CN116396285A - 氘代四氢呋喃类化合物制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了具有镇咳活性的化合物，本发明还公开了本发明化合物或其药物组合在制备药物中的用途，该药物可在治疗慢性咳嗽方面发挥作用。

Description

氘代四氢呋喃类化合物制备及其应用

本申请要求于2022年1月4日提交中国专利局、申请号为202210007482.8发明名称为“氘代四氢呋喃类化合物制备及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明属于医药化学领域，具体涉及一类新的具有镇咳活性的小分子化合物及其制备方法，以及这类化合物在治疗慢性咳嗽方面的用途。

背景技术

难治性咳嗽是以咳嗽为主诉，症状持续8周以上，常规治疗无效的慢性咳嗽。难治性咳嗽可以分为病因不明和病因清楚两类病因不明的难治性咳嗽是病因无法查明，或因病因少见；病因清楚者多见部分慢性间质性肺病、慢性阻塞性肺疾病、感染后咳嗽或支气管扩张症等患者。

全球社区成人慢性咳嗽患病率为7.6％～11.7％，亚洲为1.8％～7.4％，在咳嗽专家门诊，慢性难治性咳嗽患者占比20％～46％。

患有不明原因的慢性咳嗽患者的生活质量明显下降，身体上(例如疲劳、呼吸困难、睡眠障碍、失禁等)和心理上(易怒，沮丧和焦虑)的负面因素会促使慢性咳嗽患者向医生寻求帮助，目前虽然有许多治疗咳嗽的OTC药物，但meta分析基本无证据证明此类药物对难治性咳嗽的有效性，迄今为止，慢性难治性咳嗽患者的治疗选择极为有限，许多患者已经咳嗽多年没有得到缓解，因此，有必要确定慢性难治性咳嗽的有效治疗方法。

目前尚无获批用于治疗慢性难治性咳嗽的药物，但很多临床研究已证明P2X3拮抗剂对慢性咳嗽治疗有效，目前大多数咳嗽新药研发管线的新药都采用P2X3靶点进行开发。BAY1817080(eliapixant)是拜耳公司正在开发的一款P2X3拮抗剂，目前在全球处于II期临床开发阶段，该药物耐受性良好；拜耳公司目前在全球开展多项BAY1817080的临床试验，涉及的适应症包括子宫内膜异位、咳嗽、膀胱过动症等。国内专利CN202010852140.7，CN202011203843.3，CN202010777545.9，CN201880060205.5等专利也公开了一系列P2X3拮抗剂。

本发明提供了具有镇咳活性的P2X3拮抗剂，与其它已知化合物相比，本发明化合物具有较优的药代动力学特征和更高的安全性。

发明内容

本发明涉及一类具有镇咳活性的P2X3拮抗剂，具体涉及式(I)所示结构的化合物或其药学可接受的盐，

其中，式(I)中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅各自独立地为氢或氘；R₁、R₂、R₃、R₄、R₅不会同时为氢，当R₅为氘时，R₁、R₂、R₃、R₄均为氢；

进一步的当R₃、R₄为氘时，R₁、R₂均为氢或均为氘；当R₃、R₄为氢时，R₁、R₂均为氘，R₅为氢。

根据本发明的化合物或其药学可接受的盐，包括下列的化合物：

3-(5-甲基噻唑-2-基)-5-(((R)-四氢呋喃-3-基-2,2,5,5-d4)氧基)-N-((R)-1-(2-(三氟甲基)嘧啶-5-基)乙基)苯甲酰胺；

3-(5-甲基噻唑-2-基)-5-(((R)-四氢呋喃-3-基-5,5-d2)氧基)-N-((R)-1-(2-(三氟甲基)嘧啶-5-基)乙基)苯甲酰胺；

3-(5-甲基噻唑-2-基)-5-((四氢呋喃-3-基-3-d)氧基)-N-((R)-1-(2-(三氟甲基)嘧啶-5-基)乙基)苯甲酰胺；

3-(5-甲基噻唑-2-基)-5-(((R)-四氢呋喃-3-基-2,2-d2)氧基)-N-((R)-1-(2-(三氟甲基)嘧啶-5-基)乙基)苯甲酰胺。

本发明中，术语“可药用盐”和“药用可接受的盐”具有相同的含义。

本发明所述的药用可接受的盐可以通过在有机溶剂如乙腈、四氢呋喃中与相应的有机酸或无机酸反应制备，典型的有机酸有草酸、酒石酸、马来酸、琥珀酸、甲磺酸、苯甲酸、苯磺酸、甲苯磺酸、氨基磺酸、柠檬酸、谷氨酸、焦谷氨酸、天冬氨酸、葡糖醛酸、萘磺酸、戊二酸、乙酸、三氟乙酸、苹果酸、富马酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、乳酸、棕榈酸盐、硬脂酸、月桂酸、肉桂酸、海藻酸、抗坏血酸盐，典型的无机酸有硝酸、盐酸、硫酸、磷酸。

