CN116391047A - 用于核酸检测和疾病诊断的基于质谱的方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及使用质谱来检测核酸的方法。本公开还涉及通过检测样品中靶核酸分子的存在来检测疾病诸如HIV和COVID‑19的核酸和/或诊断这些疾病的方法。本公开还涉及用于检测核酸以及用于检测疾病诸如HIV和COVID‑19的核酸和/或诊断这些疾病的试剂盒。

Description

用于核酸检测和疾病诊断的基于质谱的方法和试剂盒
相关申请
本PCT申请要求于2020年10月26日提交的美国申请序列号63/105,554的优先权,其以引用方式并入本文。
技术领域
本公开涉及用于使用质谱来检测和测量靶核酸的方法和试剂盒。此外,本公开涉及用于疾病诊断的方法和试剂盒。
引言
准确检测和定量生物分子的能力在包括基础生物化学研究、诊断和治疗医学以及水和食品安全的多个领域中是非常重要的。处于目前方法检测的边缘处的许多潜在的诊断DNA分子和治疗性蛋白质需要被绝对定量。通过半定量“计数”方法(诸如聚合酶链反应(PCR)扩增和聚苯乙烯寡聚合成微珠上的DNA测序)发现的生物学上重要的核酸已揭示了重要的分子(Consortium,2011),这些分子需要通过线性和高斯型杂交测定与标准品一起被绝对定量。目前的技术(诸如PCR)在测定时无法定量处于仄摩尔(10-21)至幺摩尔(10-24)量的这些水平的分子(Rutledge,2003)。
PCR(Chin,2013)已被用于检测小至单个聚合酶模板,但这是非线性的,可能显示假阴性结果,具有较大的定量误差,并且从PCR反应中提取绝对定量的数学程序令人望而生畏(Rutledge,2003)。通过PCR分析HIV和其他动物病毒具有显著的假阴性率(Xie,2020;Xiao,2020)。据报道,杂交和杂交链反应具有宽泛的灵敏度值范围(Basiri,2020;Santhanam,2020;Doddapaneni,2020;Jiao,2020;Vermisoglou,2020)。基于定量DNA的测定在固体载体上的近期应用可能已达到皮摩尔(pM)浓度范围,或者使用荧光(其使用宽吸收范围)、使用本质上不是线性和高斯型的电化学检测或TIRF,或者使用通过PCR或HCR进行多轮扩增然后进行酶扩增的方案,该酶扩增可能显示误差倍增(Xu,2016)Shi,Guo,Xiong和/或超灵敏的参照物。相反,质谱更特定于单个质荷比而不是广谱,质谱本质上是线性和高斯型的,并且可用一轮酶扩增来扩增以达到pM或更低的浓度范围。
荧光的全内反射(TIRF)可用于DNA序列中核苷酸的定性检测(Vandamme,1995)。然而,该信号是非线性的,使得该校准可能输出1000倍(Tobos,2019;Tangemann,1995),并且依赖于定性数据的集合,这妨碍了安全检测限的计算(Rissin,2010)。来自TIRF的定量具有实际限制性,并且最近显示提供与使用辣根过氧化物酶(HRP)的酶扩增的那些结果类似的结果(Li,2017)。
质谱是一种线性和高斯型分析技术(Razumienko,2008;Bowden,2012),该技术检测100皮摩尔浓度(100pM)的腺苷,其中1微升注射(1μL)相当于在酶扩增之前柱上的100阿摩尔(100amol)(Florentinus,2011;Onisko,2007)。
液相色谱电喷雾电离串联质谱(LC-ESI-MS/MS)与其他方法相比具有一些有效优点:无需免疫或酶扩增即可直接检测血液中的蛋白质到ng/ml水平(Munge,2005)。
免疫基质辅助激光解吸/电离(MALDI)直接分析蛋白质或肽的免疫复合物(Li,2017),但对DNA并不适用。此外,其信号不受益于酶扩增,并且仅达到ng/ml灵敏度。
类似地,液相色谱电感耦合等离子体质谱(LC-ICP-MS)通常可达到与ELISA的现有检测限类似的ng/ml水平(Shukla,2013)。
据报道,现有的电化学方法达到幺摩尔范围。然而,该信号本质上不是线性或高斯型的(Saiki,1985;Rissin,2010)。
UV/VIS检测不如质谱分析法灵敏或特异;但酶扩增和UV/VIS检测的组合有效地提高了UV/VIS分析的灵敏度。通过碱性磷酸酶(AP)、DNA聚合酶、辣根过氧化物酶或荧光素酶进行的酶扩增的使用已经提高了诸如UV-VIS、ECL或荧光检测等方法的有用灵敏度(Ronaghi,1996;Chen,1994;Florentinus-Mefailoski,2014;Walt,2013;Munge,2005;Saiki,1985;Sun,2006;Shukla,2013;Chin,2013;Tobos,2019;Vandamme,1995;Tangemann,1995;Tucholska,2009;Li,2017;Razumienko,2008;Bowden,2012;Florentinus-Mefailoski,2015;Florentinus,2011;Onisko,2007)。
使用酶联免疫质谱测定(ELiMSA),蛋白质和抗体先前已在聚苯乙烯载体上使用含脱氧胆酸盐或N-辛基葡糖苷修饰的且LC-ESI-MS兼容的蛋白质相互作用缓冲液的96孔板进行绝对定量(Florentinus-Mefailoski,2014;Florentinus-Mefailoski,2016;Florentinus-Mefailoski,2014;Florentinus-Mefailoski,2015)。ELiMSA测定已在美国专利号9,964,538中有所描述。与达到纳克量的蛋白质的传统比色酶联免疫吸附测定(ELISA)的直接测量相比,ELiMSA使用碱性磷酸酶链霉亲和素(APSA)酶缀合物对蛋白质的检测已达到皮克灵敏度,可检测到50飞克(Florentinus-Mefailoski,2015)。
使用APSA酶缀合物对前列腺特异性抗原(PSA)和抗体的检测在正相二氧化硅固定相上达到高幺摩尔范围(Florentinus-Mefailoski,2014;Florentinus-Mefailoski,2015;Florentinus-Mefailoski,2016)。通过ELiMSA进行的蛋白检测是盲测的,以显示在高浓度下与商业荧光和ECL系统一致的结果,但是更加灵敏并且继续显示远低于1ng/ml(飞摩尔范围)的线性定量(Florentinus-Mefailoski,2015)。
通过质谱对核酸进行定量可能是困难的。例如,通常用于核酸结合、杂交和反应的缓冲液含有盐,诸如NaCl,以促进核酸相互作用。然而,无机盐诸如NaCl不能容易地用于质谱测量。
因此,需要用于对核酸进行检测和定量的线性和高斯型测定,这些测定在低浓度下是灵敏的,例如其中核酸以飞摩尔至阿摩尔浓度的范围存在,并且/或者优选与MS兼容。
发明内容
目前研究表明,来自例如生物样品或PCR反应产物的低浓度的靶核酸分子可被灵敏地且特异性地检测和定量。本文所述的方法包括:将选择性捕获和/或检测寡核苷酸探针的使用与报道酶(诸如碱性磷酸酶(AP))的酶活性的测量相结合进行扩增以通过质谱(MS)方法进行检测。此外,研究表明,当PCR反应的至少一个引物用二级靶部分诸如生物素进行官能化时,PCR产物可用报道酶检测探针直接检测和定量,该报道酶检测探针与该二级靶部分结合,并且该报道酶检测探针具有放大PCR产物的存在以通过MS检测的酶活性。
此外,研究表明,挥发性缓冲液可用于替代一种或多种缓冲液中的盐(诸如NaCl),以使MS分析中的残余盐最小化。
本公开的方法可用作具有选择性的且灵敏的诊断方法。
因此,在一个方面,本公开包括一种检测靶核酸分子的方法,该方法包括a.
i.在第一结合溶液中孵育样品与捕获寡核苷酸探针,该样品假定包含该靶核酸分子,该捕获寡核苷酸探针包含与该靶核酸分子互补的序列,并且该捕获寡核苷酸探针附接到固相,任选地其中该固相通过接头附接到该捕获寡核苷酸探针;或者
ii.在第一结合溶液中孵育样品与固相,该样品假定包含该靶核酸分子,以将所述样品/靶核酸分子附接到所述固相,任选地其中该固相通过接头附接到该样品/靶核酸分子;
b.在形成靶:检测探针复合物的条件下,在第二结合溶液中使任何靶核酸分子与检测寡核苷酸探针结合;
c.在形成靶:检测探针:酶复合物的条件下,在第三挥发性结合溶液中孵育任何靶:检测探针复合物与报道酶检测探针,该第三挥发性结合溶液基本上不含无机盐,诸如NaCl;
d.用洗涤溶液洗涤固相,以除去任何未结合的报道酶检测探针;
e.在底物反应溶液中孵育任何靶:检测探针:酶复合物与报道酶检测探针底物,以产生一种或多种可电离产物;以及
f.使用质谱(MS)检测该一种或多种可电离产物中的至少一种可电离产物,
其中
i.第一结合溶液、第二结合溶液和第三结合溶液中的至少第三结合溶液基本上不含无机盐;
ii.洗涤溶液基本上不含无机盐;
iii.该方法还包括在任选的步骤d)和步骤e)之前交联任何靶:检测探针:酶复合物的组分和捕获寡核苷酸探针;并且/或者
iv.该方法还包括在使用MS检测之前分离一种或多种可电离产物;并且
其中对一种或多种可电离产物中的至少一种可电离产物的检测指示样品包含靶核酸分子。
该检测寡核苷酸探针可以是检测寡核苷酸引物。在这种情况下,该步骤包括在扩增溶液中用检测寡核苷酸引物扩增靶核酸分子,并且在形成靶:检测探针复合物的条件下,在第二结合溶液中使任何经扩增的靶与该检测寡核苷酸探针结合。
在另一个方面,本公开包括一种定量样品中靶核酸分子的量的方法,该方法包括以下步骤:
a.根据本公开的方法检测靶核酸分子;以及
b.基于通过质谱检测的可电离产物中的一种或多种可电离产物的信号的强度来定量样品中靶核酸分子的量。
在另一个方面,本公开包括一种检测靶核酸分子的方法,该方法包括
用经修饰的引物和第二引物对推定包含靶核酸分子的测试样品进行核酸扩增,诸如聚合酶链反应(PCR)或杂交链反应(HCR)或滚环反应或其他核酸反应,以获得经扩增的核酸产物,即任选的PCR产物,该经扩增的核酸产物包含该经修饰的引物,该经修饰的引物用二级靶部分或报道酶进行官能化;
分离该经扩增的核酸产物与任何未反应的经修饰的引物;
当该经修饰的引物用该二级靶部分进行官能化时,在形成经扩增的核酸产物:报道酶复合物的条件下,在第一结合溶液中孵育该经扩增的核酸产物与报道酶检测探针,并用洗涤溶液除去任何未结合的报道酶检测探针,该报道酶检测探针包含二级靶结合部分和报道酶;
在底物反应溶液中孵育该经扩增的核酸产物或该经扩增的核酸产物:报道酶复合物与报道酶底物,以产生一种或多种可电离产物;以及
使用质谱(MS)检测该一种或多种可电离产物,
其中当经修饰的引物是正向引物时,第二引物是反向引物,并且其中当经修饰的引物是反向引物时,第二引物是正向引物。
在另一个方面,本公开包括一种定量测试样品中靶核酸分子的量的方法,该方法包括以下步骤:
a.根据检测本公开的靶核酸分子的方法检测靶核酸分子;以及
b.基于通过质谱检测的可电离产物中的一种或多种可电离产物的信号的强度来定量测试样品中靶核酸分子的量。
在另一个方面,本公开包括一种检测HIV的方法,该方法包括检测本公开的靶核酸分子的方法,其中该靶核酸分子是HIV核酸分子。
在另一个方面,本公开包括一种检测SARS-CoV2的方法,该方法包括检测本公开的靶核酸分子的方法,其中该靶核酸分子是SARS-CoV2核酸分子。
在另一个方面,本公开包括一种试剂盒,该试剂盒包括:
i.捕获寡核苷酸探针,该捕获寡核苷酸探针任选地通过接头与固相任选地结合;
ii.结合溶液,该结合溶液包含挥发性缓冲液并且基本上不含NaCl,或者包含交联剂;
iii.检测寡核苷酸探针,该检测寡核苷酸探针包含寡核苷酸和二级靶部分;
iv.报道酶检测探针,该报道酶检测探针包含报道酶和能够结合该二级靶部分的二级靶结合部分;和/或
v.以下中的一者或多者:如本文所述的底物、固相、标准品,即任选的产物离子标准品,该标准品任选地用于制备标准曲线或调整校准物;第二结合溶液、第三结合溶液、底物反应溶液、电离溶液、淬灭溶液,即任选的第二结合溶液、检测探针溶液、底物反应溶液、淬灭溶液、电离溶液。
在另一个方面,本方面包括一种试剂盒,该试剂盒包括:
i.经修饰的引物,该经修饰的引物用二级靶部分或报道酶进行官能化;
ii.第二引物;
iii.报道酶检测探针,当该经修饰的引物用该二级靶部分进行官能化时,该报道酶检测探针包含报道酶和能够结合该二级靶部分的二级靶结合部分;和
iv.以下中的一者或多者:如本文所述的底物、固相、标准品,即任选的产物离子标准品,该标准品任选地用于制备标准曲线或调整校准物;结合溶液、第二结合溶液、洗涤溶液、底物反应溶液、电离溶液、淬灭溶液,即任选的结合溶液、第二结合溶液、检测探针溶液、底物反应溶液、淬灭溶液、电离溶液,
其中当经修饰的引物是正向引物时,第二引物是反向引物,并且当经修饰的引物是反向引物时,第二引物是正向引物。
在另一个方面,本公开包括一种序列选自SEQ ID 2至37的核酸。
根据以下详细描述,本公开的其他特征和优点将变得显而易见。然而,应当理解,详细描述和具体实施例在指示本公开的优选实施方案时仅以举例说明的方式给出,因为根据该详细描述,在本公开的实质和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
附图说明
现在将本公开的实施方案描述于相关的附图中,其中:
图1是显示在没有真空的情况下使用吸附到0.45微米PVDF 96孔滤板上的捕获寡核苷酸探针进行的病毒DNA检测的一系列图。小图A示出了空白(Tris缓冲液)、无靶核酸分子(0靶)和100fmol靶核酸分子(100fmol靶)在268[M+H]+处的MS信号强度。小图B和小图C示出了从200m/z到400m/z的扫描。小图D示出了与100fmol靶核酸分子相比的无靶核酸分子的信号强度。
图2是显示在经聚赖氨酸涂覆的96孔聚苯乙烯板中通过NHS-PEG-NHS交联捕获寡核苷酸探针来对该板进行病毒DNA检测的一系列图。小图A示出了空白(Tris缓冲液)、无靶核酸分子(0靶)和100fmol靶核酸分子(100fmol靶)在268[M+H]+处的MS信号强度。小图B和小图C示出了从200m/z到400m/z的扫描。小图D示出了与100fmol靶核酸分子相比的无靶核酸分子的信号强度。
图3是显示使用固定在胺反应性Nunc ImmobilizerTM氨基96孔聚苯乙烯板上的捕获寡核苷酸探针进行的病毒DNA检测的一系列图。小图A示出了空白(Tris缓冲液)、无靶核酸分子(0靶)和100fmol靶核酸分子(100fmol靶)在268[M+H]+处的MS信号强度。小图B和小图C示出了从200m/z到400m/z的扫描。小图D示出了与100fmol靶核酸分子相比的无靶核酸分子的信号强度。
图4是显示使用固定在NOS表面化学96孔聚苯乙烯反应板上的捕获寡核苷酸探针进行的病毒DNA检测的一系列图。小图A示出了空白(Tris缓冲液)、无靶核酸分子(0靶)和100fmol靶核酸分子(100fmol靶)在268[M+H]+处的MS信号强度。小图B和小图C示出了从200m/z到400m/z的扫描。小图D示出了与100fmol靶核酸分子相比的无靶核酸分子的信号强度。
图5是显示在96孔PVDF滤板中通过与聚苯乙烯寡聚合成小珠具有3’连接的捕获寡核苷酸探针进行病毒DNA检测的一系列图。小图A示出了空白(Tris缓冲液)、无靶核酸分子(0靶)和100fmol靶核酸分子(100fmol靶)在268[M+H]+处的MS信号强度。小图B和小图C示出了从200m/z到400m/z的扫描。小图D示出了与100fmol靶核酸分子相比的无靶核酸分子的信号强度。
图6是显示在氨基甲硅烷基化的盖玻片上通过NHS-PEG-NHS交联捕获寡核苷酸探针来对该玻璃进行病毒DNA检测的一系列图。小图A示出了空白(Tris缓冲液)、无靶核酸分子(0靶)和100fmol靶核酸分子(100fmol靶)在268[M+H]+处的MS信号强度。小图B和小图C示出了从200m/z到400m/z的扫描。小图D示出了与100fmol靶核酸分子相比的无靶核酸分子的信号强度。
图7是显示使用在96孔板中与聚苯乙烯寡聚合成小珠结合的捕获寡核苷酸探针来优化结合缓冲液中的NaCl以检测HIV DNA的结果的一系列图。小图A示出了不同浓度的NaCl在268.2m/z处两次注射的平均信号强度。小图B示出了每次运行的信号强度。(B是含有Tris缓冲液的空白;0、0.05、0.1、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5和2.0表示NaCl的摩尔浓度;0tgt是没有任何靶核酸分子)
图8是显示在96孔0.45μm高结合PVDF滤板中与聚苯乙烯寡聚合成小珠连接的捕获寡核苷酸探针杂交期间和之后,优化结合缓冲液中的碳酸氢铵以检测HIV DNA的结果的一系列图表。小图A示出了作为比较物的不同浓度的碳酸氢铵和1M NaCl在268.2m/z处两次注射的平均信号强度。小图B示出了每次运行的信号强度。(B是含有Tris缓冲液的空白;0、0.1、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5表示碳酸氢铵的摩尔浓度)
图9是显示在96孔0.45μm高结合PVDF滤板中与连接到聚苯乙烯寡聚合成小珠的捕获寡核苷酸探针杂交后,用不同挥发性缓冲液:乙醇胺、乙酸铵、碳酸氢铵和碳酸氢三乙铵替代1.5M NaCl的HIV DNA的结果的一系列图。小图A示出了在X轴上所示浓度下的不同浓度的各种挥发性缓冲液和作为比较物的1.5M NaCl在268.2m/z处两次注射的平均信号强度。小图B示出了每次运行的信号强度。(Rxn缓冲液是含有Tris缓冲液的空白)
图10示出了显示HIV靶DNA检测的MS信号强度的图,其中在检测酶(APSA)结合步骤和洗涤步骤中使用不同百分比(10%至55%)的乙醇(柱5至柱10)。柱1至柱3呈现了阴性对照的结果,包括反应缓冲液对照(柱1)、在检测酶(APSA)结合步骤或洗涤步骤中没有盐的对照(柱2),以及其中在杂交步骤中使用1.5M NaCl并且在检测酶(APSA)结合步骤和洗涤步骤中不使用NaCl的对照(柱3)。柱4呈现了阳性对照,其中在杂交步骤以及检测酶(APSA)结合步骤和洗涤步骤中使用1.5M NaCl。
图11示出了在SARS-CoV2 DNA检测测定中在m/z=267.74–268.74处测量的MS信号强度的图,其中在杂交步骤、检测酶(APSA)结合步骤和洗涤步骤中使用1.5M NaCl、2M乙醇胺、0.5M三乙基碳酸氢铵、2M蔗糖或2M甘氨酸,或者其中在杂交步骤中使用1.5M NaCl并且在检测酶(APSA)结合步骤和洗涤步骤中不使用NaCl而使用2M乙醇胺、0.5M三乙基碳酸氢铵、2M蔗糖或2M甘氨酸。
图12示出了实施例11的PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶,其中泳道1对应于直接装载宽范围分子量标记物(5μl),泳道2对应于用引物组合1获得的PCR产物,泳道4对应于用引物组合2获得的PCR产物,泳道6对应于用引物组合3获得的PCR产物,泳道4对应于用引物组合4获得的PCR产物,泳道3、5、7和9对应于其中无模板质粒DNA运行的对照,并且泳道10对应于阴性对照(4μl DNA装载缓冲液)。
图13示出了一种聚丙烯酰胺凝胶,该聚丙烯酰胺凝胶示出了使用SARS-CoV2 Set1PCR引物(SEQ ID No 2和3)和来自0模板(泳道0)、痕量模板(泳道1)和线性稀释系列(0.1ng、1ng、10ng、50ng,泳道2至5)的不同量的模板的SARS-CoV2的PCR扩增产物。泳道6至10示出了使用10ng模板和不同量的Mg2+(分别为2mM、2.5mM、3.0mM、3.5mM或4.0mM Mg2+)的PCR产物。
图14示出了通过本公开的DNA检测测定使用捕获寡核苷酸探针(SEQ ID No.6)检测SARS-CoV2核衣壳基因的PCR产物而观察到m/z=267.74–268.74处的MS信号的相对丰度的图,该捕获寡核苷酸探针在无模板DNA(0NC)、PuC19作为模板DNA(PCR的阴性对照)、痕量的携带SARS-CoV2核衣壳基因(T)的质粒和不同量(10fg、100fg、1pg、10pg和100pg,分别对应于10、100、1000、10,000和100,000)的携带SARS-CoV2核衣壳基因的质粒的情况下,附接到3’和5’-生物素酰化检测寡核苷酸(SEQ ID No.5)处的固体载体。
图15A示出了说明例如假设的PCR或其他产物的检测的示例性示意图。核酸靶可以是DNA或RNA。
图15B示出了说明例如PCR产物的检测的示意图。引物可由A/B表示,表明该引物可以是未标记的或例如用生物素标记的,或者由C/D表示,表明该引物可以是未附接到固体表面的或者附接到固体表面的。
图16示出了DNA检测测定在m/z=267.74-268.74处测量的MS信号强度的图,其中(i)在盐的存在下进行杂交步骤和洗涤步骤,(ii)在盐的存在下进行杂交步骤以及APSA的结合,随后在Tris缓冲液中的酶反应发生之前交联靶:检测探针:酶复合物与戊二醛(GA),(iii)在盐的存在下进行杂交步骤以及APSA的结合,随后用包含碳酸氢铵缓冲液(AMBIC)或乙醇胺缓冲液(EA)的挥发性洗涤溶液洗涤,并且在包含碳酸氢铵缓冲液(AMBIC)或乙醇胺缓冲液(EA)的挥发性底物反应缓冲液中进行酶反应,或者(iv)在盐的存在下进行杂交步骤以及APSA的结合,随后在聚合物(PEG)或硫酸葡聚糖钠(DSS)的存在下进行酶反应。将10mMTris用作MS测量的阴性对照。将零靶核酸(0)用作DNA检测测定的阴性对照。
图17示出了说明本公开的示例性方法的流程图。
图18示出了HIV DNA检测测定在log10(阿摩尔+1)的不同浓度(即,0至100皮摩尔浓度)的靶核苷酸酸分子(对数标度,x轴)下的MS信号强度(对数标度,y轴,强度m/z=268),其中注射1微升。
图19示出了SARC-CoV2 DNA检测测定在log10(皮摩尔+1)的不同浓度(即,0nM至100nM浓度)的靶核苷酸酸分子(对数标度,x轴)下的MS信号强度图(对数标度,y轴,m/z=268),其中将1微升注射到HPLC柱上(即,柱上0至100飞摩尔分子)。
图20示出了不同浓度(1pM至500pM)的HIV DNA靶核酸分子在136m/z处的MS信号强度的图。
图21示出了不同浓度(100fM至10nM)的SARS-CoV 2靶核酸分子在136m/z处的MS信号强度的图。
图22示出了不同浓度(1pM至1nM)的STEC靶核酸分子在136m/z处的MS信号强度的图。
图23示出了不同浓度(1pM至1nM)的溶血素靶核酸分子在136m/z处的MS信号强度的图。
图24A示出了不同浓度的HIV 258nt PCR产物靶核酸分子在136m/z处的MS信号强度的图。
图24B示出了GelRed染色的琼脂糖凝胶的图像,该图像示出了使用增加量的HIV质粒的PCR反应。
图24C示出了图24B中条带的定量的图。
图25示出了不同浓度的SARS-CoV-2靶核酸分子在136m/z处的MS信号强度的图。
图26示出了不同浓度(100fM至100nM)的HIV靶核酸分子在136m/z处的MS信号强度的图。
图27示出了不同浓度(1pM至1μM)的SARS-CoV-2靶核酸分子在268m/z处的MS信号强度的图,其中捕获物与PVDF结合。
图28A示出了一种凝胶图像,其中上方小图示出了使用生物素酰化的HIV正向引物3和未标记的HIV反向引物3产生的PCR产物,并且其中下方小图示出了使用未标记的HIV正向引物3和生物素酰化的HIV反向引物3产生的PCR产物。
图28B示出了使用生物素标记的HIV正向引物和未标记的HIV反向引物在不同浓度的HIV模板下在136m/z处的MS信号强度的图。
图28C示出了使用未标记的HIV正向引物和生物素标记的HIV反向引物在不同浓度的HIV模板下在136m/z处的MS信号强度的图。
图29示出了固定在PDVF上的HIV合成靶在136m/z处的MS信号强度的图。
图30A示出了一种凝胶图像,该凝胶图像示出了各种COVID-19 PCR反应。
图30B示出了一种凝胶图像,该凝胶图像示出了在不同浓度的COVID-19模板下的COVID-19 PCR反应。
具体实施方式
I.定义
除非另有说明,否则本部分和其他部分中描述的定义和实施方案旨在适用于本文所述的本公开的所有实施方案和方面,如本领域技术人员将理解的,这些实施定义和实施方案是适合的。
如本文所用,术语“或”“和/或”意指所列项目以单独或组合方式存在或使用。实际上,该术语意指使用或存在所列项目中的“至少一个”或“一个或多个”。
如在本公开中所使用的,除非上下文另有明确规定,否则单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数引用。例如,包括“一种化合物”的实施方案应被理解为存在具有一种化合物或两种或更多种另外的化合物的某些方面。
在包含“另外的”或“第二”组分(诸如另外的或第二化合物)的实施方案中,如本文所用的第二组分在化学性质上不同于其他组分或第一组分。“第三”组分不同于其他组分、第一组分和第二组分,并且进一步列举的或“另外的”组分也类似地不同。
如在本公开和权利要求中所使用的,词语“包括”(以及任何形式的包括,诸如“包含”和“含有”)、“具有”(以及任何形式的具有,诸如“持有”和“拥有”)、“包含”(以及任何形式的包含,诸如“包括”和“含有”)或”含有”(以及任何形式的含有,诸如“包括”和“包含”)是包括性的或开放式的,并且不排除另外的、未列举的元素或方法步骤。
如本文所用,术语“由……组成”及其派生词旨在作为封闭术语,其指定所说明的特征、元素、组分、基团、整数和/或步骤的存在,并且还排除其他未说明的特征、元素、组分、基团、整数和/或步骤的存在。
如本文所用,术语“基本上由……组成”旨在指定所说明的特征、元素、组分、基团、整数和/或步骤的存在以及在实质上不影响这些特征、元素、组分、基团、整数和/或步骤的本质和新颖特性的那些。
如本文所用,术语“合适的”意指具体化合物或条件的选择将取决于待进行的具体合成操作、待转化的分子的特性和/或化合物的具体用途,但该选择将完全在本领域技术人员的技能范围内。
如本文所用,术语“胺”或“氨基”,无论其单独使用还是作为另一基团的一部分使用,都是指通式NR′R″,其中R′和R″各自独立地选自氢或C1-6烷基。
如本文所用,术语“atm”是指大气环境。
如本文所用,术语“MS”是指质谱。
如本文所用,术语“aq.”是指含水的。
如本文所用,MeOH是指甲醇。
如本文所用,MeCN是指乙腈。
如本文所用,HCl是指盐酸。
如本文所用,μwave是指微波反应容器。
如本文所用,LCMS是指液相色谱-质谱。
如本文所用,TRIS是指三(羟甲基)氨基甲烷。
如本文所用,EDTA是指乙二胺四乙酸。
如本文所用,术语“单磷酸腺苷”或“AMP”是指具有以下结构的化合物:
Figure BDA0004191243790000101
或其药学上可接受的盐或溶剂化物以及其混合物。AMP可例如从西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)获得。
如本文所用,术语“
Figure BDA0004191243790000102
Red”或“AR”是指:
Figure BDA0004191243790000111
或其药学上可接受的盐或溶剂化物以及其混合物。
Figure BDA0004191243790000115
Red可例如从Resazurin获得,该/>
Figure BDA0004191243790000116
Red在结构上是相关的并且具有式7-羟基-3H-吩噁嗪-3-酮10-氧化物(也称为/>
Figure BDA0004191243790000117
Red)。因此,如本文所用,/>
Figure BDA0004191243790000118
Red包括AR和Resazurin两者。
如本文所用,术语“5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯”或“BCIP”是指具有以下结构的化合物:
Figure BDA0004191243790000112
或其药学上可接受的盐或溶剂化物以及其混合物。BCIP可例如从西格玛奥德里奇公司获得。
如本文所用,术语“可电离产物”是指由报道酶产生的包含一个或多个可电离基团的产物。例如,可电离产物可具有用于正电离的一个或多个碱性或胺基团和用于负电离的一个或多个酸性或羟基基团。可电离基团可包括=NH、-NH2、胍鎓、甲基、乙基、烷基、苯基、核糖、肌醇、磷脂、碳水化合物、核苷酸、羰基、醛、酮、羧基、羟基、烯醇、胍鎓、咪唑、巯基、二硫化物、硫酸酯、磷酸酯、磺酰基、硝酸酯、一氧化氮、硫酯、酯、醚、酸酐、磷酰基、混合酸酐和/或本领域已知的其他可电离基团。评估可电离产物,任选地通过电喷雾电离有效地进入气相。
如本文所用,术语“L-(+)-2-氨基-6-膦酰基己酸”是指:
Figure BDA0004191243790000113
或其药学上可接受的盐或溶剂化物以及其混合物。L-(+)-2-氨基-6-膦酰基己酸可例如从西格玛奥德里奇公司获得。
如本文所用,术语“
Figure BDA0004191243790000119
TMA-3”或“TMA-3”是指
Figure BDA0004191243790000114
或其药学上可接受的盐或溶剂化物以及其混合物。TMA-3可例如从贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter Compan)获得。
如本文所用,术语“
Figure BDA0004191243790000125
TMA-6”或“TMA-6”是指/>
Figure BDA0004191243790000121
或其药学上可接受的盐或溶剂化物以及其混合物。TMA-6可例如从贝克曼库尔特公司获得。
如本文所用,术语“4-甲基伞形酮磷酸酯”或“4-MUP”是指具有以下结构的化合物:
Figure BDA0004191243790000122
或其药学上可接受的盐或溶剂化物以及其混合物。4-MUP可例如从西格玛奥德里奇公司获得。
如本文所用,术语“萘酚ASMX磷酸酯”是指具有以下结构的化合物:
Figure BDA0004191243790000123
或其药学上可接受的盐或溶剂化物以及其混合物。萘酚ASMX磷酸酯可例如从西格玛奥德里奇公司获得。
如本文所用,术语“O-磷酸-DL-苏氨酸”是指具有以下结构的化合物:
Figure BDA0004191243790000124
或其药学上可接受的盐或溶剂化物以及其混合物。O-磷酸-DL-苏氨酸可例如从西格玛奥德里奇公司获得。
