CN116377000A - 一种兼具降血糖和降血脂活性的江蓠低聚糖及其制备方法和应用 - Google Patents

一种兼具降血糖和降血脂活性的江蓠低聚糖及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于江蓠深加工的技术领域,公开了一种兼具降血糖和降血脂活性的江蓠低聚糖及其制备方法和应用。其中,一种江蓠低聚糖的制备方法,使用鲍鱼内脏水解酶对江蓠多糖进行降解制备得到江蓠低聚糖。本发明通过鲍鱼水解酶对江蓠多糖进行降解,所得到的产物江蓠低聚糖具有优异的生物活性,对于α‑葡萄糖苷酶和胰脂肪酶具有良好的抑制效果,同时也可以通过调节T2DM小鼠的糖脂代谢、肝损伤、血脂紊乱及相关信号通路,进而实现降糖效果和降脂效果。

Description

一种兼具降血糖和降血脂活性的江蓠低聚糖及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于江蓠深加工的技术领域,尤其涉及一种兼具降血糖和降血脂活性的江蓠低聚糖及其制备方法和应用。
背景技术
江蓠为红藻门、真红藻纲、杉藻目、江蓠科、江蓠属的红藻类海洋植物,广泛分布于热带和亚热带海域。江蓠的种类多达10余种,具体的如龙须菜、真江蓠、脆江蓠和扁江蓠等。江蓠中富含多种活性成分如多糖、蛋白、膳食纤维、维生素和微量元素等,且脂肪含量低,常作为一种食物藻类。
近些年对江蓠的研究热度高,研究的主要方向集中于加工方式和生物活性方面,目前已知江蓠具有抗氧化活性、降血糖活性、降血脂活性、免疫活性和抗肿瘤活性等生物活性。江蓠多糖的提取加工方式与生物活性方面关联较密切,不同加工方式制备得到的江蓠多糖在活性方面具有较大差异,如采用热水提取的龙须菜多糖可以有效消除DPPH·,展现出较好的抗氧化活性;采用酸法制备的酸性硫酸多糖能够有效抑制肿瘤细胞的生长,促进脾细胞的繁殖及巨噬细胞吞噬作用,表现出良好的抑制肿瘤及免疫调节活性;采用Vc-H2O2降解高分子量的龙须菜多糖后,中分子量的降解产物展现出更好的降血糖和抗氧化功效。
但是,江蓠最常用的加工方式如热水浸提法制备得到的提取物具有得率低、分子量大、粘性大、进入机体细胞能力低以及生物活性低等缺点。
目前,通过对江蓠多糖进行降解以提高其的生物活性,江蓠多糖的降解方法主要有物理降解法、化学降解法和生物降解法等方法。其中,生物降解法中的酶法是利用酶切断江蓠多糖中的糖苷键而实现对江蓠多糖的降解,酶法与化学和物理降解法相比,具有特异性强、无化学试剂引入、反应温、无污染以及生产可控的优点。其中比较典型的有,琼胶经过α-琼胶酶的降解后可获得琼胶寡糖,展现出更好的抗氧化活性,但因琼胶酶分离纯化较困难、市售纯酶制剂价格高昂等缺点,目前的研究只停留在实验室阶段,不适用于工业化大量制备活性多糖。复合酶通过各种酶类之间的比例调和可以达到更大作用,制备具有多种活性的提取物,因此应寻求价格更加低廉的复合酶制剂。
鲍鱼以藻类为食,具有丰富的营养价值。在加工的过程中,鲍鱼内脏是其主要的副产物,约占总重的30%。经研究发现鲍鱼内脏中含有丰富的水解消化酶类,例如:葡聚糖酶、甘露聚糖酶、褐藻胶裂解酶、琼胶酶、卡拉胶酶、淀粉酶等,可有效催化海藻中黏性多糖降解,降低粘度,发挥其最大生物活性,极大地提高海藻的利用率,可作为天然的酶制剂来源。
发明内容
由于传统的加工方式对江蓠进行提取江蓠多糖的得率低,且所提取得到的江蓠多糖具有分子量大、粘性低、进入机体细胞的能力低以及生物活性差等缺点;因此会通过物理降解法、化学降解法以及生物降解法等方法对江蓠多糖进行进一步的加工处理。但是,现有的物理降解法对于江蓠多糖的降解效果不佳,物理降解法所得产物的生物活性并没有明显的变化;在化学降解法中需要往江蓠多糖中额外加入降解物质,制备得到的产物中会残留有降解物质。而生物降解法最常使用的酶法中,利用酶切断糖苷键实现对江蓠多糖的降解,与前面所述的物理降解法和化学降解法相比,酶法具有特异性强、无化学试剂引入、反应温和、无污染以及生产可控等优点。但是,目前的酶法中使用琼胶酶等纯酶试剂对江蓠多糖进行降解,但是市售的纯酶试剂价格昂贵、降解条件要求较高,不适合于工业化的生产,且采用多种酶复配得到的复合酶进行江蓠多糖降解的效果也不理想。
本发明的发明人经过广泛而深入的研究之后发现使用鲍鱼内脏水解酶对江蓠多糖进行降解,可有效降解江蓠多糖中的粘性多糖,同时将江蓠多糖中大分子多糖水解成小分子低聚糖;且相较于其他贝类的内脏水解酶,通过鲍鱼内脏水解酶降解江蓠多糖制备得到的江蓠低聚糖在降血糖、降血脂等方面具有更加优异的生物活性。
本发明的发明人通过鲍鱼内脏水解酶降解江蓠多糖制备得到江蓠低聚糖后,还构建2型糖尿病(T2DM)小鼠模型,检测灌胃不同剂量江蓠低聚糖后T2DM小鼠血清相关指标、肝脏相关指标等,来探明江蓠低聚糖所具有的的生物活性。
本发明的发明人观察发现,中、高剂量的江蓠低聚糖可有效提高T2DM小鼠的体重和肝糖原水平,降低小鼠空腹血糖水平,改善OGTT能力,提高血清胰岛素的利用和降低胰岛素抵抗;其次,Western blotting结果表明,江蓠低聚糖可通过上调肝脏组织中的p-PI3K、p-AKT的磷酸化,激活PI3K/AKT信号通路,从而增加了FOXO1(Ser256)位点的磷酸化,并抑制PEPCK和G6pase的表达来改善肝脏糖异生的情况,同时增加GSK3β(Ser9)位点磷酸化,减少GS(Ser641)位点磷酸化来增加肝糖原合成,来改善T2DM小鼠肝脏代谢紊乱;再者,江蓠低聚糖通过激活LKB1/AMPK信号通路抑制HFD/STZ诱导的脂质积累,同时增加脂肪酸氧化,抑制肝脏中甘油三酯合成、脂肪生成、胆固醇合成和糖异生,以实现降低血脂的效果。
为了制备得到一种具有高生物活性的江蓠低聚糖,及提高江蓠低聚糖的提取率和提取效率,本发明提供了一种兼具降血糖和降血脂活性的江蓠低聚糖及其制备方法和应用。
本发明的目的之一是提供一种江蓠低聚糖的制备方法。
本发明的目的之二是提供一种江蓠低聚糖。
本发明的目的之三是提供江蓠低聚糖在制备具备降血糖、降血压功能的保健品、降血糖药和/或降压药中的应用。