本发明化合物能够以如下形式存在：光学纯的对映异构体、纯的非对应异构体、对映异构体混合物、非对应异构体混合物、对映异构体外消旋混合物、外消旋物或外消旋物混合物。式(I)的化合物的全部可能的异构体、立体异构体和其混合物也在本发明的范围内。

本发明还提供了一种药物组合物，其包含上述至少一个化合物以及任选一种或多种医药上可接受的载体和/或添加剂。

本发明所提供的药物组合物可以制备为任何形式，例如颗粒、粉末、片剂、包衣片剂、胶囊、药丸、糖浆、滴剂、溶液、混悬剂和乳剂，或者活性成分的缓释制剂，其中胶囊剂的实例包括硬或软明胶胶囊剂，颗粒剂和粉剂可以是非泡腾或泡腾形式。

本发明的药物组合物可进一步包括一种或多种医药或生理上可接受的载体，这些载体将适当配制以便于给药。例如，医药或生理上可接受的载体可以是盐水、热压水、林格氏液、缓冲盐水、葡萄糖、麦芽糖糊精、甘油、乙醇及其混合物。本发明的药物组成物还可以包括医药或生理上可接受的添加剂，例如稀释剂、润滑剂、粘合剂、助流剂、崩解剂、甜味剂、矫味剂、湿润剂、分散剂、表面活性剂、溶剂、涂层剂、发泡剂、或芳香剂。

可以使用的稀释剂的实例包括但不限于乳糖、蔗糖、淀粉、高岭土、盐、甘露糖醇和磷酸二钙；润滑剂的实例包括但不限于滑石、淀粉、镁或钙的硬脂酸盐、石松子和硬脂酸；粘合剂的实例包括但不限于微晶纤维素、黄蓍胶、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶溶液、蔗糖和淀粉糊；助流剂的实例包括但不限于胶体二氧化硅；崩解剂的实例包括但不限于交联羧甲基纤维素钠、淀粉羟乙酸钠、藻酸、玉米淀粉、马铃薯淀粉、膨润土、甲基纤维素、琼脂和羧甲基纤维素；甜味剂的实例包括但不限于蔗糖、乳糖、甘露糖醇和人工甜味剂，例如环磺酸钠和糖精，和任意数量的喷雾干燥矫味剂；矫味剂的实例包括但不限于从植物提取的天然矫味剂，例如果实，和味道较好的化合物，例如但不限于薄荷和水杨酸甲酯；湿润剂的实例包括但不限于丙二醇一硬脂酸酯、脱水山梨醇一油酸酯、二甘醇一月桂酸酯和聚氧乙烯月桂基醚。

本发明的药物组合物可以根据传统方法来通过各种途径给药，包括口服、静脉内、动脉内、腹腔内、胸腔内、透皮、鼻腔、吸入、直肠、眼部和皮下导入。

任选地添加到本发明的药物组合物中的医药上可接受的载体是：水、醇、蜂蜜、甘露醇、山梨醇、糊精、乳糖、焦糖、明胶、硫酸钙、硬脂酸镁、滑石粉、高岭土、甘油、吐温、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、环糊精及其衍生物、磷脂类、磷酸盐类、淀粉类及其衍生物、硅衍生物、纤维素类及其衍生物、吡咯烷酮类、聚乙二醇类、丙烯酸树脂类、酞酸酯类、丙烯酸共聚物、苯三酸酯类中的一种或几种。

经药理实验验证，本发明所提供的化合物或者药物组合物可用于治疗呼吸系统疾病、泌尿生殖系统疾病和疼痛；所述呼吸系统疾病为哮喘、支气管痉挛、肺纤维化、急性咳嗽、慢性咳嗽；所述泌尿生殖系统疾病为子宫内膜异位症、子宫肌瘤、痛经、盆腔炎性疾病及膀胱过动症。

具体实施方式

实施例一3-(5-甲基噻唑-2-基)-5-(((R)-四氢呋喃-3-基-2,2,5,5-d4)氧基)-N-((R)-1-(2-(三氟甲基)嘧啶-5-基)乙基)苯甲酰胺(1)

第一步3-羟基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼烷-2-基)苯甲酸甲酯(1b)

