CN116406789A - 一种大麦叶生物转化物的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种大麦叶生物转化物的制备方法及其应用，属于食品生物技术领域和医药保健品领域。本申请将大麦叶粉、小鼠肠道内容物和缓冲液按照一定用量比进行充分混合，在厌氧环境中，恒温震荡条件下进行体外发酵培养，获得大麦叶生物转化物悬浮培养液；离心，收集上清液，得到大麦叶生物转化物。本申请将该大麦叶生物转化物应用于小鼠结肠炎模型中，与未进行生物转化的大麦叶组相比，大麦叶生物转化物在提高肌苷和/或鸟苷含量、抑制体重减轻、腹泻和结肠缩短等方面表现出更好效果；此外，在减轻小鼠结肠组织病理损伤和改善粘液屏障破坏方面，大麦叶生物转化物效果更好；可用于功能性食品或医药保健品的制备。
Description
技术领域
本发明属于食品生物技术领域和医药保健品领域，涉及一种大麦叶生物转化物的制备方法及其应用，具体涉及一种以大麦叶为原料，通过小鼠肠道微生物发酵，实现营养物质生物转化的制备方法及其应用。
背景技术
炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)，包括克罗恩病(Crohn’sdisease，CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)，是一种以体重减轻、严重腹泻和腹痛为特征的慢性肠道炎症性疾病，对人类健康构成巨大的安全威胁。目前，抗炎药物和免疫抑制剂是治疗炎症性肠病的主要治疗手段，然而药物疗法在治疗效果和安全性方面仍有许多缺陷。因此，迫切需要寻找一种新的、安全有效的预防炎症性肠病的产品的方法。
人和动物肠道内存在着数量庞大的微生物群体，称为肠道微生物。据估计，人类肠道微生物由大约10到100万亿的微生物细胞组成，总数目大约是人体细胞数目的10倍。这些微生物在代谢膳食营养、促进免疫系统发育、抵抗病原微生物入侵等方面发挥重要作用。经过数百万年的互作进化，宿主已经和这些微生物建立起密不可分的共生关系。
宿主肠上皮细胞构成的肠道屏障在空间上将肠道微生物与宿主相隔离，防止肠道微生物有害成分透过肠壁转移进入机体引起过度的炎症反应。杯状细胞是一类特殊的肠上皮细胞，能够产生和分泌粘蛋白Muc2到肠腔中形成粘液层。作为肠道屏障的重要组成部分，由内粘液层和外粘液层构成的肠道粘液屏障有效保护肠上皮细胞免受感染和物理损伤，在维系肠稳态的长期平衡稳定方面发挥重要功能。然而，肠道屏障功能的破坏会引起肠道微生态紊乱，与炎症性肠病的发生有紧密联系。
大麦叶是农作物大麦(Hordeum vulgaFe L.)生长初期采收的新鲜嫩茎叶，也是我国传统的药食同源物，其富含膳食纤维、叶绿素、黄酮、维生素、抗氧化酶和多种金属矿物质等对机体健康有重要作用的活性成分。我国自古就有关于大麦叶营养和功效的历史记载。近年来，以大麦嫩叶为原料生产的“麦草食品”在多地区备受欢迎，由于其具有绿色、天然的特点未来将有广阔的市场。但是，目前国内外关于肠道微生物转化大麦叶的健康功效研究未见报道。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的第一技术问题是提供一种大麦叶生物转化物的制备方法；本发明所要解决的第二技术问题是提供该方法制备得到的大麦叶生物转化物；本发明所要解决的第三技术问题在于提供大麦叶生物转化物的用途。
为解决上述问题，本发明提供如下技术方案：
一种以大麦叶为原料，通过小鼠肠道微生物发酵，实现营养物质生物转化的制备方法，包括以下步骤：
将大麦叶粉碎后，得到大麦叶粉；将大麦叶粉、小鼠肠道内容物和缓冲液按照一定用量比进行充分混合，在厌氧环境中，恒温震荡条件下进行体外发酵培养，至菌浓度达到1×108cfu/mL以上，获得大麦叶生物转化物悬浮培养液；将大麦叶生物转化物悬浮培养液进行离心，收集上清液，得到大麦叶生物转化物。
优选地，大麦叶为禾本科植物大麦的幼苗嫩叶。
优选地，采收大麦幼苗长至15～30cm的新鲜嫩茎叶干燥后进行粉碎，粉碎筛选后得到大麦叶粉。
优选地，采收麦苗长至15～30cm的新鲜嫩茎叶，用水洗涤，切成块，并在冷冻干燥机中于60℃下干燥24小时，将干燥的大麦叶用搅拌机粉碎1分钟，通过300目筛进行筛选，得到大麦叶粉。
