CN116376824A - Nkt细胞、其衍生细胞及在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种NKT细胞、其衍生细胞及在制备抗肿瘤药物中的应用，所述NKT细胞命名为ABL‑01，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2023年1月11日，保藏编号为C202314。本发明ABL‑01细胞不会引起排异反应，适合回输给不同的癌症患者，不仅对癌细胞株具有杀伤力，对原代肺癌细胞和原代卵巢癌细胞也具有很强的裂解效果，同时还可以识别和裂解其他多种癌细胞。本发明还对ABL‑01进行加工和升级，参照嵌合抗原受体（CAR）的原理构建了CAR‑UNKT，将靶向间皮素的单链抗体基因整合到ABL‑01的染色体中，构建后的CAR‑UNKT就能精准地识别和杀伤卵巢癌细胞，而不攻击正常细胞。
Description
技术领域
本发明属于NKT细胞技术领域，具体涉及一种NKT细胞、其衍生细胞及在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
癌症防治形势十分严峻，中国在0-64岁国民中，每死亡4人，即有1人死于癌症。目前，中国每年用于癌症患者的治疗费用高达1000亿元，患者人均支出约7万元、晚期癌症的治疗基本要花掉患者家庭的全部积蓄。
以细胞治疗为主的精准医疗已经得到了高度关注。肿瘤治疗的常规手段主要有手术、放疗和化疗。这些治疗措施都具有巨大的副作用，而免疫治疗则相对安全，因此越来越受到重视。免疫治疗通过提升患者免疫系统的功能，利用免疫细胞去清除体内的癌细胞，从而达到治愈癌症的效果。免疫治疗主要又分抗体治疗和细胞治疗两种。目前最流行的PD-1抗体治疗，通过阻断对CD8+T细胞的抑制来加强CD8+T细胞对癌细胞的杀伤功能。细胞免疫治疗则是一种过继性治疗，该技术首先对患者自身T细胞在体外进行基因工程加工和扩增，然后再注射回患者体内。这种加工后的T细胞称为嵌合抗原受体修饰的T细胞，或简称CAR-T（chimeric antigen receptor-modified T cells）。CAR-T在治疗白血病，多发性骨髓瘤等血液肿瘤方面已经获得成功。并且国内已有两款CAR-T细胞治疗药物获得CFDA批准。
虽然CAR-T对血液肿瘤效果显著，但是CAR-T对实体瘤疗效甚微。嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）治疗是抗肿瘤免疫治疗最热门的领域之一，也是近十年来免疫医学的重大突破。作为CAR-T细胞的核心结构，CAR是一种基因工程加工的融合蛋白，可以在细胞表面表达并能特异性识别肿瘤抗原。它主要由细胞外单链抗体可变区（scFv）、铰链区、跨膜区和细胞内结构域组成。细胞外scFv结构一般由肿瘤抗原对应的抗体修饰而来。原则上，CAR-T细胞识别抗原的方式不同于天然TCR结构，不依赖于MHC抗原呈递，有利于克服MHC表达下调引起的免疫逃逸，进一步拓展T细胞治疗的应用。目前，靶向CD19的CAR-T细胞治疗在血液肿瘤治疗方面取得了显著进展。在全球范围内，已有八种CAR-T产品获得批准，主要针对CD19和BCMA。在实体瘤方面，针对不同类型肿瘤的靶点已经开发出来，CAR-T细胞疗法陆续进入临床试验。然而，大多数临床试验并未达到预期效果，主要障碍是肿瘤抗原的异质性、免疫逃逸和免疫抑制肿瘤微环境。尽管目前该领域的进展已被证明相当缓慢，但随着更多靶点的发现和未来临床试验的优化，实体瘤有望成为CAR-T的主要治疗领域。