如本文所用,术语“对硝基苯酚磷酸酯”或“PNPP”是指具有以下结构的化合物:
Figure BDA0004191243790000131
或其药学上可接受的盐或溶剂化物以及其混合物。对硝基苯酚磷酸酯可例如从西格玛奥德里奇公司获得。
如本文所用,术语“苯基苯ω膦酰基-α-氨基酸”是指具有以下结构的化合物:
Figure BDA0004191243790000132
或其药学上可接受的盐或溶剂化物以及其混合物。苯基苯w膦酰基-a-氨基酸可例如从西格玛奥德里奇公司获得。
如本文所用,术语“吡哆胺5-磷酸酯”或“PA5P”是指具有以下结构的化合物:
Figure BDA0004191243790000133
或其药学上可接受的盐或溶剂化物以及其混合物。PA5P可例如从西格玛奥德里奇公司获得。
如本文所用,术语“鞘氨醇-1磷酸酯”是指具有以下结构的化合物:
Figure BDA0004191243790000134
或其药学上可接受的盐或溶剂化物以及其混合物。鞘氨醇-1磷酸酯可例如从西格玛奥德里奇公司获得。
如本文所用,术语“检测寡核苷酸探针”包含与二级靶部分(诸如生物素)偶联的寡核苷酸,其中该寡核苷酸或其一部分与靶核酸分子(例如但不限于细菌、病毒或真菌核酸序列)互补并与该靶核酸分子选择性结合。在一些实施方案中,该检测寡核苷酸探针可以是检测寡核苷酸引物。该检测寡核苷酸探针还可任选地与二级靶部分(诸如生物素)偶联。该检测寡核苷酸探针还可任选地与酶(诸如报道酶)偶联。例如,该检测寡核苷酸可任选地与酶或催化剂偶联,该酶或催化剂包括但不限于核糖酶、脱氧核酶、磷酸酶(例如AP)、过氧化物酶(例如HRP)、DNA聚合酶或葡萄糖氧化酶。例如,该检测寡核苷酸探针可包含与靶核酸分子的序列互补的单链寡核苷酸序列,并且可通过杂交与靶核酸分子选择性结合。
本领域技术人员应当理解,二级靶部分和二级靶结合部分具有高的相互亲和力,使得二级靶部分和二级靶结合部分与彼此选择性结合。因此,本领域技术人员应当理解,合适的二级靶结合部分可由本领域技术人员基于二级靶部分的性质来选择,反之亦然。以下列表包含选择性结合化学实体对的非限制性示例。二级靶部分和二级靶结合部分可选自下文列出的化学实体对。例如,二级靶部分可以是生物素。例如,二级靶结合部分可以是抗生物素蛋白或链霉亲和素。
高亲和力选择性结合化学实体对的列表
Figure BDA0004191243790000141
/>
Figure BDA0004191243790000151
如本文所用,术语“寡核苷酸”是指由天然存在的碱基、糖和糖间(主链)键组成的核苷或核苷酸单体的序列。该术语还包括包含非天然存在的单体或其部分的经修饰的或取代的序列。本申请的核酸序列可以是脱氧核糖核酸序列(DNA)或核糖核酸序列(RNA),并且可包括天然存在的碱基,包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。这些序列还可含有经修饰的碱基。此类经修饰碱基的示例包括氮杂和脱氮杂腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶;以及黄嘌呤和次黄嘌呤。核酸可以是双链的或单链的,并且代表正义链或反义链。例如,捕获、检测、靶或引物序列可以是寡核苷酸。
如本文所用,术语“报道酶检测探针”包含与检测探针组分偶联的报道酶组分,该报道酶组分包含酶活性,该检测探针组分包含二级靶结合部分,例如当二级靶部分是生物素时的抗生物素蛋白或链霉亲和素。报道酶任选地是过氧化物酶(诸如辣根过氧化物酶)或磷酸酶(诸如碱性磷酸酶),尽管可使用能够产生可电离产物的任何稳定的酶,包括例如裂解酶、水解酶、合酶、合成酶、氧化还原酶、脱氢酶、氧化酶、转移酶、异构酶、连接酶、蛋白酶诸如胰蛋白酶、朊酶、过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、髓过氧化物酶、氧化酶、单加氧酶、细胞色素、磷酸酶诸如碱性磷酸酶、脱羧酶、脂肪酶、半胱天冬酶、淀粉酶、肽酶、转氨酶和激酶。另外的酶可包括DNA或RNA聚合酶、TAQ、限制性内切酶、klenow片段、DNA连接酶。二级靶结合部分选择性地结合检测寡核苷酸探针的二级靶部分。例如,二级靶结合部分包含选择性结合生物素酰化的检测寡核苷酸探针的抗生物素蛋白或链霉亲和素(例如,其中二级靶部分包含生物素)。
如本文所用,与探针(任选的寡核苷酸)有关的术语“选择性”在上下文中用于表征探针(任选的寡核苷酸)的结合特性。例如,与给定靶核酸分子选择性结合的寡核苷酸探针将以相对于另一不同靶核酸分子而言更高的抗体亲抗原性或更高的特异性与该靶核酸分子结合。在一个实施方案中,探针(任选的寡核苷酸探针)以至少2倍、3倍或5倍的抗体亲抗原性或特异性来更有效地结合,任选地以3-5倍、5-7倍、7-10倍、10-15倍、5-15倍或5-30倍的抗体亲抗原性或特异性来更有效地结合。
如本文所用,术语“靶核酸分子”是指包含与检测寡核苷酸探针的寡核苷酸部分互补的序列的任何核酸聚合物。例如,靶核酸分子可以是RNA或DNA,或它们的衍生物。靶核酸可以是至少30个核苷酸长的任何核酸。例如,靶核酸分子可以是约或至少30个核苷酸、约或至少40个核苷酸、约或至少50个核苷酸、约或至少80个核苷酸、约或至少100个核苷酸、约或至少130个核苷酸、约或至少180个核苷酸、约200个核苷酸、约250个核苷酸、约300个核苷酸、约350个核苷酸、约450个核苷酸、约600个核苷酸、约700个核苷酸、约850个核苷酸或约1000个核苷酸。在一些实施方案中,靶核酸分子的长度为约30个核苷酸至约1500个核苷酸。例如,靶核酸分子的长度为约30个核苷酸至约1000个核苷酸、长度为约30个核苷酸至约300个核苷酸、长度为约100个核苷酸至约500个核苷酸、长度为约100个核苷酸至约600个核苷酸、长度为约100个核苷酸至约700个核苷酸、长度为约100个核苷酸至约800个核苷酸、长度为约100个核苷酸至约900个核苷酸,或者长度为约100个核苷酸至约1000个核苷酸。例如,靶核酸分子可以是单链的或双链的。例如,靶核酸分子可以是质粒DNA、细菌、病毒或真菌核酸分子,或者哺乳动物或植物核酸,例如基因或mRNA中的核酸。靶核酸还可以是用于检测核酸标记的化合物等的合成核酸。
II.方法和试剂盒
本文描述了允许检测飞摩尔至皮摩尔范围和/或更低范围内的核酸分子的变革技术。本文证明,可实现仄摩尔至阿摩尔范围内的检测。
酶联免疫吸附测定(ELISA)是用于重复定量分析具有生物医学重要性的多肽分子的优选分析方法:ELISA可使用与特异性检测抗体偶联的报道酶,诸如辣根过氧化物酶(HRP)和/或碱性磷酸酶(AP),这些特异性检测抗体捕获并结合每种具有重要性的分析物(Engvall,1971;Van Weemen 1971)。
目前报道酶(辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP))的底物产生有色的、荧光或发光产物。本公开提供了用于检测被有效地电离的报道酶的酶产物的方法,这些报道酶的酶产物具有通过质谱测量的高信噪比。质谱是足够灵敏的,以允许在远低于ECL法、荧光法或比色法的量下进行检测,而且还允许在离散的m/z值下监测多种底物和产物。可能的是,使用本文所述的方法将常见工业报道酶的产物测量到仄摩尔量或更低,同时将定量的限度测量到阿摩尔量或更低。
使用质谱测量小分子通常可达到具有高信噪比的飞摩尔至皮摩尔水平。工业酶HRP或AP例如是坚固耐用的,并且对于新的小分子产物的产生具有高催化速率。AP或HRP酶例如共价附接到特异性检测探针(诸如多肽或抗体),该特异性检测探针可结合它们的靶,然后在短暂的孵育过程中催化许多不同的产物反应。因此,与阿摩尔量或甚至亚阿摩尔量的酶-探针的结合将产生大量的小分子产物,这些小分子产物累积完全处于LC-ESI-MS/MS的可检测范围内的飞摩尔至皮摩尔范围内。
液相色谱电喷雾电离和串联质谱(LC-ESI-MS/MS)比比色法、荧光法或ECL检测更灵敏。将所报告的分子的酶促生产与用于高度可电离底物的灵敏质谱偶联的组合应提供超过RIA的灵敏度,但不需要用同位素标记的标准品或用同位素标记的探针。
使用LC-ESI-MS/MS检测AP和HRP报道酶反应的产物来证明HRP和AP的定量。本文证明,质谱仪还可检测与特异性分子探针(诸如抗体)结合的报道酶活性的小分子产物。在LC-ESI-MS/MS的可靠检测和定量限度内,与特异性分子探针(诸如检测抗体)结合的一阿摩尔或更少的报道酶(诸如AP或HRP)将迅速形成飞摩尔至皮摩尔量的报道酶反应产物。因此,在ELiMSA和相关的DNA方法(例如DNAELiMSA)中,报道酶诸如HRP或AP可产生能够通过质谱容易地区分和检测的一系列产物。与广泛用于生物医学和环境应用的报道酶偶联的抗体现在可使用非常灵敏的质谱进行检测和定量,以产生灵敏和灵活的系统。由于质谱仪可使用本文所述的方法同时分离和分析许多分析物,因此可允许同时鉴定和定量许多不同抗原,使这些抗原远低于直接质谱分析所可能达到的水平。
该反应是报道酶依赖性的。例如,本文证明了在不存在报道酶检测探针的情况下,在合适的底物反应溶液中孵育可由报道酶检测探针作用的底物产生很少的信号或不产生信号。相反,添加包含HRP或AP酶的报道酶检测探针引起ELiMSA产物离子的强检测。产物离子被证明依赖于酶的存在,并且是时间和浓度依赖性的。因此,ELiMSA产物离子示出了酶依赖性测定的所有标志。
根据报道酶或酶底物,可检测不同的可电离产物。还可检测它们的片段。例如,腺苷可被电离并且在268m/z处被检测或被片段化,并且该片段可在136m/z处被检测。
如示例中所示,捕获寡核苷酸探针可用于捕获靶核酸分子。在其他示例中,靶核酸分子可直接共价或非共价附接到固体载体(例如固相),并且所标记的检测探针(任选地标记的引物)可用于检测所附接的靶核酸分子。
在一个方面,本公开包括一种检测靶核酸分子的方法,该方法包括
a.
i.在第一结合溶液中孵育样品与捕获寡核苷酸探针,该样品假定包含该靶核酸分子,该捕获寡核苷酸探针包含与该靶核酸分子互补的序列,并且该捕获寡核苷酸探针附接到固相,任选地其中该固相通过接头附接到该捕获寡核苷酸探针;或者
ii.在第一结合溶液中孵育样品与固相,该样品假定包含该靶核酸分子,以将所述样品/靶核酸分子附接到所述固相,任选地其中该固相通过接头附接到该样品/靶核酸分子;
b.在形成靶:检测探针复合物的条件下,在第二结合溶液中使任何靶核酸分子与检测寡核苷酸探针结合;
c.在形成靶:检测探针:酶复合物的条件下,在第三结合溶液中孵育任何靶:检测探针复合物与报道酶检测探针;
d.用洗涤溶液洗涤固相,以除去任何未结合的报道酶检测探针;
e.在底物反应溶液中孵育任何靶:检测探针:酶复合物与报道酶检测探针底物,以产生一种或多种可电离产物;以及
f.使用质谱(MS)检测该一种或多种可电离产物中的至少一种可电离产物,
其中
i.第一结合溶液、第二结合溶液和第三结合溶液中的至少第三结合溶液基本上不含无机盐;
ii.洗涤溶液基本上不含无机盐;
iii.该方法还包括在任选的步骤d)和步骤e)之前交联任何靶:检测探针:酶复合物的组分和捕获寡核苷酸探针;并且/或者
iv.该方法还包括在使用MS检测之前分离一种或多种可电离产物;并且
其中对一种或多种可电离产物中的至少一种可电离产物的检测指示样品包含靶核酸分子。
该检测寡核苷酸探针可以是检测寡核苷酸引物。在这种情况下,该步骤包括在扩增溶液中用检测寡核苷酸引物扩增靶核酸分子,并且在形成靶:检测探针复合物的条件下,在第二结合溶液中使任何经扩增的靶与该检测寡核苷酸探针结合。
还设想该检测寡核苷酸探针可通过共价附接,任选地通过接头共价而被直接附接到报道酶。在这种情况下,靶:检测探针复合物足以与报道酶检测探针底物发生反应。因此,不需要二级靶部分和二级靶结合部分。因此,在另一个方面,本公开包括一种检测靶核酸分子的方法,该方法包括
a.
i.在第一结合溶液中孵育样品与捕获寡核苷酸探针,该样品假定包含该靶核酸分子,该捕获寡核苷酸探针包含与该靶核酸分子互补的序列,并且该捕获寡核苷酸探针附接到固相,任选地其中该固相通过接头附接到该捕获寡核苷酸探针;或者
ii.在第一结合溶液中孵育样品与固相,该样品假定包含该靶核酸分子,以将所述样品/靶核酸分子附接到所述固相,任选地其中该固相通过接头附接到该样品/靶核酸分子;
b.在形成靶:检测探针复合物的条件下,在第二结合溶液中使任何靶核酸分子与检测寡核苷酸探针结合,该检测寡核苷酸探针包含寡核苷酸和报道酶;
c.用洗涤溶液洗涤固相,以除去任何未结合的检测寡核苷酸探针;
d.在底物反应溶液中孵育靶:检测探针复合物与报道酶检测探针底物,以产生一种或多种可电离产物;以及
e.使用质谱(MS)检测该一种或多种可电离产物中的一种或多种可电离产物,
其中任一者
i.第一结合溶液和第二结合溶液中的至少第二结合溶液基本上不含无机盐;
ii.洗涤溶液基本上不含无机盐;
iii.该方法还包括在任选的步骤c)和步骤d)之前交联任何靶:检测探针复合物的组分和捕获寡核苷酸探针;并且/或者
iv.该方法还包括在使用MS检测之前分离一种或多种可电离产物;并且
其中对一种或多种可电离产物中的至少一种可电离产物的检测指示样品包含靶核酸分子。
该检测寡核苷酸探针可以是检测寡核苷酸引物。在这种情况下,该步骤包括在扩增溶液中用检测寡核苷酸引物扩增靶核酸分子,并且在形成靶:检测探针复合物的条件下,在第二结合溶液中使任何经扩增的靶与该检测寡核苷酸探针结合。
在一些实施方案中,第二结合溶液、第三结合溶液和底物反应溶液各自包含Tris缓冲液。
在一些实施方案中,捕获寡核苷酸探针任选地通过与固相非共价或共价结合而被直接固定到固相上。
在一些实施方案中,捕获寡核苷酸探针包含寡核苷酸,该寡核苷酸具有与靶核酸分子的一部分互补的长度为至少25个核苷酸、长度为至少35个核苷酸的序列,任选地捕获寡核苷酸探针具有与靶核酸分子的序列的一部分互补的长度为约30个核苷酸至约60个核苷酸或长度为约40个核苷酸至约55个核苷酸的序列。
在一些实施方案中,检测寡核苷酸探针包含寡核苷酸和二级靶部分,该寡核苷酸具有与靶核酸分子的另一部分互补的序列,该二级靶部分选自生物素。
在一些实施方案中,与靶核酸分子的序列的另一部分互补的检测寡核苷酸探针的寡核苷酸的序列的长度为至少25个核苷酸、长度为至少35个核苷酸,任选地检测寡核苷酸探针的长度为约30个核苷酸至约60个核苷酸,或长度为约40个核苷酸至约55个核苷酸。
在一些实施方案中,捕获寡核苷酸探针和检测寡核苷酸探针均可在非重叠区域处结合靶核酸分子,任选地这些非重叠区域是直接相邻的,任选地这些非重叠区域间隔至少一个核苷酸,任选地这些非重叠区域间隔至少5个核苷酸,任选地这些非重叠区域间隔约2个核苷酸、约5个核苷酸、约10个核苷酸、约20个核苷酸、约25个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸、约500个核苷酸或约1000个核苷酸。在一些实施方案中,这些非重叠区域相隔约1kb。在一些实施方案中,这些非重叠区域相隔大于1kb。
在一些实施方案中,当结合溶液和/或洗涤溶液基本上不含无机盐时,该结合溶液和/或该洗涤溶液各自独立地是挥发性溶液。在一些实施方案中,该挥发性溶液包含挥发性缓冲液。在一些实施方案中,该挥发性缓冲液选自乙醇胺、碳酸氢铵、甲酸铵、甲酸吡啶鎓、三烷基铵/甲酸、乙酸铵、三烷基碳酸氢铵、N-乙基吗啉/乙酸盐、三烷基乙酸铵或它们的组合。在一些实施方案中,该挥发性缓冲液选自乙醇胺、乙酸铵、三烷基碳酸氢铵或它们的组合。在一些实施方案中,该三烷基铵选自三甲基铵、三乙基铵或它们的组合。在一些实施方案中,该挥发性缓冲液是乙醇胺。本领域技术人员应当理解,碳酸氢铵对热是不稳定的。例如,碳酸氢铵在约或高于90℃时分解。因此,对于涉及加热的步骤,其他挥发性缓冲液诸如乙醇胺是优选的。
在一些实施方案中,当第一结合溶液、第二溶液、第三结合溶液和/或洗涤溶液基本上不含无机盐时,第一结合溶液、第二溶液、第三结合溶液和/或洗涤溶液各自独立地包含乙醇胺,任选地第二结合溶液和第三结合溶液各自包含乙醇胺,任选地第一结合溶液、第二结合溶液和第三结合溶液各自包含乙醇胺,任选地洗涤溶液包含乙醇胺。
在一些实施方案中,步骤a)和步骤b)同时进行,并且步骤a)的第一结合溶液是步骤b)的第二结合溶液。
在一些实施方案中,第一结合溶液、第二结合溶液、第三结合溶液和底物反应溶液各自独立地具有约7至约10、任选地约7至约8、任选地约8.8的pH。
在一些实施方案中,这些挥发性结合溶液中的任何挥发性结合溶液可用于洗涤固体载体,任选地除去可能存在的任何无机盐。
在一些实施方案中,将靶:检测探针:酶复合物与报道酶检测探针底物孵育在底物反应溶液中,以产生一种或多种可电离产物达少于72小时、少于24小时、少于12小时、少于60分钟、少于50分钟、少于40分钟、少于30分钟、少于20分钟、少于15分钟、少于10分钟、少于5分钟、少于2分钟或少于1分钟的时间段。
在一些实施方案中,第一结合溶液、第二结合溶液和第三结合溶液中的至少第三结合溶液基本上不含无机盐并且包含本文所述的挥发性缓冲液。
在一些实施方案中,该方法包括用洗涤溶液洗涤固相以除去任何未结合的报道酶检测探针,其中洗涤溶液基本上不含无机盐并且包含如本文所述的挥发性缓冲液。
在一些实施方案中,在任选的步骤d)和步骤e)之前交联任何靶:检测探针:酶复合物的组分和捕获寡核苷酸探针,并且该交联是通过H-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-氧代琥珀酰亚胺(NOS)、马来酰亚胺、酰肼、戊二醛偶联、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)交联或PEG交联进行的。
在一些实施方案中,任何靶:检测探针:酶复合物的组分和捕获寡核苷酸探针的交联是通过戊二醛偶联、DSS交联或PEG交联进行的。
在另一个方面,本公开包括一种定量样品中靶核酸分子的量的方法,该方法包括以下步骤:
a.根据本公开的方法检测靶核酸分子;以及
b.基于通过质谱检测的可电离产物中的一种或多种可电离产物的信号的强度来定量样品中靶核酸分子的量。
在一些实施方案中,该定量包括在类似条件下将一种或多种产物的信号的强度与使用已知量的靶物质产生的信号强度进行比较。
在一些实施方案中,存在于或推测存在于样品中的靶核酸分子处于皮摩尔、飞摩尔或阿摩尔范围,或者最多至皮摩尔、飞摩尔或阿摩尔范围。
在一些实施方案中,靶核酸分子选自DNA、RNA以及它们的组合和衍生物。
在一些实施方案中,样品是生物样品、工业产物、环境样品或聚合酶链反应(PCR)反应产物。在一些实施方案中,该生物样品是血液样品、尿液样品、粪便样品、流出物、组织样品或痰样品。
在另一个方面,本公开包括一种检测靶核酸分子的方法,该方法包括
用经修饰的引物和第二引物对推定包含靶核酸分子的测试样品进行核酸扩增,诸如聚合酶链反应(PCR)或杂交链反应(HCR)或滚环反应或其他核酸反应,以获得经扩增的核酸产物,即任选的PCR产物,该经扩增的核酸产物包含该经修饰的引物,该经修饰的引物用二级靶部分或报道酶进行官能化;
分离该经扩增的核酸产物与任何未反应的经修饰的引物;
当该经修饰的引物用该二级靶部分进行官能化时,在形成经扩增的核酸产物:报道酶复合物的条件下,在第一结合溶液中孵育该经扩增的核酸产物与报道酶检测探针,并用洗涤溶液除去任何未结合的报道酶检测探针,该报道酶检测探针包含二级靶结合部分和报道酶;
在底物反应溶液中孵育该经扩增的核酸产物或该经扩增的核酸产物:报道酶复合物与报道酶底物,以产生一种或多种可电离产物;以及
使用质谱(MS)检测该一种或多种可电离产物,
其中当经修饰的引物是正向引物时,第二引物是反向引物,并且其中当经修饰的引物是反向引物时,第二引物是正向引物。
在一些实施方案中,第二引物附接到固相,任选地第二引物通过接头附接到该固相。
在一些实施方案中,第二引物任选地通过与固相非共价或共价结合而被直接附接到固相。
在一些实施方案中,未反应的经修饰的引物与经扩增的核酸产物的分离是通过离心、过滤和/或溶剂洗涤进行的。
在一些实施方案中,该方法还包括在孵育经扩增的核酸产物与报道酶检测探针之前,在将该经扩增的核酸产物结合到固相上的条件下,在第二结合溶液中孵育该经扩增的核酸产物与该固相,该经扩增的核酸产物包含经修饰的引物,该固相具有附接到其上的捕获寡核苷酸探针,该捕获寡核苷酸探针包含与该经扩增的核酸产物互补的序列,任选地,该固相通过接头附接到该捕获寡核苷酸探针。
在一些实施方案中,捕获寡核苷酸探针任选地通过与固相非共价或共价结合而被直接附接到固相。
例如,图15A和图15B中示出了各种实施方案。图15A和图15B示出了在一些涉及扩增(例如产生PCR产物)的实施方案中可被称为“全夹心”或“半夹心”的实施方案,以及通过共价或化学键或非共价附接(诸如吸附)到固体载体的实施方案。具体来说,使用生物素酰化的引物以及任选的捕获寡核苷酸探针的5’附接或3’附接(例如使用NOS化学附接板)示出了“半夹心”实施方案。还示出了一个实施方案,其中靶核酸分子被吸附到PVDF上,并用生物素酰化的检测器探针进行检测。还示出了“全夹心”实施方案,其中使用了捕获寡核苷酸探针和检测寡核苷酸探针。靶核酸样品可以化学方法附接或吸附,并使用标记的检测器探针进行检测。本文还描述了其他实施方案和组合。
图15A中示出的“R”可以是胺或其他接头、生物素或其他标签或者与固体载体的附接中的任何一者或多者。例如,胺可以是存在于寡核苷酸中的或加入到该寡核苷酸中的胺基团。
接头可以是化学键,或者可以是例如包含诸如末端为胺的PEG链的部分。诸如包含胺的碳链的其他部分。
接头可以是胺(或已经连接的胺键)、或NHS、或羧基键或半胱氨酸键,或者例如具有胺或胺反应性基团的PEG,或者任何合适的键。可使用其他物质,包括本文或下表中所述的其他物质。
Figure BDA0004191243790000231
可使用各种标签。例如,该标签可以是生物素、ALFA标签、Avi标签、C标签、钙调蛋白标签、聚谷氨酸标签、E标签、Flag标签、HA标签、His标签、myc标签、NE标签、Rho1D4标签、S标签、SBP标签、Sof标签1、Sof标签3、Spot标签、Strept标签、T7标签、TC标签、Ty1标签、V5标签、VSV标签、Xpress标签、Isopep标签、Spy标签、Snoop标签、Dog标签、Sdy标签、生物素羧基载体蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶标签、GFP标签、Halo标签、SNAP标签、CLIP标签、HUH标签、麦芽糖结合蛋白标签、Nus标签、硫氧还蛋白标签、Fc标签或CRDSAT标签。还可使用例如本文其他地方描述的其他物质。在一些实施方案中,该标签是生物素。
如所讨论的,可使用共价和非共价附接。例如,与载体的附接可以是共价附接,诸如[H-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-氧代琥珀酰亚胺(NOS)、马来酰亚胺、酰肼、戊二醛偶联或PEG交联,或者可以是非共价附接,[吸附到PVDF、二氧化硅、聚苯乙烯、尼龙等上。这可以通过或不通过接头来实现。诸如吸附到PVDF、聚苯乙烯或二氧化硅或尼龙、丙烯酰胺、藻酸酯、三聚氰胺或任何其他载体上
固体载体可以是例如板(诸如聚苯乙烯板或化学反应性NOS聚苯乙烯板,并且该板可以是96孔板、微孔板或纳米孔板)、膜(诸如在例如96孔板中的PVDF膜),或者微米或纳米级颗粒(诸如小珠)。其他附接包括例如二氧化硅、PVDF、聚苯乙烯、尼龙、丙烯酰胺、藻酸酯、三聚氰胺
更具体的示例如图15B所示。在该图中,P是指磷酸酯,并且N是指胺。引物A/B是指具有和不具有标签诸如生物素的引物。引物C/D是指不含表面载体或附接到该表面载体的引物。
在一些实施方案中,捕获寡核苷酸探针具有与经扩增的核酸产物的序列的一部分互补的序列,该扩增核酸产物包含经修饰的引物。
在一些实施方案中,第一结合溶液和/或洗涤溶液是挥发性的并且基本上不含NaCl。
在一些实施方案中,第二结合溶液是挥发性的并且基本上不含NaCl。
在一些实施方案中,第一结合溶液或第二结合溶液各自包含挥发性缓冲液。
在一些实施方案中,该挥发性缓冲液选自乙醇胺、碳酸氢铵、甲酸铵、甲酸吡啶鎓、三烷基铵/甲酸、乙酸铵、三烷基碳酸氢铵、N-乙基吗啉/乙酸盐、三烷基乙酸铵以及它们的组合。
在一些实施方案中,该挥发性缓冲液选自乙醇胺、乙酸铵、三烷基碳酸氢铵以及它们的组合。
在一些实施方案中,该三烷基铵选自三甲基铵、三乙基铵以及它们的组合。
在一些实施方案中,该挥发性缓冲液是乙醇胺。
在一些实施方案中,该方法还包括在将经扩增的核酸产物结合到固相之前,用封闭剂即任选的牛血清白蛋白(BSA)洗涤固相。
在一些实施方案中,第一结合溶液或第二结合溶液各自独立地具有约7至约10、任选地约7至约8、任选地约8.8的pH。
在一些实施方案中,任何未结合的报道酶检测探针从经扩增的核酸产物:报道酶复合物中的去除是通过离心、过滤和/或溶剂洗涤进行的。
在一些实施方案中,将经扩增的核酸产物或经扩增的核酸产物:报道酶复合物与报道酶底物孵育在底物反应溶液中,以产生一种或多种可电离产物达少于72小时、少于24小时、少于12小时、少于60分钟、少于50分钟、少于40分钟、少于30分钟、少于20分钟、少于15分钟、少于10分钟、少于5分钟、少于2分钟或少于1分钟的时间段。
在一些实施方案中,测试样品是生物样品、工业产物或环境样品。
在一些实施方案中,该生物样品是血液样品、尿液样品、粪便样品、流出物、组织样品或痰样品。
在一些实施方案中,PCR选自实时PCR(rtPCR)、定量PCR(qPCR)、逆转录PCR、巢式PCR、杂交链反应、滚环PCR和底物再循环反应。
报道酶检测探针可包含任选地共价偶联在一起的报道酶组分和检测探针组分。还设想在一些实施方案中,检测寡核苷酸探针可通过共价附接,任选地通过接头而被直接附接到报道酶。当检测寡核苷酸探针已经附接到报道酶时,不再需要报道酶检测探针。在一个实施方案中,报道酶包括过氧化物酶活性、单加氧酶活性、磷酸酶活性、葡萄糖氧化酶、蛋白酶或半胱天冬酶活性,例如报道酶是过氧化物酶、单加氧酶、磷酸酶、葡萄糖氧化酶、蛋白酶、内切蛋白酶、外肽酶或半胱天冬酶。在另一个实施方案中,报道酶选自裂解酶、水解酶、合酶、合成酶、氧化还原酶、脱氢酶、氧化酶、转移酶、异构酶、连接酶、蛋白酶诸如胰蛋白酶、内切蛋白酶、外肽酶、朊酶、过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、髓过氧化物酶、氧化酶、单加氧酶、细胞色素、磷酸酶诸如碱性磷酸酶、脱羧酶、脂肪酶、半胱天冬酶、淀粉酶、肽酶、转氨酶和激酶。另外的酶可包括DNA或RNA聚合酶、TAQ、限制性内切酶、klenow片段、DNA连接酶。在又一个实施方案中,报道酶选自HRP、AP、连接酶、DNA聚合酶(例如klenow或TAQ)、限制性内切酶和蛋白酶、细胞色素单加氧酶、葡萄糖氧化酶、GAPDH以及其他糖酵解和TCA循环酶。
固相可以是任何反应容器,任选的小珠、棒或板,诸如微量滴定板,例如具有聚苯乙烯表面的微量滴定板。固相可以是任何表面,包括金属、金、不锈钢、塑料、玻璃、二氧化硅、正相、反相、聚碳酸酯、聚酯、PVDF、硝化纤维素、纤维素、聚苯乙烯、聚合物、铁、磁、经涂覆的磁、微珠、纳米珠、纳米管、纳米纤维或富勒烯。具有8至12个凸出圆柱体的免疫吸附聚苯乙烯棒描述于例如美国专利7510687中。
靶核酸分子与检测寡核苷酸探针的结合以及检测寡核苷酸探针与报道酶检测探针的结合可发生在缓冲溶液中。报道酶检测探针对底物的转化可发生在底物反应缓冲液中。合适的缓冲液包括基本上不含NaCl的挥发性缓冲液,并且是与质谱条件兼容的挥发性缓冲液。此类合适的缓冲液包括但不限于碳酸氢铵、甲酸铵、甲酸吡啶鎓、三甲胺/甲酸、乙酸铵、三甲胺碳酸氢盐、N-乙基吗啉/乙酸盐、三乙胺/甲酸、三乙胺碳酸氢盐,或者聚合物诸如聚乙二醇或葡聚糖硫酸盐以及它们的组合。将溶液的pH保持在接近报道酶的最大活性的最佳值的缓冲液是优选的。这些相同的缓冲液可用于测试物质或反应缓冲液的结合。
相同的结合缓冲液可用于靶核酸分子与检测寡核苷酸探针的结合,以及检测寡核苷酸探针与报道酶检测探针的结合。任选地,底物反应缓冲液可与结合缓冲液相同。
在包括扩增的实施方案中,结合缓冲液可包含用于扩增的试剂并被称为扩增溶液,例如在适用于扩增的缓冲液中包含聚合酶、核苷酸等。
本文公开的方法还可在不存在固相的溶液中进行,其中靶物质不是固定的而是悬浮在微珠或磁性微珠上,或者悬浮在胶态悬浮液中,或者以其他方式不是完全固定的而是在溶液中自由移动的
需要产生可电离产物的底物,这些可电离产物提供高信噪比。例如,所选定的信噪比为至少3、至少4、至少5、至少6、至少10。在一个实施方案中,信噪比大于或等于5。信噪比是质量信号(峰值高度)与噪声(基本电平波动的幅度)的比率。信噪比可例如通过使用MS测量来自空白样品或基线的信号强度与已知量的分析物或样品的信号强度的比率来确定。产生当电离成产物离子时具有高信噪比的可电离产物的底物的示例是脱磷酸化的萘酚ASMX磷酸酯。如本文所用,高信噪比是大于至少5、至少6、至少10的信噪比。
底物需要可通过例如电喷雾或MALDI电离的至少一种可电离基团,例如包含NO2、SO4、PO3、NH2、=NH-、COOH、NH-NHR-、NH2-NR-NH2中的至少一者,并且是所选定的报道酶的底物。就HRP而言,例如合适的底物是能够向H2O2提供电子的底物。作为另一个示例,就磷酸酶(诸如AP)而言,底物具有至少一个可被酶裂解的磷酸酯基团。
在一些实施方案中,本公开的方法还包括在使用MS检测之前分离一种或多种可电离产物。在一些实施方案中,该分离是通过液相色谱、离心、过滤、溶剂洗涤和/或盐转移进行的。在一些实施方案中,该分离是通过液相色谱,任选的等度正相色谱进行的。在一些实施方案中,液相色谱是通过反相色谱进行的。在一些实施方案中,反相色谱是C18色谱。在一些实施方案中,液相色谱是高效液相色谱(HPLC)。在一些实施方案中,HPLC是纳米流液相色谱。
在一些实施方案中,使用MS检测一种或多种可电离产物的步骤包括任选地通过电喷雾电离(ESI)、MALDI、化学电离、电子碰撞、激光解吸、电气电离或热电离来电离一种或多种可电离产物,以产生一种或多种产物离子,并且使该一种或多种产物离子进行MS,任选的串联MS(MS/MS)。
在一些实施方案中,该电离是正电离或负电离。
在一些实施方案中,所产生的一种或多种产物离子具有为至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10的选定信噪比。
在一些实施方案中,MS选自电喷雾电离串联MS(ESI-MS/MS)、基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)、串联MS(MS/MS)、多轮碎裂MSN、MALDI、电喷雾、纳米喷雾、表面电离、激光解吸和电离、大气电离、真空电离,以及配备有毛细管电泳、超声波或声波或震动、纳米液滴或微滴样品引入系统的MS。
