μgの全ＤＮＡ）を６−ウェルのマイクロタ
イタープレートのウェル中で１０5個の細胞上にもたらした。沈殿を６時間細胞
上に放置し、その後ダルベッコのＰＢＳで２回洗浄した。細胞をさらにＤＭＥＭ
培地中で増殖した。１８時間後、培地サンプルをそれぞれのウェルから取り出し
ホスファ−ライトアッセイ（Tropix）を用いてＳＥＡＰ活性を測定した。発光を
トップカウント発光測定器で測定した。４μgの全ＤＮＡ中の４００pgのｐＭＥ
Ｔ７−ｈｉＬ−５ｓｙｎ（１／１０4希釈）でのトランスフェクションであって
も、陰性対照と比較して、まだ明白なＳＥＡＰ産生を生じる結果となったことは
、オートクリンループが形成されたことを示している（図６）。
【００６８】 参考文献 Barnes, W.M. (1994) PCR amplification of up to 35-kb DNA with high fidel
ity and high yield from lambda bacteriophage templates. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91, 2216-2220. Darnell, J.E., Kerr, I.M. and Stark, G.R. (1994) Jak-STAT pathways and t
ranscriptional activation in response to IFNs and other extracellular si
gnaling proteins. Science, 264, 1415-1421. Graham, F.L. and Van der Eb (1973) A new technique for the assay of infe
ctivity of human adenovirus 5 DNA. Virology, 52, 456-467. Greene, L.A. and Tischler, A. (1996) Establishment of a noradrenergic cl
onal line of rat adrenal pheochromocytoma cells which respond to nerve g
rowth factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 2424-2428. Kinoshita, N., Minshull,J. And Kirschner, M.W. (1995): The identificatio
n of two novel ligands of the FGF receptor by a yeast screening method a
nd their activity in Xenopus development. Cell, 83, 621-630. Kitamura, T., Onishi, M., Kinoshita, S., Shibuya, A., Miyajima, A. and N
olan, G. P. (1995) Efficient screening of retroviral cDNA expression lib
raries. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 9146-9150. Loeffner, J.-P. and Behr, J.-P. (1993) Gene transfer into primary and e
stablished mammalian cell lines with lipopolyamine-coated DNA. Meth. En
zymology 217, 599-618. Mitra, R.D., Silva, C.M. and Youvan, D.C. (1996) Fluorescence resonance
energy transfer between blue-emitting and red-shifted excitation derivat
ives of the green fluorescent protein. Gene, 173, 13-17. Miyawaki, A., et al (1997): Fluorescent indicators for Ca2+ based on gre
en fluorescent proteins and calmodulin. Nature, 388,882-887. Mizushima,S. And Nagata, S. (1990) pEFBOS, a powerful mammalian expressi
on vector. Nucleic acids Res. 18, 5322. Pellegrini, S., John, J., Shearer, M., Kerr, I.M. and Stark, G.R. (1989) Use of a selectable marker regulated by alpha interferon to obtain muta
tions in the signaling pathway. Mol. Cell. Biol., 9, 4605-4612. Pereschini, A., Lynch, J.A. and Rosomer, V.A. (1997) Novel fluorescent i
ndicater proteins for monitoring intracellular Ca2+. Cell Calcium, 22, 2
09-216. Porter, A.C.G., Chernajovsky, Y., Dale, T.C., Gilbert, C.S., Stark, G.R.
and Kerr, I.M. (1988) Interferon response element of the human gene 6-1
6. EMBO, 7, 85-92. Romoser, V.A., Hinkle, P.M. and Persechini, A. (1997) Detection in livin
g cells of Ca2+ dependent changes in the fluorescence emission of an ind
icator composed of two green fluorescent protein variants linked by a ca
lmodulin-binding sequence. A new class of fluorescent indicators. J. Bio
l. Chem., 16, 13270-13274. Takebe, Y., Seiki, M., Fujisawa, J., Hoy, P., Yokota, K., Arai, K., Yosh
ida, M. And Arai, N. (1988) SR alpha promoter: an efficient and versatil
e mammalian cDNA expression system composed of the simian virus 40 early
promoter and the R-U5 segment of human T-cell leukemia virus type I lon
g terminal repeat. Mol. Cell. Biol., 8, 466-472. Tartaglia, L.A., Dembski, M., Weng, X., Deng, N., Culpepper, J., Devos,
R., Richards, G.J., Camfield, L.A., Clark, F.T. and Deeds, J.(1994) Iden
tification and expression cloning of a leptin receptor, OB-R. Cell, 83,
1263-1271. Tavernier, J., Devos, R., Van der Heyden, J., Hauquir, G., Bauden, R., F
ache, I., Kawashima, E., Vandekerckhoven J., Contreras, R. and Fiers, W.