间皮素（MSLN）是一种细胞表面糖蛋白，在大多数恶性胸膜间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌和直肠癌中过表达，而正常组织表达很少。由于MSLN在正常组织和肿瘤组织之间差异表达，MSLN是肿瘤治疗的潜在靶点之一。在临床前研究中，Carl June的研究小组观察到CAR-T通过靶向MSLN具有更大的抗肿瘤作用。随后，他们使用mRNA转染的CAR-T评估了MSLN作为靶标在临床实践中的疗效，并报道了CAR-T在乳腺癌患者中的安全性和有效性。另一项I期临床试验评估了靶向MSLN的CAR-T治疗转移性胰腺导管腺癌的疗效。静脉滴注CAR-T后，临床结果显示2例患者都出现对症反应，无进展生存期分别为3.8个月或5.4个月。并且治疗同样具有良好的安全性。目前，已经对卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌等多种实体瘤的治疗进行了多项临床研究，多项数据表明了该疗法的可行性和安全性。
Natural killer T（NKT）细胞，又称自然杀伤T细胞，是一类表面既表达T细胞受体，又表达NK细胞受体的特殊T细胞亚群。NKT主要分成3种类型，I型和II型NKT细胞主要识别脂类或糖酯类分子，都可以被α-半乳糖神经酰胺激活，其中I型NKT为恒定NKT（invariantNKT，简称iNKT），iNKT细胞的特点是其T细胞受体alpha链的可变区含有V24a恒定氨基酸序列。不含有V24a氨基酸序列的归为II型NKT。第三类型NKT不能被α-半乳糖神经酰胺激活，识别的抗原主要为多肽，通常被称为NK-like T细胞。
NKT细胞表面标志物主要有T细胞的标志物CD3以及NK细胞的表面标志物CD56，NKG2D等。这类NKT细胞遇到靶细胞后被激活并分泌穿孔素和颗粒酶，因而可以有效清除体内的多种肿瘤细胞以及病毒感染的细胞。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明目的是提供一种NKT细胞、其衍生细胞及在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：
本发明提供了一种NKT细胞，命名为ABL-01，保藏于中国典型培养物保藏中心（武汉大学保藏中心），保藏日期为2023年1月11日，保藏编号为C202314。
所述NKT细胞含有如SEQ ID NO.1所示的基因序列。
所述NKT细胞来源于口腔癌术后康复的肿瘤患者外周血。
本发明还提供了上述NKT细胞的衍生细胞，将所述NKT细胞经过嵌合抗原受体修饰，构建CAR-UNKT细胞，即为所述衍生细胞。
进一步的，所述衍生细胞是利用靶向间皮素的单链抗体基因对NKT细胞进行基因修饰。
进一步的，所述嵌合抗原受体包括依序连接的EF-1α核心启动子、CD8 A前导体、MSLN scFv、CD8 A铰链、CD8 A跨膜结构域、共刺激域4-1BB和CD3Z的细胞内结构域。优选的，所述MSLN scFv基因序列为SEQ ID NO.2所示序列。
本发明最后提供了所述的NKT细胞、所述的衍生细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步的，所述肿瘤包括卵巢癌、肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌、胆管癌、前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、皮肤癌、胶质瘤、膀胱癌、食管癌、纤维肉瘤、B淋巴细胞白血病或T淋巴细胞白血病。