化合物3-溴-5-羟基苯甲酸甲酯1a(7.0g，30mmol)，硼酸频哪醇脂(11.5g,45mmol)，乙酸钾(5.9g,60mmol),Pd(dppf)Cl2(2.7g,3mmol)加入到无水二氧六环(150mL)中，置换氮气，110度搅拌6小时，浓缩，过flash柱子得到化合物1b(8g，收率96％)。

MS m/z(ESI):279.1[M+1]⁺

第二步3-羟基-5-(5-甲基噻唑-2-基)苯甲酸甲酯(1c)

化合物1b(8g，28.7mmol)，2-溴-5-甲基噻唑(6g,34.5mmol)，

Pd(dppf)Cl2(2.6g,2.8mmol)，碳酸钾(7.9g,57.4mmol)溶于二氧六环(150mml)中，加入15ml水，置换氮气，110度搅拌6小时，浓缩，过flash柱子得到化合物1c(7g，收率99％)。MS m/z(ESI):250.2[M+1]⁺

第三步3-羟基-5-(5-甲基噻唑-2-基)苯甲酸(1d)

化合物1c(7g，28.1mmol)，溶于甲醇/THF(50ml/50ml)中，加入氢氧化锂(3.3g,140mmol)，加入10ml水，0度左右搅拌2小时，浓缩，加入40ml水，4N盐酸调PH至6-7，EA萃取4次，合并有机相，干燥，浓缩得到化合物1d(5g，收率75％)。

MS m/z(ESI):236.2[M+1]⁺

第四步(R)-3-羟基-5-(5-甲基噻唑-2-基)-N-(1-(2-(三氟甲基)嘧啶-5-基)乙基)苯甲酰胺(1f)

化合物1d(5g，21mmol)，化合物1e(4g，21mmol),HATU(11g,31mmol)溶于DMF中，滴入DIPEA(10g,84mmol)，室温搅拌2小时，加入水搅拌，EA萃取，浓缩，制备得到化合物1f(4.5g，收率52％)。

MS m/z(ESI):409.3[M+1]⁺

第五步(S)-2-(苄氧基)琥珀酸二乙酯(1h)

将(S)-2-羟基琥珀酸二乙酯(10.0g，52.6mmol，1.0eq)，氧化银(14.6g，63.1mmol，1.2eq)投于乙酸乙酯(50ml)中，加入BnBr(7.5ml，63.1mmol，1.1eq)，室温反应24h。过滤，浓缩，flash柱纯化得淡黄色液体1h(5.8g)。

MS m/z(ESI):281[M+1]⁺

第六步(S)-2-(苄氧基)丁烷-1,1,4,4-d4-1,4-二醇(1i)

将LiAlD4(1.2g，29.6mmol，1.3eq)投于无水THF(40ml)中，冰水浴冷却下，滴加化合物1h(6.4g，22.8mmol，1.0eq)THF(10ml)，加毕，继续反应10min。加入适量甲醇淬灭，浓缩，柱层析纯化得淡黄色油状物1i(3.6g)。

MS m/z(ESI):201[M+1]⁺

第七步(S)-3-(苄氧基)-2,2,5,5-d4-四氢呋喃(1j)

将化合物1i(3.6g，18.0mmol，1.0eq)溶于无水THF(50ml)中，冰水浴冷却下，分批加入NaH(2.2g，54.0mmol，3.0eq)，加毕，继续反应30min后，滴加TsCl(3.4g，18.0mmol，1.0eq)，加毕，继续反应1h。加入适量甲醇淬灭，浓缩，加入水(50ml)，乙酸乙酯(50ml×2)萃取，合并有机层，依次经brine洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析纯化得无色液体1j(2.5g)。

MS m/z(ESI):183[M+1]⁺

第八步(S)-四氢呋喃-2,2,5,5-d4-3-醇(1k)

将化合物1j(2.5g，13.7mmol，1.0eq)溶于(50ml)中，加入10％Pd-C(0.7g)，室温反应过夜，过滤，滤液直接用于下步反应。

第九步(S)-四氢呋喃-3-基-2,2,5,5-d4 -4-甲基苯磺酸酯(1l)

将上步滤液用冰水浴冷却，分批加入NaH(1.0g，25.0mmol，1.8eq)，继续反应30min，加入TsCl(2.6g，13.7mmol，1.0eq)，继续反应2h。加入适量甲醇淬灭，浓缩，加入brine(20ml)，分出有机层，水层用乙酸乙酯(20ml)萃取，合并有机层，经无水硫酸钠干燥后，浓缩，柱层析纯化得无色液体1l(1.2g)