本发明提供的江蓠低聚糖的制备方法中,使用鲍鱼内脏水解酶对江蓠多糖进行降解制备得到所述江蓠低聚糖。
在一些优选的实施方式中,使用所述鲍鱼内脏水解酶对江蓠多糖溶液进行降解,所述江蓠多糖溶液的浓度为10~20mg/mL。
在一些优选的实施方式中,所述降解中鲍鱼内脏水解酶的添加量为10~30U/mL。
在一些优选的实施方式中,所述降解的pH值为3.0~6.5,温度为35~60℃,降解时间为30~120min。
在一些优选的实施方式中,所述鲍鱼内脏水解酶通过以下步骤制备得到:取鲍鱼内脏与水混合之后并进行组织捣碎、离心、过滤,收集得到滤液;往所述滤液中加入活性炭混合均匀,离心得到上清液;对所述上清液进行超滤浓缩收集得到外液;对所述外液进行冷冻干燥得到所述鲍鱼内脏水解酶。
在一些优选的实施方式中,所述鲍鱼内脏的离体时间不超过3个月,且所述鲍鱼内脏离体后置于-20~-15℃下保存。
在一些优选的实施方式中,所述江蓠多糖通过高温高压提取法、热水提取法、冻融提取法、纤维素酶提取法或柠檬酸提取法制备得到。
在一些优选的实施方式中,当采用所述高温高压提取法制备江蓠多糖时,具体制备步骤为:将江蓠藻粉碎后并加入水配制成悬浮液,所述悬浮液于120~125℃、0.08~0.12MPa下处理30~60min,后经离心、去蛋白、蒸发浓缩、沉淀以及冷冻干燥处理,制备得到所述江蓠多糖。
在一些优选的实施方式中,所述去蛋白的方式为使用三氯乙酸沉淀除去江蓠多糖中的蛋白质。
本发明提供的一种江蓠低聚糖,通过上述的制备方法制备得到的。
本发明提供了江蓠低聚糖在制备具备降血糖、降血脂功能的营养保健、减肥药、降血糖药和/或降压药中的应用。
有益效果:
(1)本发明提供的制备方法中的鲍鱼内脏水解酶包含了葡聚糖酶、甘露聚糖酶、褐藻胶裂酶、琼胶酶、卡拉胶酶以及淀粉酶等多种酶,可实现对江蓠多糖的有效降解,鲍鱼内脏水解酶催化江蓠多糖中粘性多糖的降解,同时也将江蓠多糖水解成分子量更小的江蓠低聚糖,该江蓠低聚糖相较于现有的江蓠多糖而言,具有粘度低、进入机体细胞能力强以及进生物活性高等优点;
(2)采用高温高压处理江蓠相较于其他的处理技术而言,可在缩短提取时间的同时也显著提高了江蓠多糖的提取率,并且对通过高温高压处理制备得到的江蓠多糖进行降解所得到的江蓠低聚糖也体现出更好的生物活性;
(3)本发明提供的通过鲍鱼内脏水解酶降解江蓠多糖制备得到的江蓠低聚糖具有通过调节TG、TC、HDL-C以及LDL-C水平和肝脏脂肪含量以改善血脂代谢紊乱情况的作用,同时也具有通过上调肝脏组织中p-PI3K、p-AKT以及GSK3β的磷酸化的效果来改善肝脏代谢紊乱情况的作用,并且还具有通过提高肝脏中p-LKB1、p-AMPKα和p-ACC的表达以抑制脂质积累的作用,在降低血糖、血脂以及改善肝脏代谢情况等方面具有良好的生物活性。
附图说明
图1为本发明制备例1~5提供的江蓠多糖制备方法中江蓠多糖得率柱状图;
图2为本发明中鲍鱼内脏水解酶添加量对于还原糖江蓠低聚糖的生成量的折线图;
图3为本发明中降解溶液pH值对于还原糖江蓠低聚糖的生成量的折线图;
图4为本发明提供实施例16中江蓠低聚糖对于α-葡萄糖苷酶抑制效果的实验结果图;
图5为本发明提供实施例16中江蓠低聚糖对于胰脂肪酶抑制效果的实验结果图;
图6(a)为本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠空腹血糖影响的实验结果图;
图6(b)为本发明江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠摄食量影响的实验结果图;
图6(c)为本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠饮水量影响的实验结果图;
图7(a)为本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠耐糖量影响实验的结果图之一;
图7(b)为本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠耐糖量影响实验的结果图之二;
图7(c)为本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠耐糖量影响实验的结果图之三;
图7(d)为本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠耐糖量影响实验的结果图之四;
图7(e)为本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠耐糖量影响实验的结果图之五;
图7(f)为本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠耐糖量影响实验的结果图之六;
图7(g)为本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠耐糖量影响实验的结果图之七;
图7(h)为本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠耐糖量影响实验的结果图之八;
图8(a)为本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠糖化血清蛋白影响实验的结果图;
图8(b)为本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠糖化血红蛋白影响实验的结果图;
图8(c)为本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠胰岛素影响实验的结果图;
图8(d)为本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠胰高血糖素影响实验的结果图;
图8(e)为本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠胰高血糖素样肽-1影响实验的结果图;