(1989) Expression of human and murine interleukin-5 in eukaryotic syste
ms. DNA, 8, 491-501.
ity and high yield from lambda bacteriophage templates. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91, 2216-2220. Darnell, J.E., Kerr, I.M. and Stark, G.R. (1994) Jak-STAT pathways and t
ranscriptional activation in response to IFNs and other extracellular si
gnaling proteins. Science, 264, 1415-1421. Graham, F.L. and Van der Eb (1973) A new technique for the assay of infe
ctivity of human adenovirus 5 DNA. Virology, 52, 456-467. Greene, L.A. and Tischler, A. (1996) Establishment of a noradrenergic cl
onal line of rat adrenal pheochromocytoma cells which respond to nerve g
rowth factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 2424-2428. Kinoshita, N., Minshull,J. And Kirschner, M.W. (1995): The identificatio
n of two novel ligands of the FGF receptor by a yeast screening method a
nd their activity in Xenopus development. Cell, 83, 621-630. Kitamura, T., Onishi, M., Kinoshita, S., Shibuya, A., Miyajima, A. and N
olan, G. P. (1995) Efficient screening of retroviral cDNA expression lib
raries. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 9146-9150. Loeffner, J.-P. and Behr, J.-P. (1993) Gene transfer into primary and e
stablished mammalian cell lines with lipopolyamine-coated DNA. Meth. En
zymology 217, 599-618. Mitra, R.D., Silva, C.M. and Youvan, D.C. (1996) Fluorescence resonance
energy transfer between blue-emitting and red-shifted excitation derivat
ives of the green fluorescent protein. Gene, 173, 13-17. Miyawaki, A., et al (1997): Fluorescent indicators for Ca2+ based on gre
en fluorescent proteins and calmodulin. Nature, 388,882-887. Mizushima,S. And Nagata, S. (1990) pEFBOS, a powerful mammalian expressi
on vector. Nucleic acids Res. 18, 5322. Pellegrini, S., John, J., Shearer, M., Kerr, I.M. and Stark, G.R. (1989) Use of a selectable marker regulated by alpha interferon to obtain muta
tions in the signaling pathway. Mol. Cell. Biol., 9, 4605-4612. Pereschini, A., Lynch, J.A. and Rosomer, V.A. (1997) Novel fluorescent i
ndicater proteins for monitoring intracellular Ca2+. Cell Calcium, 22, 2
09-216. Porter, A.C.G., Chernajovsky, Y., Dale, T.C., Gilbert, C.S., Stark, G.R.
and Kerr, I.M. (1988) Interferon response element of the human gene 6-1
6. EMBO, 7, 85-92. Romoser, V.A., Hinkle, P.M. and Persechini, A. (1997) Detection in livin
g cells of Ca2+ dependent changes in the fluorescence emission of an ind
icator composed of two green fluorescent protein variants linked by a ca
lmodulin-binding sequence. A new class of fluorescent indicators. J. Bio
l. Chem., 16, 13270-13274. Takebe, Y., Seiki, M., Fujisawa, J., Hoy, P., Yokota, K., Arai, K., Yosh
ida, M. And Arai, N. (1988) SR alpha promoter: an efficient and versatil
e mammalian cDNA expression system composed of the simian virus 40 early
promoter and the R-U5 segment of human T-cell leukemia virus type I lon
g terminal repeat. Mol. Cell. Biol., 8, 466-472. Tartaglia, L.A., Dembski, M., Weng, X., Deng, N., Culpepper, J., Devos,
R., Richards, G.J., Camfield, L.A., Clark, F.T. and Deeds, J.(1994) Iden
tification and expression cloning of a leptin receptor, OB-R. Cell, 83,
1263-1271. Tavernier, J., Devos, R., Van der Heyden, J., Hauquir, G., Bauden, R., F
ache, I., Kawashima, E., Vandekerckhoven J., Contreras, R. and Fiers, W.
(1989) Expression of human and murine interleukin-5 in eukaryotic syste
ms. DNA, 8, 491-501.