优选地，收集8周龄C57B1/6J雌性小鼠肠道内容物。
优选地，小鼠肠道内容物中厚壁菌Firmicutes的相对丰度比例为28％～58％，拟杆菌Bacteroidetes的相对丰度比例为30％～55％。
优选地，小鼠肠道内容物中厚壁菌Firmicutes的相对丰度比例为42.74±14.81％、拟杆菌Bacteroidetes的相对丰度比例为42.58±11.95％、变形杆菌Proteobacteria的相对丰度比例为0.28±0.16％、放线菌Actinobacteriota的相对丰度比例为0.53±0.22％、疣微菌Verrucomicrobiota的相对丰度比例为0.22±0.13％、脱硫菌Desulfobacterota的相对丰度比例为0.31±0.18％。
优选地，将大麦叶粉、小鼠肠道内容物和缓冲液按照用量比1g∶(6～10)g：20ml进行充分混合。
优选地，缓冲液为PBS缓冲液。
优选地，厌氧环境中CO2的体积分数为20％，N2的体积分数为80％。
优选地，恒温震荡条件为35～39℃，转速200～240转/分钟，培养22～26小时。
优选地，恒温震荡条件为37℃，转速220转/分钟，培养24小时。
上述方法制备得到的大麦叶生物转化物也在本发明的保护范围内。
大麦叶生物转化物在提高肌苷含量变化中的应用。
大麦叶生物转化物在提高鸟苷含量变化中的应用。
大麦叶生物转化物在制备治疗和/或预防肠道疾病、改善肠道屏障功能药物和/或膳食营养补充剂中的应用。
优选地，肠屏障功能包括肠上皮细胞组成的物理屏障和产粘液杯状细胞组成的化学屏障。
优选地，改善肠屏障功能为促进肠上皮细胞增生和/或肠粘液增加。
优选地，药物和/或膳食营养补充剂的活性成分为大麦叶生物转化物。
优选地，药物和/或膳食营养补充剂还含有药学上或食品上可接受的载体或辅料。
本发明取得的有益效果：
本发明提供了一种以新鲜大麦叶为原料，通过小鼠肠道微生物在合适的时间、氧化、温度条件下实现营养物质的生物转化，得到具有特殊微生物群落组成的大麦叶生物转化物，将该大麦叶生物转化物应用于小鼠结肠炎模型中，与空白对照组、未进行生物转化的大麦叶组相比，大麦叶生物转化物在抑制体重减轻、腹泻和结肠缩短等方面表现出更好效果；此外，在减轻小鼠结肠组织病理损伤和改善粘液屏障破坏方面，大麦叶生物转化物效果更好；可用于功能性食品或医药保健品的制备。
附图说明
为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例2的大麦叶在生物转化前(发酵前)和生物转化后(发酵后)的微生物组成主成分分析图；
图2为实施例2的大麦叶在生物转化前(发酵前)和生物转化后(发酵后)的α多样性分析图；
图3为实施例2的大麦叶在生物转化前(发酵前)和生物转化后(发酵后)的厚壁菌门Firmicutes和变形菌门Proteobacteria的相对丰度对比图；
图4为实施例2的大麦叶在生物转化前(发酵前)和生物转化后(发酵后)的螺杆菌科Helicobacteraceae和普雷沃菌科Prevotellaceae的相对丰度对比图；
图5为实施例2的大麦叶在生物转化前(发酵前)和生物转化后(发酵后)的杜博西菌属Dubosiella和理研菌属Rikenella的相对丰度对比图；
图6为实施例2的生物转化前大麦叶组(未发酵大麦叶组)与生物转化后大麦叶组(大麦叶发酵物组)的肌苷含量变化的对比图；
图7为实施例2的生物转化前大麦叶组(未发酵大麦叶组)与生物转化后大麦叶组(大麦叶发酵物组)的鸟苷含量变化的对比图；
图8为实施例3的生物转化前大麦叶组(未发酵大麦叶组)与生物转化后大麦叶组(大麦叶发酵物组)对小鼠体重的影响变化图；
图9为实施例3的生物转化前大麦叶组(未发酵大麦叶组)与生物转化后大麦叶组(大麦叶发酵物组)对小鼠疾病活动指数(DAI)的影响变化图；
图10为实施例3的生物转化前大麦叶组(未发酵大麦叶组)与生物转化后大麦叶组(大麦叶发酵物组)对小鼠结肠长度的影响变化图；
图11为实施例3的生物转化前大麦叶组(未发酵大麦叶组)与生物转化后的大麦叶组(大麦叶发酵物组)对小鼠结肠组织病理损伤和粘液屏障的影响变化图。
具体实施方式
以下对本申请的具体实施方式进行详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例1：大麦叶生物转化物的制备