一种NKT细胞，其含有如SEQ ID NO.1所示的基因序列，或者含有与该序列同源性等于或高于90%的基因序列。
本发明发现的ABL-01细胞属于第三类型的NKT，由于NKT不会引起排异反应，因此适合回输给不同的癌症患者，所以我们又称ABL-01为通用型NKT（universal NKT），或UNKT。UNKT不仅对癌细胞株具有杀伤力，对原代肺癌细胞和原代卵巢癌细胞也具有很强的裂解效果。同时在小鼠动物模型以及非注册人体临床试验中都看到明显的肿瘤抑制效果，尤其对晚期卵巢癌患者腹腔积液中癌细胞的清除效果十分显著。
MSLN是一种细胞表面糖蛋白，很少在正常组织中表达，但在大多数癌症中过表达。我们的研究结果表明，MSLN在输卵管组织中的表达相对较高，在其他组织中的表达较少。宫颈鳞状细胞癌和宫颈管腺癌（CESC）、结肠腺癌（COAD）、肾状细胞癌（KIRP）、卵巢浆液性囊腺癌（OV）、胰腺腺癌（PAAD）、直肠腺癌（READ）、胃腺癌（STAD）和子宫内膜癌（UCEC）组织中的MSLNS显示每百万人的转录本数量远高于正常组织。MSLN在这些癌症中的表达也明显高于配对的正常组织。据报道，MSLN在癌症的发展中起重要作用。在对卵巢癌、胰腺癌和直肠癌患者的分析中发现MSLN表达高的患者总体上明显较短生存时间，表明MSLN在OV，PAAD和READ的发展中起作用。综上所述，MSLN在肿瘤中的表达水平显著高于正常组织，且预后不良。
因此，针对卵巢癌治疗，本发明对ABL-01进行加工和升级。本发明参照CAR-T的原理构建了CAR-UNKT。将靶向间皮素（MSLN）的单链抗体（scFv）基因整合到ABL-01的染色体中。MESO在卵巢癌细胞表面高效表达，而在正常细胞不表达。CAR分子的构建可以按照CAR-T中CAR分子的策略进行克隆，通常由scFv-CD8TM-(4-1BB)-CD3zeta构成。UNKT的加工主要利用慢病毒载体把CAR基因整合到NKT细胞的染色体中。因此，构建后的CAR-UNKT就能精准地识别和杀伤卵巢癌细胞，而不攻击正常细胞。
有益效果：与现有技术相比，本发明通过高通量筛选技术，从口腔癌术后康复的肿瘤患者外周血中分离到一个稳定的NK-likeT细胞系，即ABL-01。
由于NKT细胞主要通过NKG2D受体识别癌细胞表面MICA，MICB和ULBP1-6等8种抗原，因此NKT细胞可以识别和裂解多种癌细胞。通过体外杀伤实验，我们发现ABL-01能在短时间内（12小时内）裂解18种肿瘤细胞株，这些癌细胞株包括卵巢癌、肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌、胆管癌、前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、皮肤癌、胶质瘤、膀胱癌、食管癌、纤维肉瘤、B淋巴细胞白血病、T淋巴细胞白血病的癌细胞株。利用小鼠模型，还发现ABL-01可以有效地抑制癌细胞扩散，并提高荷瘤小鼠的生存期。
此外，UNKT细胞也可以被靶向CD19或Claudin18.2的CAR分子修饰，从而在UNKT内源性抗肿瘤活性的基础上增加CAR介导的抗肿瘤新机制。因此，本发明将靶向间皮素的单链抗体在ABL-01细胞表达，构建的CAR-NKT在小鼠模型中显示更强的抗癌效果。本发明证明了UNKT细胞可以被靶向MSLN的慢病毒稳定转导，从而为MSLN阳性肿瘤提供安全有效的细胞治疗手段。