【配列表】
【図１】 ２ｆｔＧＨ細胞におけるｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ２−
２、ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−βｃ／ＩＦＮａＲ１及びｐ６−１６ＳＥＡＰの一時的
共トランスフェクション及びＳＥＡＰ活性の誘導の解析である。トランスフェク
ションの２４時間後、細胞を、刺激なしのままか又はＩＦＮβ（陽性対照）又は
ＩＬ−５（１及び２ng／ml）で刺激した。培地からのサンプルを刺激の２４時間
後に採取し、発光原基質としてＣＳＰＤを用いてＳＥＡＰ活性を測定した（ホス
ファ−ライトキット、Tropix）。発生した光の量は、トップカウント発光測定器
（Packard）で測定した。
２、ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−βｃ／ＩＦＮａＲ１及びｐ６−１６ＳＥＡＰの一時的
共トランスフェクション及びＳＥＡＰ活性の誘導の解析である。トランスフェク
ションの２４時間後、細胞を、刺激なしのままか又はＩＦＮβ（陽性対照）又は
ＩＬ−５（１及び２ng／ml）で刺激した。培地からのサンプルを刺激の２４時間
後に採取し、発光原基質としてＣＳＰＤを用いてＳＥＡＰ活性を測定した（ホス
ファ−ライトキット、Tropix）。発生した光の量は、トップカウント発光測定器
（Packard）で測定した。
【図２】 ２ｆｔＧＨ ６−１６ＳＥＡＰクローン５細胞におけるｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−
ＥｐｏＲ／ＩＦＮａＲ１＋ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＥｐｏＲ／ＩＦＮａＲ２−２、
ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＥｐｏＲ／ＩＦＮａＲ１又はｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−Ｅｐｏ
Ｒ／ＩＦＮａＲ２−２の一時的共トランスフェクションである。トランスフェク
ションの２４時間後、細胞を、刺激なしのままか又はＩＦＮβ（１ng／ml：陽性
対照）又はＥｐｏ（５ng／ml）で刺激した。培地からのサンプルを刺激の２４時
間後に採取し、発光原基質としてＣＳＰＤを用いてＳＥＡＰ活性を測定した（ホ
スファ−ライトキット、Tropix）。発生した光の量は、トップカウント発光測定
器（Packard）で測定した。
ＥｐｏＲ／ＩＦＮａＲ１＋ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＥｐｏＲ／ＩＦＮａＲ２−２、
ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＥｐｏＲ／ＩＦＮａＲ１又はｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−Ｅｐｏ
Ｒ／ＩＦＮａＲ２−２の一時的共トランスフェクションである。トランスフェク
ションの２４時間後、細胞を、刺激なしのままか又はＩＦＮβ（１ng／ml：陽性
対照）又はＥｐｏ（５ng／ml）で刺激した。培地からのサンプルを刺激の２４時
間後に採取し、発光原基質としてＣＳＰＤを用いてＳＥＡＰ活性を測定した（ホ
スファ−ライトキット、Tropix）。発生した光の量は、トップカウント発光測定
器（Packard）で測定した。
【図３】 無関係のＤＮＡにおいてベクターｐＥＦＢＯＳ−ｈＩＬ−５ｓｙｎの希釈でト
ランスフェクトされた２ｆＴＧＨ ＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ２−２＋βｃ／Ｉ
ＦＮａＲ１クローンＣ細胞である。オートクリンループの形成は、ＨＡＴ培地中
における細胞の生存という結果をもたらした。トランスフェクションの１５日後
、それぞれのペトリ皿中の代表的な領域の写真を撮影した。
ランスフェクトされた２ｆＴＧＨ ＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ２−２＋βｃ／Ｉ
ＦＮａＲ１クローンＣ細胞である。オートクリンループの形成は、ＨＡＴ培地中
における細胞の生存という結果をもたらした。トランスフェクションの１５日後
、それぞれのペトリ皿中の代表的な領域の写真を撮影した。
【図４】 無関係のＤＮＡにおいて、ベクターｐＭＥＴ７−ｈｉＬ−５ｓｙｎの希釈でト
ランスフェクションしたＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ２−２＋βｃ／ＩＦＮａＲ１
クローンＥにおける、ＳＥＡＰ活性の誘導。オートクリンループの形成は、６−