图8(f)为本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠血清游离脂肪酸影响实验的结果图;
图9(a)为本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠谷草转氨酶影响实验的结果图;
图9(b)为本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠谷丙转氨酶影响实验的结果图;
图9(c)为本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠总蛋白影响实验的结果图;
图9(d)为本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠白蛋白影响实验的结果图;
图9(e)为本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠球蛋白影响实验的结果图;
图9(f)为本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠总胆固醇影响实验的结果图;
图9(g)为本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠甘油三酯影响实验的结果图;
图9(h)为本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠高密度脂蛋白影响实验的结果图;
图9(i)为本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠低密度脂蛋白影响实验的结果图;
图9(j)为本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠肝糖原影响实验的结果图;
图10是本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠小鼠肝脏病理学的影响(HE,200x);
图11是本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠肝脏脂肪积累的影响(油红O,200x);
图12是本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠肝脏AMPKα、p-AMPKα、LKB1、p-LKB1表达影响的实验结果图;
图13是本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠肝脏中p-ACC,ACC,FAS,SERBP-1表达影响的实验结果图;
图14(a)是本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠SERBP-1表达影响实验的结果图;
图14(b)是本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠FAS表达影响实验的结果图;
图15是本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠肝脏细胞表达p-IRS1、IRS1、p-AKT、AKT、p-PI3K以及PI3K的影响实验的结果图;
图16是本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠肝脏细胞表达p-GSK3β、GSK3β、p-GS以及GS的影响实验的结果图;
图17是本发明实施例17中江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠肝脏细胞表达p-Foxo1、Foxo1、G6pase以及PEPCK的影响实验的结果图。
具体实施方式
本申请提供了一种江蓠低聚糖的制备方法,使用鲍鱼内脏水解酶对江蓠多糖进行降解制备得到江蓠低聚糖。发明人经过创造性的努力,从数量庞杂的以藻类为食的动物中选择鲍鱼,从其的内脏中提取水解酶,鲍鱼内脏含有葡聚糖、甘露聚糖酶、褐藻胶裂解酶、琼胶酶、卡拉胶酶以及淀粉酶等多种水解酶,可有效催化降解江蓠中的黏性多糖,使用鲍鱼内脏水解酶对江蓠多糖进行水解能够制备得到具有更强机体细胞进入能力、更优异生物活性的江蓠低聚糖。本发明中,鲍鱼内脏水解酶的提取制备具体为:将鲍鱼内脏清洗干净后,与水混合,置于组织捣碎机中,进行组织捣碎,经离心、过滤后收集得到滤液,往滤液中加入活性炭并混合均匀,再次离心得到上清液,使用截留分子量为100kDa的超滤膜对上清液进行超滤浓缩,收集透过超滤膜的外液,并对外液进行冷冻干燥,得到鲍鱼内脏水解酶。
在一些具体的实施方式中,鲍鱼内脏可以是但不限于皱纹盘鲍内脏、杂色鲍内脏、耳鲍内脏、羊鲍内脏和半纹鲍内脏中的一种或多种。
在一些优选的实施方式中,鲍鱼内脏的离体时间在3个月内,且鲍鱼内脏置于-20~-15℃的低温下进行保存;更加优选地,当鲍鱼内脏从鲍鱼中取下时,立即对鲍鱼进行处理提取鲍鱼内脏水解酶,使得制备得到的鲍鱼内脏水解酶不会因为鲍鱼内脏离体时间过长出现活性降低甚至失活的情况,对于江蓠多糖具有优异的催化降解作用。
本发明中,江蓠多糖的制备方法可以但不限于高温高压提取法、热水提取法、冻融法、纤维素酶提取法或柠檬酸提取法等多种方法。
在一些具体的实施方式中,高温高压提取法具体为:将江蓠藻粉碎后并加入水配制成悬浮液,悬浮液于120~125℃、0.08~0.12MPa下处理30~60min,后经离心取上清、去蛋白、蒸发浓缩、沉淀去上清以及冷冻干燥处理,即可制备得到江蓠多糖。
在一些具体的实施方式中,热水提取法具体为:将江蓠藻研磨成粉末后,与水混合,于90~100℃下提取1.5~2.5h,再经离心取上清、去蛋白、蒸发浓缩、沉淀去上清以及冷冻干燥处理,即可制备得到江蓠多糖。
在一些具体的实施方式中,冻融法具体为:江蓠藻研磨成粉末后,与水混合,于-20~-15℃下冷冻1.5~2.5h;再置于50~55℃的水浴锅中解冻20~25min,并重复以上操作3~5次,再经离心取上清、去蛋白、蒸发浓缩、沉淀去上清以及冷冻干燥处理,即可制备得到江蓠多糖。