综上所述，本发明提供的ABL-01细胞及其修饰后的细胞，实验结果显示，两者均具有显著的抗肿瘤效果，将在肿瘤细胞治疗中发挥应用的作用。
附图说明
图1为通用型自然杀伤性T细胞（UNKT）的表征（细胞流式仪分析结果）。
图2为肺癌细胞单独培养（a），以及肺癌细胞与UNKT混合培养（b）后的显微镜观察结果。
图3为原代肺癌细胞单独培养（a），以及原代肺癌细胞与UNKT混合培养（b）后的显微镜观察结果。
图4为卵巢癌细胞SKOV3单独培养（a），以及卵巢癌细胞SKOV3与UNKT混合培养（b）后的显微镜观察结果。
图5为原代卵巢癌细胞单独培养（a），以及原代卵巢癌细胞与UNKT混合培养（b）后的显微镜观察结果。
图6为细胞流式仪分析不同效靶比对UNKT杀伤卵巢癌细胞SKOV3的影响。
图7为RTCA分析不同效靶比对UNKT杀伤肺癌细胞A549的影响。
图8为RTCA分析不同效靶比对UNKT杀伤胃癌细胞SNU-16的影响。
图9为RTCA分析不同效靶比对UNKT杀伤纤维肉瘤癌细胞HT-1080的影响。
图10为RTCA分析不同效靶比对UNKT杀伤结肠癌细胞SW480的影响。
图11为RTCA分析不同效靶比对UNKT杀伤肝癌细胞HepG2的影响。
图12为RTCA分析不同效靶比对UNKT杀伤卵巢癌细胞SKOV3的影响。
图13为RTCA分析不同效靶比对UNKT杀伤宫颈癌细胞CaSki的影响。
图14为RTCA分析不同效靶比对UNKT杀伤胆管癌癌细胞RBE的影响。
图15为RTCA分析不同效靶比对UNKT杀伤乳腺癌细胞MCF7的影响。
图16为RTCA分析不同效靶比对UNKT杀伤子宫内膜癌细胞MCF7的影响。
图17为RTCA分析不同效靶比对UNKT杀伤前列腺癌细胞PC-3的影响。
图18为RTCA分析不同效靶比对UNKT杀伤食管癌细胞TE-1的影响。
图19为RTCA分析不同效靶比对UNKT杀伤膀胱癌细胞EJ-1的影响。
图20为RTCA分析不同效靶比对UNKT杀伤胶质瘤细胞U251的影响。
图21为RTCA分析不同效靶比对UNKT杀伤胰腺癌细胞PANC-1的影响。
图22为UNKT处理一周之后每只小鼠肿瘤进展。
图23为CAR-UNKT的构建。
图24为体外试验验证CAR-UNKT比CART和UNKT对MSLN阳性癌细胞（MCF7和SKOV3）具备更强的杀伤力。
图25为体内试验验证CAR-UNKT比CART和UNKT对卵巢癌具备更强的杀伤力。
实施方式
通过以下实施例进一步对本发明进行进一步阐述。这些实施例完全是例证性的，他们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1 通用型自然杀伤性T细胞（UNKT）的表征
ABL-01分离主要经过四个步骤，首先从口腔癌康复患者的外周血分离PBMC，然后利用该PBMC把NKT细胞经过2轮磁珠选择从其中分离出来。第一轮使用STEMCELLTechnologies公司的CD3分离试剂盒对CD3阳性T细胞进行选择，第二轮是使用STEMCELLTechnologies公司的CD56分离试剂盒选择CD3 / CD56双阳性NKT细胞。最后利用人卵巢癌细胞系SKOV-3作为靶细胞，上述纯化的NKT细胞中具有最强细胞毒性的细胞克隆再通过高通量筛选，从而分离出ABL-01细胞系。ABL-01细胞可以在含有15%胎牛血清（Gibco）的ALyS505N-0培养基中进行扩增，培养基需要添加100 IU/ml白细胞介素-2，培养条件为37°C和5%CO2。通过基因测序，发现ABL-01细胞有一段特异的基因序列：GCTGTGAGTGAAGGGAAAACC，如SEQ ID No.1所示，该序列编码的多肽序列为AVSEGKT。