１６プロモーターの活性化に続くＳＥＡＰの分泌をもたらす結果となった。培地
からのサンプルを刺激の２４時間後に採取し、発光原基質としてＣＳＰＤを用い
てＳＥＡＰ活性を測定した（ホスファ−ライトキット、Tropix）。発生した光の
量は、トップカウント発光測定器（Packard）で測定した。
ランスフェクションしたＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ２−２＋βｃ／ＩＦＮａＲ１
クローンＥにおける、ＳＥＡＰ活性の誘導。オートクリンループの形成は、６−
１６プロモーターの活性化に続くＳＥＡＰの分泌をもたらす結果となった。培地
からのサンプルを刺激の２４時間後に採取し、発光原基質としてＣＳＰＤを用い
てＳＥＡＰ活性を測定した（ホスファ−ライトキット、Tropix）。発生した光の
量は、トップカウント発光測定器（Packard）で測定した。
【図５Ａ】 真核発現ベクターｐＡＣＧＧＳにおいて発現する、ＥＬ４ｃＤＮＡライブラリ
ーにおけるベクターｐＭＥＴ７−ｈＩＬ−５ｓｙｎの希釈によってトランスフェ
クションされた２ｆＴＧＨ ＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ２−２＋βｃ／ＩＦＮａ
Ｒ１クローンＥ細胞である。全ての希釈はｐ６−１６プラスミドと一緒に共トラ
ンスフェクションされた。陰性対照をｐＡＣＧＧＳ−ＥＬ４ｃＤＮＡ＋ｐ６−１
６ＳＥＡＰとした。トランスフェクションは、リン酸カルシウム法で行った。オ
ートクリンループの形成は、６−１６プロモーターの活性化に続くＳＥＡＰの分
泌という結果になった。培地からのサンプルを刺激の２４時間後に採取し、発光
原基質としてＣＳＰＤを用いてＳＥＡＰ活性を測定した（ホスファ−ライトキッ
ト、Tropix）。発生した光の量は、トップカウント発光測定器（Packard）で測
定した。
ーにおけるベクターｐＭＥＴ７−ｈＩＬ−５ｓｙｎの希釈によってトランスフェ
クションされた２ｆＴＧＨ ＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ２−２＋βｃ／ＩＦＮａ
Ｒ１クローンＥ細胞である。全ての希釈はｐ６−１６プラスミドと一緒に共トラ
ンスフェクションされた。陰性対照をｐＡＣＧＧＳ−ＥＬ４ｃＤＮＡ＋ｐ６−１
６ＳＥＡＰとした。トランスフェクションは、リン酸カルシウム法で行った。オ
ートクリンループの形成は、６−１６プロモーターの活性化に続くＳＥＡＰの分
泌という結果になった。培地からのサンプルを刺激の２４時間後に採取し、発光
原基質としてＣＳＰＤを用いてＳＥＡＰ活性を測定した（ホスファ−ライトキッ
ト、Tropix）。発生した光の量は、トップカウント発光測定器（Packard）で測
定した。
【図５Ｂ】 Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬（Qiagen）を用いて、リポフェクション法によってト
ランスフェクションを行った以外は同じ条件を用いた。
ランスフェクションを行った以外は同じ条件を用いた。
【図６】 真核発現ベクターｐＡＣＧＧＳにおいて発現する、ＥＬ４ｃＤＮＡライブラリ
ーにおけるベクターｐＭＥＴ７−ｍｏＥｐｏの希釈によってトランスフェクショ
ンされた２ｆＴＧＨ ６−１６ＳＥＡＰ／ＩＦＮａＲ２−２＋βｃ／ＩＦＮａＲ
１クローン４細胞である。全ての希釈はｐ６−１６プラスミドと一緒に共トラン
スフェクションした。陰性対照をｐＡＣＧＧＳ−ＥＬ４ｃＤＮＡ＋ｐ６−１６Ｓ
ＥＡＰとした。オートクリンループの形成は、６−１６プロモーターの活性化に
続くＳＥＡＰの分泌という結果になった。培地からのサンプルを刺激の２４時間
後に採取し、発光原基質としてＣＳＰＤを用いてＳＥＡＰ活性を測定した（ホス
ファ−ライトキット、Tropix）。発生した光の量は、トップカウント発光測定器
（Packard）で測定した。
ーにおけるベクターｐＭＥＴ７−ｍｏＥｐｏの希釈によってトランスフェクショ
ンされた２ｆＴＧＨ ６−１６ＳＥＡＰ／ＩＦＮａＲ２−２＋βｃ／ＩＦＮａＲ
１クローン４細胞である。全ての希釈はｐ６−１６プラスミドと一緒に共トラン
スフェクションした。陰性対照をｐＡＣＧＧＳ−ＥＬ４ｃＤＮＡ＋ｐ６−１６Ｓ
ＥＡＰとした。オートクリンループの形成は、６−１６プロモーターの活性化に
続くＳＥＡＰの分泌という結果になった。培地からのサンプルを刺激の２４時間
後に採取し、発光原基質としてＣＳＰＤを用いてＳＥＡＰ活性を測定した（ホス
ファ−ライトキット、Tropix）。発生した光の量は、トップカウント発光測定器