在一些实施方案中,使用MS的检测包括通过单离子监测(SIM)记录产物离子强度,并且/或者通过单试剂监测(SRM)记录产物离子母体到片段的转变。
在一些实施方案中,报道酶检测探针包含报道酶和任选的二级靶结合部分,并且其中该二级靶结合部分与该报道酶共价结合。
在一些实施方案中,二级靶部分选自生物素、ALFA标签、Avi标签、C标签、钙调蛋白标签、聚谷氨酸标签、E标签、Flag标签、HA标签、His标签、myc标签、NE标签、Rho1D4标签、S标签、SBP标签、Sof标签1、Sof标签3、Spot标签、Strept标签、T7标签、TC标签、Ty1标签、V5标签、VSV标签、Xpress标签、Isopep标签、Spy标签、Snoop标签、Dog标签、Sdy标签、生物素羧基载体蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶标签、GFP标签、Halo标签、SNAP标签、CLIP标签、HUH标签、麦芽糖结合蛋白标签、Nus标签、硫氧还蛋白标签、Fc标签和CRDSAT标签,任选地二级靶部分是生物素。
在一些实施方案中,二级靶结合部分结合二级靶部分,并且该二级靶结合部分选自抗生物素蛋白、链霉亲和素、钙调蛋白、阴离子交换树脂、Mono-Q、阳离子交换树脂、抗E标签抗体、抗FLAG标签抗体、抗HA标签抗体、镍或钴螯合物、抗Myc标签抗体、抗NE标签抗体、抗Rho1D4标签抗体、抗S标签抗体、抗Sof标签1抗体、抗Sof标签3抗体、纳米抗体、Streptactin、抗T7标签抗体、FIAsH双砷化合物、ReAsH双砷化合物、抗Ty1标签抗体、抗V5标签抗体、抗VSV标签抗体、抗Xpress标签抗体、pilin-C蛋白、SpyCatcher蛋白、SnoopCatcher蛋白、SnoopTagJr蛋白、SdyCatcher蛋白、谷胱甘肽、GFP抗体、卤代烷烃底物、苄基鸟嘌呤衍生物、苄基胞嘧啶衍生物、HUH特异性DNA序列、直链淀粉琼脂糖、Nus标签抗体、抗硫氧还蛋白标签抗体、蛋白A琼脂糖凝胶、乳糖、琼脂糖和琼脂糖凝胶,任选地二级靶结合部分选自抗生物素蛋白和链霉亲和素。
在一些实施方案中,二级靶结合部分结合检测寡核苷酸探针的二级靶部分,并且当二级靶部分是生物素时,该二级靶结合部分选自抗生物素蛋白和链霉亲和素。
在一些实施方案中,报道酶选自磷酸酶、任选的碱性磷酸酶、裂解酶、水解酶、合酶、合成酶、氧化还原酶、脱氢酶、氧化酶、转移酶、异构酶、连接酶、蛋白酶诸如胰蛋白酶、朊酶、过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、髓过氧化物酶、氧化酶、单加氧酶、细胞色素、脱羧酶、脂肪酶、半胱天冬酶、淀粉酶、肽酶、转氨酶、激酶活性、DNA或RNA聚合酶、任选的TAQ、限制性内切酶、klenow片段和DNA连接酶。
在一些实施方案中,报道酶选自碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、胰蛋白酶、细胞色素C单加氧酶和髓过氧化物酶,任选地,报道酶是碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
在一些实施方案中,一种或多种可电离产物在ESI-MS/MS或MALDI-TOF下可容易地电离并且产生特征在于高信噪比的产物离子,并且底物任选地选自:
a.磷酸化的核苷即任选的AMP或CMP、或磷酸化的核苷酸即任选的ATP或CTP、磷酸化的生物碱、磷酸化的氨基酸、磷酸化的氨基酸聚合物和磷酸化的代谢物,当该酶是碱性磷酸酶(AP)时;
b.选自以下的化合物:酚、胺、任选的酚胺、芳族化合物、烯烃卤化物、鲁米诺、连苯三酚、2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)和
Figure BDA0004191243790000271
Red,当该报道酶是辣根过氧化物酶(HRP)时;或者选自
c.阿片制剂、洗涤剂、染料前体、醇和基质。
在一些实施方案中,报道酶检测探针底物选自吡哆胺-5-磷酸酯(PA5P)、对硝基苯基磷酸酯(PNPP)、
Figure BDA0004191243790000272
Red(AR)、萘酚ASMX磷酸酯、鲁米诺、/>
Figure BDA0004191243790000273
TMA3、
Figure BDA0004191243790000274
TMA6、鞘氨醇、4MUP、L-(+)-2-氨基-6-膦酰基己酸、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)、/>
Figure BDA0004191243790000275
苯基苯ω膦酰基-α-氨基酸、O-磷酸-DL-苏氨酸、单磷酸腺苷(AMP)、AR(3-氨基-9-乙基咔唑)、4-CN(4-氯-1-萘酚)、DAB(3,3'-二氨基苯甲脒)、OPD(邻苯二胺)、TMB(/>
Figure BDA0004191243790000284
-四甲基联苯胺)、pNPP(对硝基苯基磷酸酯)、NBT(硝基蓝四唑)、INT(对碘硝基四唑)、MUP(4-甲基伞形酮磷酸酯)和FDP荧光素二磷酸酯)、连苯三酚。
在一些实施方案中,报道酶检测探针底物选自:
a.AR、鲁米诺、
Figure BDA0004191243790000281
TMA3和/>
Figure BDA0004191243790000282
TMA6,当该报道酶检测探针包含HRP时;或者选自
b.萘酚ASMX磷酸酯和PNPP,当该报道酶检测探针包含AP时。
在一些实施方案中,检测本公开的靶核酸分子的方法还包括在孵育靶:检测探针复合物与报道酶检测探针之前,用第二结合溶液洗涤固相。
在一些实施方案中,检测本公开的靶核酸分子的方法还包括在将靶核酸分子结合到固相之前,用封闭剂即任选的牛血清白蛋白(BSA)洗涤固相。
在一些实施方案中,底物反应溶液包含非离子型非聚合物型洗涤剂,该非离子型非聚合物型洗涤剂任选地选自N-辛基葡糖苷、脱氧胆酸盐、rapigest、辛基-β-吡喃葡糖苷、辛基吡喃葡糖苷、chaps、big chap、非离子型酸不稳定表面活性剂、葡糖苷、正辛基-β-D-吡喃葡糖苷、正壬基-β-D-吡喃葡糖苷硫代葡糖苷、正辛基-β-D-硫代吡喃葡糖苷麦芽糖苷、正癸基-β-D-吡喃麦芽糖苷、正十二烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷、正十一烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷、正十三烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷、cymal-5、cymal-6、硫代麦芽糖苷、正十二烷基-β-D-硫代吡喃麦芽糖苷、烷基糖苷、辛基葡萄糖新戊二醇、聚氧乙二醇、triton、NP40、tweenTM、tweenTM20、Triton X-100、triton x-45、C8E4、C8E5、C10E5、C12E8、C12E9、Brij、Anapoe-58、Brij-58以及它们的组合。
在一些实施方案中,当底物包含鲁米诺时,底物反应溶液还包含4-碘苯基硼酸。
在一些实施方案中,固相是反应容器,该反应容器是任选的小珠、板、毛细管、过滤器或纳米/微/毫孔反应容器,并且其中该表面选自纸、硝化纤维素、丙烯酸酯、塑料、聚苯乙烯、聚偏二氟乙烯(PVDF)、三聚氰胺、二氧化硅、经聚赖氨酸涂覆的玻璃、经3-氨基丙基-三乙氧基硅烷(APTES)处理的玻璃和经3-氨基丙基-三甲氧基硅烷(APTMS)处理的玻璃。
在一些实施方案中,捕获寡核苷酸探针与固相的附接是通过H-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-氧代琥珀酰亚胺(NOS)、马来酰亚胺、酰肼、戊二醛偶联或PEG交联进行的。
在一些实施方案中,产物离子通过SIM和/或SRM使用优化的碎裂能量和m/z范围进行测定。
在一些实施方案中,底物是AMP、ADP或ATP,并且所产生的一种或多种可电离产物包括腺苷,该腺苷的产物离子通过SIM在268m/z处测定;或者底物是CMP、CDP或CTP,并且所产生的一种或多种可电离产物包括胞嘧啶,该胞嘧啶的产物离子通过SIM在283m/z处测定;或者底物是AR,并且所产生的一种或多种可电离产物中的一种可电离产物包括试卤灵,该试卤灵的产物离子通过SIM在214m/z处测定并且通过SRM使用主要强片段在214m/z-186m/z处测定。
在一些实施方案中,底物是萘酚ASMX磷酸酯,并且所产生的一种或多种可电离产物中的一种可电离产物包括脱磷酸化的萘酚ASMX,该脱磷酸化的萘酚ASMX的产物离子通过SIM在292m/z处测定并且通过SRM使用主要强片段在292m/z-171m/z处测定;或者底物是PA5P,并且所产生的一种或多种可电离产物包括PA,该PA的产物离子通过SIM在169m/z处测定。
在一些实施方案中,可电离产物在电离溶液中被电离成产物离子。
在另一个方面,本公开包括一种定量测试样品中靶核酸分子的量的方法,该方法包括以下步骤:
a.根据检测本公开的靶核酸分子的方法检测靶核酸分子;以及
b.基于通过质谱检测的可电离产物中的一种或多种可电离产物的信号的强度来定量测试样品中靶核酸分子的量。
在一些实施方案中,该定量包括在类似条件下将一种或多种产物的信号的强度与使用已知量的靶核酸分子产生的信号强度进行比较。
在一些实施方案中,存在于或推测存在于样品中的靶核酸分子处于皮摩尔、飞摩尔或阿摩尔范围,或者最多至皮摩尔、飞摩尔或阿摩尔范围。
在一些实施方案中,检测一种或多种靶寡核苷酸模板。
在一些实施方案中,靶核酸分子是质粒DNA,或者包含在细菌、病毒、真菌、哺乳动物或植物基因组中的序列。
在一些实施方案中,细菌基因组选自大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌、衣原体、霍乱弧菌、梭状芽胞杆菌、肠球菌、梭杆菌属、厌氧杆菌、革兰氏阴性球菌、革兰氏阳性杆菌、嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、克雷伯氏菌属、乳杆菌属、李斯特菌属、包柔氏螺旋体属、分枝杆菌、支原体、奈瑟氏球菌属、普雷沃氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、螺旋体属、葡萄球菌属、链球菌属和耶尔森氏菌属基因组。
在一些实施方案中,细菌基因组选自大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。
在一些实施方案中,病毒基因组选自HIV、SARS-CoV、MERS、SARS-CoV-2、埃博拉病毒、流感病毒、冠状病毒基因组、肠道病毒、肝炎病毒、疱疹病毒、HPV、诺如病毒、副流感病毒、鼻病毒和水痘病毒基因组
在一些实施方案中,病毒基因组选自HIV、SARS-CoV、MERS、SARS-CoV-2、埃博拉病毒、流感病毒和冠状病毒基因组。
在一些实施方案中,真菌基因组选自假丝酵母属基因组。
在一些实施方案中,哺乳动物基因组是人基因组。
在一些实施方案中,靶核酸分子具有包含在HIV基因组中的序列。在一些实施方案中,靶核酸分子具有包含在SARS-CoV-2基因组中的序列。
在另一个方面,本公开包括一种检测HIV的方法,该方法包括检测本公开的靶核酸分子的方法,其中该靶核酸分子是HIV核酸分子。
在一些实施方案中,检测HIV的方法包括检测本公开的靶核酸分子的方法,其中捕获寡核苷酸探针具有选自SEQ ID No.14、SEQ ID No 17、SEQ ID No 20和SEQ ID No 23的序列。
在一些实施方案中,检测HIV的方法包括检测本公开的靶核酸分子的方法,其中检测寡核苷酸探针寡核苷酸具有选自SEQ ID No.16、SEQ ID No 19、SEQ ID No 22和SEQ IDNo.25的序列。
在一些实施方案中,检测HIV的方法包括检测本公开的靶核酸分子的方法,其中捕获寡核苷酸探针具有选自SEQ ID No.14、SEQ ID No 17、SEQ ID No 20和SEQ ID No 23的序列。
在另一个方面,本公开包括一种检测SARS-CoV2的方法,该方法包括检测本公开的靶核酸分子的方法,其中该靶核酸分子是SARS-CoV2核酸分子。
在一些实施方案中,检测本公开的SARS-CoV2的方法包括检测本公开的靶核酸分子的方法,其中捕获寡核苷酸探针具有选自SEQ ID No.6和SEQ ID No.13的序列。
在一些实施方案中,检测本公开的SARS-CoV2的方法包括检测本公开的靶核酸分子的方法,其中检测寡核苷酸探针寡核苷酸具有选自SEQ ID No.5和SEQ ID No.12的序列。
在检测本公开的SARS-CoV2的方法的一些实施方案中,经修饰的引物具有选自SEQID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和SEQ ID No.10的序列。
在检测本公开的SARS-CoV2的方法的一些实施方案中,第二引物具有选自SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和SEQ ID No.10的序列。
在检测本公开的SARS-CoV2的方法的一些实施方案中,经修饰的引物具有SEQ IDNo.2的序列,并且第二引物具有SEQ ID No.3或SEQ ID No 8的序列。
在检测本公开的SARS-CoV2的方法的一些实施方案中,经修饰的引物具有SEQ IDNo.3的序列,并且第二引物具有SEQ ID No.2或SEQ ID No.7的序列。
在检测本公开的SARS-CoV2的方法的一些实施方案中,经修饰的引物具有SEQ IDNo.7的序列,并且第二引物具有SEQ ID No 3或SEQ ID No.8的序列。
在检测本公开的SARS-CoV2的方法的一些实施方案中,经修饰的引物具有SEQ IDNo.8的序列,并且第二引物具有SEQ ID No 2、SEQ ID No.7的序列。
在检测本公开的SARS-CoV2的方法的一些实施方案中,经修饰的引物具有SEQ IDNo.9的序列,并且第二引物具有SEQ ID No.10的序列。
在检测本公开的SARS-CoV2的方法的一些实施方案中,经修饰的引物具有SEQ IDNo.10的序列,并且第二引物具有SEQ ID No.9的序列。
在检测本公开的SARS-CoV2的方法的一些实施方案中,经修饰的引物具有SEQ IDNo.38的序列,并且第二引物具有SEQ ID No.39的序列。
在检测本公开的SARS-CoV2的方法的一些实施方案中,经修饰的引物具有SEQ IDNo.39的序列,并且第二引物具有SEQ ID No.38的序列。
在检测本公开的SARS-CoV2的方法的一些实施方案中,经修饰的引物具有SEQ IDNo.41的序列,并且第二引物具有SEQ ID No.42的序列。
在检测本公开的SARS-CoV2的方法的一些实施方案中,经修饰的引物具有SEQ IDNo.42的序列,并且第二引物具有SEQ ID No.41的序列。
还可使用其他引物。
在另一个方面,本公开包括一种试剂盒,该试剂盒包括:
i.捕获寡核苷酸探针,该捕获寡核苷酸探针任选地通过接头与固相任选地结合;
ii.结合溶液,该结合溶液包含挥发性缓冲液并且基本上不含NaCl,或者包含交联剂;
iii.检测寡核苷酸探针,该检测寡核苷酸探针包含寡核苷酸和二级靶部分;
iv.报道酶检测探针,该报道酶检测探针包含报道酶和能够结合该二级靶部分的二级靶结合部分;和/或
v.以下中的一者或多者:如本文所述的底物、固相、标准品,即任选的产物离子标准品,该标准品任选地用于制备标准曲线或调整校准物;第二结合溶液、第三结合溶液、底物反应溶液、电离溶液、淬灭溶液,即任选的第二结合溶液、检测探针溶液、底物反应溶液、淬灭溶液、电离溶液。
在另一个方面,本方面包括一种试剂盒,该试剂盒包括:
i.经修饰的引物,该经修饰的引物用二级靶部分或报道酶进行官能化;
ii.第二引物;
iii.报道酶检测探针,当该经修饰的引物用该二级靶部分进行官能化时,该报道酶检测探针包含报道酶和能够结合该二级靶部分的二级靶结合部分;和
iv.以下中的一者或多者:如本文所述的底物、固相、标准品,即任选的产物离子标准品,该标准品任选地用于制备标准曲线或调整校准物;结合溶液、第二结合溶液、底物反应溶液、电离溶液、淬灭溶液、洗涤溶液、交联剂,即任选的结合溶液、第二结合溶液、检测探针溶液、底物反应溶液、淬灭溶液、电离溶液,
其中当经修饰的引物是正向引物时,第二引物是反向引物,并且当经修饰的引物是反向引物时,第二引物是正向引物。
在一些实施方案中,电离溶液包含任选地选自甲酸、乙酸、三氟乙酸的酸或碱。氢氧化铵、甲胺、乙胺或丙胺。
在一些实施方案中,淬灭溶液任选地包含用于正电离的50%乙腈、0.1%乙酸或0.1%甲酸或0.1%三氟乙酸,或者用于负电离的0.1%氢氧化铵。
在一些实施方案中,捕获寡核苷酸探针包含选自SEQ ID No.6、SEQ ID No.13、SEQID No.14、SEQ ID No 17、SEQ ID No 20、SEQ ID No 23、SEQ ID No 26、SEQ ID No 29、SEQID No 32和SEQ ID No 35的序列。
在一些实施方案中,检测寡核苷酸探针的寡核苷酸包含选自SEQ ID No.5、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.16、SEQ ID No 19、SEQ ID No 22、SEQ ID No 25、SEQ ID No 28、SEQ IDNo 31、SEQ ID No 34和SEQ ID No 37的序列。
在一些实施方案中,捕获寡核苷酸探针包含SEQ ID No 14的序列,并且检测寡核苷酸探针的寡核苷酸具有SEQ ID No.16的序列。
在一些实施方案中,捕获寡核苷酸探针包含SEQ ID No.6的序列,并且检测寡核苷酸探针的寡核苷酸具有SEQ ID No.5的序列。
在一些实施方案中,捕获寡核苷酸探针包含SEQ ID No.13的序列,并且检测寡核苷酸探针的寡核苷酸具有SEQ ID No.12的序列。
在一些实施方案中,捕获寡核苷酸探针包含SEQ ID No 17的序列,并且检测寡核苷酸探针的寡核苷酸具有SEQ ID No.19的序列。
在一些实施方案中,捕获寡核苷酸探针包含SEQ ID No 20的序列,并且检测寡核苷酸探针的寡核苷酸具有SEQ ID No.22的序列。
在一些实施方案中,捕获寡核苷酸探针包含SEQ ID No 23的序列,并且检测寡核苷酸探针的寡核苷酸具有SEQ ID No.25的序列。
在一些实施方案中,捕获寡核苷酸探针包含SEQ ID No 26的序列,并且检测寡核苷酸探针的寡核苷酸具有SEQ ID No.28的序列。
在一些实施方案中,捕获寡核苷酸探针包含SEQ ID No 29的序列,并且检测寡核苷酸探针的寡核苷酸具有SEQ ID No.31的序列。
在一些实施方案中,捕获寡核苷酸探针包含SEQ ID No 32的序列,并且检测寡核苷酸探针的寡核苷酸具有SEQ ID No.34的序列。
在一些实施方案中,捕获寡核苷酸探针包含SEQ ID No 35的序列,并且检测寡核苷酸探针的寡核苷酸具有SEQ ID No.37的序列。
在一些实施方案中,捕获探针是SEQ ID NO:44或45。
捕获寡核苷酸探针还可以是本文所述的捕获探针的片段,例如包含该探针序列的至少70%、80%或90%。
在一些实施方案中,经修饰的引物和第二引物是靶核酸分子的引物,该靶核酸分子具有包含在细菌、病毒、真菌、哺乳动物或植物基因组中的序列。
在一些实施方案中,经修饰的引物具有选自SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:41和SEQ ID NO:42的序列。
在一些实施方案中,第二引物具有选自SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42的序列。
在一些实施方案中,经修饰的引物具有SEQ ID No.2的序列,并且第二引物具有SEQ ID No.3或SEQ ID No 8的序列。
在一些实施方案中,经修饰的引物具有SEQ ID No.3的序列,并且第二引物具有SEQ ID No.2或SEQ ID 7的序列。
在一些实施方案中,捕获寡核苷酸具有SEQ ID No.6的序列。
在一些实施方案中,经修饰的引物具有SEQ ID No.7的序列,并且第二引物具有SEQ ID No.8的序列。
在一些实施方案中,经修饰的引物具有SEQ ID No.8的序列,并且第二引物具有SEQ ID No.7的序列。
在一些实施方案中,经修饰的引物具有SEQ ID No.9的序列,并且第二引物具有SEQ ID No.10的序列。
在一些实施方案中,经修饰的引物具有SEQ ID No.10的序列,并且第二引物具有SEQ ID No.9的序列。
在一些实施方案中,捕获寡核苷酸具有SEQ ID No.13的序列。
在一些实施方案中,经修饰的引物具有SEQ ID No.38的序列,并且第二引物具有SEQ ID No.39的序列。
在一些实施方案中,经修饰的引物具有SEQ ID No.39的序列,并且第二引物具有SEQ ID No.38的序列。
在一些实施方案中,经修饰的引物具有SEQ ID No.41的序列,并且第二引物具有SEQ ID No.42的序列。
在一些实施方案中,经修饰的引物具有SEQ ID No.42的序列,并且第二引物具有SEQ ID No.41的序列。
引物还可以是本文提供的引物的片段,或者包含另外的互补序列。例如,该片段可以是本文所述的引物的序列的至少70%、80%或90%。
在一些实施方案中,捕获寡核苷酸具有SEQ ID No.44或45的序列。
在另一个方面,本公开包括一种序列选自SEQ ID No.2至46的核酸。
还提供了包含选自SEQ ID No.2至46的序列的核酸中的一种或多种核酸的媒介物、试剂盒或组合物。
在一些实施方案中,这些核酸可用标签标记。它们还可未标记的形式提供,诸如在试剂盒中任选地与用于产生经标记的核酸的标记和试剂组合。
实施例
以下非限制性实施例是对本公开的说明。
一般方法
标称质量为195,000kDa的碱性磷酸酶链霉亲和素缀合物(APSA)(1mg溶于含15mg/mL牛血清白蛋白的1mL 0.01M Tris-HCl、0.25M NaCl中,pH 8.0)来自Jackson ImmunoResearch Laboratories(West Grove,PA,USA)。AMP底物和Tris缓冲液来自西格玛奥德里奇公司(St Louis MO,USA)。NHS-PEG12-生物素来自Pierce(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))。NHS-PEG-NHS是O,O’-双[2-(N-琥珀酰亚胺基-琥珀酰氨基)乙基]聚乙二醇,2000,来自西格玛奥德里奇公司。96孔反应板是来自赛默飞世尔科技公司的NuncTMImmobilizer Amino板和来自西格玛奥德里奇公司的
Figure BDA0004191243790000342
96孔板。圆形盖玻片(直径为5mm,厚度为0.16mm-0.19mm)来自Electron Microscopy Sciences。3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)来自赛默飞世尔科技公司。
PVDF膜可以是用于例如蛋白质印记的任何常见PVDF转移膜。例如,合适的PVDF膜包括Immobilon-PTM转移膜。例如,合适的PVDF膜可具有0.45μm的孔径。例如,PVDF膜可以是滤板的形式,任选地是多孔滤板。例如,板的每个孔的底部可装配有PVDF膜。例如,该多孔板可以是96孔滤板。
下面使用的聚苯乙烯载体是获自ChemGenes Coporation(目录号N-4545-10b)的
Figure BDA0004191243790000343
附接C-18接头的不可裂解的间隔聚苯乙烯载体。聚苯乙烯载体具有以下结构,其中DMTr是指二甲基三苯甲基:
Figure BDA0004191243790000341
长链烷基胺羧基受控的多孔玻璃(CPG长链烷基胺载体,孔径为500A,直径为125微米-177微米)可获自Pierce Chem。Co.Sephacryl S-500可获自Pharmacia。12%交联的聚苯乙烯二乙烯基苯(12%聚苯乙烯-二乙烯基苯)树脂(200目-400目)购自Polysciences。
核衣壳质粒获自IDT 2019-nCoV_N_阳性对照质粒(目录号10006625),并将该核衣壳质粒转化到来自Invitrogen的DH5α中,并在氨苄青霉素板上铺板,划线,培养过夜,然后生长为Qiagen maxi-prep,随后以260/280比例定量。PCR反应将使用ROCHE PCR缓冲液进行,并对核衣壳质粒的1仄摩尔、10仄摩尔、100仄摩尔、1阿摩尔、10阿摩尔、100阿摩尔、1飞摩尔、10飞摩尔、100飞摩尔、1皮摩尔、10皮摩尔进行对数滴定,获自质粒的该核衣壳质粒在Bio-Rad T100热循环仪中每次反应35个循环。将少于300个碱基的PCR产物通过TBE PAGE进行分解,以用于通过Gelred进行定量,同时将标准品和切割质粒定量的标准曲线运行到凝胶中。
1100型HPLC来自Agilent(Santa Clara,CA,USA)。7725型注射器来自Rheodyne(IDEX,Rohnert Park,CA)。LTQ XL线性四极杆离子阱来自热电公司(Thermo ElectronCorporation)(Waltham,MA,USA)。Zorbax 3.5微米
Figure BDA0004191243790000344
C18树脂来自ChromatographicSpecialties(Brockville,ON,CANADA)。
APSA酶是一种通用生物素结合信号扩增酶缀合物,该酶通过在约600nm处的UV/VIS检测,用BCIP/NBT的20mM Tris溶液(pH 8.85)显示出1pg至50pg/96孔的线性范围。
将APSA溶解在反应缓冲液(20mM Tris,pH 8.85)中,以用于通过以下方法进行测定:使该APSA与BCIP/NBT染料底物发生比色反应,以形成靛蓝的0.1%吐温20溶液,并在96孔板读板器(Bio-Rad)上在595nm处测量。腺苷用作LC-ESI-MS反应的绝对标准品,并溶解在含0.1%乙酸的70%乙腈(ACN)中。同时,使APSA与AMP反应,以形成可通过LC-ESI-MS灵敏检测的腺苷。对于“DNAELiMSA”测定,将APSA溶解在10ml反应缓冲液(20mM Tris,pH 8.85)中,得到1ng/μL储备液。通过将10μL APSA溶解在10ml缓冲液中而对1ng/μL APSA进行系列稀释,得到1pg/μL APSA,然后得到1fg/μL(1000ag/μL)工作储备液。1fg/μL工作储备液被用于制备0.1飞克/ml至1000飞克/ml缓冲液的线性稀释系列,并在37℃下与1μM至1mM AMP反应2小时。对于LC-ESI-MS/MS测定,将反应物在冰上用含0.2%乙酸的乙腈(DF 2)以1:1进行淬灭,然后装载到96孔板自动进样器中,注射2μL,使用Agilent 1100HPLC在5微米的C18(2.1mm×150mm)上在含0.1%乙酸的7.5%或95%乙腈中以200μL/分钟进行等度分离,使用268.2[M+H]+的腺苷调节的线性四极杆离子阱(Thermo)以20μL/min进行LC-ESI-MS。在SIM模式中定量来自酶缀合物APSA的AMP底物和腺苷产物,并在约1.2分钟处减去并平均与268.24[M+H]+m/z色谱峰相邻的局部背景后,提取腺苷峰值数据。另选地,监测MS/MS的SRM产物:全扫描:120m/z至400m/z SRM:268→136,隔离窗口:2Da,碰撞能量35CID。
封闭缓冲液可以是但不限于基于血清、基于BSA或白蛋白、基于聚赖氨酸、基于纤连蛋白、基于明胶或基于脱脂奶粉的缓冲液。封闭缓冲液还可包含洗涤剂,诸如非离子型去洗涤剂,这些非离子型洗涤剂包括脱氧胆酸盐、正辛基葡糖苷、N-辛基-β-吡喃葡糖苷、BigCHAP脱氧、酸可裂解洗涤剂、EDTA。封闭缓冲液还可包含缓冲剂,诸如TRIS。本领域技术人员应当理解,根据本公开的方法的具体应用,还可使用与上述封闭缓冲液类似的其他封闭缓冲液。
结合缓冲液可以是但不限于基于TRIS、PBS、HEPES、MES或MOPS的缓冲液。本领域技术人员应当理解,根据本公开的方法的具体应用,还可使用与上述结合缓冲液类似的其他结合缓冲液。在一些情况下,结合缓冲液还可包含其他组分,诸如盐。在结合缓冲液包含盐的情况下,对于MS分析,含有一种或多种可电离产物的样品可任选地与盐转向阀一起运行,以防止盐到达电离源。另选地或除此之外,含有一种或多种可电离产物的样品还可在MS分析之前通过色谱(例如使用C18色谱柱)进行脱盐。此外,含有一种或多种可电离产物的样品还可在注射之前稀释于有机溶剂中并离心。
实施例1高结合0.45微米PVDF 96孔滤板上的核酸的检测
下面示出了PVDF滤板上的核酸吸附和检测的一般方法。
·将捕获寡核苷酸探针吸附到PVDF滤板上:将PVDF用甲醇预润湿;每孔加入10μL100μM捕获寡核苷酸探针;将其在通风橱下干燥1小时。
·封闭:每孔加入200μL封闭溶液(3%(w/v)BSA的20mM Tris pH8.00+1mM EDTA溶液),在37℃下孵育1小时,并用20mM Tris pH8.00+1mM EDTA洗涤3次,每次2分钟(与下面的洗涤步骤相同)。
·洗涤:将孔用结合缓冲液(20mM Tris pH8.00+1M NaCl+1mM EDTA)洗涤3次。
·靶核酸分子杂交
ο将靶核酸分子(1μM)和检测寡核苷酸探针以1/10稀释于结合缓冲液中。以100μL结合缓冲液+10μL检测寡核苷酸探针1/10(用于0靶核酸分子)/反应物与100μL 1μM靶核酸分子+10μL检测寡核苷酸探针1/10(用于1μM靶核酸分子)(100fmol靶向注射)/反应物加入,并在90℃下孵育15分钟。
ο将板预孵育至杂交温度,60℃。每孔加入110μL的靶核酸分子和检测寡核苷酸探针混合物溶液,并孵育1小时。