MS m/z(ESI):247[M+1]⁺

第十步3-(5-甲基噻唑-2-基)-5-(((R)-四氢呋喃-3-基-2,2,5,5-d4)氧基)-N-((R)-1-(2-(三氟甲基)嘧啶-5-基)乙基)苯甲酰胺(1)

将化合物1f(300mg，0.73mmol，1.0eq)和化合物1l(0.22g，0.88mmol，1.2eq)，碳酸铯(0.36g，1.1mmol，1.5eq)投于DMF(5ml)中，90℃反应4h。冷至室温，加入水(30ml)，乙酸乙酯(30ml×2)萃取，合并有机层，经brine(30ml×2)洗涤，浓缩，制备柱纯化得白色固体1(180mg)。

MS m/z(ESI):483[M+1]⁺

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.96(s,2H),8.08(s,1H),7.60(s,1H),7.45(q,J＝2.3Hz,2H),5.36(t,J＝6.8Hz,1H),5.05(d,J＝5.9Hz,1H),2.57(s,3H),2.27(dd,J＝13.9,5.9Hz,1H),2.14(d,J＝13.5Hz,1H),1.73(d,J＝7.1Hz,3H).

实施例二3-(5-甲基噻唑-2-基)-5-(((R)-四氢呋喃-3-基-5,5-d2)氧基)-N-((R)-1-(2-(三氟甲基)嘧啶-5-基)乙基)苯甲酰胺(2)

第一步(S)-β-苄氧基-γ-丁内酯(2c)

将化合物2a(4.0g，39.2mmol)溶于DCM(80mL)，加入2,2,2-三氯乙酰胺苄酯(14.8g,58.8mmol)，降温至0℃下，滴加三氟甲磺酸(0.59g，3.92mmol)，滴完，反应液于室温反应16小时。LCMS检测部分原料残留，反应液加水(100mL)，DCM(80mL*2)萃取。合并有机相，饱和食盐水(50mL)洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩。残余物柱层析(EA/PE＝0-30％)得淡黄色油状化合物2c(2.6g,34.6％yield)。

LCMS(ESI-MS)m/z:193(M+H⁺).

第二步(S)-2-(苄氧基)丁烷-4,4-d2-1,4-二醇(2d)

将化合物2c(1.0g，5.2mmol)溶于THF(20mL)，降温至0℃下，分批加入氘代氢化锂铝(219mg,5.2mmol)，加完反应液于室温反应2小时。LCMS检测原料反应完毕，反应液依次用水(0.22mL)，15％NaOH溶液(0.22mL)，水(0.66mL)淬灭，过滤，浓缩。残余物柱层析(EA/PE＝0-30％)得无色油状化合物2d(650mg,63.1％yield)。

LCMS(ESI-MS)m/z:221(M+Na⁺).

第三步(S)-3-(苄氧基)-5,5-d2-四氢呋喃(2e)

将化合物2d(650mg，3.28mmol)溶于THF(10mL)，降温至0℃下，分批加入氢化钠(262mg,6.56mmol)，加完反应液于0℃反应1小时。将TsCl(623mg，3.28mmol)溶于THF(2mL)滴加到上述反应液中，滴完，反应液升温至室温反应3小时。LCMS检测原料反应完毕，反应液用饱和氯化铵溶液淬灭，加水(80mL)，EA(60mL X 2)萃取。合并有机相，饱和食盐水(50mL)洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩。残余物柱层析(EA/PE＝0-30％)得无色油状化合物2e(420mg,71.1％yield)。

LCMS(ESI-MS)m/z:181(M+H⁺).

第四步(S)-四氢呋喃-5,5-d2-3-醇(2f)

将化合物2e(320mg，1.77mmol)溶于THF(8mL)，加入10％钯碳(300mg)，反应液于氢气球下搅拌3小时。LCMS检测原料反应完毕，反应液过滤，浓缩得淡黄色油状粗品化合物2f(150mg,93.7％yield)。

第五步(S)-四氢呋喃-3-基-5,5-d2 -4-甲基苯磺酸酯(2g)

将化合物2f(150mg，1.66mmol)溶于DCM(5mL)，加入三乙胺(335mg,3.32mmol)、DMAP(21mg,0.17mmol)降温至0℃,将TsCl(317mg，1.66mmol)溶于THF(0.5mL)滴加到上述反应液中，反应液于室温反应3小时。LCMS显示反应完全，反应液加水(80mL)，DCM(60mL*2)萃取。合并有机相，饱和食盐水(50mL)洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩得淡黄色油状化合物2g(210mg,51.7％yield)。

LCMS(ESI-MS)m/z:267.1(M+Na⁺).