在一些具体的实施方式中,纤维素酶提取法具体为:江蓠藻研磨成粉末后,与pH为4.3~4.5的乙酸-乙酸钠缓冲液按照45~55mL/g的料液比进行混合,接着按照0.02u/1g江蓠多糖粉末的加酶量加入纤维素酶,于45~50℃下提取2h,后灭酶,再经离心取上清、去蛋白、蒸发浓缩、沉淀去上清以及冷冻干燥处理,即可制备得到江蓠多糖。
在一些具体的实施方式中,柠檬酸提取法具体为:江蓠藻研磨成粉末后,与pH为1.8~2.2的柠檬酸溶液按照45~55mL/g的料液比进行混合,于95~100℃下提取2~2.5h,再经离心取上清、去蛋白、蒸发浓缩、沉淀去上清以及冷冻干燥处理,即可制备得到江蓠多糖。
本发明中,在江蓠多糖制备过程中,通过加入三氯乙酸,使得混杂在江蓠多糖中的蛋白质以沉淀的形式析出,以实现去除江蓠多糖中的蛋白质的效果;具体地,三氯乙酸的加入量为江蓠藻粉末的0.5~5%。
发明人通过大量的实践发现,当使用高温高压提取法对江蓠藻进行处理不仅处理的时间较短,江蓠多糖的得率高,且使用该江蓠多糖进行降解得到的江蓠低聚糖的生物活性相较于其他方法更高。
在一些更优选的实施方式中,使用高温高压提取法制备江蓠多糖时,将江蓠藻粉末与水的混合质量比调控在1:(40~80)时,能够进一步提高江蓠多糖的得率。
本发明中,将通过以上方法制备得到的江蓠多糖与缓冲液混合后,配制成浓度为10~20mg/mL的江蓠多糖溶液,往江蓠多糖溶液中加入鲍鱼内脏水解酶进行降解,制备得到江蓠低聚糖。
在一些具体的实施方式中,缓冲液可以是但不限定于乙酸-乙酸钠缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液中的一种。
在一些具体的实施例中,鲍鱼内脏水解酶的添加量根据江蓠多糖溶液中江蓠多糖的浓度确定,添加量在10~30U/mL的范围内,具体的添加量可以是但不限于10U/mL、12U/mL、15U/mL、16U/mL、18U/mL、20U/mL、21.5U/mL、24.5U/mL、25.0U/mL、27.5U/mL或30.0U/mL。
本发明中,鲍鱼内脏水解酶在pH为3.0~6.5、温度为35~60℃的条件下对江蓠多糖进行降解30~120min。在一些具体的实施例中,降解的温度可以是但不限于35℃、40℃、45℃、50℃、55℃或60℃;相应地,江蓠多糖溶液的pH值随着降解温度的变化而发生改变,具体的可以是但不限于3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0或6.5。
在一些具体的实施方式中,通过调整降解过程中溶液的pH值及温度,使得鲍鱼内脏水解酶中的各种酶均能够处于高活性状态,并且调控鲍鱼内脏水解酶与江蓠多糖的投入质量比使得酶促反应速率保持高水平,可实现对江蓠多糖有效且高效的降解。
本发明中,完成对江篱多糖的降解后,使用膜浓缩技术对降解后的溶液进行超滤浓缩,收集2kDa以下的滤液,并对收集得到的滤液进行冻干,制备得到江蓠低聚糖,去除大分子的蛋白和/或未被降解的多糖,使得江蓠低聚糖能够更好地发挥其生物活性。
本申请还提供了通过以上方法制备得到的江蓠低聚糖,发明人在对该江蓠低聚糖的生物活性进行研究时发现:
首先,江蓠低聚糖可增加T2DM小鼠对胰岛素的有效利用,并且通过提高T2DM小鼠GLP-1水平,来降低T2DM小鼠的胰岛素抵抗状况,进而实现降低血糖的效果。
其次,江蓠低聚糖可通过调节TG、TC、HDL-C、LDL-C水平及肝脏脂肪含量,以改善T2DM小鼠的血脂代谢紊乱;
具体地,江蓠低聚糖通过上调肝脏组织细胞中的p-PI3K、p-AKT的磷酸化,激活PI3K/AKT信号通路,从而增加了FOXO1(Ser256)位点的磷酸化,并抑制PEPCK和G6pase的表达来改善肝脏糖异生的情况;同时增加GSK3β(Ser9)位点磷酸化,减少GS(Ser641)位点磷酸化来增加肝糖原合成,以改善T2DM小鼠肝脏代谢紊乱;
同时,江蓠低聚糖也可通过提高肝脏中p-LKB1、p-AMPKα和p-ACC的表达,降低了FAS和SREBP-1的水平,以激活LKB1/AMPK信号通路抑制HFD/STZ诱导的脂质积累。
基于江蓠低聚糖所具有的生物活性,本申请还提供了江蓠低聚糖在制备具备降血糖、降血脂功能的营养保健品、减肥药、降血糖药和/或降血脂药中的应用。
下面详细描述本发明的实施例,所述实施例的示例旨在用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
在以下实施例中,一个酶活力单位定义为,在37℃的条件下,每小时分解浓度为1wt%的江蓠多糖溶液产生1mg还原糖所需要的酶量。
制备例1~5
制备例1~5中均提供了制备江蓠多糖的方法,其中,制备例1采用高温高压提取法,而制备例2~5分别热水提取法、冻融提取法、纤维素酶提取法以及柠檬酸提取法,对江蓠藻粉末进行处理制备得到江蓠多糖,包括以下步骤:
S1、江蓠多糖粗样的制备:将干燥江蓠藻放入打粉机中进行粉碎,过200目的筛子后即得江蓠藻粉末,而后制备例1~5分别按照表1的方法对江蓠藻粉末进行处理:
表1.江蓠多糖粗样的制备
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S2、江蓠多糖粗的提纯:江蓠多糖粗样在离心力为10000×g的条件下离心15min,除去沉淀得到上清液,往上清液中加入适量三氯乙酸,使得溶液中三氯乙酸的浓度为5wt%;接着置于4℃环境下静置2h,离心除去蛋白沉淀得到上清液,对上清液进行减压浓缩至原来体积的1/4,接着加入4倍体积的无水乙醇搅拌均匀,置于4℃下过夜,离心取沉淀,沉淀与水复溶后进行冷冻干燥,即制备得到江蓠多糖。
并且测定使用制备例1~5提供方法制备江蓠多糖的得率,测试结果如图1所示。由图1可知,制备例1~5的江蓠多糖得率分别为42.52±0.84%、13.1±0.72%、11.3±0.24%、13.9±0.47%、12.9±0.35%;即采用高温高压提取法对江蓠藻进行处理的江蓠多糖得率最高,且处理的时间较短,适于大规模的工业化生产。
制备例6.