·洗涤(任选的):用200μL结合缓冲液洗涤3次。
·报道酶检测探针结合:将10μg(10μL)报道酶检测探针(例如APSA)溶解在1mL结合缓冲液中,并将报道酶检测探针以1/100进一步稀释于结合缓冲液中(10ng/ml);每孔加入100μL报道酶检测探针稀释液(1ng),并在37℃下孵育15分钟。
·洗涤:用20mM Tris pH8.00+1M NaCl(无EDTA)洗涤9次,并除去孔中的最后一点溶液。
·报道酶反应:在底物反应溶液(20mM Tris,pH 8.85)中加入100μL 1mM报道酶检测探针底物(例如AMP),并在37℃下孵育2小时。
·每孔收集50μL反应物并将其转移到新管中。
·将反应物用50μL含0.2%乙酸的100%乙腈(ACN)以1:1进行淬灭(HPLC),然后以1:10进行稀释(最终DF20),以扫描模式进行MS分析。
使用表6中列出的HIV病毒DNA的靶核酸分子、捕获寡核苷酸和检测寡核苷酸序列作为示例,通过将特异性捕获寡核苷酸探针吸附到96孔板中的Immobilon-PTMPVDF膜上来固定化该特异性捕获寡核苷酸探针,在来自特异性检测DNA的少于7,000个计数的背景上产生超过55,000个任意计数的信号强度。柱4上独立重复的100fmol靶病毒DNA的信号示于图1中。
实施例2在96孔聚苯乙烯板中与聚赖氨酸涂层交联的核酸的检测
下面示出了经聚赖氨酸涂覆的聚苯乙烯板上的核酸吸附和检测的一般方法。
·用聚赖氨酸涂覆聚苯乙烯板:每孔加入100μL 0.01%聚-L-赖氨酸溶液(SigmaP4707),并在4℃下孵育过夜(16小时-18小时);在倾斜摇床上用200μL 1XPBS pH7.2洗涤3次,每次2分钟(与下面的洗涤步骤相同)
·捕获寡核苷酸探针交联:将1mM NHS-PEG-NHS 1XPBS溶液加入到溶解有1μM胺化的捕获寡核苷酸探针溶液的1XPBS中,直到终浓度为10μM(DF100,10μL/1ml捕获寡核苷酸探针溶液);转移100μL到每个孔中,并在37℃下孵育30分钟;用1XPBS洗涤3次。
·淬灭和封闭:每孔加入200μL 3%(w/v)BSA的20mM Tris pH8.00+1mM EDTA溶液,在37℃下孵育1小时,并用20mM Tris pH8.00+1mM EDTA洗涤3次。
·洗涤(任选的):将孔用结合缓冲液(20mM Tris pH8.00+1M NaCl+1mM EDTA)洗涤3次
·靶核酸分子杂交:(与实施例1相同)
·洗涤:(与实施例1相同)
·报道酶检测探针结合:(与实施例1相同)
·洗涤(任选的):(与实施例1相同)
·报道酶反应:(与实施例1相同)
使用表6中列出的HIV病毒DNA的靶核酸分子、捕获寡核苷酸和检测寡核苷酸序列作为示例,当病毒靶核酸分子被捕获在涂覆有聚赖氨酸的聚苯乙烯板上并将该病毒靶核酸分子通过NHS-PEG-NHS与5’-或3’-胺化的病毒捕获寡核苷酸探针交联,并将100fmol的所捕获的靶核酸分子的等效物注射到柱上时,在约8,000个计数的背景上观察到42,000个计数的信号强度。来自3次独立重复的注射到柱上的100fmol靶核酸分子的等效物的结果示于图2中。
实施例3胺反应性Nunc Immobilizer氨基96孔聚苯乙烯板上的核酸的检测
下面示出了胺反应性Nunc ImmobilizerTM氨基聚苯乙烯板上的核酸吸附和检测的一般方法。
·将捕获寡核苷酸探针固定到板上:将捕获寡核苷酸探针储备液(100μM)以1/10稀释于表面结合缓冲液(100mM碳酸钠缓冲液,pH 9.6)中,并且每孔加入100μL稀释液;在4℃下孵育过夜;在倾斜台上用200μL表面结合缓冲液洗涤3次,每次2分钟(与下面的洗涤步骤相同)
·淬灭和封闭:每孔加入200μL 3%(w/v)BSA的20mM Tris pH8.00+1mM EDTA溶液,在37℃下孵育1小时,并用20mM Tris pH8.00+1mM EDTA洗涤3次
·洗涤:用结合缓冲液(20mM Tris pH8.00+1M NaCl+1mM EDTA)洗涤3次
·靶核酸分子杂交:(与实施例1相同)
·洗涤(任选的):(与实施例1相同)
·报道酶检测探针结合:(与实施例1相同)
·洗涤:(与实施例1相同)
·报道酶反应:(与实施例1相同)
使用表6中列出的HIV病毒DNA的靶核酸分子、捕获寡核苷酸和检测寡核苷酸序列作为示例,经由胺反应性官能团(反应性羧酸官能团)将5’-或3’-胺化的病毒捕获寡核苷酸探针固定在96孔Nunc Immobilizer氨基板中,从而在3,000个计数的背景上产生27,000个计数。注射到柱上的100fmol靶核酸分子的等效物的结果示于图3中。
实施例4NOS表面化学96孔聚苯乙烯反应板上的核酸的检测
下面示出了N-氧代琥珀酰亚胺(NOS)表面化学聚苯乙烯板上的核酸吸附和检测的一般方法。
·将捕获寡核苷酸探针固定到板上:将捕获DNA储备液(100μM)以1/10稀释于表面结合缓冲液(10mM Na2PO4+1mM EDTA缓冲液,pH 8.5)中,并且每孔加入100μL,在4℃下孵育过夜,将溶液倾析并用表面结合缓冲液洗涤3次,每次2分钟
·淬灭和封闭:将每孔用200μL 3%(w/v)BSA的20mM Tris pH8.00+1mM EDTA溶液封闭并淬灭,在37℃下孵育1小时,倾析,并用20mM Tris pH8.00+1mM EDTA洗涤3次。
·洗涤:用结合缓冲液(20mM Tris pH8.00+1M NaCl+1mM EDTA)洗涤3次。
·靶核酸分子杂交:(与实施例1相同)
·洗涤:(与实施例1相同)
·报道酶检测探针结合:(与实施例1相同)
·洗涤(任选的):(与实施例1相同)
·报道酶反应:(与实施例1相同)
使用表6中列出的HIV病毒DNA的靶核酸分子、捕获寡核苷酸和检测寡核苷酸序列作为示例,通过N-氧代琥珀酰亚胺(NOS)表面化学将5’-或3’-胺化的病毒捕获寡核苷酸探针固定在
Figure BDA0004191243790000381
96孔板中,以用于捕获靶核酸分子,与约3,000个计数的背景相比,产生22,000个特异性计数。来自3次独立重复的注射到柱上的100fmol靶DNA的等效物的结果示于图4中。
实施例5 96孔PVDF滤板中与聚苯乙烯寡聚合成小珠进行3’连接的核酸的检测
下面示出了核酸检测的一般方法,其中捕获寡核苷酸探针是PVDF滤板中的3’连接的聚苯乙烯寡聚合成小珠。
·封闭滤板:每孔加入200μL封闭溶液(3%(w/v)BSA的20mM Tris pH8.00+1mMEDTA溶液),在37℃下孵育1小时,倾析,并使用真空歧管设置用20mM Tris(pH 8.00)+1mMEDTA洗涤3次(与下面的洗涤步骤相同)。
·洗涤:用结合缓冲液(20mM Tris pH8.00+1M NaCl+1mM EDTA)洗涤3次
·靶核酸杂交
ο每孔使用10μL捕获寡核苷酸探针小珠悬浮液。将小珠沉淀在离心管中(以16,000RCF离心5分钟),并除去上清液。
ο在室温下将重悬于500μL封闭溶液中的捕获小珠在费理斯摩天轮(FerrisWheel)上转动15分钟。
ο将小珠在1mL 20mM Tris pH 8.00+1mM EDTA中洗涤珠2次,并以16,000RCF离心5分钟,以除去上清液。
ο将捕获小珠重悬于结合缓冲液(20mM Tris pH8.00+1M NaCl+1mM EDTA)中。
ο将靶核酸分子(1μM)和捕获寡核苷酸探针以1/10稀释于结合缓冲液中,并以100μL结合缓冲液+10μL捕获寡核苷酸探针1/10(用于0靶核酸分子)/反应物与100μL 1μM靶核酸分子+10μL捕获寡核苷酸探针1/10(用于1μM靶核酸分子)/反应物加入到具有捕获小珠的每个管中。
ο在90℃下孵育15分钟,然后在60℃下孵育1小时
ο将DNA混合物转移到滤板上。
·洗涤(任选的):将每孔用200μL结合缓冲液洗涤3次。
·报道酶检测探针结合:(与实施例1相同)
·洗涤:(与实施例1相同)
·报道酶反应:(与实施例1相同)
使用表6中列出的HIV病毒DNA的靶核酸分子、捕获寡核苷酸和检测寡核苷酸序列作为示例,在96孔PVDF滤板中通过与聚苯乙烯寡聚合成小珠具有3’连接的捕获寡核苷酸探针来捕获病毒DNA,与约8,000个计数的背景相比,产生42,000个特异性计数的信号。来自3次独立重复的注射到柱上的100fmol靶核酸分子的等效物的结果示于图5中。
实施例6具有与氨基甲硅烷基化的盖玻片表面交联的捕获寡核苷酸探针的核酸的 检测
下面示出了核酸检测的一般方法,其中捕获寡核苷酸探针与氨基甲硅烷基化的盖玻片表面交联。
·盖玻片的氨基甲硅烷基化
ο通过以下方法彻底洗涤盖玻片:将盖玻片浸泡在2.5M NaOH中过夜,用DI水洗涤,浸入10% HCl中,用DI水和甲醇冲洗,并使表面风干。
ο制备2%的ATPES的丙酮溶液,并将盖玻片浸入该溶液中达15分钟。用丙酮冲洗盖玻片并使其风干。
ο将盖玻片小心地放入96孔聚苯乙烯板的孔中。
·捕获寡核苷酸探针交联:将1mM NHS-PEG-NHS 1XPBS溶液加入到溶解有1μM捕获寡核苷酸探针溶液的1XPBS中,直到终浓度为10μM(10μL/1ml捕获寡核苷酸探针溶液);每孔转移100μL,并在37℃下孵育30分钟;用1XPBS洗涤3次。
·淬灭和封闭:每孔加入200μL 3%(w/v)BSA的20mM Tris pH8.00+1mM EDTA溶液,在37℃下孵育1小时,并用20mM Tris pH8.00+1mM EDTA洗涤3次。
·洗涤:将孔用结合缓冲液(20mM Tris pH8.00+1M NaCl+1mM EDTA)洗涤3次。
·靶核酸分子杂交:(与先前的实施例1相同)
·洗涤(任选的):(与实施例1相同)
·报道酶检测探针结合:(与实施例1相同)
·洗涤:(与实施例1相同)
·报道酶反应:(与实施例1相同)
使用表6中列出的HIV病毒DNA的靶核酸分子、捕获寡核苷酸和检测寡核苷酸序列作为示例,经由玻璃的氨基甲硅烷基化将5’-或3’-胺化的病毒捕获寡核苷酸探针固定在该玻璃表面上并将该病毒捕获寡核苷酸探针通过NHS-PEG-NHS交联,从而在6,000个计数的背景上产生35,000个计数。来自3次独立重复的注射到柱上的100fmol靶核酸分子的等效物的结果示于图6中。
实施例7用于DNA的结合缓冲液中的NaCl的优化
缓冲液优化
实施例7和8中描述的缓冲液优化实验在96孔0.45μm PVDF滤板中使用连接到聚苯乙烯寡聚合成小珠的捕获寡核苷酸探针,如先前实施例5所述,略有修改。
将PVDF滤板用3% BSA封闭1小时,并用20mM Tris-HCl、1mM EDTA(pH8.0)洗涤3次,并在具有各种NaCl浓度(0M、0.05M、0.1M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1.0M、1.5M和2.0M)的结合缓冲液中平衡。单独地,将捕获小珠用3% BSA封闭15分钟,并在20mM Tris-HCl、1mM EDTA中通过离心洗涤,并在各种结合缓冲液中平衡。将捕获寡核苷酸探针和靶核酸分子施加到各种结合缓冲液中的小珠上以用于DNA杂交,在90℃下15分钟,随后在60℃下1小时。将小珠转移到PVDF滤板上,用各种结合缓冲液洗涤3次,并在37℃下与APSA一起孵育15分钟。未结合的APSA在各种结合缓冲液的9次洗涤中被洗掉,并将小珠与1mM AMP底物在20mM Tris-HCl(pH 8.85)中一起孵育2小时。将反应物淬灭并以1:20稀释于100%乙酸中,直到终浓度为0.1%乙酸。将样品通过具有100%乙腈、0.1%乙酸流动相的C18反相3.5μm柱分离,并将腺苷产物通过LTQ线性离子阱在268.2m/z[M+H]+处检测。每份样品注射两次,并确定NaCl最佳浓度为1.5M。不同NaCl浓度下的MS信号强度的结果示于图7中。
实施例8用于DNA的结合缓冲液中的碳酸氢铵的优化
将PVDF滤板用3% BSA封闭1小时,并用20mM Tris-HCl、1mM EDTA(pH8.0)洗涤3次,并在具有各种碳酸氢铵浓度(0M、0.1M、0.5M、1.0M、1.5M、2.0M、2.5M)的结合缓冲液中平衡。单独地,将捕获小珠用3% BSA封闭15分钟,并在20mM Tris-HCl、1mM EDTA中通过离心洗涤,并在各种结合缓冲液中平衡。将捕获寡核苷酸探针和靶核酸分子施加到各种结合缓冲液中的小珠上以用于DNA杂交,在90℃下15分钟,随后在60℃下1小时。将小珠转移到PVDF滤板上,用各种结合缓冲液洗涤3次,并在37℃下与APSA一起孵育15分钟。未结合的APSA在各种结合缓冲液的9次洗涤中被洗掉,并将小珠与1mM AMP底物在20mM Tris-HCl(pH 8.85)中一起孵育2小时。将反应物淬灭并以1:20稀释于100%乙酸中,直到终浓度为0.1%乙酸。将样品通过具有100%乙腈、0.1%乙酸流动相的C18反相3.5μm柱分离,并将腺苷产物通过LTQ线性离子阱在268.2m/z[M+H]+处检测。每份样品注射两次,并确定碳酸氢铵的最佳浓度为1.5M。结果示于图8中。
靶核酸分子、捕获寡核苷酸探针和检测寡核苷酸探针是HIV序列,如表6所示。
实施例9杂交后结合缓冲液中的挥发性缓冲液的比较
将PVDF滤板用3% BSA封闭1小时,并用20mM Tris-HCl、1mM EDTA(pH8.0)洗涤3次,并在1.5M NaCl、20mM Tris-HCl、1mM EDTA(pH8.0)(结合缓冲液)中平衡。单独地,将捕获小珠用3% BSA封闭15分钟,并在20mM Tris-HCl、1mM EDTA中通过离心洗涤,并在结合缓冲液中平衡。将捕获寡核苷酸探针和靶核酸分子施加到结合缓冲液中的小珠上以用于DNA杂交,在90℃下15分钟,随后在60℃下1小时。将小珠转移到用结合缓冲液洗涤3次的PVDF滤板中,其中1.5M NaCl被以下物质中的任一者替代:0.5M、1.0M、1.5M、2.0M、2.5M乙醇胺,0.5M、1.0M、1.5M、2.0M、2.5M乙酸铵,0.5M三乙基碳酸氢铵,0.5M、1.0M、1.5M、2.0M、2.5M碳酸氢铵,或标准1.5M NaCl。将APSA施加到各种结合缓冲液中的小珠上,并在37℃下孵育15分钟。未结合的APSA在各种结合缓冲液的9次洗涤中被洗掉,并将小珠与1mM AMP底物在20mM Tris-HCl(pH 8.85)中一起孵育2小时。将反应物淬灭并以1:20稀释于100%乙酸中,直到终浓度为0.1%乙酸。将样品通过具有100%乙腈、0.1%乙酸流动相的C18反相3.5μm柱分离,并将腺苷产物通过LTQ线性离子阱在268.2m/z[M+H]+处检测。每份样品注射两次,并且表现最好的挥发性缓冲液是2M乙醇胺。结果示于图9中。
实施例10PCR引物、寡核苷酸捕获探针和寡核苷酸检测探针序列
使用考虑了miRNA和ncRNA的干扰效应的NCBI PCR和寡核苷酸DNA算法PCR-BLAST来设计PCR引物以及寡核苷酸捕获和检测DNA序列(表1至表6)。在rtPCR反应中观察到SARS-CoV-2的高假阴性比例(Xie,2020)。一组灵活的PCR引物和/或嵌套寡核苷酸捕获序列被设计用于扩增SARS-CoV-2PCR产物然后捕获该产物,以便通过碱性磷酸酶和LC-ESI-MS检测进行第二阶段扩增。将这些引物与世界卫生组织推荐的作为对照的那些引物进行比较。
针对与SARS和MERS同源的SARS-CoV-2核衣壳基因(SEQ ID No.1)具有特异性的寡核苷酸杂交探针的设计考虑示出了在NC_045512.2:28274-29533分离株核衣壳基因中由NCBI引物-BLAST算法靶向的区域。在表1中,捕获和检测寡核苷酸位点以粗体下划线示出。
表1 SARS-CoV-2核衣壳序列
Figure BDA0004191243790000421
捕获和检测区域带有下划线。斜体表示引物区域。
用于SARS-CoV-2核衣壳的第一组(SARS CoV2组1)PCR引物示于表2中。缩写:FP,正向引物;RP,反向引物;P/N,聚苯乙烯寡聚合成小珠/共价胺连接96孔板;B,生物素。任选地,引物(例如,SEQ ID No.2)可用生物素进行官能化,以及/或者与聚苯乙烯寡聚合成小珠缀合。
表2用于SARS-CoV-2的SARS CoV2组1 PCR引物
Figure BDA0004191243790000431
用于SARS-CoV-2核衣壳基因的第二组(SARS CoV2组2)PCR引物、相应靶核酸分子序列的示例以及相应捕获和检测寡核苷酸探针的示例性组示于表3中。缩写:C,捕获寡核苷酸;D,检测寡核苷酸;FP,正向引物;RP,反向引物;P/N,聚苯乙烯寡聚合成小珠/共价胺连接96孔板;b,生物素;PCR,反应产物。
表3用于SARS-CoV-2的SARS CoV2组2PCR引物和探针设计
Figure BDA0004191243790000432
Figure BDA0004191243790000441
用于SARS-CoV-2核衣壳序列的第三组(SARS CoV2组3)PCR引物示于表4中。缩写:FP,正向引物;RP,反向引物;P/N,聚苯乙烯寡聚合成小珠/共价胺连接96孔板;B,生物素。
表4 SARS CoV2组3PCR引物
Figure BDA0004191243790000442
用于SARS-CoV-2的另一组(SARS CoV2组4)PCR引物设计、相应靶核酸分子序列的示例以及相应捕获和检测寡核苷酸探针的示例性组示于表5中。缩写:FP,正向引物;RP,反向引物;P/N,聚苯乙烯寡聚合成小珠/胺连接;b,生物素。具有相同捕获和检测寡核苷酸(表3)的较长反应产物由以下引物产生:正向,5’-TGGACCCCAAAATCAGCGAA-3’(SEQ ID No.7);反向,5’-TGCCGTCTTTGTTAGCACCA-3’(SEQ ID No.8)。
表5用于SARS-CoV-2的SARS CoV2组4PCR引物和捕获/检测探针设计
Figure BDA0004191243790000443
Figure BDA0004191243790000451
/>
HIV特异性捕获和检测寡核苷酸探针序列(HIV组1)以及可能的相应靶核酸分子列于表6中。其他组(HIV组2至4)的HIV特异性捕获和检测寡核苷酸探针序列以及可能的相应靶核酸分子分别列于表7至表9中。靶核酸分子序列中的加粗序列对应于与捕获和检测寡核苷酸探针序列的重叠。
表6 HIV组1:HIV特异性捕获和检测寡核苷酸探针以及靶核酸分子
Figure BDA0004191243790000452
表7 HIV组2:HIV特异性捕获和检测寡核苷酸探针以及靶核酸分子
Figure BDA0004191243790000461
/>
表8 HIV组3:HIV特异性捕获和检测寡核苷酸探针以及靶核酸分子
Figure BDA0004191243790000462
表9 HIV组4:HIV特异性捕获和检测寡核苷酸探针以及靶核酸分子
Figure BDA0004191243790000471
产志贺毒素的大肠杆菌(STEC)特异性捕获和检测寡核苷酸探针序列(STEC组1至3)以及可能的相应靶核酸分子分别列于表10至表12中。靶核酸分子序列中的加粗序列对应于与捕获和检测寡核苷酸探针序列的重叠。
表10 STEC组1:STEC特异性捕获和检测寡核苷酸探针以及靶核酸分子
Figure BDA0004191243790000472
Figure BDA0004191243790000481
表11 STEC组2:STEC特异性捕获和检测寡核苷酸探针以及靶核酸分子
Figure BDA0004191243790000482
/>
表12 STEC组3:STEC特异性捕获和检测寡核苷酸探针以及靶核酸分子
Figure BDA0004191243790000483
Figure BDA0004191243790000491
产α-溶血素的金黄色葡萄球菌特异性捕获和检测寡核苷酸探针序列(SAUREUS组1)以及可能的相应靶核酸分子列于表13中。靶核酸分子序列中的加粗序列对应于与捕获和检测寡核苷酸探针序列的重叠。
表13 SAUREUS组1:产α-溶血素的金黄色葡萄球菌特异性捕获和检测寡核苷酸探 针以及靶核酸分子
Figure BDA0004191243790000492
对于表6、表7、表8、表9,PCR引物可位于5’侧的前36个碱基或任何旁侧序列中,该旁侧序列将扩增靶,从而将产生至少100bp或更优选地150bp、200bp或300bp的产物。
P/N表示序列可包含磷酸酯末端(诸如在核苷酸中发现的)或胺(例如用于附接到固体载体)。
实施例11SARS-CoV2的PCR检测
用10ng模板质粒DNA(SARS-CoV2核衣壳质粒)和以下引物组合启动PCR反应:
1.正向引物SEQ ID No 2和反向引物SEQ ID No 3(138bp的PCR产物);
2.正向引物SEQ ID No 2和反向引物SEQ ID No 8(279bp的PCR产物);
3.正向引物SEQ ID No 7和反向引物SEQ ID No 3(236bp的PCR产物);和
4.正向引物SEQ ID No 7和反向引物SEQ ID No 8(377bp的PCR产物)。
如表1所示,可使用SARS-CoV2的核衣壳基因序列来计算每种引物组合的相应PCR产物的预期长度。PCR产物的预期长度列于上面的括号中。PCR反应物运行35个循环,其中盖温度为105℃,反应体积为100μl,熔解温度为94℃(30秒),退火温度为55℃(30秒),延伸温度为72℃(1分钟)。通过在100伏特下运行16% TBE聚丙烯酰胺凝胶与分子量标记物来分离PCR产物。所得凝胶示于图10中。该凝胶表明,在每种引物组合中观察到对应于预期长度的PCR产物,这证实PCR反应成功地扩增了SARS-CoV2核衣壳基因中的期望序列。
图11示出了使用含有SARS-CoV2核衣壳基因的质粒作为模板和SARS-CoV2组1PCR引物(SEQ ID No 2和3)的PCR结果。使用不同量的模板,包括0模板、痕量检测量的模板和不同量(0.1ng、1ng、10ng、50ng)的模板。图13还示出了在泳道6至泳道10中使用不同浓度(2mM、2.5mM、3.0mM、3.5mM或4.0mM)的Mg产生的PCR产物。PCR运行35个循环,其中退火温度为55℃,使用热启动。在使用Qiagen mastermix的PCR rxn中,将引物重悬于10mM Tris、0.1mM EDTA中,直到终浓度为0.2μM。通过在100伏特下运行16% TBE聚丙烯酰胺凝胶来分离质粒浓度范围为100μL的PCR产物。使用50ng起始质粒DNA和1.5mM至4mM的Mg2+产生最大量的PCR产物。使用痕量检测量的模板(泳道1)、亚纳克(泳道2)和纳克量(泳道3)的模板DNA获得显著的且可观察量的PCR产物。
图12示出了使用本公开的DNA检测方法检测SARS-CoV2核衣壳基因的PCR产物的结果。使用捕获寡核苷酸探针SEQ ID No.6和5’-生物素酰化的检测寡核苷酸SEQ ID No.5进行检测,该捕获寡核苷酸探针具有附接到固体载体的3’。将零模板DNA和PuC19质粒DNA用作阴性对照。使用各种量(范围为痕量、10fg、100fg、1pg、10pg至100pg)的模板DNA。对于所有量的模板DNA都观察到MS信号。对于无模板或Puc19质粒未观察到信号。经扩增的靶核酸产物的长度为SEQ ID No.4的138nt。
当捕获寡核苷酸被固定到固态上并且使用单独生物素酰化的检测寡核苷酸探针通过AMP与APSA的反应进行二级酶扩增时,本文所述的方法可用于通过高度选择性杂交方法检测病毒靶核酸分子。如本文所示,病毒DNA可使用捕获寡核苷酸探针的各种固定化方法进行检测,随后进行选择性杂交和APSA扩增,包括:将捕获寡核苷酸探针与PVDF膜非共价结合,将捕获寡核苷酸探针3’与96孔滤板中的聚苯乙烯小珠偶联,将捕获寡核苷酸探针共价固定到96孔反应板上,通过聚赖氨酸涂层将捕获寡核苷酸探针共价固定到96孔聚苯乙烯板上,以及通过氨基甲硅烷基化和交联将捕获寡核苷酸探针固定到盖玻片上(SiO2)。
实施例12寡核苷酸探针的制备
应当理解,本公开的寡核苷酸探针可根据本领域技术人员已知的方法制备,或者可从现有商业来源购买。
例如,捕获寡核苷酸可存在于二氧化硅、聚苯乙烯、琼脂糖、三聚氰胺、PVDF或其他载体上。二氧化硅、聚苯乙烯、琼脂糖、三聚氰胺、PVDF或其他载体可以是微粒或纳米颗粒的形式。任选地,二氧化硅、聚苯乙烯、琼脂糖、三聚氰胺、PVDF或其他载体可以是2维表面、3维表面或1维纤维或长丝。
例如,二氧化硅微粒或纳米颗粒可被官能化以产生用于附接寡核苷酸的反应位点。例如,二氧化硅微粒或纳米颗粒可使用含3-氨基丙基三甲氧基硅烷的胺基团进行官能化,或者使用含3’环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷的环氧化物基团进行官能化。在这种情况下,胺或环氧化物可用作附接寡核苷酸的反应位点。其他反应位点或官能位点包括硅烷醇、羟基、羧酸、与胺或羧基基团反应的任何物质、马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-氧代琥珀酰亚胺(NOS)、H-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-氧代琥珀酰亚胺(NOS)、马来酰亚胺、酰肼、戊二醛偶联或PEG交联等。尽管捕获物或引物通常包含胺基团并且固体载体包含可与之反应的基团,但也可使用其他构型。例如,可将NHS基团或其他NOS接头加入到待附接到固体表面的捕获寡核苷酸或引物中,并且固体表面可包含可官能化的胺。
例如,寡核苷酸可以一次一个核苷酸的方式附接到反应位点。例如,第一核苷酸可经由C1位置、3’-OH基团或5’-OH基团进行附接。任选地,第一核苷酸可经由接头附接到固体载体。例如,胺寡核苷酸可任选地通过其活化的酯附接到羧基基团,诸如羧酸基团。例如,第一核苷酸可经由3’-OH位置进行附接,并且5’-OH可用二甲基三苯甲基(DMT)基团进行保护。
例如,寡核苷酸可附接在核苷酸的寡聚物的部分中,或者该寡核苷酸可作为一个寡核苷酸进行附接。
寡核苷酸可通过本领域技术人员已知的常规核苷酸合成方法进行合成。在有机合成期间,合成中间体可使用本领域技术人员已知的常规保护基团进行保护。例如,核苷酸碱基可使用苯甲酰基基团或异丁酰基基团进行保护。另外,在有机合成期间,可使用本领域技术人员已知的方法修饰官能团以提高它们的反应性。例如,羧酸可通过活化的酯(诸如琥珀酰亚胺酯)进行活化。例如,硫醇、巯基或硫化物或SH-寡核苷酸可经由烷基化剂(诸如碘乙酰胺)进行共价连接。
应当理解,寡核苷酸可通过本领域技术人员已知的方法与酶共价附接。例如,检测寡核苷酸可与检测酶(诸如APSA)共价附接。
例如,蛋白质、肽、酶、DNA、RNA或抗体、寡聚物或聚合物可以是偶联或交联的以下物质:存在于N末端和许多氨基酸中的伯胺(-NH2)、位于每条多肽链的C末端处以及位于天冬氨酸(Asp,D)和谷氨酸(Glu,E)的侧链中的羧基(-COOH)、位于半胱氨酸(Cys,C)的侧链中的巯基(-SH),以及可通过用偏高碘酸钠氧化多糖翻译后修饰(糖基化)而在糖蛋白中产生的羰基(-CHO),诸如酮或醛基基团。例如,经NHS活化的酸可在有机碱的存在下,在无水溶剂中与羧酸偶联。然后加入偶联剂(诸如二环己基碳二亚胺(DCC)或乙基(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC))以形成与伯胺的稳定结合。
任选地,可使用交联剂。例如,可使用单官能交联剂、双官能交联剂或多官能交联剂。例如,可使用NHS、磺基-NHS、DSS、BS3(磺基-DSS)、胺-胺交联剂。例如,水溶性类似物磺基-NHS、羟基苯并三唑(HOBt)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)和五氟苯酚都可用作核酸、肽和蛋白质或抗体的连接试剂。例如,马来酰亚胺可用于交联例如半胱氨酸中的硫醇基团。
本领域技术人员应当理解,蛋白质、肽和核酸存在伯胺和/或羟基基团,并且可通过伯胺和/或羟基基团进行修饰或交联。
例如,磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯)、EDC 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、磺基-NHS(N-羟基磺基琥珀酰亚胺)、BS3(双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯)、DST(二琥珀酰亚胺基酒石酸酯)、SPDP(琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯)可用作交联剂。例如,二硫基双琥珀酰亚胺基丙酸酯可用于交联胺-胺。例如,BMH双马来酰亚胺己烷可用于交联巯基-巯基,诸如在蛋白质或肽中的半胱氨酸残基中。
例如,磺基-EGS(乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)可用于交联胺-胺。
例如,SM(PEG)4(聚乙二醇化的SMCC交联剂)可用于交联胺-巯基。这些交联剂在水溶性聚乙二醇间隔臂(17.6至95.2A)的末端含有NHS-酯和马来酰亚胺基团。
例如,磺基-EMCS(N-ε-马来酰亚胺己酰基-氧代磺基琥珀酰亚胺酯)可用于交联胺-巯基。
例如,磺基-SMPB(磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺苯基)丁酸酯)可用于交联胺-巯基。
应当理解,蛋白质、肽或含胺的分子可使用本领域技术人员已知的方法进行生物素酰化。例如,NHS-PEG 4-生物素N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)是用于生物素标记的聚乙二醇化的水溶性试剂。
任选地,可在寡核苷酸和蛋白质(诸如酶)之间使用接头。
例如,1%交联聚苯乙烯树脂的衍生化可根据Horiki等人(15)的方法进行。
例如,聚苯乙烯羧基树脂:可通过Bayer等人(16)的方法制备。
例如,Sephacryl S-500的溴化氰活化可按照Biinemann(8)的描述进行。
例如,经硫酸软骨素涂覆的CPG载体:可通过硫酸软骨素的CPG长链烷基胺(A型或C型)与EDC(Ghosh Musso NAR 1987)制备。
例如,寡核苷酸可通过用5'-氨基己基和5'-胱胺基氨基磷酸酯或寡核苷酸的其他衍生物进行封闭来制备。例如,5'-磷酸化的寡核苷酸与1,6-二氨基己烷在0.1M EDC的0.1MN-甲基咪唑溶液(pH 6.0)的存在下的反应可根据Chu等人(20)描述的直接偶联方案进行