第六步3-(5-甲基噻唑-2-基)-5-(((R)-四氢呋喃-3-基-5,5-d2)氧基)-N-((R)-1-(2-(三氟甲基)嘧啶-5-基)乙基)苯甲酰胺(2)

将化合物2g(180mg，0.74mmol)溶于DMF(5mL)，加入化合物6(301mg,0.74mmol)、碳酸铯(722mg,2.22mmol),反应液于氮气保护90℃反应2小时.LCMS显示反应完全，反应液加水(80mL)，DCM(60mL X 2)萃取。合并有机相，饱和食盐水(50mL)洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩,残余物用Prep-HPLC纯化得白色固体化合物2(56mg,17.2％yield)。

LCMS(ESI-MS)m/z:481.3(M+H⁺).

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.93(s,2H),7.91(q,J＝1.5Hz,1H),7.53(t,J＝1.2Hz,1H),7.49(t,J＝1.9Hz,1H),7.37(p,J＝1.5Hz,1H),6.78(d,J＝6.6Hz,1H),5.35(p,J＝7.0Hz,1H),5.05(t,J＝4.1Hz,1H),4.03–3.96(m,2H),2.53(d,J＝1.2Hz,3H),2.25(dd,J＝13.6,6.1Hz,1H),2.13(d,J＝13.6Hz,1H),1.71(d,J＝7.2Hz,3H).

实施例三3-(5-甲基噻唑-2-基)-5-((四氢呋喃-3-基-3-d)氧基)-N-((R)-1-(2-(三氟甲基)嘧啶-5-基)乙基)苯甲酰胺(3A和3B)

第一步四氢呋喃-3-基-3-d–醇(3b)

取单口瓶，加入化合物3a(430mg，5mmol)溶于20mL无水THF中，反应液移至0℃，缓慢加入LiAlD₄(231mg，5.5mmol)，反应液在0℃下搅拌半小时，室温搅拌1小时。反应结束后，加入水合硫酸钠固体，抽滤，滤液浓缩至干。粗品加乙酸乙酯复溶。水洗2次，饱和氯化钠洗一次，浓缩至干，不经后处理直接进行下一步反应。

第二步四氢呋喃-3-基-3-d-对甲基苯磺酸酯(3c)

取单口瓶，依次加入化合物3b(上步粗品)，DCM(15ml)，TsCl(1.14g，6mmol)，DIEA(1.7g，10mmol)和DMAP(732mg，6mmol)。混合物在室温下搅拌过夜，反应结束后浓缩至干。乙酸乙酯复溶，水洗3～4次，饱和氯化钠水溶液洗1次，有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，经柱层析纯化得到标题化合物3c(106mg)，无色透明油状物。

LCMS:[2M+Na⁺]＝509

第三步3-(5-甲基噻唑-2-基)-5-((四氢呋喃-3-基-3-d)氧基)-N-((R)-1-(2-(三氟甲基)嘧啶-5-基)乙基)苯甲酰胺(3A和3B)

取单口瓶，依次加入3c(100mg，0.4mmol)，DMF(4mL)，1f(132mg，0.5mmol)和碳酸铯(37mg，0.7mmol)，反应在90℃下搅拌3小时。反应结束后，乙酸乙酯稀释，饱和氯化钠水溶液水洗3～4次，有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干，经柱层析纯化得到标题化合物3A和3B(72mg，白色固体)。

LCMS(ESI-MS)m/z:480.3(M+H⁺).

实施例四3-(5-甲基噻唑-2-基)-5-(((R)-四氢呋喃-3-基-2,2-d2)氧基)-N-((R)-1-(2-(三氟甲基)嘧啶-5-基)乙基)苯甲酰胺(4)

以(S)-α-羟基-γ-丁内酯替代(S)-β-羟基-γ-丁内酯(2c)，按照实施例2的方法可制备化合物4。

LCMS(ESI-MS)m/z:481.3(M+H⁺).