将上述分离的细胞命名为ABL-01细胞，保藏于中国典型培养物保藏中心（武汉大学保藏中心），保藏日期为2023年1月11日，保藏编号为C202314。
ABL-01细胞，又称UNKT细胞，用PerCP标记的CD3抗体，PE-H7标记的CD56抗体和PE标记的NKG2D抗体分别进行染色。染色时间为30分钟，染色温度4℃。如图1所示，细胞流式仪分析后显示UNKT为CD3阳性，NKG2D阳性，CD56部分阳性（大约65%）。NKG2D是NK和NKT以及gdT细胞等先天免疫细胞的主要受体，在UNKT杀伤中提供了关键的肿瘤细胞识别机制。
实施例2体外实验观察ABL-01对多种癌细胞的杀伤性
UNKT对肿瘤的杀伤具有广谱性。我们一共测试了18种不同癌种的细胞株，发现UNKT均可以裂解这些细胞。这些细胞株包括卵巢癌、肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌、胆管癌、前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、皮肤癌、胶质瘤、膀胱癌、食管癌、纤维肉瘤、B淋巴细胞白血病、T淋巴细胞白血病的癌细胞。UNKT对每一种种癌细胞都有极强的杀伤能力。在96-孔培养板中，对照孔里加入3万癌细胞单独培养，而处理组按照效靶比1：1，即每孔加入3万癌细胞和3万UNKT细胞，12小时在显微镜下观察，就可以观察到所有的癌细胞被UNKT裂解，对照孔里只剩下活化聚团的UNKT细胞。
癌细胞体积通常比UNKT的体积上大，显微镜下观察时可以区分开。图2a显示体积较大的肺癌细胞单独培养时的形态，图2b显示肺癌细胞与UNKT混合培养12小时后所有的肺癌细胞都被裂解，图中只见到聚团的UNKT。UNKT和其它17种癌细胞混合培养时也显示类似的杀伤效果。
图3a显示体积较大的原代肺癌细胞单独培养时的形态，图3b显示原代肺癌细胞与UNKT混合培养12小时后大部分原代肺癌细胞都被裂解，剩下的主要是活化后聚团的UNKT。
图4a显示体积较大的卵巢癌细胞SKOV3单独培养时的形态，图4b显示卵巢癌细胞与UNKT混合培养12小时后所有的卵巢癌细胞都被裂解，图中只见到活化后聚团的UNKT。
图5a显示体积较大的原代卵巢癌细胞单独培养时的形态，图5b显示原代卵巢癌细胞与UNKT混合培养12小时后大部分原代卵巢癌细胞都被裂解，剩下的主要是活化后聚团的UNKT。
实施例3利用流式细胞仪分析UNKT细胞对癌细胞系的细胞毒性
利用PE-CD3抗体，可以借助流式细胞仪分析来鉴定和计数靶细胞SKOV-3和UNKT的比例。靶细胞SKOV3表达GFP蛋白，而UNKT可以被CD3-PE抗体标记。所有SKOV3和UNKT均可以在细胞流式仪进行计数。从图6数据可以看出，随着E:T比例从5：1降低到1：5时，可以看到存活的靶细胞SKOV-3的比例由低向高提升，可以看到在E:T=1：1时，90.1% SKOV-3都被UNKT裂解。
实施例4 利用实时监控仪（RTCA）分析UNKT细胞对不同癌细胞系的细胞毒性
艾森公司的实时监控仪可以长时间观察贴壁细胞的生长状况，而悬浮细胞对贴壁细胞的计数不产生影响。当贴壁细胞数目越多，细胞计数（cell index）就越高。实时监控仪这种功能为测试CART等效应细胞杀伤癌细胞提供了一种动态的杀伤图谱。