采收麦苗长至15～30cm的新鲜嫩茎叶，用水洗涤，切成块，并在冷冻干燥机中于60℃下干燥24小时，将干燥的大麦叶用搅拌机粉碎1分钟，通过300目筛进行筛选，并在-20℃下储存直至使用。
收集8周龄C57B1/6J雌性小鼠肠道内容物3-5克于10ml PBS缓冲液中，加入大麦叶0.5克，漩涡震荡5分钟，悬浮液样品转移至日本三菱MGCAnaeroPack系列厌氧产气袋中，密封后形成厌氧环境(20％CO2，80％N2)，置于恒温摇床上220转/分钟、37℃下晃动培养进行体外发酵24小时，获得大麦叶生物转化物悬浮培养液，将大麦叶生物转化物悬浮培养液在2000g下离心20分钟，重复2次，收集上清液，获得大麦叶生物转化物。
实施例2：大麦叶生物转化物的微生物组成分析
使用16S rRNA测序技术对大麦叶在生物转化前和生物转化后的微生物组成进行对比分析，以表征生物转化前后的微生物群落特征变化，提取大麦叶在生物转化前和生物转化后的基因组DNA，以该DNA样品为模板，使用特定引物对16S rRNA基因V3-V4区域可变区进行PCR扩增，建立测序文库，使用Illumina Miseq测序平台对测序文库进行测序，根据Index序列区分各个样本数据。在QIIME软件中按照97％相似性对非重复序列进行操作分类单元聚类(Operational Taxonomic Units，OTU)，使用SILVA数据库进行分类学分析。使用MOTHUR软件计算各测序样品稀释曲线、群落丰富度Chaol和ACE指数以及群落多样性Shannon和Simpson指数，通过主成分分析将数据差异反映在二维坐标图上，通过LEfSe软件对样本进行线性判别分析，找出显著性差异群落或物种。
在对序列进行去杂、质控和OTU聚类后，总共得到337个相似水平达到97％的OTU。
图1为大麦叶在生物转化前和生物转化后的微生物组成主成分分析图；横坐标PC1为25.36％，纵坐标为15.51％。
图2为大麦叶在生物转化前和生物转化后的α多样性分析图；由图2可知，大麦叶生物转化后的微生物组成α多样性比生物转化前升高。
图3为大麦叶在生物转化前和生物转化后的微生物菌落在菌门水平上的相对丰度对比图；由图3可知，大麦叶在生物转化前的厚壁菌门Firmicutes的相对丰度为42.75％，在生物转化后的厚壁菌门Firmicutes的相对丰度为37.58％，含量降低；大麦叶在生物转化前的变形菌门Proteobacteria的相对丰度为0.28％，在生物转化后的变形菌门Proteobacteria的相对丰度为0.75％，含量升高。
图4为大麦叶在生物转化前和生物转化后的微生物菌落在菌科水平上的相对丰度对比图；由图4可知，大麦叶在生物转化前的螺杆菌科Helicobacteraceae的相对丰度为5.28％，在生物转化后的螺杆菌科Helicobacteraceae的相对丰度为14.61％，含量升高；大麦叶在生物转化前的普雷沃菌科Prevotellaceae的相对丰度为2.06％，在生物转化后的普雷沃菌科Prevotellaceae的相对丰度为1.53％，含量降低。
图5为大麦叶在生物转化前和生物转化后的微生物菌落在菌属水平上的相对丰度对比图；由图5可知，大麦叶在生物转化前的杜博西菌属Dubosiella的相对丰度为0.25％，在生物转化后的杜博西菌属Dubosiella的相对丰度为1.56％，含量升高；大麦叶在生物转化前的理研菌属Rikenella的相对丰度为1.58％，在生物转化后的理研菌属Rikenella的相对丰度为0.49％，含量降低。
图6为大麦叶在生物转化前和生物转化后的肌苷含量变化的对比图：由图6可知，大麦叶在生物转化前的肌苷含量为258.01μg/ml，在生物转化后的肌苷含量为709.69μg/ml，含量升高。
图7为大麦叶在生物转化前和生物转化后的鸟苷含量变化的对比图：由图6可知，大麦叶在生物转化前的鸟苷含量为169.65μg/ml，在生物转化后的鸟苷含量为543.92μg/ml，含量升高。
其中，大麦叶生物转化前指的是大麦叶粉、小鼠肠道内容物和缓冲液混合后，厌氧发酵培养前。
实施例3：以葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导结肠炎模型评价大麦叶生物转化物的功能以DSS诱导小鼠结肠炎模型，模型建立如下：