生物活性试验实验一、Fluorescence imaging plate reader(FLIPR)测定法筛选比较化合物对hP2X3和hP2X2/3受体的拮抗活性

细胞准备

将稳定转染hP2X3受体或稳定转染hP2X2/3受体的1321N1受体细胞消化，离心后用铺板培养基重悬并计数，在384孔测试板中每孔铺50微升(μL)细胞，置于5％ CO₂，37℃培养箱中培养16-24小时。

2.化合物准备

2.1供试品：用二甲基亚砜(DMSO)配制180倍所需浓度供试化合物，每孔取500纳升(nL)加到化合物板中，补充30微升(μL)测试缓冲液，振摇20-40分钟以混匀。

2.2激动剂：用测试缓冲液配制3倍所需浓度激动剂α，β-meATP，每孔加45微升(μL)激动剂到细胞板中。

3.染料孵育

取出细胞板，吸去细胞上清，每孔加入30微升(μL)染料(

钙4测定试剂盒，

Calcium 4Assay Kit，测试缓冲液稀释)，孵育1小时。

4.FLIPR检测

向细胞板中每孔加15微升化合物(FLIPR仪器加样)，15分钟后，每孔加22.5微升激动剂，检测荧光信号(激发光波长470纳米-495纳米，发射波长515纳米-575纳米)。

5.数据处理

取信号峰值和谷值的差值作为基础数据，在软件Graphpad Prism6上拟合化合物的抑制效应曲线并计算半数抑制浓度(IC₅₀)值。

6.实验结果

表1实施例化合物在1321N1-hP2X3受体细胞功能钙流试验中的结果

7.实验结论

以上方案测得结果表明，本发明所示的化合物在1321N1-hP2X3受体细胞功能钙流试验中显示出较好的抑制作用及较好的选择性。

实验二、本发明化合物在大鼠中药物代谢动力学实验

1.实验目的

以SD大鼠为例，以液相色谱-串联质谱(LS/MS/MS)法测定了大鼠分别灌胃和静脉给予实施例化合物后不同时刻血浆中药物浓度并计算相关药代参数，评价本发明实施例化合物在大鼠体内的药代动力学特性。

2.试验方案

2.1试验药物

实施例1化合物、实施例2化合物、实施例3化合物、实施例4化合物、BAY1817080；2.2试验动物

健康成年的SD大鼠，SPF级，雄性，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号SCXK(沪)2018-0006。

2.3药物配置

称取一定量的化合物，溶于5％二甲基亚砜(DMSO)，然后加入5％蓖麻油，最后加入90％生理盐水，超声，配置成均一的溶液。

2.4给药

具体给药按照试验方案进行，详情见表2。

表2.大鼠药代动力学试验方案

2.5采血时间及样品处理

口服给药后15分钟、0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时及24小时，静脉给药后5分钟、15分钟、0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时及24小时分别通过眼眶采血，每次采血0.2毫升(mL)，置于抗凝管中，混匀，保存于-20℃冰箱中备用。

3.样品测试及数据分析

采用液相色谱-串联质谱(LS/MS/MS)方法测定大鼠全血中化合物的含量。

利用WinNonLin5.3软件的非房室模型计算给药后化合物的药代动力学参数。

4.试验结果

本发明化合物给药后药代动力学参数见以下表3。由表3所示，本发明的化合物具有较好的代谢特征及生物利用度。

表3.本发明的化合物的药代动力学参数

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5.试验结论

药代结果表明，本发明实施例化合物1、2、3、4在大鼠体内表现为吸收速度适中，暴露量AUC和最大血药浓度Cmax较高且生物利用度较高的药代动力学特征。

实验三、本发明化合物的肝微粒体代谢稳定性试验

1.试验目的

使用不同种属(小鼠、大鼠、犬、人)肝微粒体代谢酶系统研究实施例化合物的体外肝微粒体代谢稳定性。

2.试验步骤

2.1微粒体孵育

精密称量一定质量的化合物，以100％二甲基亚砜(DMSO)溶解获得浓度为10毫摩尔(mM)的储备液。以乙腈和水按一定比例稀释储备液获得浓度为100微摩尔(μM)的工作溶液。

代谢稳定性实验在96深孔板中进行，两个复孔。每个孔内加入肝微粒体，对照化合物或受试物，氯化镁(MgCl₂)，及磷酸盐缓冲液，在37℃预孵5分钟后加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)起始反应。阴性对照组用等体积磷酸盐缓冲液取代NADPH。反应体系总体积为250μL，其中各组分的终浓度为肝微粒体蛋白0.5mg/mL，化合物1μM，NADPH 1.0mM。孵育0、5、10、20、40分钟后加入3-5倍体积含有内标的冰乙腈终止反应。阴性对照组仅在孵育0、40分钟终止反应。

2.2液质联用分析

2.2.1仪器

色谱系统为ACQUITY UPLC高效液相色谱系统(Waters，美国)。质谱系统为ABSciex API4000三级四级杆质谱配备电喷雾电离源(ESI)(Applied Biosystems，加拿大)。用于控制液质联用仪和定量分析的软件为Analyst 1.6(Applied Biosystems，加拿大)。