图7显示不同效靶比对UNKT杀伤肺癌细胞A549的影响。在没有加入UNKT之前，每个孔中的癌细胞（起始加入3万癌细胞）正常生长，各自的生长曲线持续升高，但是加入UNKT后，除了对照组A549细胞的生长曲线继续上升，其它处理组细胞的生长曲线开始回落。当E:T=4:1时，A549的生长曲线下降最快，表明大量的癌细胞被裂解，在短短的5个小时癌细胞基本全部被裂解。
图8显示不同效靶比对UNKT杀伤胃癌细胞SNU-16的影响。在没有加入UNKT之前，每个孔中的癌细胞（起始加入3万癌细胞）正常生长，各自的生长曲线持续升高，但是加入UNKT后，除了对照组SNU-16细胞的生长曲线继续上升，其它处理组细胞的生长曲线开始回落。当E:T=4:1和2：1时，SUN-16的生长曲线快速下降，表明大量的癌细胞被裂解，在短短的5个小时癌细胞基本全部被裂解。
图9显示不同效靶比对UNKT杀伤纤维肉瘤细胞HT-1080的影响。在没有加入UNKT之前，每个孔中的癌细胞（起始加入3万癌细胞）正常生长，各自的生长曲线持续升高，但是加入UNKT后，除了对照组HT-1080细胞的生长曲线继续上升，其它处理组细胞的生长曲线开始回落。当E:T=4:1时，HT-1080细胞的生长曲线下降最快，表明大量的癌细胞被裂解，在短短的4个小时癌细胞基本全部被裂解。
图10显示不同效靶比对UNKT杀伤结肠癌细胞SW480的影响。在没有加入UNKT之前，每个孔中的癌细胞（起始加入3万癌细胞）正常生长，各自的生长曲线持续升高，但是加入UNKT后，除了对照组SW480细胞的生长曲线继续上升，其它处理组细胞的生长曲线开始回落。当E:T=4:1时，SW480细胞的生长曲线下降最快，表明大量的癌细胞被裂解，在短短的3个小时癌细胞基本全部被裂解。
图11显示不同效靶比对UNKT杀伤肝癌细胞HepG2的影响。在没有加入UNKT之前，每个孔中的癌细胞（起始加入3万癌细胞）正常生长，各自的生长曲线持续升高，但是加入UNKT后，除了对照组HepG2细胞的生长曲线继续上升，其它处理组细胞的生长曲线开始回落。当E:T=4:1时，HepG2细胞的生长曲线下降最快，表明大量的癌细胞被裂解，在11个小时内癌细胞基本全部被裂解。
图12显示不同效靶比对UNKT杀伤卵巢癌细胞SKOV3的影响。在没有加入UNKT之前，每个孔中的癌细胞（起始加入3万癌细胞）正常生长，各自的生长曲线持续升高，但是加入UNKT后，除了对照组SKOV3细胞的生长曲线继续上升，其它处理组细胞的生长曲线开始回落。当E:T=4:1时，SKOV3细胞的生长曲线下降最快，表明大量的癌细胞被裂解，在11个小时内癌细胞基本全部被裂解。
图13显示不同效靶比对UNKT杀伤宫颈癌细胞CaSki的影响。在没有加入UNKT之前，每个孔中的癌细胞（起始加入3万癌细胞）正常生长，各自的生长曲线持续升高，但是加入UNKT后，除了对照组CaSki细胞的生长曲线继续上升，其它处理组细胞的生长曲线开始回落。当E:T=4:1时，CaSki细胞的生长曲线下降最快，表明大量的癌细胞被裂解，在8小时内癌细胞基本全部被裂解。
图14显示不同效靶比对UNKT杀伤胆管癌细胞RBE的影响。在没有加入UNKT之前，每个孔中的癌细胞（起始加入3万癌细胞）正常生长，各自的生长曲线持续升高，但是加入UNKT后，除了对照组RBE细胞的生长曲线继续上升，其它处理组细胞的生长曲线开始回落。当E:T=4:1时，RBE细胞的生长曲线下降最快，表明大量的癌细胞被裂解，在3小时内癌细胞基本全部被裂解。