本制备例提供了制备鲍鱼内脏水解酶的方法,该方法具体包括以下步骤:
将从鲜活鲍鱼上取下的鲍鱼内脏清洗干净后,与水混合,置于组织捣碎机中,进行组织捣碎,经离心、过滤、收集滤液等步骤后,加入活性炭混合均匀,再次离心得到上清液,将上清液置于截留分子量为100kDa超滤膜中进行超滤浓缩,收集透过超滤膜的外液,之后进行冷冻干燥,得鲍鱼内脏水解酶。
实施例1~15.
实施例1~15均提供了一种江蓠低聚糖,通过使用制备例6提供的鲍鱼内脏水解酶对制备例1提供的江蓠多糖进行降解制备得到;具体为:取江蓠多糖与缓冲溶液混合,配制得到浓度为10mg/mL的江蓠多糖溶液,并置于50℃下降解2h,再经过灭酶、超滤收集2kDa以下的滤液,并对收集得到的滤液进行冻干,制备得到江蓠低聚糖。实施例1~15中江蓠低聚糖的制备条件具体如表2所示:
表2.江蓠低聚糖的制备
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并且测定实施例1~13中还原糖的生成量,并以未加入鲍鱼内脏水解酶作为空白对照,结果如图2和图3所示。
由图2可知,随着鲍鱼内脏水解酶添加量的增大,还原糖的生成量也随之增加,但是当降解体系中鲍鱼内脏水解酶浓度到达20U/mL时,还原糖的生成量为0.49mg/mL,接着再增大鲍鱼内脏水解酶的投入量,最后降解得到的还原糖的量并未有明显的增加,因此,使用20U/mL对10mg/mL的江蓠多糖溶液进行降解较佳。
由图3可知,鲍鱼内脏水解酶在不同的pH值下进行江蓠多糖的降解,还原糖的生成量呈现先上升再下降的趋势,当降解中溶液的pH值为4.5时,还原糖的生成量最大,达到了0.55mg/mL,因此,在pH=4.5的条件下鲍鱼内脏水解酶对于江蓠多糖降解的催化活性最高。即实施例7提供的方法为制备江蓠低聚糖较优的方案。
实施例16.江蓠低聚糖的体外活性测定
1、江蓠低聚糖对α-葡萄糖苷酶的体外抑制效果
通过测定不同浓度江蓠低聚糖对α-葡萄糖苷酶的抑制程度来评价其降血糖活性,具体为:
S1、用磷酸盐缓冲液(pH=6.8)分别配制浓度为1U/mL的ɑ-葡萄糖苷酶溶液和10mmol/L的PNPG溶液;
S2、将50μL的ɑ-葡萄糖苷酶以及50μL不同浓度的江蓠低聚糖溶液加入到96孔培养皿中,混匀后,于37℃下保温15min。然后加入50μL的PNPG溶液,混匀后,于37℃保温10min,酶标仪测定405nm处光吸收值,结果如图4所示。
由图4可知,当加入江蓠低聚糖的浓度为10mg/mL时,对于α-葡萄糖苷酶的抑制率高达80%,其对α-葡萄糖苷酶具有较好的抑制效果,且对α-葡萄糖苷酶IC50值为2.757mg/mL。
2、江蓠低聚糖对胰脂肪酶的体外抑制效果
通过测定不同浓度江蓠低聚糖对胰脂肪酶的抑制程度来评价其降血脂活性,具体为:
S1、用75mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)配制胰脂肪酶液,10000×g下离心5min后取上清液,即为1.25mg/ml的胰脂肪酶液;
S2、将反应底物p-NPA溶于DMSO中,制备得到2mmol/L的p-NPA溶液;
S3、将50μL的胰脂肪酶(1.25mg/ml)以及50μL不同浓度的江蓠低聚糖溶液加入到96孔培养皿中,混匀后,于37℃下避光孵育15min;
S4、接着加入50μL浓度为2mmol/L的底物p-NPA,混匀后,于37℃避光反应15min,酶标仪测定405nm处光吸收值,结果如图5所示。
由图5可知,当加入江蓠低聚糖的浓度为20mg/mL时对于胰脂肪酶的抑制率高达78%,其对胰脂肪酶有良好的抑制效果,且对胰脂肪酶IC50值为4.423mg/mL。
实施例17.江蓠低聚糖对2型糖尿病的降糖效果及其机制研究
1、动物模型建立
SPF级雄性C57BL/6小鼠,4周龄;重量12±2g,由常州卡文斯实验动物:限公司提供,动物合格证号:SCXK(苏)2021-0013,实验程序按照《研究实验动物护理和使用原则》进行。所有动物均安置在南京第一医院SPF动物室,环境条件控制在21℃~25℃,湿度40%~70%,光暗交替照射12h,自由喂养。
适应性喂养1周后,将小鼠分为正常对照组(正常饲粮)和HFD/STZ(高脂饲粮)。对照组(A)正常饲粮喂养2周。HFD/STZ组在高脂饮食2周(14天)后,连续3天尾静脉注射STZ诱导剂(55mg/kg/d)。空腹12h后测空腹血糖水平(FBG)≥11.9mg/ml,造模成功;失败组则继续注射至FBG≥11.9mg/ml。
然后将HFD/STZ组小鼠平均分为5组(n=6),(B)PC组(n=6),(C)HFD/STZ+MET组(n=6),(D)HFD/STZ+GLP-L(50mg/kg)(n=6),(E)HFD/STZ+GLP-M(100mg/kg)(n=6),(F)HFD/STZ+GLP-H(200mg/kg)(n=6)。接下来开始为期8周的实验,A组正常饮食喂养,B组继续高脂饲粮喂养,灌胃等体积蒸馏水;C组继续高脂饲粮喂养,并灌胃100mg/kg的二甲双胍。DEF组饲喂高脂饲粮,分别饲喂50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg的江蓠低聚糖。
8周治疗结束时,所有小鼠禁食12小时,但允许自由饮水。麻醉后迅速取眼球采血,4℃、14000×g离心5min。采集血清标本进行生化分析。小鼠的肝脏被解剖后储存于-80℃冰箱。
2、指标测定
(1)空腹血糖含量测定
造模前、STZ造模后12h和灌胃后第2、4、6、8周,尾静脉采血检测小鼠空腹血糖含量FBG,并记录小鼠进食量和饮水量;
(2)OGTT测量及AUC计算