例如,在0.2M HEPES(pH 7.7)中,可使用N-羟基琥珀酰亚胺活化的羧基Sephacryl(其负载有5'-氨基己基或5'-胱胺基氨基磷酸酯或其他受保护的寡核苷酸)将寡核苷酸附接到活化的N-羟基琥珀酰亚胺。
实施例13在阿摩尔浓度下的DNA检测
根据本文所述的DNA检测方法(实施例5)进行DNA检测测定。将HIV DNA用作靶。靶核酸分子具有SEQ ID No.15的序列。使用SEQ ID No.14的捕获寡核苷酸探针,其中3’附接到作为固体载体的聚苯乙烯。使用SEQ ID No.16的检测寡核苷酸探针,其中5'被生物素酰化。使用不同浓度的靶核酸分子:0阿摩尔(阴性对照)、1阿摩尔、2阿摩尔、3阿摩尔、4阿摩尔、5阿摩尔和6阿摩尔。在NaCl的存在下进行捕获和检测寡核苷酸探针与靶核酸分子的杂交。将固体载体(聚苯乙烯小珠)用含有NaCl的缓冲液洗涤,并通过离心分离。在NaCl的存在下进行APSA酶反应。将反应混合物用C18反相色谱处理,使用70%乙腈水溶液作为流动相。将1μL反应产物注射到MS上。在m/z=268处进行MS检测。
图18示出了DNA靶核酸分子的浓度与MS信号强度的标准曲线。结果表明DNA检测测定在阿摩尔范围是灵敏的。
实施例14在阿摩尔浓度下的DNA检测
根据本文所述的DNA检测方法(实施例5)进行DNA检测测定。将SARS-CoV2 DNA用作靶。靶核酸分子具有SEQ ID No.11的序列。使用SEQ ID No.13的捕获寡核苷酸探针,其中3’附接到作为固体载体的聚苯乙烯。使用SEQ ID No.12的检测寡核苷酸探针,其中5'被生物素酰化。使用不同浓度的靶核酸分子:1皮摩尔至1微摩尔(0.1阿摩尔、1阿摩尔、10阿摩尔、100阿摩尔、1飞摩尔、10飞摩尔、100飞摩尔)。将Tris缓冲液用作MS检测的空白阴性对照。将零DNA靶核酸用作检测测定的阴性对照。在NaCl的存在下进行捕获和检测寡核苷酸探针与靶核酸分子的杂交。将固体载体(聚苯乙烯小珠)用含有NaCl的缓冲液洗涤,并通过离心分离。在NaCl的存在下进行APSA酶反应。将反应混合物用C18反相色谱处理,使用95%乙腈水溶液、0.1%乙酸作为流动相,20μL/分钟。将1μL反应产物注射到MS上。在m/z=268处进行MS检测。
图19示出了DNA靶核酸分子的浓度与MS信号强度的标准曲线。结果表明DNA检测测定在皮摩尔至微摩尔范围是灵敏的。
实施例15低浓度合成DNA靶的检测
将合成DNA、PCR产物和质粒DNA各自用作靶核酸分子。PCR产物和质粒DNA测定进一步描述于实施例16中。这些实施例中使用的合成DNA是指合成的单链DNA。PCR产物是指经扩增的DNA(任选地从RNA开始),并且质粒DNA在较大质粒的情况下包含感兴趣的靶。
实施例10中设计的PCR引物、寡核苷酸捕获和检测探针用于本实施例和实施例16中。使用如下所述的本公开的各种方法检测来自合成靶的HIV、COVID、产志贺毒素的大肠杆菌(STEC)和溶血素DNA以及HIV和COVID质粒。
将捕获寡核苷酸固定在NOS表面化学96孔聚苯乙烯反应板上。
通常,将表面结合缓冲液(10mM Na2PO4+1mM EDTA缓冲液,pH 8.5)中的捕获寡核苷酸探针加入到板中,并在4℃下孵育过夜。然后将孔用另外的表面结合缓冲液洗涤3次,并用3% BSA淬灭并封闭1小时。将经淬灭和封闭的板用20mM Tris pH8.00+1mM EDTA洗涤3次,随后用结合缓冲液(20mM Tris pH8.00+1M NaCl+1mM EDTA)洗涤3次
使用本文所述的捕获寡核苷酸探针检测来自合成靶的HIV、COVID、志贺和溶血素DNA以及HIV和COVID质粒。
如在NOS表面化学96孔聚苯乙烯反应板上所提及的,经由胺官能团将合适的捕获寡核苷酸探针固定在3’端或5’端。每个实验重复进行三次(n=3)。
将合成DNA(结果如下所述)、PCR或质粒病毒DNA(结果如实施例16所述)(例如靶核酸分子)和相应检测寡核苷酸探针加入到板(包含捕获寡核苷酸探针)的每个孔中,以启动DNA杂交约1.5小时。然后将孔用结合缓冲液(20mM Tris pH8.00+1M NaCl+1mM EDTA)洗涤3次。将板用1%BSA封闭5分钟,然后用APSA的1% BSA溶液孵育15分钟,并用指定缓冲液洗涤11次(用结合缓冲液(20mM Tris pH8.00+1M NaCl+1mM EDTA快速洗涤6次);用20mM TrispH8.00+1M NaCl(无EDTA)洗涤3次,每次5分钟;并用20mM Tris pH8.00+2M AMBIC洗涤2次(1次5分钟和1次15分钟))。然后将板与1mM AMP一起孵育2小时,然后收集测定产物。使用质谱(136m/z)分析所述收集的样品。
图20、图21、图22和图23示出了单链合成DNA靶的结果。
HIV寡核苷酸靶
图20示出了不同浓度(1pM至500pM)的HIV合成DNA靶核酸分子在136m/z处的MS信号强度的图。
所使用的HIV DNA序列示于表9中。靶核酸分子具有SEQ ID No.24的序列。使用SEQID No.23的捕获寡核苷酸探针,其中3’通过胺官能团附接到作为固体载体的NOS表面聚苯乙烯。使用SEQ ID No.25的检测寡核苷酸探针,其中5'被生物素酰化。
图20表明本文所述的检测方法能够检测浓度低至1pM的HIV DNA靶核酸分子。注射1μL的1pM溶液对应于在阿摩尔量下的检测。这种水平的检测无需PCR即可实现。
SARS-CoV 2(COVID)DNA寡核苷酸靶检测
图21示出了不同浓度(100fM至10nM)的SARS-CoV 2合成靶核酸分子在136m/z处的MS信号强度的图。如本文所用,该方法能够检测浓度低至100fM的SARS-CoV 2靶寡核苷酸。所检测到的序列是核衣壳磷蛋白的一部分。
图21的测定中使用的SARS-Co-V 2DNA序列示于表3中。靶核酸分子具有SEQ IDNo.4的序列。使用SEQ ID No.6的捕获寡核苷酸探针,其中3’通过胺官能团附接到作为固体载体的NOS表面聚苯乙烯。使用SEQ ID No.5的检测寡核苷酸探针,其中5'被生物素酰化
产志贺毒素的大肠杆菌(STEC)DNA检测
图22示出了不同浓度(1pM至1nM)的合成STEC靶核酸分子在136m/z处的MS信号强度的图。如本文所用,该方法能够检测浓度低至1pM的STEC靶核酸分子。
所使用的STEC DNA序列示于表11中。靶核酸分子具有SEQ ID No.30的序列。使用SEQ ID No.29的捕获寡核苷酸探针,其中3’通过胺官能团附接到作为固体载体的NOS表面聚苯乙烯。使用SEQ ID No.31的检测寡核苷酸探针,其中5'被生物素酰化。
金黄色葡萄球菌溶血素DNA检测
图23示出了不同浓度(1pM至1nM)的溶血素合成靶核酸分子在136m/z处的MS信号强度的图。如本文所用,该方法能够检测浓度低至1pM的溶血素靶核酸分子(例如1μL的1pM溶液是可检测的或1阿摩尔)。
所使用的溶血素DNA序列示于表13中。靶核酸分子具有SEQ ID No.36的序列。使用SEQ ID No.35的捕获寡核苷酸探针,其中3’通过胺官能团附接到作为固体载体的NOS表面聚苯乙烯。使用SEQ ID No.37的检测寡核苷酸探针,其中5'被生物素酰化。
实施例16低浓度PCR和质粒DNA靶的检测
实施例15提供了本文进一步描述的PCR和质粒DNA产物的检测的一些细节。
对于PCR靶,通过使用PCR反应扩增质粒来制备靶核酸。运行琼脂糖凝胶以显现从HIV质粒扩增的PCR产物,并用于与本文所述的方法进行灵敏度比较。
如本文所述和所示,所述方法使用质谱导致灵敏度增强。
使用1ng至1阿克(rep1和rep2)作为模板运行PCR反应。使用1μl HIV质粒DNA启动反应。PCR运行35个循环,盖温度为105℃,反应体积为25μL,在94℃下熔解(30秒),在58℃下退火(30秒),在72℃下延伸(30秒)。通过在100伏特下运行2%琼脂糖凝胶达2小时来分离产物,大凝胶槽,直梯运行)。装载5μl样品。装载3μl梯。使用GelRedTM进行凝胶染色。
在使用PCR模板的实验中,还使5μl PCR样品(与装载在凝胶上的相同)进行本文所述的杂交步骤。
在使用质粒的实验中,质粒经由NOS与96孔形式的PVDF附接或吸附于其上。
下面提供进一步的细节。
HIV DNA检测
HIV Gag Pr55编码质粒(例如,登录号GQ432554.1)用于比较以下引物的测定:在捕获寡核苷酸探针区域内杂交的引物和在捕获寡核苷酸探针的探针区域外杂交的引物。使用两组引物产生两种不同长度的PCR产物,一组引物为133bp片段(捕获探针区域内的引物)并且一组引物为258bp片段(捕获探针区域外的引物),并将PCR产物用作靶核酸分子(例如PCR模板)。该测定涉及使用捕获探针和检测探针(例如全夹心法),并与如凝胶所示的灵敏度PCR扩增质粒进行比较,并使用图像分析进行定量。掺见图24A、图24B和图24C。
使用阿克、飞克、皮克或纳克量的模板HIV质粒DNA运行PCR反应。使用1μl HIV质粒DNA启动反应。PCR运行35个循环,盖温度为105℃,反应体积为25μL,在94℃下熔解(30秒),在58℃下退火(30秒),在72℃下延伸(30秒)。使用PCR产物(用于凝胶可视化或者用于所述测定和质谱分析)而无需纯化(例如直接使用5μl等分试样的反应物)。
用于258bp靶的捕获寡核苷酸探针(SEQ ID No.23)和检测寡核苷酸探针(SEQ IDNo.25)示于表9中。用于产生PCR产物的正向引物具有序列5’-CCAGGCCAGATGAGAGAACC-3’(SEQ ID No.38)。用于产生PCR产物的反向引物具有序列5’-TGAAGCTTGCTCGGCTCTTA-3’(SEQ ID No.39)。该258靶核酸分子具有序列:
5’-CCAGGCCAGATGAGAGAACCAAGGGGAAGTGACATAGCAGGAACTACTAGTACCCTTCAGGAACAAATAGGATGGATGACAAATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAATTTATAAAAGATGGATAATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTACCAGCATTCTGGACATAAGACAAGGACCAAAAGAACCCTTTAGAGACTATGTAGACCGGTTCTATAAAACTCTAAGAGCCGAGCAAGCTTCA-3’(SEQ ID No.40)。
对于258bp PCR产物靶,PCR引物位于捕获和检测序列的外部或旁侧。如下所述进行检测。
将5μL PCR样品溶液用结合缓冲液稀释至100μL,以用于各种“DNA ELiMSA反应”,例如用于与捕获和检测探针一起孵育、用于与报道酶检测探针和底物一起孵育,以及用于质谱分析)。通过捕获寡核苷酸探针上的3'胺将捕获寡核苷酸探针共价固定在NOS表面化学96孔聚苯乙烯反应板(n=3)上。将捕获寡核苷酸探针(也称为捕获DNA)的表面结合缓冲液(10mM Na2PO4+1mM EDTA缓冲液,pH 8.5)的加入到板中,并在4℃下孵育过夜。用表面结合缓冲液洗涤3次,然后将板淬灭并用3% BSA封闭1小时,并用20mM Tris pH8.00+1mM EDTA洗涤3次,随后用结合缓冲液(20mM Tris pH8.00+1M NaCl+1mM EDTA)洗涤3次。将靶核酸分子和检测探针DNA加入到板的每个孔中以启动DNA杂交约1.5小时,并用结合缓冲液(20mMTris pH8.00+1M NaCl+1mM EDTA)洗涤3次。将板用1% BSA封闭5分钟,然后用APSA的1%BSA溶液孵育15分钟,并用指定缓冲液洗涤10次(用结合缓冲液(20mM Tris pH8.00+1MNaCl+1mM EDTA快速洗涤6次);用20mM Tris pH8.00+1M NaCl(无EDTA)洗涤3次,每次5分钟;并用20mM Tris pH8.00+2M AMBIC洗涤2次(1次5分钟和1次15分钟))。然后将板与1mMAMP一起孵育2小时,然后收集测定产物。NTC表示PCR反应的无模板对照。误差棒=STDEV
图24A示出了来自飞克量的HIV质粒DNA序列的258nt PCR产物的质谱检测,其中PCR引物位于捕获和检测序列的外部或旁侧。在测定中使用所提及的粗PCR产物。
图24B示出了琼脂糖凝胶,其证明仅100fg是微弱可见的。图24C量化了图24B中凝胶上看到的量。
用于133bp靶的捕获寡核苷酸探针(SEQ ID No.23)和检测寡核苷酸探针(SEQ IDNo.25)与用于258np PCR产物的捕获寡核苷酸探针和检测寡核苷酸探针是相同的,并将该捕获寡核苷酸探针和该检测寡核苷酸探针示于表9中。用于产生PCR产物的正向引物具有序列5’-CCACCTATCCCAGTAGGAGAAATCTATAAAAGATGG-3’(SEQ ID No.41)。用于产生PCR产物的反向引物具有序列5’-CTACATAGTCTCTAAAGGGTTCTTTTGGTCCTTGTC-3’(SEQ ID No.42)。靶核酸分子具有序列:
5’-CCACCTATCCCAGTAGGAGAAATTTATAAAAGATGGATAATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTACCAGCATTCTGGACATAAGACAAGGACCAAAAGAACCCTTTAGAGACTATGTAG-3’(SEQID No.43)。
Covid检测
使用本文所述的引物和探针还测定了Covid PCR产物。
通过以下PCR条件制备SARS-Co-V 2靶核酸分子PCR产物。使用10ng SARS-CoV-2阳性对照质粒启动PCR反应。(运行35个循环,盖温度为105℃,反应体积为50μL,在94℃下熔解(30秒),在58℃下退火(30秒),在72℃下延伸(1分钟))。分离5μl产物,并使5μl产物进行本文所述的测定。具体地,然后将25μL PCR反应物等分成用于GEL分析的5μL以及用于杂交和质谱分析的5μL。
图25示出了来自Covid DNA质粒DNA序列的138nt PCR产物的检测,其中PCR引物位于捕获和检测序列内。
所述方法非常灵敏,特别是考虑到仅对总反应体积的小体积进行质谱分析。通常对200μl最终反应体积中的1μl-2μl进行质谱。在每种情况下,本文所述的“DNA EliMSA”以10倍-100倍的更高灵敏度来检测靶。因为通过质谱仅测定了反应体积的1/100或1/200,所以本文所述的用于相同水平的模板的DNA EliMSA测定可具有10,000倍-20,000倍的更高灵敏度。
PCR被认为是非常灵敏的,但可能是劳动密集型或耗时的,因为它通常涉及手动的凝胶装载、凝胶染色和定量。所述方法可以是自动化的。例如,当本文所述的测定可在96孔板中进行时,可使用96孔注射机器人进行自动化操作。
还证明了质粒DNA的直接检测。图26示出了经由核苷酸胺附接到NOS板的HIV质粒的检测。以100fM至100nM来测试所测试的质粒的浓度。其他步骤和所使用的检测探针如上所述。图26示出了无需样品操作(例如裂解)即可检测的超螺旋质粒的皮摩尔范围内的检测。
实施例17PVDF上的SARS-CoV-2DNA的检测
捕获寡核苷酸探针还可以是非共价附接的。
用吸附到高结合0.45微米PVDF 96孔滤板上的捕获寡核苷酸探针检测SARS-CoV-2质粒,即IDT CAT10006625。通过吸附固定的捕获DNA来进行“DNA ELiMSA”(n=3)。将捕获DNA加入到PVDF中。将PVDF用3%BSA封闭1小时,并用20mM Tris pH8.00+1mM EDTA洗涤3次,随后用结合缓冲液(20mM Tris pH8.00+1M NaCl+1mM EDTA)洗涤3次。将靶核酸分子(例如Covid质粒)和检测寡核苷酸探针DNA加热至95℃,并加入到板的每个孔中以启动DNA杂交约1.5小时,并用结合缓冲液(20mM Tris pH8.00+1M NaCl+1mM EDTA)洗涤3次。将板用1%BSA封闭5分钟,然后用APSA的1%BSA溶液孵育15分钟,并用指定缓冲液洗涤10次(用结合缓冲液(20mM Tris pH8.00+1M NaCl+1mM EDTA快速洗涤6次);用20mM Tris pH8.00+1M NaCl(无EDTA)洗涤3次,每次5分钟;并用20mM Tris pH8.00+2M AMBIC洗涤2次(1次5分钟和1次15分钟))。然后将板与1mM AMP一起孵育2小时,然后收集测定产物。
图27示出了不同浓度(1pM至1μM)的SARS-CoV-2靶核酸分子(例如双链盘绕质粒)在268m/z处的MS信号强度的图。如本文所用,该方法能够检测浓度低至1pM的SARS-CoV-2靶核酸分子。可在约6个对数上进行线性检测。在该实施方案中,靶核酸是Covid质粒,并且该靶被吸附到PVDF上(例如,双链质粒的非共价附接)。
实施例18
图15A所示的使用捕获探针和标记引物的几种方法在此举例说明。这些方法可称为半夹心法,在这些测定中不使用作为检测探针的方法。
各种单链捕获寡核苷酸探针经由胺官能团附接到NOS板上。还可使用其他附接。经由捕获寡核苷酸探针的3’或5’端附接到固体表面(例如胺官能团可能位于在3’或5’端或两者上)。对3’附接和5’附接两者进行测试,并且两者都显示允许检测。对反义链和正义链两者进行附接,并且两者都显示允许检测。如果将反义链附接到固体载体,则使用5’生物素酰化的正向引物。如果将正义链附接到固体载体,则使用5’生物素酰化的反向引物。可对正义链和反义链两者进行附接,并且在这种情况下,可使用5’生物素标记的正向引物和反向引物。
在一个实施例中,将生物素酰化的PCR引物序列与3’胺捕获探针一起用于NOS板。
生物素酰化的HIV_引物_3_正向5’生物素-CCAGGCCAGATGAGAGAACC(SEQ IDNO.38)
生物素酰化的HIV_引物_3_反向5’生物素-TGAAGCTTGCTCGGCTCTTA(SEQ IDNo.39)
在另一个实施例中,生物素酰化的PCR引物序列与5’胺捕获探针一起用于NOS板。
用于使用HIV引物3的反应的捕获探针可以是CCACCTATCCCAGTAGGAGAAATCTATAAAAGATGGATAATCCTGGGAT(SEQ ID NO:45),该捕获探针可经由5’胺固定。如所证明的,可有利地使用5’固定和3’固定。
图28A和图28B示出了使用生物素酰化的正向引物和生物素酰化的反向引物进行测定的结果。
图28A示出了来自HIV质粒的PCR反应。使用1ng-1阿克质粒作为模板。使用1μl HIV质粒DNA启动反应。PCR运行35个循环,盖温度为105℃,反应体积为25μL,在94℃下熔解(30秒),在58℃下退火(30秒),在72℃下延伸(1分钟)。通过在100伏特下运行2%琼脂糖凝胶达1小时20分钟来分离产物。装载5μl样品。装载3μl梯。使用GelRed进行凝胶染色。图28A上部凝胶:BHIV_引物_3_正向+HIV_引物_3_反向PCR组。下部凝胶:HIV_引物_3_正向+BHIV_引物_3_反向PCR组。
经扩增的反义链(捕获寡核苷酸探针)是在NOS板上捕获的3’胺。当反义链被共价附接到NOS板时,生物素酰化的正向引物被用于制备可附着到捕获寡核苷酸探针的经标记的正义链。由于PCR链经由引物生物素酰化被扩增,因此检测探针本身不是必需的。
这可称为使用NOS_3’-胺捕获探针的半夹心测定。如本文所述,对粗生物素-PCR258nt进行质谱。
所产生的HIV PCR产物是包含生物素5’端的SEQ ID NO:40(258nt),例如生物素-5’-SEQ ID NO:40。
本实施例中使用的HIV捕获III探针是(50nt):5’-AATCCCAGGATTATCCATCTTTTATAGATTTCTCCTACTGGGATAGGTGG-3’-胺(SEQ ID NO:44)。
如所提及的,使用了生物素标记的正向引物+未标记的反向引物。
图28B示出了使用下述方法用质谱进行检测后的结果。
所产生的生物素标记的正向引物是一种HIV生物素酰化的PCR产物,该PCR产物为258nt。包含PCR产物的PCR反应物无需纯化,即可通过半夹心HIV PCR DNA ELiMSA(例如捕获探针、使引物生物素酰化、与报道酶检测探针反应,以及检测一种或多种可电离产物)进行检测,通过将捕获DNA固定在NOS表面化学96孔聚苯乙烯反应板上来进行该半夹心HIVPCR DNA ELiMSA(n=3)。将5μL PCR样品溶液用结合缓冲液稀释至100μL,以用于各种DNAELiMSA反应。零表示不添加靶DNA序列;NTC表示PCR反应的无模板对照;将具有100nM的合成靶DNA序列的全夹心HIV DNA ELiMSA用作阳性对照。误差棒=STDEV
通过将捕获DNA固定在NOS表面化学96孔聚苯乙烯反应板上来进行DNA ELiMSA。将捕获DNA的表面结合缓冲液(10mM Na2PO4+1mM EDTA缓冲液,pH 8.5)加入到板中,并在4℃下孵育过夜。用结合缓冲液(20mM Tris pH8.00+1M NaCl+1mM EDTA)洗涤3次,然后将板淬灭并用3% BSA封闭1小时,并用20mM Tris pH8.00+1mM EDTA洗涤3次,随后用结合缓冲液洗涤3次。将变性的PCR产物以及合成靶和检测DNA序列加入到板的每个孔中,以启动DNA杂交约1.5小时,并用结合缓冲液洗涤3次。将板用1%BSA封闭5分钟,然后用APSA的1% BSA溶液孵育15分钟,并用指定缓冲液洗涤10次(用结合缓冲液(20mM Tris pH8.00+1M NaCl+1mMEDTA快速洗涤6次);用20mM Tris pH8.00+1M NaCl(无EDTA)洗涤3次,每次5分钟;并用20mMTris pH8.00+2M AMBIC洗涤2次(1次5分钟和1次15分钟))。然后将板与1mM AMP一起孵育2小时,然后收集测定产物。对1μl或2μl测定产物(200μl)进行质谱,注射1μl或2μl(参见图28B)。在图28A所示的凝胶中,几乎检测不到100fg靶。使用本文所述的方法,并且如图28B所示,100fg模板是可清晰检测的。此外,如所提及的,当凝胶使用全部等效样品时,使用质谱运行仅小部分(1/100、1/200)的测定产物。
使用捕获探针的5’胺附接和生物素酰化的反向引物来进行类似的测定。
在该测定中,单链正义链HIV捕获探针通过其5'端处的胺共价附接到NOS板。
HIV捕获III(50nt)是胺-5'-CCACCTATCCCAGTAGGAGAAATCTATAAAAGATGGATAATCCTGGGATT-3’(SEQ ID NO:45)。
在该测定中,粗PCR产物(也称为“未加工的”产物)证明了该方法的稳健性。
HIV PCR产物(258nt):生物素-5’-TGAAGCTTGCTCGGCTCTTAGAGTTTTATAGAACCGGTCTACATAGTCTCTAAAGGGTTCTTTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGCTGGTAGGGCTATACATTCTTACTATTTTATTTAATCCCAGGATTATCCATCTTTTATAAATTTCTCCTACTGGGATAGGTGGATTATTTGTCATCCATCCTATTTGTTCCTGAAGGGTACTAGTAGTTCCTGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCTCATCTGGCCTGG-3(SEQ IDNO;46)与SEQ ID NO:40的互补
结果示于图28C中。
图28C示出了HIV生物素酰化的PCR产物258nt无需纯化,即可通过半夹心HIV PCRDNA ELiMSA进行检测,通过将捕获DNA固定在NOS表面化学96孔聚苯乙烯反应板上来进行该半夹心HIV PCR DNA杂交(n=3)。将5μL PCR样品溶液用结合缓冲液稀释至100μL,以用于各种DNA ELiMSA反应。零表示不添加靶DNA序列;NTC表示PCR反应的无模板对照;将具有100nM的合成靶DNA序列的全夹心HIV DNA ELiMSA用作阳性对照。误差棒=STDEV
通过将捕获DNA固定在NOS表面化学96孔聚苯乙烯反应板上来进行DNAELiMSA。将捕获DNA的表面结合缓冲液(10mM Na2PO4+1mM EDTA缓冲液,pH 8.5)加入到板中,并在4℃下孵育过夜。用结合缓冲液(20mM Tris pH8.00+1M NaCl+1mM EDTA)洗涤3次,然后将板淬灭并用3% BSA封闭1小时,并用20mM Tris pH8.00+1mM EDTA洗涤3次,随后用结合缓冲液洗涤3次。将通过加热变性的PCR产物以及合成靶和检测DNA序列加入到板的每个孔中,以启动DNA杂交约1.5小时,并用结合缓冲液洗涤3次。将板用1% BSA封闭5分钟,然后用APSA的1% BSA溶液孵育15分钟,并用指定缓冲液洗涤10次(用结合缓冲液(20mM Tris pH8.00+1MNaCl+1mM EDTA快速洗涤6次);用20mM Tris pH8.00+1M NaCl(无EDTA)洗涤3次,每次5分钟;并用20mM Tris pH8.00+2M AMBIC洗涤2次(1次5分钟和1次15分钟))。然后将板与1mMAMP一起孵育2小时,然后收集测定产物。
在该测定中,只需10fg起始模板,即可产生可再现的信号。
进一步的测定使用非共价附接和PVDF。在该实施例中,使用半夹心测定检测HIV,其中将单链HIV靶序列吸附到PVDF上,并使用互补的且标记有标签的检测探针来检测靶序列。该测定比较了0pmol靶与100pmol靶。
HIV检测III(50nt):生物素-5’-CTACATAGTCTCTAAAGGGTTCTTTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATG-3’(SEQ ID NO:25)。
HIV寡核苷酸靶III:(133nt):
CCACCTATCCCAGTAGGAGAAATCTATAAAAGATGGATAATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTACCAGCATTCTGGACATAAGACAAGGACCAAAAGAACCCTTTAGAGACTATGTAG(SEQ ID NO:24)。
通过将合成靶DNA吸附到0.45微米PVDF 96孔滤板(n=3)上来进行HIV半夹心DNAELiMSA。将PVDF滤板用甲醇预润湿,用靶DNA点样,用3%BSA封闭1小时,并用20mM TrispH8.00+1mM EDTA洗涤3次,随后用结合缓冲液(20mM Tris pH8.00+1M NaCl+1mM EDTA)洗涤3次。将变性的检测DNA序列加入到板的每个孔中以启动DNA杂交约1.5小时,并用结合缓冲液洗涤3次。将板用1% BSA封闭5分钟,然后用APSA的1% BSA溶液孵育15分钟,并用指定缓冲液洗涤10次(用结合缓冲液(20mM Tris pH8.00+1M NaCl+1mM EDTA快速洗涤6次);用20mM Tris pH8.00+1M NaCl(无EDTA)洗涤3次,每次5分钟;并用20mM Tris pH8.00+2MAMBIC洗涤2次(1次5分钟和1次15分钟))。然后将板与1mM AMP一起孵育2小时,然后收集测定产物。
如图29所示,非共价附接的HIV靶序列可用本文所述的“DNA ELIMSA”方法进行检测。
实施例19
通过加入SDS或非相关的核酸来进行另外的测定,以评估该方法的稳健性。
通过将5’N捕获DNA固定在NOS表面化学96孔聚苯乙烯反应板上来进行CovidDNAELiMSA。将捕获DNA的表面结合缓冲液(10mM Na2PO4+1mM EDTA缓冲液,pH 8.5)加入到板中,并在4℃下孵育过夜。用表面结合缓冲液洗涤3次,然后在20mM Tris pH 8.5中淬灭。在BSA之前、期间或之后或者在靶杂交期间,将板用3% BSA封闭和/或用5微克鲑鱼精DNA封闭板1小时,并用20mM Tris pH8.00+1mM EDTA洗涤3次,随后用结合缓冲液(20mM TrispH8.00+1M NaCl+1mM EDTA)洗涤3次。将板用1%BSA封闭5分钟,然后用APSA的1% BSA溶液孵育15分钟,并用指定缓冲液洗涤10次(用结合缓冲液快速洗涤6次;用20mM Tris pH8.00+1M NaCl(无EDTA)洗涤3次,每次5分钟;并用20mM Tris+2M AMBIC洗涤2次(1次5分钟和1次15分钟))。然后将板与1mM AMP一起孵育2小时,然后收集测定产物。使用质谱在136m/z处测量分析产物。
在BSA之前,或与BSA组合时,或在杂交步骤期间添加鲑鱼精,所添加的鲑鱼精DNA不会明显影响测定。
在其他测试中也加入SDS。
将靶和探针DNA与0、0.1%、0.5%、1%和2%w/v十二烷基硫酸钠(SDS)一起孵育,将它们加入到板的指定孔中以启动DNA杂交约1.5小时。在长模板浓度下,添加SDS似乎减少了非特异性结合。该测定能够耐受高浓度的SDS或非离子型表面活性剂。
实施例20
PCR引物被设计用于COVID,这些引物在PCR中的效果非常好。它们还可用于本文所述的方法中。
使用以下PCR条件,使用包含核衣壳的SARS-Co-V2质粒来制备SARS-Co-V 2PCR反应物。使用10ng SARS-CoV-2阳性对照质粒启动PCR反应。(运行35个循环,盖温度为105℃,反应体积为50μL,在94℃下熔解(30秒),在58℃下退火(30秒),在72℃下延伸(1分钟))。
如图30所示,装载10μl PCR反应物以用于WHO引物(WHO N1(72nt)和WHO N2(67nt产物)),并装载5μl PCR样品以用于所测试的引物(参见实施例11),SEQ ID NO:2和3产生138nt产物,并且SEQ ID NO:7和8产生377nt产物。装载4μl梯。使用GelRed进行后染色达30分钟。在不存在模板或不存在待扩增的DNA模板的情况下,不存在条带。根据所使用的引物对,获得了预期大小为67nt至377nt的范围内的片段。由引物对SEQ ID No:2和3以及7和8产生的产物产生了比WHO引物中的任一对引物更强的条带。参见图30。
尽管已参考实施例描述了本公开,但应当理解,权利要求书的范围不应受实施例中阐述的实施方案限制,而是应给予与作为整体的描述一致的最广泛解释。
所有出版物、专利和专利申请均以引用方式全文并入本文,其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被明确地且单独地指示以引用方式全文并入。当发现本公开中的术语在以引用方式并入本文的文献中具有不同定义时,本文提供的定义用作该术语的定义。