（Packard）で測定した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 ファンデケルクホーフェ，ヨエル・ステフ ァーン ベルギー国、ベー−8210 ロッペム、ロー デ・ベンケンドレーフ 27 (72)発明者 フェルヘー，アニック ベルギー国、ベー−8810 リヒテルフェル デ、パストール・デニスラーン 60 (72)発明者 タフェルニール，ヤン ベルギー国、ベー−9860 バレゲム、ボッ テルウェヒ ２ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB01 DA13 DA20 DA36 FB01 FB02 FB07 4B024 AA01 AA11 AA15 BA63 CA04 DA02 EA04 FA02 FA10 GA13 HA03 HA11 4B063 QA01 QQ08 QR48 QS02 QS36 4B065 AA90X AA99Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA46
Claims (16)
- 【請求項１】 １）キメラレセプターをコードする第１の組換え遺伝子、２
）その発現がオートクリン又は抗オートクリンループをつくりだす化合物をコー
ドする第２の組換え遺伝子、３）該オートクリン又は抗オートクリンループの創
出に基づいて活性化又は不活性化されるレポーター系、を含む、真核細胞。 - 【請求項２】 細胞がいかなる細胞であってもよく、ただし該細胞は酵母で
はない、請求項１記載の真核細胞。 - 【請求項３】 キメラレセプターが多量体レセプターであるか又は多量体化
するレセプターである、請求項１又は２記載の真核細胞。 - 【請求項４】 該第２の組換え遺伝子が構成プロモーターの後に位置する、
請求項１〜３のいずれか１項記載の真核細胞。 - 【請求項５】 該レポーター系が、該キメラレセプターにリガンドが結合し
た結果として活性化される、請求項１〜４のいずれか１項記載の真核細胞。 - 【請求項６】 キメラレセプターの細胞質部位が、インターフェロンレセプ
ターサブユニットの１つの細胞質部位である、請求項１〜５のいずれか１項記載
の真核細胞。 - 【請求項７】 レポーター系が E. coliキサンチン−グアニンホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）である、請求項１〜６のいずれか１項記載の真
核細胞。 - 【請求項８】 該レポーター系が６−１６プロモーターの制御下に置かれて
いる、請求項６記載の真核細胞。 - 【請求項９】 該第２の組換え遺伝子がＳＲα又はＨＥＦ１ａプロモーター
の後に位置している、請求項４記載の真核細胞。 - 【請求項１０】 細胞が、２ｆＴＧＨ細胞である、請求項１〜９のいずれか
１項記載の真核細胞。 - 【請求項１１】 オーファンレセプター及び／又は未知のリガンドをスクリ
ーニングするための、請求項１〜１０のいずれか１項記載の真核細胞の使用。 - 【請求項１２】 該キメラレセプターの細胞外部位とのリガンドの結合及び
／又は該キメラレセプターの細胞質部位のシグナル伝達経路に干渉する化合物を
スクリーニングするための、請求項１〜１０のいずれか１項記載の真核細胞の使
用。 - 【請求項１３】 ａ）キメラレセプターをコードする遺伝子による真核宿主
細胞の形質転換、ｂ）該キメラレセプターへのリガンドの結合によって誘導され
得るレポーター系をコードする遺伝子による該宿主細胞の形質転換、ｃ）該キメ
ラレセプターのリガンドをコードする遺伝子による該宿主細胞の形質転換、ｄ）
レポーター系が活性化されているか、又は不活性化されている細胞の選択、を含
む、オーファンレセプター及び／又は未知のリガンドのスクリーニング方法。 - 【請求項１４】 請求項１３の方法によって得ることができる、オーファン
レセプター及び／又は未知のリガンド。 - 【請求項１５】 ａ）キメラレセプターをコードする遺伝子による真核宿主
細胞の形質転換、ｂ）該キメラレセプターへのリガンドの結合によって誘導され
得るレポーター系をコードする遺伝子による該宿主細胞の形質転換、ｃ）該キメ
ラレセプターへの該リガンドの結合の阻害剤をコードする遺伝子による該宿主細
胞の形質転換、ｄ）該キメラレセプターに対するリガンドをコードする遺伝子に
よる該宿主細胞の形質転換及び／又は宿主細胞への該リガンドの供給、ｅ）レポ
ーター系が活性化されているか、又は不活性化されている細胞の選択、を含む、
レセプターへのリガンドの結合及び／又はレセプターのシグナル伝達経路に干渉
する化合物をスクリーニングする方法。 - 【請求項１６】 真核宿主細胞及び１種以上の形質転換ベクターを含み、該
細胞を該ベクター（１種又は複数種）でトランスフェクションすると、請求項１
〜１０のいずれか１項記載の真核細胞を生じるキット。
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