将大麦叶生物转化物和未进行生物转化的大麦叶通过灌胃方式以200μl转移给抗生素处理C57B1/6J小鼠，2周进行5个灌胃，抗生素处理小鼠在灌胃前饮水中加入抗生素混合物(100mg/L新霉素、50mg/L链霉素、100mg/L青霉素、50mg/L万古霉素和100mg/L甲硝唑)连续处理7天，以清除肠道微生物。
在灌胃大麦叶生物转化物和未进行生物转化的大麦叶24小时后，将DSS以2.5％质量分数的比例添加到两组小鼠的饮用水中，使小鼠连续自由饮水7天诱导结肠炎，在诱导过程中，每日记录小鼠体重、粪便状态；实验结束后，解剖小鼠，量取结肠长度，拍照，收集结肠内容物，用4％的福尔马林固定液保存结肠组织样品，检测结肠组织病理损伤和改善粘液屏障破坏程度变化。
其中，两组小鼠的体重对比数据如图8所示，从图8可以看出，DSS诱导7天后，未进行生物转化的大麦叶组的小鼠体重为初始体重的84.41％，大麦叶生物转化物组的小鼠体重为初始体重的88.39％，与未进行生物转化的大麦叶组小鼠相比，大麦叶生物转化物组小鼠体重下降趋势显著降低，差异显著性p＜0.05，表明大麦叶生物转化物可显著抑制DSS诱导的小鼠体重降低。
疾病活动指数(Disease activity index，DAI)是结合体重降低百分比、粪便稀疏度和直肠出血情况三个指标的分数总和评价结肠炎模型严重程度的重要指标，两组小鼠DAI对比数据如图9所示，其中从图9可以看出，与未进行生物转化的大麦叶组小鼠相比，大麦叶生物转化物组小鼠DAI明显降低，即小鼠结肠炎症状得到明显改善，表明大麦叶生物转化物能够显著改善DSS诱导的小鼠疾病活动指数。
结肠长度是评价结肠炎症严重程度的另一重要参考指标，图10为两组小鼠的结肠长度对比数据，其中上图为实物对比图，下图为数据对比图。从图10可以看出，与未进行生物转化的大麦叶组小鼠相比，大麦叶生物转化物组小鼠结肠长度较长，即大麦叶生物转化物组能够显著改善DSS诱导引起的结肠长度变短。
肠屏障功能，包括肠上皮细胞组成的物理屏障和产粘液杯状细胞组成的化学屏障，图11苏木精/伊红染色法和阿辛蓝染色的结肠组织切片结果表明，与未进行生物转化的大麦叶组小鼠相比，大麦叶生物转化物组小鼠结肠组织病理损伤和改善粘液屏障破坏程度显著减轻。
Claims (10)
1.一种大麦叶生物转化物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将大麦叶粉碎后，得到大麦叶粉；然后将大麦叶粉、小鼠肠道内容物和缓冲液按照一定用量比进行充分混合，在厌氧环境中，恒温震荡条件下进行体外发酵培养，至微生物总活菌浓度达到1×108cfu/mL以上，获得大麦叶生物转化物悬浮培养液；将大麦叶生物转化物悬浮培养液进行离心，收集上清液，得到大麦叶生物转化物。
2.根据权利要求1所述的大麦叶生物转化物的制备方法，其特征在于，采收大麦幼苗长至15～30cm的新鲜嫩茎叶干燥后进行粉碎、筛选后得到大麦叶粉。
3.根据权利要求1所述的大麦叶生物转化物的制备方法，其特征在于，小鼠肠道内容物中厚壁菌Firmicutes的相对丰度比例为28％～58％，拟杆菌Bacteroidetes的相对丰度比例为30％～55％。
4.根据权利要求1所述的大麦叶生物转化物的制备方法，其特征在于，将大麦叶粉、小鼠肠道内容物和缓冲液按照用量比1g:(6～10)g:20ml进行充分混合。
5.根据权利要求4所述的大麦叶生物转化物的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为PBS缓冲液。
6.根据权利要求1所述的大麦叶生物转化物的制备方法，其特征在于，所述厌氧环境中CO2的体积分数为20％，N2的体积分数为80％。
7.根据权利要求1所述的大麦叶生物转化物的制备方法，其特征在于，恒温震荡条件为35～39℃，转速200～240转/分钟，培养22～26小时。
8.权利要求1至7任一项权利要求所述方法制备得到的大麦叶生物转化物。
9.权利要求8所述的大麦叶生物转化物在提高肌苷和/或鸟苷含量变化中的应用。
10.权利要求8所述的大麦叶生物转化物在制备治疗和/或预防肠道疾病、改善肠道屏障功能药物和/或膳食营养补充剂中的应用。
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