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Vermisoglou E,
Figure BDA0004191243790000651
D,Jayaramulu K,Pykal M,Frébort I,/>
Figure BDA0004191243790000652
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<160> 75
<170> PatentIn 3.5版本
<210> 1
<211> 1260
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS COV-2核衣壳
<400> 1
atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc 60
tcagattcaa ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt 120
cggccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc 180
aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca 240
gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa 300
atgaaagatc tcagtccaag atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga 360
cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat 420
acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa 480
cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 540
caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 600
agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct 660
ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa 720
caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa 780
aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa 840
caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat 900
tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt 960
ggcatggaag tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat 1020
gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac 1080
aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa 1140
gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg 1200
gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcctaa 1260
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS COV-2引物
<400> 2
caaaacaacg tcggccccaa gg 22
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS COV-2引物
<400> 3
ggtcatctgg actgctattg gtgt 24
<210> 4
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS COV-2靶序列
<400> 4
caaaacaacg tcggccccaa ggtttaccca ataatactgc gtcttggttc accgctctca 60
ctcaacatgg caaggaagac cttaaattcc ctcgaggaca aggcgttcca attaacacca 120
atagcagtcc agatgacc 138
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS COV-2检测探针
<400> 5
gaaccaagac gcagtattat tgggtaaacc ttggggccga cgttgttttg 50
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 捕获寡核苷酸探针序列
<400> 6
gaaccaagac gcagtattat tgggtaaacc ttggggccga cgttgttttg 50
<210> 7
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<212> DNA
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<220>
<223> SARS CoV2组3 PCR引物
<400> 7
tggaccccaa aatcagcgaa 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS CoV2组3 PCR引物
<400> 8
tgccgtcttt gttagcacca 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS CoV2组3 PCR引物
<400> 9
cgaggacaag gcgttccaat 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS CoV2组3 PCR引物
<400> 10
tgttagcagg attgcgggtg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2的靶核酸分子
<400> 11
gcgttccaat taacaccaat agcagtccag atgaccaaat tggctactac cgaagagcta 60
ccagacgaat tcgtggtggt gacggtaaaa tgaaagatct cagtccaaga tggtatttct 120
actacctagg aactgggcca gaagctggac ttccctatgg tgctaacaaa gacggcatca 180
tatgggttgc aactgaggga gccttgaata caccaaaaga tcac 224
<210> 12
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS COV-2检测探针寡核苷酸
<400> 12
gcatcatatg ggttgcaact gagggagcct tgaatacacc aaaagatcac 50
<210> 13
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 捕获寡核苷酸探针序列
<400> 13
gcgttccaat taacaccaat agcagtccag atgaccaaat tggctactac 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV捕获寡核苷酸探针
<400> 14
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<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV靶核酸分子
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cagtcccgcc caggccacgc ctccctggaa agtccccagc ggaaagtccc ttgtagcaag 60
ctcgatgtca gcagttcttg aagtactccg gat 93
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV检测寡核苷酸探针
<400> 16
gatccggagt acttcaagaa ctgctgacat cgagcttgct acaag 45
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> HIV捕获寡核苷酸探针
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gaataatagg gcatttacaa ccatcccttc agacaggatc agaagaactt aaatcattat 60
ataatttagt agcagtcctt tattgttatt gtgtgcatca aaggatagag gtaaaagaca 120
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<223> 检测寡核苷酸探针
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<223> HIV靶核酸分子
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gcccagaagt aatacccatg tttacagcat tatcagaagg ggccacccca caagatttaa 60
acaccatgtt aaacacagtg gggggacatc aagcagccat gcaaatgtta aaagagacca 120
tcaatgagga agctgcagaa tg 142
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cattctgcag cttcctcatt gatggtctct tttaacattt gcatggctgc 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> HIV捕获寡核苷酸探针
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aatcccagga ttatccatct tttatagatt tctcctactg ggataggtgg 50
<210> 24
<211> 133
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> HIV靶核酸分子
<400> 24
ccacctatcc cagtaggaga aatctataaa agatggataa tcctgggatt aaataaaata 60
gtaagaatgt atagccctac cagcattctg gacataagac aaggaccaaa agaacccttt 120
agagactatg tag 133
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> HIV检测寡核苷酸探针
<400> 25
ctacatagtc tctaaagggt tcttttggtc cttgtcttat gtccagaatg 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 志贺毒素大肠杆菌(STEC)捕获寡核苷酸探针
<400> 26
tatatgttca agaggggtcg atatctctgt ccgtatacta tttaacgaag 50
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<223> STEC靶核酸分子
<400> 27
cttcgttaaa tagtatacgg acagagatat cgacccctct tgaacatata tctcagggga 60
ccacatcggt gtctgttatt aaccacaccc caccgggcag ttattttgct gtggatatac 120
gagggcttga tgtctatc 138
<210> 28
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> STEC 检测寡核苷酸探针
<400> 28
gatagacatc aagccctcgt atatccacag caaaataact gcccggtggg 50
<210> 29
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> STEC捕获寡核苷酸探针
<400> 29
attcagtata acggccacag tccccagtat cgctgatata ttattaaagg 50
<210> 30
<211> 121
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> STEC靶核酸分子
<400> 30
cctttaataa tatatcagcg atactgggga ctgtggccgt tatactgaat tgccatcatc 60
agggggcgcg ttctgttcgc gccgtgaatg aagagagtca accagaatgt cagataactg 120
g 121
<210> 31
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> STEC 检测寡核苷酸探针
<400> 31
ccagttatct gacattctgg ttgactctct tcattcacgg cgcgaacaga 50
<210> 32
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> STEC捕获寡核苷酸探针
<400> 32
cagcgactgg tccagtattc tttcccgtca accttcactg taaatgtgtc 50
<210> 33
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> STEC靶核酸分子
<400> 33
gacacattta cagtgaaggt tgacgggaaa gaatactgga ccagtcgctg gaatctgcaa 60
ccgttactgc aaagtgctca gttgacagga atgactgtca caatcaaatc cagtacctgt 120
gaatcaggct 130
<210> 34
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> STEC 检测寡核苷酸探针
<400> 34
agcctgattc acaggtactg gatttgattg tgacagtcat tcctgtcaac 50
<210> 35
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 金黄色葡萄球菌捕获寡核苷酸探针
<400> 35
catgaaaagt tgattgccat ataccgggtt ccaagaatct ctatcatatg 50
<210> 36
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 金黄色葡萄球菌靶核酸分子
<400> 36
catatgatag agattcttgg aacccggtat atggcaatca acttttcatg aaaactagaa 60
atggttctat gaaagcagca gagaacttcc ttgatcctaa caaagcaagt tctctattat 120
cttcagggtt ttcaccagac ttcg 144
<210> 37
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> S AUREUS 检测寡核苷酸探针
<400> 37
cgaagtctgg tgaaaaccct gaagataata gagaacttgc tttgttagga 50
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV正向引物
<400> 38
ccaggccaga tgagagaacc 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV反向引物
<400> 39
tgaagcttgc tcggctctta 20
<210> 40
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV靶核酸分子
<400> 40
ccaggccaga tgagagaacc aaggggaagt gacatagcag gaactactag tacccttcag 60
gaacaaatag gatggatgac aaataatcca cctatcccag taggagaaat ttataaaaga 120
tggataatcc tgggattaaa taaaatagta agaatgtata gccctaccag cattctggac 180
ataagacaag gaccaaaaga accctttaga gactatgtag accggttcta taaaactcta 240
agagccgagc aagcttca 258
<210> 41
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV正向引物
<400> 41
ccacctatcc cagtaggaga aatctataaa agatgg 36
<210> 42
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV反向引物
<400> 42
ctacatagtc tctaaagggt tcttttggtc cttgtc 36
<210> 43
<211> 133
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV靶核酸分子
<400> 43
ccacctatcc cagtaggaga aatttataaa agatggataa tcctgggatt aaataaaata 60
gtaagaatgt atagccctac cagcattctg gacataagac aaggaccaaa agaacccttt 120
agagactatg tag 133
<210> 44
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV捕获探针
<400> 44
aatcccagga ttatccatct tttatagatt tctcctactg ggataggtgg 50
<210> 45
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV捕获探针
<400> 45
ccacctatcc cagtaggaga aatctataaa agatggataa tcctgggatt 50
<210> 46
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV PCR产物
<400> 46
tgaagcttgc tcggctctta gagttttata gaaccggtct acatagtctc taaagggttc 60
ttttggtcct tgtcttatgt ccagaatgct ggtagggcta tacattctta ctattttatt 120
taatcccagg attatccatc ttttataaat ttctcctact gggataggtg gattatttgt 180
catccatcct atttgttcct gaagggtact agtagttcct gctatgtcac ttccccttgg 240
ttctctcatc tggcctgg 258
<210> 47
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ALFA-标签
<400> 47
Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu
1 5 10
<210> 48
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Avi标签
<400> 48
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
1 5 10 15
<210> 49
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C-标签
<400> 49
Glu Pro Glu Ala
1
<210> 50
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 钙调蛋白标签
<400> 50
Lys Arg Arg Trp Lys Lys Asn Phe Ile Ala Val Ser Ala Ala Asn Arg
1 5 10 15
Phe Lys Lys Ile Ser Ser Ser Gly Ala Leu
20 25
<210> 51
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 聚谷氨酸标签
<400> 51
Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5
<210> 52
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E-标签
<400> 52
Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg
1 5 10
<210> 53
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FLAG-标签
<400> 53
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HA-标签
<400> 54
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Myc-标签
<400> 55
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 56
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NET标签
<400> 56
Thr Lys Glu Asn Pro Arg Ser Asn Gln Glu Glu Ser Tyr Asp Asp Asn
1 5 10 15
Glu Ser
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Rho1D4-标签
<400> 57
Thr Glu Thr Ser Gln Val Ala Pro Ala
1 5
<210> 58
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S-标签
<400> 58
Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser
1 5 10 15
<210> 59
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SBP-标签
<400> 59
Met Asp Glu Lys Thr Thr Gly Trp Arg Gly Gly His Val Val Glu Gly
1 5 10 15
Leu Ala Gly Glu Leu Glu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Glu His His Pro
20 25 30
Gln Gly Gln Arg Glu Pro
35
<210> 60
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Softag1
<400> 60
Ser Leu Ala Glu Leu Leu Asn Ala Gly Leu Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 61
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Softag3
<400> 61
Thr Gln Asp Pro Ser Arg Val Gly
1 5
<210> 62
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Spot-标签
<400> 62
Pro Asp Arg Val Arg Ala Val Ser His Trp Ser Ser
1 5 10
<210> 63
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Strep-标签
<400> 63
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 64
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Strep-标签
<400> 64
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 65
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T7-标签
<400> 65
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly
1 5 10
<210> 66
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TC-标签
<400> 66
Cys Cys Pro Gly Cys Cys
1 5
<210> 67
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ty1标签
<400> 67
Glu Val His Thr Asn Gln Asp Pro Leu Asp
1 5 10
<210> 68
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> V5标签
<400> 68
Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr
1 5 10
<210> 69
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VSV-标签
<400> 69
Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys
1 5 10
<210> 70
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Xpress标签
<400> 70
Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 71
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Isopep标签
<400> 71
Thr Asp Lys Asp Met Thr Ile Thr Phe Thr Asn Lys Lys Asp Ala Glu
1 5 10 15
<210> 72
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Spy标签
<400> 72
Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys
1 5 10
<210> 73
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Snoop标签
<400> 73
Lys Leu Gly Asp Ile Glu Phe Ile Lys Val Asn Lys
1 5 10
<210> 74
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Dog标签
<400> 74
Asp Ile Pro Ala Thr Tyr Glu Phe Thr Asp Gly Lys His Tyr Ile Thr
1 5 10 15
Asn Glu Pro Ile Pro Pro Lys
20
<210> 75
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Sdy标签
<400> 75
Asp Pro Ile Val Met Ile Asp Asn Asp Lys Pro Ile Thr
1 5 10

Claims (181)

1.一种检测靶核酸分子的方法,所述方法包括
a.