灌胃开始后第2、4、6、8周,进行口服葡萄糖耐量测试(OGTT),尾静脉采血检测小鼠0、15、30、60、90、120分钟血糖水平。绘制血糖变化,计算曲线线下面积(AUC)。
(3)血清指标测定
取适量小鼠血清,全自动生化仪测定谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)。
血清胰岛素(Ins)、血清胰高血糖素、胰高血糖素样肽(CLP-1)水平均采用ELSA试剂盒测定完成;血清游离脂肪酸(NEFA)采用游离脂肪酸试剂盒测定。
(4)GSP和HbAlc测定
取适量小鼠血清,全自动生化仪测定糖化血清蛋白(GSP);取适量小鼠全血,糖化血红蛋白分析仪测定HbA1c。
(5)肝脏相关指标测定
肝糖原测定:采用肝/肌糖原检测试剂盒(比色法)进行检测。
肝脏组织学采用苏木精—伊红(H&E)染色进行肝脏病理评价。采用油红O染色检测肝脏中脂肪含量变化。
(6)Western blotting
利用Western blotting的方法经总蛋白提取、SDS-PAGE凝胶电泳、转模、封闭、一抗孵育、清洗、二抗孵育、清洗、显影等一系列操作对小鼠肝脏中蛋白变化进行分析,检测PI3K-Akt轴下FoXO1和GSK3β两条通路中IRS1、phos-IRS1(Ser307)、phos-Akt(Ser473)、Akt、phos-PI3K p85(Tyr458)/p55(Tyr199)、PI3K-p85、phos-GSK3β(Ser9)、GSK3β、phos-GS(Ser641)、GS、Phos-Foxo1(Ser256)、Foxo1、PEPCK、G6pase蛋白表达水平;LKB1-AMPK通路ACC-SERBP-1-FAS轴的LKB1、Phos-LKB1(Ser428)、Phos-AMPKα(Thr172)、AMPKα、Phos-ACC(Ser79)、ACC、SERBP-1、FAS蛋白表达水平;
(7)免疫组化
根据以上两条信号通路,分别测定肝脏SERBP-1和FAS的表达、PEPCK、G6pase、phos-GS(Ser641)的表达。
3、数据分析
数据采用Graphpad Prism9(Version 9.4.0)进行分析与作图,AdobeIllustrator2022(Version 26.3.1)进行整理合图。所有数据均以means±SD表示,组间统计学差异采用one-way ANOVA和Dunnt检验以及two-way ANOVA和Tukey检验,P值小于0.05认为有显著性差异。
4、结论
(1)江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠空腹血糖、摄食量和饮水量的影响
如图6(a)~(c)所示,B组小鼠空腹血糖、摄食量、饮水量相比A组小鼠显著上升(p<0.01),并且在给药期间,未出现自主下降,说明高脂高糖联合STZ诱导构建T2DM小鼠模型成功。和B组小鼠比,C、D、E、F组小鼠空腹血糖、饮水量显著下降(p<0.05或p<0.01),C、F组小鼠摄食量显著下降(p<0.05)。
(2)江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠糖耐量(OGTT)的影响
如图7(a)~(h)所示,测定灌胃期间的口服葡萄糖耐量变化,各组小鼠的血糖水平在60min时达到峰值,随后逐渐下降;AUC结果显示,B组小鼠AUC相比A组小鼠显著上升(p<0.01);和B组小鼠比,C、D、E、F组小鼠AUC显著下降(p<0.05或p<0.01),表明江蓠低聚糖可显著改善T2DM小鼠的糖耐量能力。
(3)江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠糖化血清蛋白(GSP)、糖化血红蛋白(HbA1c)、胰岛素、胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、血清游离脂肪酸(NEFA)的影响
持续的高血糖会导致血液中的血清蛋白和血红蛋白发生非酶糖基化反应生成糖基化蛋白,糖基化蛋白再经过氧化、降解、交联等反应生成糖基化终产物,也是导致糖尿病并发症的原因之一。糖化血清蛋白和糖化血红蛋白可以反映出一段时间内血糖变化。胰高血糖素样肽-1是肠道黏膜L细胞分泌的多肽,能够起到降低食欲和改善胰岛素抵抗的作用。
如图8(a)~(f)所示,B组小鼠GSP、HbA1c、血清胰岛素、GLP-1相比A组小鼠显著上升(p<0.01),血清GLP-1含量相比A组小鼠显著下降(p<0.01);和B组小鼠比,C、E、F组小鼠GSP、HbALc、血清胰岛素、血清胰高血糖素显著下降(p<0.01),血清GLP-1含量显著上升(p<0.01)。以上结果说明,GLP可增加T2DM小鼠对胰岛素的有效利用,并且通过提高T2DM小鼠GLP-1水平,来降低T2DM小鼠的胰岛素抵抗状况。
肥胖和糖尿病患者NEFA一般高于正常人水平,高浓度的NEFA会引发慢性炎症、胰岛素抵抗、胰岛β细胞凋亡、动脉周硬化等疾病,如图8(f)所示,B组小鼠NEFA显著高于A组小鼠(p<0.01),说明此时T2DM小鼠已经出现了严重的代谢紊乱,江蓠低聚糖给药8周后,低中高浓度的江蓠低聚糖均能有效降低NEFA含量(p<0.01),其中高剂量的江蓠低聚糖作用尤为明显,表现出与二甲双胍近似的效果。综上江蓠低聚糖在改善T2DM小鼠NEFA方面具有显著的效果。
(4)江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、肝糖原的影响