2.2.2色谱条件

流动相梯度见表2：

表4.液相条件

2.2.3质谱条件

表5.质谱条件

2.3样品准备

不同时间点所取样品加入3倍体积含内标的乙腈，以4000转离心20分钟，取上清混合相等体积的水后进行LC-MS/MS分析。

2.4数据分析

以孵育体系中药物的剩余率的对数值对孵育时间作图，进行线性回归得到斜率k，按公式计算体外消除半衰期T_1/2(分钟)；根据公式可计算内在清除率(CLint，毫升/分钟/毫克)；根据公式按不同种属动物生理系数(即a、b、d值)换算可推导出肝脏的内在(表观)清除率(CLapp，mL/min/kg)；在考虑到肝血流量的情况下根据公式可推导出肝脏总清除率(CLh，mL/min/kg)；根据公式可计算出肝提取率(Eh，Hepatic extraction ratio)。不同种属的生理系数和肝血流量见表4。

表6.不同种属动物的相关生理系数和肝血流量

3.试验结果

表7实施例化合物的消除半衰期、清除率和肝提取率

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4.试验结论

实施例化合物1、2、4在小鼠、大鼠、人和犬上均显示出中等肝摄取率，而实施例化合物3在小鼠、大鼠、人和犬上均显示出低肝摄取率，说明实施例化合物3在以上种属肝微粒体代谢稳定性较高。

实验四、本发明化合物的SD大鼠味觉敏感性试验

1.试验目的

观察实施例化合物对SD大鼠味觉的影响

2.试验方案

2.1试验动物

健康成年的SD大鼠，SPF级，雄性，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号SCXK(沪)2018-0006。

2.2奎宁水溶液及实施例化合物的配制

称取适量的奎宁单盐酸二水合物，用超纯水配置成浓度3mM的溶液备用。另称取适量的实施例化合物，用5％二甲基亚砜(DMSO)+5％蓖麻油+90％生理盐水配置为目标浓度备用。

2.3试验步骤

2.3.1分组：试验开始前1天，根据大鼠体重将其随机分为6组，每组10只，分别为溶剂对照组，实施例1化合物10mg/kg组、实施例2化合物10mg/kg组，实施例3化合物10mg/kg组、实施例4化合物10mg/kg组，BAY1817080 10mg/kg组，并于给药前16小时禁水，不禁食。

2.3.2给药：试验当天按试验设计进行大鼠给药。

2.3.3饮水量测量：给药后的大鼠放回原来的笼子，给药一定时间后在每个笼子轻柔地放入一瓶灭菌的自来水，一瓶含3mM盐酸奎宁的灭菌自来水，所有笼子的水瓶放置的左右位置一致。让动物自由饮水30分钟后，分别测量两瓶水的饮用量。

2.3.4数据统计：计算奎宁水饮用量占总饮水量的百分比，用方差分析比较各组间的差异有无显著性差异。

3.试验结果

表8各组SD大鼠正常自来水和含奎宁的苦味水的饮水量结果

4.试验结论

实施例3给药组苦味水的饮用量与溶媒组相似，而实施例2给药组及阳性对照BAY1817080组SD大鼠苦味水的饮用量明显增加，实施例1给药组与实施例4给药组苦味水的饮用量也有所增加，表明在本试验条件下实施例化合物3对大鼠味觉没有明显影响。实验五、本发明化合物的hERG检测

1.试验目的

使用电生理手动膜片钳方法测试化合物对hERG钾通道(human Ether-a-go-goRelated Gene potassium channel)电流的影响。

2.试验方法

2.1细胞培养和处理

稳定表达hERG的CHO(Chinese Hamster Ovary)细胞培养于直径35毫米(mm)的细胞培养皿中，置于37℃，5％ CO₂的培养箱培养，每48小时按1:5比例进行传代。试验当天，吸走细胞培养液，用细胞外液淋洗一遍后加入0.25％胰蛋白酶，在室温下消化3-5分钟。吸走消化液，用细胞外液重悬后将细胞转移到用于电生理记录的实验皿中备用。