i.在第一结合溶液中孵育样品与捕获寡核苷酸探针,所述样品假定包含所述靶核酸分子,所述捕获寡核苷酸探针包含与所述靶核酸分子互补的序列,并且所述捕获寡核苷酸探针附接到固相,任选地其中所述固相通过接头附接到所述捕获寡核苷酸探针;或者
ii.在第一结合溶液中孵育样品与固相,所述样品假定包含所述靶核酸分子,以将所述样品/靶核酸分子附接到所述固相,任选地其中所述固相通过接头附接到所述样品/靶核酸分子;
b.在形成靶:检测探针复合物的条件下,在第二结合溶液中使任何靶核酸分子与检测寡核苷酸探针结合;
c.在形成靶:检测探针:酶复合物的条件下,在第三结合溶液中孵育任何靶:检测探针复合物与报道酶检测探针;
d.用洗涤溶液洗涤所述固相,以除去任何未结合的报道酶检测探针;
e.在底物反应溶液中孵育任何靶:检测探针:酶复合物与报道酶检测探针底物,以产生一种或多种可电离产物;以及
f.使用质谱(MS)检测所述一种或多种可电离产物中的至少一种可电离产物,
其中
i.所述第一结合溶液、所述第二结合溶液和所述第三结合溶液中的至少所述第三结合溶液基本上不含无机盐;
ii.所述洗涤溶液基本上不含无机盐;
iii.所述方法还包括在所述任选的步骤d)和所述步骤e)之前交联任何靶:检测探针:酶复合物的组分和所述捕获寡核苷酸探针;并且/或者
iv.所述方法还包括在使用MS检测之前分离所述一种或多种可电离产物;并且
其中对所述一种或多种可电离产物中的所述至少一种可电离产物的检测指示所述样品包含所述靶核酸分子。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述第二结合溶液、所述第三结合溶液和所述底物反应溶液各自包含Tris缓冲液。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述捕获寡核苷酸探针任选地通过与所述固相非共价或共价结合而被直接固定到所述固相上,或者所述检测寡核苷酸探针是检测寡核苷酸引物,并且所述步骤包括在扩增溶液中用检测寡核苷酸引物扩增所述靶核酸分子,并且在形成靶:检测探针复合物的条件下,在所述第二结合溶液中将任何经扩增的靶与所述检测寡核苷酸探针结合。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中所述方法包括在使用MS检测之前分离所述一种或多种可电离产物。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述分离是通过液相色谱进行的。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述液相色谱选自正相色谱、反相色谱和高效液相色谱(HPLC)。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述液相色谱是等度的。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法,其中使用MS检测所述一种或多种可电离产物的所述步骤包括任选地通过电喷雾电离(ESI)、MALDI、化学电离、电子碰撞、激光解吸、电气电离或热电离来电离所述一种或多种可电离产物,以产生一种或多种产物离子,并且使所述一种或多种产物离子进行MS,任选的串联MS(MS/MS)。
9.根据权利要求8所述的方法,其中所述电离是正电离或负电离。
10.根据权利要求8或9所述的方法,其中所产生的一种或多种产物离子具有为至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10的选定信噪比。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法,其中所述MS选自电喷雾电离串联MS(ESI-MS/MS)、基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)、串联MS(MS/MS)、多轮碎裂MSN、MALDI、电喷雾、纳米喷雾、表面电离、激光解吸和电离、大气电离、真空电离,以及配备有毛细管电泳、超声波或声波或震动、纳米液滴或微滴样品引入系统的MS。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法,其中使用MS的所述检测包括通过单离子监测(SIM)记录产物离子强度,并且/或者通过单试剂监测(SRM)记录产物离子母体到片段的转变。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法,其中所述捕获寡核苷酸探针包含寡核苷酸,所述寡核苷酸具有与部分所述靶核酸分子互补的长度为至少25个核苷酸、长度为至少35个核苷酸的序列,任选地所述捕获寡核苷酸探针具有与所述靶核酸分子的所述序列的一部分互补的长度为约30个核苷酸至约60个核苷酸或长度为约40个核苷酸至约55个核苷酸的序列。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述检测寡核苷酸探针包含寡核苷酸和二级靶部分,所述寡核苷酸具有与所述靶核酸分子的另一部分互补的序列,所述二级靶部分选自生物素、ALFA标签、Avi标签、C标签、钙调蛋白标签、聚谷氨酸标签、E标签、Flag标签、HA标签、His标签、myc标签、NE标签、Rho1D4标签、S标签、SBP标签、Sof标签1、Sof标签3、Spot标签、Strept标签、T7标签、TC标签、Ty1标签、V5标签、VSV标签、Xpress标签、Isopep标签、Spy标签、Snoop标签、Dog标签、Sdy标签、生物素羧基载体蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶标签、GFP标签、Halo标签、SNAP标签、CLIP标签、HUH标签、麦芽糖结合蛋白标签、Nus标签、硫氧还蛋白标签、Fc标签和CRDSAT标签,任选地所述二级靶部分是生物素。
15.根据权利要求14所述的方法,其中与所述靶核酸分子的所述另一部分互补的所述检测寡核苷酸探针的所述寡核苷酸的所述序列的长度为至少25个核苷酸、长度为至少35个核苷酸,任选地所述检测寡核苷酸探针的长度为约30个核苷酸至约60个核苷酸,或长度为约40个核苷酸至约55个核苷酸。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法,其中所述捕获寡核苷酸探针和所述检测寡核苷酸探针均可在非重叠区域处结合所述靶核酸分子,任选地所述非重叠区域是相邻的,任选地所述非重叠区域间隔至少一个核苷酸,任选地所述非重叠区域间隔至少5个核苷酸,任选地所述非重叠区域间隔约2个核苷酸、约5个核苷酸、约10个核苷酸、约20个核苷酸或约25个核苷酸。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法,其中所述报道酶检测探针包含报道酶和任选的二级靶结合部分,并且其中所述二级靶结合部分与所述报道酶共价结合。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述二级靶结合部分结合所述检测寡核苷酸探针的所述二级靶部分,并且所述二级靶结合部分选自抗生物素蛋白、链霉亲和素、钙调蛋白、阴离子交换树脂、Mono-Q、阳离子交换树脂、抗E标签抗体、抗FLAG标签抗体、抗HA标签抗体、镍或钴螯合物、抗Myc标签抗体、抗NE标签抗体、抗Rho1D4标签抗体、抗S标签抗体、抗Sof标签1抗体、抗Sof标签3抗体、纳米抗体、Streptactin、抗T7标签抗体、FIAsH双砷化合物、ReAsH双砷化合物、抗Ty1标签抗体、抗V5标签抗体、抗VSV标签抗体、抗Xpress标签抗体、pilin-C蛋白、SpyCatcher蛋白、SnoopCatcher蛋白、SnoopTagJr蛋白、SdyCatcher蛋白、谷胱甘肽、GFP抗体、卤代烷烃底物、苄基鸟嘌呤衍生物、苄基胞嘧啶衍生物、HUH特异性DNA序列、直链淀粉琼脂糖、Nus标签抗体、抗硫氧还蛋白标签抗体、蛋白A琼脂糖凝胶、乳糖、琼脂糖,当所述二级靶部分是生物素时,任选地所述二级靶结合部分选自抗生物素蛋白和链霉亲和素。
19.根据权利要求17或18所述的方法,其中所述报道酶选自磷酸酶、任选的碱性磷酸酶、裂解酶、水解酶、合酶、合成酶、氧化还原酶、脱氢酶、氧化酶、转移酶、异构酶、连接酶、蛋白酶诸如胰蛋白酶、朊酶、过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、髓过氧化物酶、氧化酶、单加氧酶、细胞色素、脱羧酶、脂肪酶、半胱天冬酶、淀粉酶、肽酶、转氨酶、激酶、DNA或RNA聚合酶、任选的TAQ、限制性内切酶、klenow片段和DNA连接酶。
20.根据权利要求19所述的方法,其中所述报道酶选自碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、胰蛋白酶、细胞色素C单加氧酶和髓过氧化物酶,任选地,所述报道酶是碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法,其中所述一种或多种可电离产物在ESI-MS/MS或MALDI-TOF下可容易地电离并且产生特征在于高信噪比的产物离子,并且所述底物任选地选自:
a.磷酸化的核苷即任选的AMP或CMP、或磷酸化的核苷酸即任选的ATP或CTP、磷酸化的生物碱、磷酸化的氨基酸、磷酸化的氨基酸聚合物和磷酸化的代谢物,当所述酶是碱性磷酸酶(AP)时;
b.选自以下的化合物:酚、胺、任选的酚胺、芳族化合物、烯烃卤化物、鲁米诺、连苯三酚、2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)和
Figure FDA0004191243780000041
Red,当所述报道酶是辣根过氧化物酶(HRP)时;或者选自
c.阿片制剂、洗涤剂、染料前体、醇和基质。
22.根据权利要求21所述的方法,其中所述报道酶检测探针底物选自吡哆胺-5-磷酸酯(PA5P)、对硝基苯基磷酸酯(PNPP)、
Figure FDA0004191243780000042
Red(AR)、萘酚ASMX磷酸酯、鲁米诺、
Figure FDA0004191243780000043
TMA3、/>
Figure FDA0004191243780000044
TMA6、鞘氨醇、4MUP、L-(+)-2-氨基-6-膦酰基己酸、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)、/>
Figure FDA0004191243780000045
苯基苯ω膦酰基-α-氨基酸、O-磷酸-DL-苏氨酸、单磷酸腺苷(AMP)、AR(3-氨基-9-乙基咔唑)、4-CN(4-氯-1-萘酚)、DAB(3,3'-二氨基苯甲脒)、OPD(邻苯二胺)、TMB(3,/>
Figure FDA0004191243780000048
,5,/>
Figure FDA0004191243780000049
-四甲基联苯胺)、pNPP(对硝基苯基磷酸酯)、NBT(硝基蓝四唑)、INT(对碘硝基四唑)、MUP(4-甲基伞形酮磷酸酯)和FDP荧光素二磷酸酯)、连苯三酚。
23.根据权利要求22所述的方法,其中所述报道酶检测探针底物选自:
a.AR、鲁米诺、
Figure FDA0004191243780000046
TMA3和/>
Figure FDA0004191243780000047
TMA6,当所述报道酶检测探针包含HRP时;或者选自
b.萘酚ASMX磷酸酯和PNPP,当所述报道酶检测探针包含AP时。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法,其中当所述第一结合溶液、所述第二溶液、所述第三结合溶液和/或所述洗涤溶液基本上不含无机盐时,所述第一结合溶液、所述第二溶液、所述第三结合溶液和/或所述洗涤溶液各自独立地是挥发性溶液,所述挥发性溶液包含挥发性缓冲液,所述挥发性缓冲液选自乙醇胺、碳酸氢铵、甲酸铵、甲酸吡啶鎓、三烷基铵/甲酸、乙酸铵、三烷基碳酸氢铵、N-乙基吗啉/乙酸盐、三烷基乙酸铵或它们的组合。
25.根据权利要求24所述的方法,其中所述挥发性缓冲液选自乙醇胺、乙酸铵、三烷基碳酸氢铵或它们的组合。
26.根据权利要求24或25所述的方法,其中所述三烷基铵选自三甲基铵、三乙基铵或它们的组合。
27.根据权利要求24或25所述的方法,其中所述挥发性缓冲液是乙醇胺。
28.根据权利要求24至27中任一项所述的方法,其中当所述第一结合溶液、所述第二溶液、所述第三结合溶液和/或所述洗涤溶液基本上不含无机盐时,所述第一结合溶液、所述第二溶液、所述第三结合溶液和/或所述洗涤溶液各自独立地包含乙醇胺,任选地所述第二结合溶液和所述第三结合溶液各自包含乙醇胺,任选地所述第一结合溶液、所述第二结合溶液和所述第三结合溶液各自包含乙醇胺,任选地所述洗涤溶液包含乙醇胺。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法,其中步骤a)和步骤b)同时进行,并且所述步骤a)的所述第一结合溶液是所述步骤b)的所述第二结合溶液。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法,还包括在孵育所述靶:检测探针复合物与所述报道酶检测探针之前,用所述第二结合溶液洗涤所述固相。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法,还包括在孵育所述靶核酸分子与所述捕获寡核苷酸探针之前,用封闭剂即任选的牛血清白蛋白(BSA)洗涤所述固相。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法,其中所述第一结合溶液、所述第二结合溶液、所述第三结合溶液和所述底物反应溶液各自独立地具有约7至约10、任选地约7至约8、任选地约8.8的pH。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的方法,其中所述底物反应溶液包含非离子型非聚合物型洗涤剂,所述非离子型非聚合物型洗涤剂任选地选自N-辛基葡糖苷、脱氧胆酸盐、rapigest、辛基-β-吡喃葡糖苷、辛基吡喃葡糖苷、chaps、big chap、非离子型酸不稳定表面活性剂、葡糖苷、正辛基-β-D-吡喃葡糖苷、正壬基-β-D-吡喃葡糖苷硫代葡糖苷、正辛基-β-D-硫代吡喃葡糖苷麦芽糖苷、正癸基-β-D-吡喃麦芽糖苷、正十二烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷、正十一烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷、正十三烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷、cymal-5、cymal-6、硫代麦芽糖苷、正十二烷基-β-D-硫代吡喃麦芽糖苷、烷基糖苷、辛基葡萄糖新戊二醇、聚氧乙二醇、triton、NP40、tweenTM、tweenTM 20、Triton X-100、triton x-45、C8E4、C8E5、C10E5、C12E8、C12E9、Brij、Anapoe-58、Brij-58以及它们的组合。
34.根据权利要求23至33中任一项所述的方法,其中当所述底物包含鲁米诺时,所述底物反应溶液还包含4-碘苯基硼酸。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的方法,其中所述固相是反应容器,所述反应容器是任选的小珠、板、毛细管、过滤器或纳米/微/毫孔反应容器,并且其中所述表面选自纸、硝化纤维素、丙烯酸酯、塑料、聚苯乙烯、聚偏二氟乙烯(PVDF)、三聚氰胺、二氧化硅、经聚赖氨酸涂覆的玻璃、经3-氨基丙基-三乙氧基硅烷(APTES)处理的玻璃和经3-氨基丙基-三甲氧基硅烷(APTMS)处理的玻璃。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的方法,其中所述捕获寡核苷酸探针与所述固相的所述附接是通过H-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-氧代琥珀酰亚胺(NOS)、马来酰亚胺、酰肼、戊二醛偶联或PEG交联进行的。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的方法,其中将所述靶:检测探针:酶复合物与所述报道酶检测探针底物孵育在所述底物反应溶液中,以产生所述一种或多种可电离产物达少于72小时、少于24小时、少于12小时、少于60分钟、少于50分钟、少于40分钟、少于30分钟、少于20分钟、少于15分钟、少于10分钟、少于5分钟、少于2分钟或少于1分钟的时间段。
38.根据权利要求12至37中任一项所述的方法,其中所述产物离子通过SIM和/或SRM使用优化的碎裂能量和m/z范围进行测定。
39.根据权利要求21所述的方法,其中所述底物是AMP、ADP或ATP,并且所产生的一种或多种可电离产物包括腺苷,所述腺苷的所述产物离子通过SIM在268m/z处测定;或者所述底物是CMP、CDP或CTP,并且所产生的一种或多种可电离产物包括胞嘧啶,所述胞嘧啶的所述产物离子通过SIM在283m/z处测定;或者所述底物是AR,并且所产生的一种或多种可电离产物中的一种可电离产物包括试卤灵,所述试卤灵的所述产物离子通过SIM在214m/z处测定并且通过SRM使用主要强片段在214m/z-186m/z处测定。
40.根据权利要求22所述的方法,其中所述底物是萘酚ASMX磷酸酯,并且所产生的一种或多种可电离产物中的一种可电离产物包括脱磷酸化的萘酚ASMX,所述脱磷酸化的萘酚ASMX的所述产物离子通过SIM在292m/z处测定并且通过SRM使用所述主要强片段在292m/z-171m/z处测定;或者所述底物是PA5P,并且所产生的一种或多种可电离产物包括PA,所述PA的所述产物离子通过SIM在169m/z处测定。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的方法,其中所述可电离产物在电离溶液中被电离成产物离子。
42.根据权利要求1至41中任一项所述的方法,其中所述第一结合溶液、所述第二结合溶液和所述第三结合溶液中的至少所述第三结合溶液基本上不含无机盐并且包含根据权利要求24至27中任一项所述的挥发性缓冲液。
43.根据权利要求1至41中任一项所述的方法,其中所述方法包括用所述洗涤溶液洗涤所述固相以除去任何未结合的报道酶检测探针,其中所述洗涤溶液基本上不含无机盐并且包含根据权利要求24至27中任一项所述的挥发性缓冲液。
44.根据权利要求1至41中任一项所述的方法,其中在所述任选的步骤d)和所述步骤e)之前交联任何靶:检测探针:酶复合物的所述组分和所述捕获寡核苷酸探针,并且所述交联是通过H-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-氧代琥珀酰亚胺(NOS)、马来酰亚胺、酰肼、戊二醛偶联、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)交联或PEG交联进行的。
45.根据权利要求43所述的方法,其中任何靶:检测探针:酶复合物的所述组分和所述捕获寡核苷酸探针的所述交联是通过戊二醛偶联、DSS交联或PEG交联进行的。
46.一种定量样品中靶核酸分子的量的方法,所述方法包括以下步骤:
a.根据权利要求1至45中任一项所述的方法检测靶核酸分子;以及
b.基于通过质谱检测的所述可电离产物中的一种或多种可电离产物的所述信号的所述强度来定量所述样品中靶核酸分子的所述量。
47.根据权利要求46所述的方法,其中所述定量包括在类似条件下将一种或多种产物的所述信号的所述强度与使用已知量的靶物质产生的信号强度进行比较。
48.根据权利要求46或47所述的方法,其中存在于或推测存在于所述样品中的所述靶核酸分子处于皮摩尔、飞摩尔或阿摩尔范围,或者最多至皮摩尔、飞摩尔或阿摩尔范围。
49.根据权利要求1至48中任一项所述的方法,所述靶核酸分子选自DNA、RNA以及它们的组合和衍生物。
50.根据权利要求46至49中任一项所述的方法,其中所述样品是生物样品、工业产物、环境样品或聚合酶链反应(PCR)反应产物。
51.根据权利要求50所述的方法,其中所述生物样品是血液样品、尿液样品、粪便样品、流出物、组织样品或痰样品。
52.一种检测靶核酸分子的方法,所述方法包括
用经修饰的引物和第二引物对推定包含所述靶核酸分子的测试样品进行核酸扩增,诸如聚合酶链反应(PCR)或杂交链反应(HCR)或滚环反应或其他核酸反应,以获得经扩增的核酸产物,即任选的PCR产物,所述经扩增的核酸产物包含所述经修饰的引物,所述经修饰的引物用二级靶部分或报道酶进行官能化;
分离所述经扩增的核酸产物与任何未反应的经修饰的引物;
当所述经修饰的引物用所述二级靶部分进行官能化时,在形成经扩增的核酸产物:报道酶复合物的条件下,在第一结合溶液中孵育所述经扩增的核酸产物与报道酶检测探针,并用洗涤溶液除去任何未结合的报道酶检测探针,所述报道酶检测探针包含二级靶结合部分和报道酶;
在底物反应溶液中孵育所述经扩增的核酸产物或所述经扩增的核酸产物:报道酶复合物与报道酶底物,以产生一种或多种可电离产物;以及
使用质谱(MS)检测所述一种或多种可电离产物,
其中当所述经修饰的引物是正向引物时,所述第二引物是反向引物,并且其中当所述经修饰的引物是反向引物时,所述第二引物是正向引物。
53.根据权利要求52所述的方法,其中所述第二引物附接到固相,任选地所述第二引物通过接头附接到所述固相。
54.根据权利要求53所述的方法,其中所述第二引物任选地通过与所述固相非共价或共价结合而被直接附接到所述固相。
55.根据权利要求53或54所述的方法,其中所述未反应的经修饰的引物与所述经扩增的核酸产物的所述分离是通过离心、过滤和/或溶剂洗涤进行的。
56.根据权利要求52所述的方法,其中所述方法还包括在孵育所述经扩增的核酸产物与所述报道酶检测探针之前,在将所述经扩增的核酸产物结合到固相上的条件下,在第二结合溶液中孵育所述经扩增的核酸产物与所述固相,所述经扩增的核酸产物包含所述经修饰的引物,所述固相具有附接到其上的捕获寡核苷酸探针,所述捕获寡核苷酸探针包含与所述经扩增的核酸产物互补的序列,任选地,所述固相通过接头附接到所述捕获寡核苷酸探针。
57.根据权利要求56所述的方法,其中所述捕获寡核苷酸探针任选地通过与所述固相非共价或共价结合而被直接附接到所述固相。
58.根据权利要求52至57中任一项所述的方法,其中所述第一结合溶液和/或所述洗涤溶液是挥发性的并且基本上不含NaCl。
59.根据权利要求56至57中任一项所述的方法,其中所述第二结合溶液是挥发性的并且基本上不含NaCl。
60.根据权利要求58或59所述的方法,其中所述第一结合溶液或所述第二结合溶液各自包含挥发性缓冲液。
61.根据权利要求60所述的方法,其中所述挥发性缓冲液选自乙醇胺、碳酸氢铵、甲酸铵、甲酸吡啶鎓、三烷基铵/甲酸、乙酸铵、三烷基碳酸氢铵、N-乙基吗啉/乙酸盐、三烷基乙酸铵以及它们的组合。
62.根据权利要求61所述的方法,其中所述挥发性缓冲液选自乙醇胺、乙酸铵、三烷基碳酸氢铵以及它们的组合。
63.根据权利要求60或61所述的方法,其中所述三烷基铵选自三甲基铵、三乙基铵以及它们的组合。
64.根据权利要求62或63所述的方法,其中所述挥发性缓冲液是乙醇胺。
65.根据权利要求56所述的方法,还包括在将所述经扩增的核酸产物结合到所述固相之前,用封闭剂即任选的牛血清白蛋白(BSA)洗涤所述固相。
66.根据权利要求60所述的方法,其中所述第一结合溶液或所述第二结合溶液各自独立地具有约7至约10、任选地约7至约8、任选地约8.8的pH。
67.根据权利要求52至66中任一项所述的方法,其中任何未结合的报道酶检测探针从所述经扩增的核酸产物:报道酶复合物中的所述去除是通过离心、过滤和/或溶剂洗涤进行的。
68.根据权利要求52至67中任一项所述的方法,还包括在使用MS检测之前分离所述一种或多种可电离产物。
69.根据权利要求68所述的方法,其中所述分离是通过液相色谱、任选的正相色谱或反相色谱,任选的所述色谱是等度的进行的。
70.根据权利要求69所述的方法,其中所述液相色谱是尺寸排阻色谱、凝胶渗透色谱、离子交换色谱、正相色谱、反相色谱、亲和色谱、电泳分离、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)以及它们的组合。
71.根据权利要求70所述的方法,其中所述HPLC是纳米流液相色谱。
72.根据权利要求52至71中任一项所述的方法,其中使用MS检测所述一种或多种可电离产物的所述步骤包括任选地通过电喷雾电离(ESI)、MALDI、化学电离、电子碰撞、激光解吸、电气电离或热电离来电离所述一种或多种可电离产物,以产生具有选定信噪比的一种或多种产物离子,并且使所述一种或多种产物离子进行MS,任选的串联MS(MS/MS)。
73.根据权利要求72所述的方法,其中所述电离是正电离或负电离。
74.根据权利要求73所述的方法,其中所选定的信噪比为至少3、至少4、至少5、至少6或至少10。
75.根据权利要求52至74中任一项所述的方法,其中所述MS选自电喷雾电离串联MS(ESI-MS/MS)、基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)、串联MS(MS/MS)、多轮碎裂MSN、MALDI、电喷雾、纳米喷雾、表面电离、激光解吸和电离、大气电离、真空电离,以及配备有毛细管电泳、超声波或声波或震动、纳米液滴或微滴样品引入系统的MS。
76.根据权利要求52至75中任一项所述的方法,其中使用MS的检测包括通过单离子监测(SIM)记录产物离子强度,并且/或者通过单试剂监测(SRM)记录产物离子母体到片段的转变。
77.根据权利要求52至76中任一项所述的方法,其中所述二级靶部分选自生物素、ALFA标签、Avi标签、C标签、钙调蛋白标签、聚谷氨酸标签、E标签、Flag标签、HA标签、His标签、myc标签、NE标签、Rho1D4标签、S标签、SBP标签、Sof标签1、Sof标签3、Spot标签、Strept标签、T7标签、TC标签、Ty1标签、V5标签、VSV标签、Xpress标签、Isopep标签、Spy标签、Snoop标签、Dog标签、Sdy标签、生物素羧基载体蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶标签、GFP标签、Halo标签、SNAP标签、CLIP标签、HUH标签、麦芽糖结合蛋白标签、Nus标签、硫氧还蛋白标签、Fc标签和CRDSAT标签,任选地所述二级靶部分是生物素。
78.根据权利要求52至77中任一项所述的方法,其中所述二级靶结合部分结合所述二级靶部分,并且所述二级靶结合部分选自抗生物素蛋白、链霉亲和素、钙调蛋白、阴离子交换树脂、Mono-Q、阳离子交换树脂、抗E标签抗体、抗FLAG标签抗体、抗HA标签抗体、镍或钴螯合物、抗Myc标签抗体、抗NE标签抗体、抗Rho1D4标签抗体、抗S标签抗体、抗Sof标签1抗体、抗Sof标签3抗体、纳米抗体、Streptactin、抗T7标签抗体、FIAsH双砷化合物、ReAsH双砷化合物、抗Ty1标签抗体、抗V5标签抗体、抗VSV标签抗体、抗Xpress标签抗体、pilin-C蛋白、SpyCatcher蛋白、SnoopCatcher蛋白、SnoopTagJr蛋白、SdyCatcher蛋白、谷胱甘肽、GFP抗体、卤代烷烃底物、苄基鸟嘌呤衍生物、苄基胞嘧啶衍生物、HUH特异性DNA序列、直链淀粉琼脂糖、Nus标签抗体、抗硫氧还蛋白标签抗体、蛋白A琼脂糖凝胶、乳糖、琼脂糖和琼脂糖凝胶,任选地所述二级靶结合部分选自抗生物素蛋白和链霉亲和素。
79.根据权利要求52至78中任一项所述的方法,其中所述报道酶选自磷酸酶、任选的碱性磷酸酶、裂解酶、水解酶、合酶、合成酶、氧化还原酶、脱氢酶、氧化酶、转移酶、异构酶、连接酶、蛋白酶诸如胰蛋白酶、朊酶、过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、髓过氧化物酶、氧化酶、单加氧酶、细胞色素、脱羧酶、脂肪酶、半胱天冬酶、淀粉酶、肽酶、转氨酶、激酶活性、DNA或RNA聚合酶、任选的TAQ、限制性内切酶、klenow片段和DNA连接酶。
80.根据权利要求79所述的方法,其中所述报道酶选自碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、胰蛋白酶、细胞色素C单加氧酶和髓过氧化物酶。
81.根据权利要求52至80中任一项所述的方法,其中所述一种或多种可电离产物在ESI-MS/MS或MALDI-TOF下可容易地电离并且产生特征在于高信噪比的产物离子,并且所述底物任选地选自:
a.磷酸化的核苷即任选的AMP或CMP、或磷酸化的核苷酸即任选的ATP或CTP、磷酸化的生物碱、磷酸化的氨基氨基酸、磷酸化的氨基酸聚合物和磷酸化的代谢物,当所述酶是碱性磷酸酶(AP)时;
b.选自以下的化合物:酚、胺、任选的酚胺、芳族化合物、烯烃卤化物、鲁米诺、连苯三酚、2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)和
Figure FDA0004191243780000101
Red,当所述报道酶是辣根过氧化物酶(HRP)时;或者选自
c.阿片制剂、洗涤剂、染料前体、醇和基质。
82.根据权利要求79所述的方法,其中所述报道酶底物选自吡哆胺-5-磷酸酯(PA5P)、对硝基苯基磷酸酯(PNPP)、