AST、ALT等指标时评价肝功能的生物标志物,如图9(a)~(e)所示,B组T2DM小鼠肝脏中可以明显观察到血清AST、ALT相比A组小鼠显著上升(p<0.01),血清TP、ALB、GLO含量相比A组小鼠显著下降(p<0.01);和B组小鼠比,C、D、E、F组小鼠血清AST、ALT显著下降(p<0.01),血清TP、ALB、GLO含量显著上升(p<0.05或p<0.01)。说明经过江蓠低聚糖的干预治疗后,可以有效改善T2DM小鼠肝功能损伤。
甘油三脂(TG)和胆固醇(TC)分别与心血管疾病和动脉粥硬化密切相关,且血清中的TG、TC异常升高常作为肾病综合征、糖尿病和甲状腺功能障碍等预警指标。如图9(f)~(g)所示,B组T2DM小鼠中的血清TG、TC值显著高于A组(p<0.01),说明T2DM小鼠出现严重的脂代谢紊乱症状,C、D、E、F组均可以改善T2DM小鼠中的血清TG、TC的水平异常,并且随着GLP浓度的增加,效果越来越明显,其中高剂量江蓠低聚糖对T2DM小鼠中的血清TG的改善效果与MET效果相当。高密度脂蛋白(HDL-C)属于抑制动脉粥样硬化的一种血液脂蛋白,能够抑制低密度脂蛋白(LDL-C)的氧化修饰以及血栓形成,修复内皮损伤促进血管生成。如图9(h)~(i)所示,B组T2DM小鼠中的血清LDL-C水平显著增加(p<0.01),而HDL-C显著降低(p<0.01),经过8周的GLP或MET干预后,各组小鼠的脂质代谢情况得到明显的改善,且随浓度呈依赖性,其中高剂量江蓠低聚糖对T2DM小鼠中的血清LDL-C的改善效果与MET效果相当。综上,高剂量江蓠低聚糖对T2DM小鼠的血脂代谢紊乱具有较好的改善效果,在改善TG、LDL-C水平上与MET效果相当。
肝糖原的分解、合成是集体调节血糖的一条重要途径,当机体内胰岛素分泌不足,出现胰岛素抵抗时,肝糖原合成减少,抑制肝糖原分解作用减弱,从而导致肝糖原含量下降,血糖水平上升。如图9(j)所示,B组T2DM小鼠中肝糖原含量显著低于A组(p<0.01),经过不同浓度的GLP干预后,肝糖原含量显著增加(p<0.05或p<0.01),江蓠低聚糖具有较好的改善机体肝糖原含量的作用效果,能够有效促进糖原的合成并抑制其分解,增加肝糖原的含量,改善血糖的上升。
(5)江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠肝脏病理学的影响
如图10所示,A组细胞结构正常,细胞边界清晰,未见炎症细胞的浸润;B组中明显观察到脂肪变性、空泡变性及炎症细胞的浸润,且细胞边界模糊,细胞核大量溶解或萎缩;D、E、F组中随着浓度的增大炎症细胞浸润现象减小,细胞坏死现象减少,细胞边界逐渐明显。
(6)江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠肝脏脂肪积累的影响(油红O,200x)
如图11所示,A组中只存在少量的脂肪,而B组中的脂肪含量明显增加(p<0.01),说明T2DM小鼠由于代谢紊乱造成了脂肪的蓄积,这与之前的TC、TG升高的结果相一致。给药8周后,小鼠肝脏中的脂肪含量显著减少(p<0.01),说明江蓠低聚糖可以有效改善T2DM小鼠肝脏中的脂肪蓄积。
(7)江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠肝脏中AMPKα、p-AMPKα、LKB1、p-LKB1表达的影响
在肝脏中,AMPK是调节脂代谢和糖异生的主要开关,激活AMPK会减少胆固醇、血糖、甘油三脂的产生。AMPK的活性受到上游LKB1活性的调节。LKB1能够磷酸化并激活AMPK的催化亚基T环上的Thr172。如图12所示,B组小鼠肝脏p-AMPKα、p-LKB1表达相比A组小鼠显著下降;和B组小鼠比,C、D、E、F组小鼠肝脏p-AMPKα、p-LKB1表达显著上升(p<0.05或p<0.01),AMPKα、LKB1表达无显著差异。总AMPKα和总LKB1无明显变化。说明T2DM的发生会抑制LKB1和AMPKα的活化,而江蓠低聚糖可以有效逆转T2DM引起的LKB1蛋白活性的降低,促进AMPKα的活化,从而改善糖脂代谢的发生。
(8)江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠肝脏中p-ACC、ACC、FAS以及SERBP-1表达及免疫组化
在LKB1-AMPK-ACC信号通路通路中,AMPK也会通过抑制ACC的活性而达到抑制脂肪酸合成脂肪以及促进脂肪氧化分解利用。如图13、图14(a)和(b)所示,与正常组相比,B组T2DM小鼠的p-ACC表达明显降低(p<0.01),脂肪酸相关蛋白FAS和SERBP-1的表达明显升高(p<0.01),而经过8周的干预治疗后,随着不同浓度的干预,以上的情况得到了明显的改善,p-ACC表达显著增加(p<0.05或p<0.01),FAS和SERBP-的表达显著降低(p<0.05或p<0.01),同样的在免疫组化中也得到相同的结果(p<0.01)。
以上结果说明,江蓠低聚糖通过AMPK介导的信号通路调节脂质积累,而AMPK的激活主要通过上游激酶LKB1的磷酸化和下游因子ACC、FAS和SERBP-1的磷酸化,最终证明了江蓠低聚糖通过激活LKB1/AMPK通路,提高p-ACC的表达,降低FAS和SERBP-1水平来改善T2DM。
(9)江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠肝脏中p-IRS1、IRS1、p-AKT、AKT、p-PI3K以及PI3K表达的影响