2.2化合物准备

测试当天，将化合物二甲基亚砜(DMSO)母液用100％二甲基亚砜进行3倍连续稀释成中间浓度。

然后再取10微升(μL)的化合物中间浓度加入到4990微升(μL)细胞外液中，500倍稀释得到需要测试的最终浓度。

阳性对照化合物西沙必利准备：稀释得到需要测试的最终浓度300纳摩尔每升(nM)。

最终测试浓度中的二甲基亚砜(DMSO)含量不超过0.2％，此浓度对hERG钾通道没有影响。

2.3电生理记录过程

稳定表达hERG钾通道的CHO(Chinese Hamster Ovary)细胞，在室温下用全细胞膜片钳技术记录hERG钾通道电流。玻璃微电极由玻璃电极毛胚(BF150-86-10，Sutter)经拉制仪拉制而成，灌注电极内液后的尖端电阻为2-5毫欧(MΩ)左右，将玻璃微电极插入放大器探头即可连接至膜片钳放大器。钳制电压和数据记录由pClamp 10软件通过电脑控制和记录，采样频率为10千赫兹(kHz)，滤波频率为2千赫兹(kHz)。在得到全细胞记录后，细胞钳制在-80毫伏(mV)，诱发hERG钾电流(I _hERG)的步阶电压从-80毫伏(mV)给予一个2秒的去极化电压到+20毫伏(mV)，再复极化到-50毫伏(mV)，持续1秒后回到-80毫伏(mV)。每10秒给予此电压刺激，确定hERG钾电流稳定后(1分钟)开始给药过程。化合物每个测试浓度给予1分钟。化合物每个浓度至少测试2个细胞(n≥2)。

2.4数据处理

数据分析处理采用pClamp 10，GraphPad Prism 5和Excel软件。不同化合物浓度对hERG钾电流(-50毫伏(mV)时诱发的hERG尾电流峰值)的抑制程度用以下公式计算：Inhibition％＝[1–(I/Io)]×100％

其中，Inhibition％代表化合物对hERG钾电流的抑制百分率，I和Io分别表示在加药后和加药前hERG钾电流的幅度。

化合物IC₅₀使用GraphPad Prism 5软件通过以下方程拟合计算得出：

Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC₅₀-X)*HillSlope))

其中，X为供试品检测浓度的Log值，Y为对应浓度下抑制百分率，Bottom和Top分别为最小和最大抑制百分率。

3.试验结果

试验结果如表9所示：

表9实施例化合物hERG检测结果

4.试验结论

实施例化合物1、实施例化合物2、实施例化合物3及实施例化合物4的hERG IC₅₀均大于40μM，心脏安全性较好，而BAY1817080的hERG IC₅₀为小于40μM，存在一定心脏安全性风险。

Claims (7)

1.一种具备如下式(I)所示结构的化合物或其药学可接受的盐，

其特征在于，式(I)中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅各自独立地为氢或氘；R₁、R₂、R₃、R₄、R₅不会同时为氢，当R₅为氘时，R₁、R₂、R₃、R₄均为氢。

2.根据权利要求1所述的化合物或其药学可接受的盐，其特征在于，当R₃、R₄为氘时，R₁、R₂均为氢或均为氘；当R₃、R₄为氢时，R₁、R₂均为氘，R₅为氢。

3.根据权利要求1所述的化合物或其药学可接受的盐，其特征在于，所述化合物选自下列的化合物：

3-(5-甲基噻唑-2-基)-5-(((R)-四氢呋喃-3-基-2,2,5,5-d4)氧基)-N-((R)-1-(2-(三氟甲基)嘧啶-5-基)乙基)苯甲酰胺；

3-(5-甲基噻唑-2-基)-5-(((R)-四氢呋喃-3-基-5,5-d2)氧基)-N-((R)-1-(2-(三氟甲基)嘧啶-5-基)乙基)苯甲酰胺；

3-(5-甲基噻唑-2-基)-5-((四氢呋喃-3-基-3-d)氧基)-N-((R)-1-(2-(三氟甲基)嘧啶-5-基)乙基)苯甲酰胺；

3-(5-甲基噻唑-2-基)-5-(((R)-四氢呋喃-3-基-2,2-d2)氧基)-N-((R)-1-(2-(三氟甲基)嘧啶-5-基)乙基)苯甲酰胺。

4.一种药物组合物，其特征在于，其包含根据权利要求1-3任一项所述的化合物或其药学可接受的盐，和药学可接受的载体、赋形剂、稀释剂、增稠剂、辅料、防腐剂中的一种或多种。

5.一种根据权利要求1-3任一项所述的化合物或其药学可接受的盐在制备P2X3拮抗剂中的用途。

6.根据权利要求1-3任一项所述的化合物或其药学可接受的盐，或者根据权利要求4所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗P2X3介导的相关疾病的药物中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其中所述P2X3介导的相关疾病包括呼吸系统疾病、泌尿生殖系统疾病和疼痛；所述呼吸系统疾病为哮喘、支气管痉挛、肺纤维化、急性咳嗽、慢性咳嗽；所述泌尿生殖系统疾病为子宫内膜异位症、子宫肌瘤、痛经、盆腔炎性疾病及膀胱过动症。