Figure FDA0004191243780000102
Red(AR)、萘酚ASMX磷酸酯、鲁米诺、/>
Figure FDA0004191243780000103
TMA3、
Figure FDA0004191243780000104
TMA6、鞘氨醇、4MUP、L-(+)-2-氨基-6-膦酰基己酸、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)、/>
Figure FDA0004191243780000105
苯基苯ω膦酰基-α-氨基酸、O-磷酸-DL-苏氨酸、单磷酸腺苷(AMP)、AR(3-氨基-9-乙基咔唑)、4-CN(4-氯-1-萘酚)、DAB(3,3'-二氨基苯甲脒)、OPD(邻苯二胺)、TMB(3,/>
Figure FDA0004191243780000108
,5,/>
Figure FDA0004191243780000109
-四甲基联苯胺)、pNPP(对硝基苯基磷酸酯)、NBT(硝基蓝四唑)、INT(对碘硝基四唑)、MUP(4-甲基伞形酮磷酸酯)和FDP荧光素二磷酸酯)、连苯三酚。
83.根据权利要求82所述的方法,其中所述报道酶底物选自:
a.AR、鲁米诺、
Figure FDA0004191243780000106
TMA3和/>
Figure FDA0004191243780000107
TMA6,当所述报道酶检测探针包含HRP时;或者选自
b.萘酚ASMX磷酸酯和PNPP,当所述报道酶检测探针包含AP时。
84.根据权利要求52至83中任一项所述的方法,其中所述底物反应溶液包含非离子型非聚合物型洗涤剂,所述非离子型非聚合物型洗涤剂任选地选自N-辛基葡糖苷、脱氧胆酸盐、rapigest、辛基-β-吡喃葡糖苷、辛基吡喃葡糖苷、chaps、big chap、非离子型酸不稳定表面活性剂、葡糖苷、正辛基-β-D-吡喃葡糖苷、正壬基-β-D-吡喃葡糖苷硫代葡糖苷、正辛基-β-D-硫代吡喃葡糖苷麦芽糖苷、正癸基-β-D-吡喃麦芽糖苷、正十二烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷、正十一烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷、正十三烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷、cymal-5、cymal-6、硫代麦芽糖苷、正十二烷基-β-D-硫代吡喃麦芽糖苷、烷基糖苷、辛基葡萄糖新戊二醇、聚氧乙二醇、triton、NP40、tweenTM、tweenTM 20、Triton X-100、triton x-45、C8E4、C8E5、C10E5、C12E8、C12E9、Brij、Anapoe-58、Brij-58以及它们的组合。
85.根据权利要求52至84中任一项所述的方法,其中当所述底物包含鲁米诺时,所述底物反应溶液还包含4-碘苯基硼酸。
86.根据权利要求52至85中任一项所述的方法,其中所述固相是反应容器,所述反应容器是任选的小珠、板、毛细管、过滤器或纳米/微/毫孔反应容器,并且其中所述表面选自纸、硝化纤维素、丙烯酸酯、塑料、聚苯乙烯、聚偏二氟乙烯(PVDF)、三聚氰胺、二氧化硅、经聚赖氨酸涂覆的玻璃、经3-氨基丙基-三乙氧基硅烷(APTES)处理的玻璃和经3-氨基丙基-三甲氧基硅烷(APTMS)处理的玻璃。
87.根据权利要求56至86中任一项所述的方法,其中所述捕获寡核苷酸探针与所述固相的所述附接是通过H-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-氧代琥珀酰亚胺(NOS)、马来酰亚胺、酰肼或戊二醛偶联进行的。
88.根据权利要求52至87中任一项所述的方法,其中将所述经扩增的核酸产物或所述经扩增的核酸产物:报道酶复合物与所述报道酶底物孵育在所述底物反应溶液中,以产生所述一种或多种可电离产物达少于72小时、少于24小时、少于12小时、少于60分钟、少于50分钟、少于40分钟、少于30分钟、少于20分钟、少于15分钟、少于10分钟、少于5分钟、少于2分钟或少于1分钟的时间段。
89.根据权利要求76至88中任一项所述的方法,其中所述产物离子通过SIM和/或SRM使用优化的碎裂能量和m/z范围进行测定。
90.根据权利要求81所述的方法,其中所述底物是AMP、ADP或ATP,并且所产生的一种或多种可电离产物包括腺苷,所述腺苷的所述产物离子通过SIM在268m/z处测定;或者所述底物是CMP、CDP或CTP,并且所产生的一种或多种可电离产物包括胞嘧啶,所述胞嘧啶的所述产物离子通过SIM在283m/z处测定;或者所述底物是AR,并且所产生的一种或多种可电离产物中的一种可电离产物包括试卤灵,所述试卤灵的所述产物离子通过SIM在214m/z处测定并且通过SRM使用主要强片段在214m/z-186m/z处测定。
91.根据权利要求81所述的方法,其中所述底物是萘酚ASMX磷酸酯,并且所产生的一种或多种可电离产物中的一种可电离产物包括脱磷酸化的萘酚ASMX,所述脱磷酸化的萘酚ASMX的所述产物离子通过SIM在292m/z处测定并且通过SRM使用所述主要强片段在292m/z-171m/z处测定;或者所述底物是PA5P,并且所产生的一种或多种可电离产物包括PA,所述PA的所述产物离子通过SIM在169m/z处测定。
92.根据权利要求52至91中任一项所述的方法,其中所述可电离产物在电离溶液中被电离成产物离子。
93.根据权利要求52至91中任一项所述的方法,其中所述测试样品是生物样品、工业产物或环境样品。
94.根据权利要求93所述的方法,其中所述生物样品是血液样品、尿液样品、粪便样品、流出物、组织样品或痰样品。
95.根据权利要求52至93中任一项所述的方法,其中所述PCR选自实时PCR(rtPCR)、定量PCR(qPCR)、逆转录PCR、巢式PCR、杂交链反应、滚环PCR和底物再循环反应。
96.一种定量测试样品中靶核酸分子的量的方法,所述方法包括以下步骤:
a.根据权利要求1至51中任一项所述的方法检测所述靶核酸分子;以及
b.基于通过质谱检测的所述可电离产物中的一种或多种可电离产物的所述信号的所述强度来定量所述测试样品中靶核酸分子的所述量。
97.根据权利要求96所述的方法,其中所述定量包括在类似条件下将一种或多种产物的所述信号的所述强度与使用已知量的所述靶核酸分子产生的信号强度进行比较。
98.根据权利要求96或97所述的方法,其中存在于或推测存在于所述样品中的所述靶核酸分子处于皮摩尔、飞摩尔或阿摩尔范围,或者最多至皮摩尔、飞摩尔或阿摩尔范围。
99.根据权利要求1至98中任一项所述的方法,其中检测一种或多种靶寡核苷酸模板。
100.根据权利要求1至99中任一项所述的方法,其中所述靶核酸分子是质粒DNA,或者包含在细菌、病毒、真菌、哺乳动物或植物基因组中的序列。
101.根据权利要求100所述的方法,其中所述细菌基因组选自大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、衣原体、霍乱弧菌、梭状芽胞杆菌、肠球菌、梭杆菌属、厌氧杆菌、革兰氏阴性球菌、革兰氏阳性杆菌、嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、克雷伯氏菌属、乳杆菌属、李斯特菌属、包柔氏螺旋体属、分枝杆菌、支原体、奈瑟氏球菌属、普雷沃氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、螺旋体属、葡萄球菌属、链球菌属和耶尔森氏菌属基因组,任选地所述细菌基因组选自大肠杆菌和金黄色葡萄球菌,并且/或者其中所述真菌基因组选自假丝酵母属基因组。
102.根据权利要求100所述的方法,其中所述病毒基因组选自HIV、SARS-CoV、MERS、SARS-CoV-2、埃博拉病毒、流感病毒、冠状病毒基因组、肠道病毒、肝炎病毒、疱疹病毒、HPV、诺如病毒、副流感病毒、鼻病毒和水痘病毒基因组,任选地所述病毒基因组选自HIV、SARS-CoV、MERS、SARS-CoV-2、埃博拉病毒、流感病毒和冠状病毒基因组。
103.根据权利要求100所述的方法,其中所述哺乳动物基因组是人基因组。
104.根据权利要求100所述的方法,其中所述靶核酸分子具有包含在所述HIV基因组中的序列。
105.根据权利要求100所述的方法,其中所述靶核酸分子具有包含在所述SARS-CoV-2基因组中的序列。
106.一种检测HIV的方法,所述方法包括根据权利要求1至51中任一项所述的方法,其中所述靶核酸分子是HIV核酸分子。
107.根据权利要求106所述的方法,其中所述捕获寡核苷酸探针具有选自SEQ IDNo.14、SEQ ID No 17、SEQ ID No 20和SEQ ID No 23的序列。
108.根据权利要求106或107所述的方法,其中所述检测寡核苷酸探针寡核苷酸具有选自SEQ ID No.16、SEQ ID No 19、SEQ ID No 22和SEQ ID No.25的序列。
109.一种检测SARS-CoV-2的方法,所述方法包括根据权利要求1至51中任一项所述的方法,其中所述靶核酸分子是SARS-CoV-2核酸分子。
110.根据权利要求109所述的方法,其中所述捕获寡核苷酸探针具有选自SEQ ID No.6和SEQ ID No.13的序列。
111.根据权利要求109或110所述的方法,其中所述检测寡核苷酸探针寡核苷酸具有选自SEQ ID No.5和SEQ ID No.12的序列。
112.一种检测HIV的方法,所述方法包括根据权利要求52至98中任一项所述的方法,其中所述靶核酸分子是HIV核酸分子。
113.当权利要求57至98从属于权利要求56时,根据权利要求112所述的方法包括根据权利要求56至98中任一项所述的方法,其中所述捕获寡核苷酸探针具有选自SEQ IDNo.14、SEQ ID No 17、SEQ ID No 20和SEQ ID No23的序列。
114.一种检测SARS-CoV-2的方法,所述方法包括根据权利要求52至98中任一项所述的方法,其中所述靶核酸分子是SARS-CoV-2核酸分子。
115.根据权利要求114所述的方法,其中所述经修饰的引物具有选自SEQ ID No.2、SEQID No.3、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和SEQ ID No.10的序列。
116.根据权利要求114所述的方法,其中所述第二引物具有选自SEQ IDNo.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和SEQ IDNo.10的序列。
117.根据权利要求114所述的方法,其中所述经修饰的引物具有SEQ IDNo.2的序列,并且所述第二引物具有SEQ ID No.3或SEQ ID No 8的序列。
118.根据权利要求114所述的方法,其中所述经修饰的引物具有SEQ IDNo.3的序列,并且所述第二引物具有SEQ ID No.2或SEQ ID No.7的序列。
119.根据权利要求114所述的方法,其中所述经修饰的引物具有SEQ IDNo.7的序列,并且所述第二引物具有SEQ ID No 3或SEQ ID No.8的序列。
120.根据权利要求114所述的方法,其中所述经修饰的引物具有SEQ IDNo.8的序列,并且所述第二引物具有SEQ ID No 2、SEQ ID No.7的序列。
121.根据权利要求114所述的方法,其中所述经修饰的引物具有SEQ IDNo.9的序列,并且所述第二引物具有SEQ ID No.10的序列。
122.根据权利要求114所述的方法,其中所述经修饰的引物具有SEQ IDNo.10的序列,并且所述第二引物具有SEQ ID No.9的序列。
123.当权利要求57至98从属于权利要求56时,根据权利要求111141所述的方法包括根据权利要求56至98中任一项所述的方法,其中所述捕获寡核苷酸探针具有选自SEQ IDNo.6和SEQ ID No.13的序列。
124.一种试剂盒,所述试剂盒包括:
i.捕获寡核苷酸探针,所述捕获寡核苷酸探针任选地通过接头与固相任选地结合;
ii.挥发性结合溶液,所述挥发性结合溶液包含挥发性缓冲液并且基本上不含NaCl或交联剂;
iii.检测寡核苷酸探针,所述检测寡核苷酸探针包含寡核苷酸和二级靶部分;
iv.报道酶检测探针,所述报道酶检测探针包含报道酶和能够结合所述二级靶部分的二级靶结合部分;和/或
v.以下中的一者或多者:根据权利要求1至51中任一项所述的底物、固相、标准品,即任选的产物离子标准品,所述标准品任选地用于制备标准曲线或调整校准物;第二结合溶液、第三结合溶液、底物反应溶液、电离溶液、淬灭溶液,即任选的第二结合溶液、检测探针溶液、底物反应溶液、淬灭溶液、电离溶液。
125.根据权利要求124所述的试剂盒,其中所述第二结合缓冲液和所述底物反应缓冲液各自是挥发性的并且各自独立地包含挥发性缓冲液。
126.根据权利要求125所述的试剂盒,其中所述挥发性缓冲液是乙醇胺、碳酸氢铵、甲酸铵、甲酸吡啶鎓、三烷基铵/甲酸、乙酸铵、三烷基碳酸氢铵、N-乙基吗啉/乙酸盐、三烷基乙酸铵以及它们的组合。
127.根据权利要求125或126所述的试剂盒,其中所述挥发性缓冲液选自乙醇胺、乙酸铵、三烷基碳酸氢铵以及它们的组合。
128.根据权利要求126或127所述的试剂盒,其中所述三烷基铵选自三甲基铵、三乙基铵以及它们的组合。
129.根据权利要求125至127中任一项所述的试剂盒,其中所述挥发性缓冲液是乙醇胺。
130.根据权利要求124至129中任一项所述的试剂盒,其中所述捕获寡核苷酸探针和所述检测寡核苷酸探针两者结合靶核酸分子。
131.根据权利要求130所述的试剂盒,其中所述靶核酸分子具有包含在细菌、病毒、真菌、哺乳动物或植物基因组中的序列。
132.根据权利要求124至131中任一项所述的试剂盒,其中所述报道酶检测探针的所述酶选自碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、胰蛋白酶、细胞色素C单加氧酶和髓过氧化物酶。
133.根据权利要求124至132中任一项所述的试剂盒,其中所述底物选自单磷酸腺苷(AMP)、CMP、ATP、CMP、P5AP、对硝基苯基磷酸酯(PNPP)、
Figure FDA0004191243780000141
Red(AR)、萘酚ASMX磷酸酯、鲁米诺、/>
Figure FDA0004191243780000142
TMA3、/>
Figure FDA0004191243780000143
TMA6、鞘氨醇、4MUP、L-(+)-2-氨基-6-膦酰基己酸、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)、/>
Figure FDA0004191243780000144
苯基苯ω膦酰基-α-氨基酸、O-磷酸-DL-苏氨酸、AR(3-氨基-9-乙基咔唑)、4-CN(4-氯-1-萘酚)、DAB(3,3'-二氨基苯甲脒)、OPD(邻苯二胺)、TMB(3,/>
Figure FDA0004191243780000145
,5,/>
Figure FDA0004191243780000146
-四甲基联苯胺)、pNPP(对硝基苯基磷酸酯)、NBT(硝基蓝四唑)、INT(对碘硝基四唑)、MUP(4-甲基伞形酮磷酸酯)、FDP(荧光素二磷酸酯)和连苯三酚。
134.根据权利要求124至133中任一项所述的试剂盒,其中所述电离溶液包含任选地选自甲酸、乙酸、三氟乙酸的酸或碱,氢氧化铵、甲胺、乙胺或丙胺。
135.根据权利要求124至134中任一项所述的试剂盒,其中所述淬灭溶液任选地包含用于正电离的50%乙腈、0.1%乙酸或0.1%甲酸或0.1%三氟乙酸,或者用于负电离的0.1%氢氧化铵。
136.根据权利要求124至135中任一项所述的试剂盒,其中所述二级靶部分选自生物素、ALFA标签、Avi标签、C标签、钙调蛋白标签、聚谷氨酸标签、E标签、Flag标签、HA标签、His标签、myc标签、NE标签、Rho1D4标签、S标签、SBP标签、Sof标签1、Sof标签3、Spot标签、Strept标签、T7标签、TC标签、Ty1标签、V5标签、VSV标签、Xpress标签、Isopep标签、Spy标签、Snoop标签、Dog标签、Sdy标签、生物素羧基载体蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶标签、GFP标签、Halo标签、SNAP标签、CLIP标签、HUH标签、麦芽糖结合蛋白标签、Nus标签、硫氧还蛋白标签、Fc标签和CRDSAT标签,任选地所述二级靶部分是生物素。
137.根据权利要求124至136中任一项所述的方法,其中所述二级靶结合选自以下的部分:抗生物素蛋白、链霉亲和素、钙调蛋白、阴离子交换树脂、Mono-Q、阳离子交换树脂、抗E标签抗体、抗FLAG标签抗体、抗HA标签抗体、镍或钴螯合物、抗Myc标签抗体、抗NE标签抗体、抗Rho1D4标签抗体、抗S标签抗体、抗Sof标签1抗体、抗Sof标签3抗体、纳米抗体、Streptactin、抗T7标签抗体、FIAsH双砷化合物、ReAsH双砷化合物、抗Ty1标签抗体、抗V5标签抗体、抗VSV标签抗体、抗Xpress标签抗体、pilin-C蛋白、SpyCatcher蛋白、SnoopCatcher蛋白、SnoopTagJr蛋白、SdyCatcher蛋白、谷胱甘肽、GFP抗体、卤代烷烃底物、苄基鸟嘌呤衍生物、苄基胞嘧啶衍生物、HUH特异性DNA序列、直链淀粉琼脂糖、Nus标签抗体、抗硫氧还蛋白标签抗体、蛋白A琼脂糖凝胶、乳糖、琼脂糖和琼脂糖凝胶,任选地所述二级靶结合部分选自抗生物素蛋白和链霉亲和素。
138.根据权利要求136或137所述的试剂盒,其中所述检测寡核苷酸探针是生物素酰化的寡核苷酸探针,所述生物素酰化的寡核苷酸探针包含与所述靶核酸分子的一部分互补的序列。
139.根据权利要求137或138所述的试剂盒,其中所述报道酶检测探针是碱性磷酸酶链霉亲和素(APSA)酶。
140.根据权利要求134至139中任一项所述的试剂盒,其中所述捕获寡核苷酸探针包含选自SEQ ID No.6、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No17、SEQ ID No 20、SEQ ID No23、SEQ ID No 26、SEQ ID No 29、SEQ ID No 32和SEQ ID No 35的序列。
141.根据权利要求124至139中任一项所述的试剂盒,其中所述检测寡核苷酸探针的所述寡核苷酸包含选自SEQ ID No.5、SEQ ID No.12、SEQ ID No.16、SEQ ID No 19、SEQ IDNo 22、SEQ ID No 25、SEQ ID No 28、SEQ ID No 31、SEQ ID No 34和SEQ ID No 37的序列。
142.根据权利要求124至139中任一项所述的试剂盒,其中所述捕获寡核苷酸探针包含SEQ ID No 14的序列,并且所述检测寡核苷酸探针的所述寡核苷酸具有SEQ ID No.16的序列。
143.根据权利要求124至139中任一项所述的试剂盒,其中所述捕获寡核苷酸探针包含SEQ ID No.6的序列,并且所述检测寡核苷酸探针的所述寡核苷酸具有SEQ ID No.5的序列。
144.根据权利要求124至139中任一项所述的试剂盒,其中所述捕获寡核苷酸探针包含SEQ ID No.13的序列,并且所述检测寡核苷酸探针的所述寡核苷酸具有SEQ ID No.12的序列。
145.根据权利要求124至139中任一项所述的试剂盒,其中所述捕获寡核苷酸探针包含SEQ ID No 17的序列,并且所述检测寡核苷酸探针的所述寡核苷酸具有SEQ ID No.19的序列。
146.根据权利要求124至139中任一项所述的试剂盒,其中所述捕获寡核苷酸探针包含SEQ ID No 20的序列,并且所述检测寡核苷酸探针的所述寡核苷酸具有SEQ ID No.22的序列。
147.根据权利要求124至139中任一项所述的试剂盒,其中所述捕获寡核苷酸探针包含SEQ ID No 23的序列,并且所述检测寡核苷酸探针的所述寡核苷酸具有SEQ ID No.25的序列。
148.根据权利要求124至139中任一项所述的试剂盒,其中所述捕获寡核苷酸探针包含SEQ ID No 26的序列,并且所述检测寡核苷酸探针的所述寡核苷酸具有SEQ ID No.28的序列。
149.根据权利要求124至139中任一项所述的试剂盒,其中所述捕获寡核苷酸探针包含SEQ ID No 29的序列,并且所述检测寡核苷酸探针的所述寡核苷酸具有SEQ ID No.31的序列。
150.根据权利要求124至139中任一项所述的试剂盒,其中所述捕获寡核苷酸探针包含SEQ ID No 32的序列,并且所述检测寡核苷酸探针的所述寡核苷酸具有SEQ ID No.34的序列。
151.根据权利要求124至139中任一项所述的试剂盒,其中所述捕获寡核苷酸探针包含SEQ ID No 35的序列,并且所述检测寡核苷酸探针的所述寡核苷酸具有SEQ ID No.37的序列。
152.一种试剂盒,所述试剂盒包括:
i.经修饰的引物,所述经修饰的引物用二级靶部分或报道酶进行官能化;
ii.第二引物;
iii.报道酶检测探针,当所述经修饰的引物用所述二级靶部分进行官能化时,所述报道酶检测探针包含报道酶和能够结合所述二级靶部分的二级靶结合部分;和
iv.以下中的一者或多者:根据权利要求1至95中任一项所述的底物、固相、标准品,即任选的产物离子标准品,所述标准品任选地用于制备标准曲线或调整校准物;结合溶液、第二结合溶液、底物反应溶液、电离溶液、淬灭溶液,即任选的结合溶液、第二结合溶液、检测探针溶液、洗涤溶液、底物反应溶液、淬灭溶液、电离溶液,
其中当所述经修饰的引物是正向引物时,所述第二引物是反向引物,并且当所述经修饰的引物是反向引物时,所述第二引物是正向引物。
153.根据权利要求152所述的试剂盒,其中将所述第二引物附接到所述固相。
154.根据权利要求152所述的试剂盒,其中所述固相任选地通过接头附接到捕获寡核苷酸探针。
155.根据权利要求152至154中任一项所述的试剂盒,其中所述结合溶液和所述第二结合溶液各自独立地是挥发性的并且基本上不含NaCl。
156.根据权利要求155所述的试剂盒,其中所述结合溶液、所述第二结合溶液和所述洗涤溶液各自独立地包含挥发性缓冲液。
157.根据权利要求156所述的试剂盒,其中所述挥发性缓冲液是乙醇胺、碳酸氢铵、甲酸铵、甲酸吡啶鎓、三烷基铵/甲酸、乙酸铵、三烷基碳酸氢铵、N-乙基吗啉/乙酸盐、三烷基乙酸铵以及它们的组合。
158.根据权利要求156或157所述的试剂盒,其中所述挥发性缓冲液选自乙醇胺、乙酸铵、三烷基碳酸氢铵以及它们的组合。
159.根据权利要求157或158所述的试剂盒,其中所述三烷基铵选自三甲基铵、三乙基铵以及它们的组合。
160.根据权利要求155至159中任一项所述的试剂盒,其中所述挥发性缓冲液是乙醇胺。
161.根据权利要求152至160中任一项所述的试剂盒,其中所述报道酶检测探针的所述酶选自碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、胰蛋白酶、细胞色素C单加氧酶和髓过氧化物酶。
162.根据权利要求152至161中任一项所述的试剂盒,其中所述底物选自单磷酸腺苷(AMP)、CMP、ATP、CMP、P5AP、对硝基苯基磷酸酯(PNPP)、
Figure FDA0004191243780000171
Red(AR)、萘酚ASMX磷酸酯、鲁米诺、/>
Figure FDA0004191243780000172
TMA3、/>
Figure FDA0004191243780000173
TMA6、鞘氨醇、4MUP、L-(+)-2-氨基-6-膦酰基己酸、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)、/>
Figure FDA0004191243780000174
苯基苯ω膦酰基-α-氨基酸、O-磷酸-DL-苏氨酸、AR(3-氨基-9-乙基咔唑)、4-CN(4-氯-1-萘酚)、DAB(3,3'-二氨基苯甲脒)、OPD(邻苯二胺)、TMB(3,/>
Figure FDA0004191243780000175
,5,/>
Figure FDA0004191243780000176
-四甲基联苯胺)、pNPP(对硝基苯基磷酸酯)、NBT(硝基蓝四唑)、INT(对碘硝基四唑)、MUP(4-甲基伞形酮磷酸酯)、FDP(荧光素二磷酸酯)和连苯三酚。
163.根据权利要求152至162中任一项所述的试剂盒,其中所述电离溶液包含任选地选自甲酸、乙酸、三氟乙酸的酸或碱,氢氧化铵、甲胺、乙胺或丙胺。
164.根据权利要求152至163中任一项所述的试剂盒,其中所述淬灭溶液任选地包含用于正电离的50%乙腈、0.1%乙酸或0.1%甲酸或0.1%三氟乙酸,或者用于负电离的0.1%氢氧化铵。
165.根据权利要求152至164中任一项所述的试剂盒,其中所述二级靶部分选自生物素、ALFA标签、Avi标签、C标签、钙调蛋白标签、聚谷氨酸标签、E标签、Flag标签、HA标签、His标签、myc标签、NE标签、Rho1D4标签、S标签、SBP标签、Sof标签1、Sof标签3、Spot标签、Strept标签、T7标签、TC标签、Ty1标签、V5标签、VSV标签、Xpress标签、Isopep标签、Spy标签、Snoop标签、Dog标签、Sdy标签、生物素羧基载体蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶标签、GFP标签、Halo标签、SNAP标签、CLIP标签、HUH标签、麦芽糖结合蛋白标签、Nus标签、硫氧还蛋白标签、Fc标签和CRDSAT标签,任选地所述二级靶部分是生物素。
166.根据权利要求152至165中任一项所述的方法,其中所述二级靶结合选自以下的部分:抗生物素蛋白、链霉亲和素、钙调蛋白、阴离子交换树脂、Mono-Q、阳离子交换树脂、抗E标签抗体、抗FLAG标签抗体、抗HA标签抗体、镍或钴螯合物、抗Myc标签抗体、抗NE标签抗体、抗Rho1D4标签抗体、抗S标签抗体、抗Sof标签1抗体、抗Sof标签3抗体、纳米抗体、Streptactin、抗T7标签抗体、FIAsH双砷化合物、ReAsH双砷化合物、抗Ty1标签抗体、抗V5标签抗体、抗VSV标签抗体、抗Xpress标签抗体、pilin-C蛋白、SpyCatcher蛋白、SnoopCatcher蛋白、SnoopTagJr蛋白、SdyCatcher蛋白、谷胱甘肽、GFP抗体、卤代烷烃底物、苄基鸟嘌呤衍生物、苄基胞嘧啶衍生物、HUH特异性DNA序列、直链淀粉琼脂糖、Nus标签抗体、抗硫氧还蛋白标签抗体、蛋白A琼脂糖凝胶、乳糖、琼脂糖和琼脂糖凝胶,任选地所述二级靶结合部分选自抗生物素蛋白和链霉亲和素。
167.根据权利要求165或166所述的试剂盒,其中所述报道酶检测探针是碱性磷酸酶链霉亲和素(APSA)酶。
168.根据权利要求152至167中任一项所述的试剂盒,其中所述经修饰的引物和所述第二引物是靶核酸分子的引物,所述靶核酸分子具有包含在细菌、病毒、真菌、哺乳动物或植物基因组中的序列。
169.根据权利要求152至168中任一项所述的试剂盒,其中所述经修饰的引物具有选自SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和SEQ ID No.10的序列。
170.根据权利要求152至168中任一项所述的试剂盒,其中所述第二引物具有选自SEQID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和SEQ ID No.10的序列。
171.根据权利要求152至168中任一项所述的试剂盒,其中所述经修饰的引物具有SEQID No.2的序列,并且所述第二引物具有SEQ ID No.3或SEQ ID No 8的序列。
172.根据权利要求152至168中任一项所述的试剂盒,其中所述经修饰的引物具有SEQID No.3的序列,并且所述第二引物具有SEQ ID No.2或SEQ ID 7的序列。
173.根据权利要求171或172所述的试剂盒,其中所述捕获寡核苷酸具有SEQ ID No.6的序列。
174.根据权利要求152至168中任一项所述的试剂盒,其中所述经修饰的引物具有SEQID No.7的序列,并且所述第二引物具有SEQ ID No.8的序列。
175.根据权利要求152至168中任一项所述的试剂盒,其中所述经修饰的引物具有SEQID No.8的序列,并且所述第二引物具有SEQ ID No.7的序列。
176.根据权利要求152至168中任一项所述的试剂盒,其中所述经修饰的引物具有SEQID No.9的序列,并且所述第二引物具有SEQ ID No.10的序列。
177.根据权利要求152至168中任一项所述的试剂盒,其中所述经修饰的引物具有SEQID No.10的序列,并且所述第二引物具有SEQ ID No.9的序列。
178.根据权利要求176或177所述的试剂盒,其中所述捕获寡核苷酸具有SEQ ID No.13的序列。
179.一种序列选自SEQ ID No.2至46的核酸。
180.根据权利要求179所述的核酸,其中所述核酸附接到固体载体,根据权利要求86或87所述的任选的固体载体。
181.根据权利要求179所述的核酸,其中所述核酸附接到根据权利要求77所述的第二靶部分。
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