PI3K/AKT通路属于胰岛素的下游分子信号转导通路,其作用机制是胰岛素(Ins)与IRS的α亚基相结合,并活化β亚基,促使β亚基自我磷酸化进而引起IRS的酪氨酸位点被磷酸化。而磷酸化的酪氨酸则可以通过磷酸化的Tyr结合域与InsR相结合,并在IRS上形成一个能与含SH2结构域的蛋白结合的“停泊位点”,PI3K的p85亚基因含有SH2结构域,则可以与这个“停泊位点”相结合,从而激活PI3K。激活后的PI3K信号因子可以催化细胞膜侧的P1(4,5)P2肌醇转化为P1(3,4,5)P3肌醇。P1(3,4,5)P3肌醇与含有PH结构域的信号蛋白AKT和PDK1结合,诱发PDK1磷酸化AKT的Ser308位点,从而激活AKT。AKT是葡萄糖代谢的关键酶,也是PI3K下游信号通路的主要效应器之一,在糖脂代谢中发挥着作用。基于以上对p-IRS1、IRS1、p-AKT、AKT、p-PI3K以及PI3K表达进行测定。
如图15所示,B组小鼠肝脏p-IRS1表达相比A组小鼠显著上升(p<0.01),p-AKT、p-PI3K表达相比A组小鼠显著下降(p<0.01)。和B组小鼠比,C、D、E、F组小鼠肝脏p-IRS1表达显著下降(p<0.05或p<0.01),p-AKT、p-PI3K表达显著上升(p<0.05或p<0.01)。这说明,MET和江蓠低聚糖均可显著上调T2DM小鼠肝脏中PI3K的活化表达,并且是通过对IRS1的调节来激活上游基因PI3K,诱发AKT的磷酸化,从而促进胰岛素的敏感性。
(10)江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠肝脏中p-GSK3β、GSK3β、p-GS以及GS表达的影响
G3K3β是糖原合成的一种关键酶,属于胰岛素PI3K/AKT通路的下游信号分子,被激活的AKT信号因子可以通过调节其下游信号分子的表达,进而调节葡萄糖摄取、糖原合成、糖异生及蛋白质合成,最终改善机体的肝脏糖代谢紊乱和胰岛素抵抗情况。如图16所示,B组小鼠肝脏p-GSK3β表达相比A组小鼠显著下降(p<0.01),p-GS表达相比A组小鼠显著上升(p<0.01)。和B组小鼠比,C、D、E、F组小鼠肝脏p-GSK3β表达显著上升(p<0.05或p<0.01),p-GS表达显著下降(p<0.05或p<0.01)。
(11)江蓠低聚糖对HFD/STZ小鼠肝脏中p-Foxo1、Foxo1、G6pase以及PEPCK表达及免疫组化
Foxo1也属于胰岛素PI3K/AKT通路的下游信号分子,能够调节机体糖异生关键酶G6pase和PEPCK的表达,增强糖异生作用,并调节脂代谢相关基因的转录。当胰岛素抵抗发生时,Foxo1一直处于高激活表达状态,进而导致机体的糖脂代谢相关基因的异常表达,最终加重糖脂代谢紊乱。如图17所示,B组小鼠肝脏p-Foxo1表达相比A组小鼠显著下降(p<0.01),G6pase、PEPCK表达相比A组小鼠显著上升(p<0.01)。和B组小鼠比,C、D、E、F组小鼠肝脏p-Foxo1表达显著上升(p<0.05或p<0.01),G6pase、PEPCK表达显著下降(p<0.05或p<0.01)。说明江蓠低聚糖通过下调Foxo1的活化表达,来抑制糖异生作用,增强胰岛素敏感性,降低胰岛素抵抗。
以上结果说明,江蓠低聚糖可以激活胰岛素PI3K/AKT转导通路通路,主要是通过对IRS1的调节来激活上游基因PI3K,诱发AKT的磷酸化,从而促进胰岛素的敏感性;调控其下游信号分子GSK3β、GS的表达来促进肝糖原的合成,减轻胰岛素抵抗的症状;同时,通过控制Foxo1以及糖原合成的关键酶G6pase、PEPCK的表达来改善肝糖代谢紊乱,最终改善改善T2DM的情况。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种江蓠低聚糖的制备方法,其特征在于,使用鲍鱼内脏水解酶对江蓠多糖进行降解制备得到所述江蓠低聚糖。
2.根据权利要求1所述的江蓠低聚糖的制备方法,其特征在于,使用所述鲍鱼内脏水解酶对江蓠多糖溶液进行降解,所述江蓠多糖溶液的浓度为10~20mg/mL。
3.根据权利要求2所述的江蓠低聚糖的制备方法,其特征在于,在降解过程中,所述鲍鱼内脏水解酶的添加量为10~30U/mL。
4.根据权利要求1所述的江蓠低聚糖的制备方法,其特征在于,所述降解的pH值为3.0~6.5,温度为35~60℃,降解时间为30~120min。
5.根据权利要求1所述的江蓠低聚糖的制备方法,其特征在于,所述鲍鱼内脏水解酶通过以下步骤制备得到:取鲍鱼内脏与水混合之后并进行组织捣碎、离心、过滤,收集得到滤液;往所述滤液中加入活性炭混合均匀,离心得到上清液;对所述上清液进行超滤浓缩收集得到外液;对所述外液进行冷冻干燥得到所述鲍鱼内脏水解酶。
6.根据权利要求5所述的江蓠低聚糖的制备方法,其特征在于,所述鲍鱼内脏的离体时间不超过3个月,且所述鲍鱼内脏离体后置于-20~-15℃下保存。
7.根据权利要求1所述的江蓠低聚糖的制备方法,其特征在于,所述江蓠多糖通过高温高压提取法、热水提取法、冻融提取法、纤维素酶提取法或柠檬酸提取法制备得到。
8.根据权利要求7所述的江蓠低聚糖的制备方法,其特征在于,当采用所述高温高压提取法制备江蓠多糖时,具体制备步骤为:将江蓠藻粉碎后并加入水配制成悬浮液,所述悬浮液于120~125℃、0.08~0.12MPa下处理30~60min,后经离心取上清、去蛋白、蒸发浓缩、沉淀去上清以及冷冻干燥处理,制备得到所述江蓠多糖;
任选地,所述去蛋白的方式为使用三氯乙酸沉淀除去江蓠多糖中的蛋白质。
9.一种江蓠低聚糖,其特征在于,通过权利要求1~8任一所述的制备方法制备得到。
10.权利要求9所述的江蓠低聚糖在制备具备降血糖、降血脂功能的营养保健品、减肥药、降血糖药和/或降血脂药中的应用。
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