图15显示不同效靶比对UNKT杀伤乳腺癌细胞MCF7的影响。在没有加入UNKT之前，每个孔中的癌细胞（起始加入3万癌细胞）正常生长，各自的生长曲线持续升高，但是加入UNKT后，除了对照组MCF7细胞的生长曲线继续上升，其它处理组细胞的生长曲线开始回落。当E:T=4:1时，MCF7细胞的生长曲线下降最快，表明大量的癌细胞被裂解，在4小时内癌细胞基本全部被裂解。
图16显示不同效靶比对UNKT杀伤子宫内膜癌细胞Ishikawa的影响。在没有加入UNKT之前，每个孔中的癌细胞（起始加入3万癌细胞）正常生长，各自的生长曲线持续升高，但是加入UNKT后，除了对照组Ishikawa细胞的生长曲线继续上升，其它处理组细胞的生长曲线开始回落。当E:T=4:1时，Ishikawa细胞的生长曲线下降最快，表明大量的癌细胞被裂解，11小时内癌细胞基本全部被裂解。
图17显示不同效靶比对UNKT杀伤前列腺癌细胞PC-3的影响。在没有加入UNKT之前，每个孔中的癌细胞（起始加入3万癌细胞）正常生长，各自的生长曲线持续升高，但是加入UNKT后，除了对照组PC-3细胞的生长曲线继续上升，其它处理组细胞的生长曲线开始回落。当E:T=4:1时，PC-3细胞的生长曲线下降最快，表明大量的癌细胞被裂解，14小时内癌细胞基本全部被裂解。
图18显示不同效靶比对UNKT杀伤食管癌细胞TE-1的影响。在没有加入UNKT之前，每个孔中的癌细胞（起始加入3万癌细胞）正常生长，各自的生长曲线持续升高，但是加入UNKT后，除了对照组TE-1细胞的生长曲线继续上升，其它处理组细胞的生长曲线开始回落。当E:T=4:1时，TE-1细胞的生长曲线下降最快，表明大量的癌细胞被裂解，4小时内癌细胞基本全部被裂解。
图19显示不同效靶比对UNKT杀伤膀胱癌细胞EJ-1的影响。在没有加入UNKT之前，每个孔中的癌细胞（起始加入3万癌细胞）正常生长，各自的生长曲线持续升高，但是加入UNKT后，除了对照组EJ-1细胞的生长曲线继续上升，其它处理组细胞的生长曲线开始回落。当E:T=4:1时，EJ-1细胞的生长曲线下降最快，表明大量的癌细胞被裂解，3小时内癌细胞基本全部被裂解。
图20显示不同效靶比对UNKT杀伤胶质瘤细胞U251的影响。在没有加入UNKT之前，每个孔中的癌细胞（起始加入3万癌细胞）正常生长，各自的生长曲线持续升高，但是加入UNKT后，除了对照组EJ-1细胞的生长曲线继续上升，其它处理组细胞的生长曲线开始回落。当E:T=4:1时，EJ-1细胞的生长曲线下降最快，表明大量的癌细胞被裂解，3小时内癌细胞基本全部被裂解。
图21显示不同效靶比对UNKT杀伤胰腺癌细胞PANC-1的影响。在没有加入UNKT之前，每个孔中的癌细胞（起始加入3万癌细胞）正常生长，各自的生长曲线持续升高，但是加入UNKT后，除了对照组PANC-1细胞的生长曲线继续上升，其它处理组细胞的生长曲线开始回落。当E:T=4:1和2:1时，PANC-1细胞的生长曲线快速下降，表明大量的癌细胞被裂解，5小时内癌细胞基本全部被裂解。
实施例5 小鼠模型验证ABL-01对肿瘤生长的抑制效果
利用小鼠模型，我们测试了UNKT的药效，药代和致瘤性。UNKT经过腹腔注射或尾静脉注射后，在体内存活时间为2天。将UNKT 在SCID小鼠皮下注射后，跟踪7个月也没有成瘤。将UNKT 在NCG小鼠皮下注射后，跟踪3个月也没有成瘤。
在药效实验中，我们把SKOV3细胞转入荧光素酶基因，这样就可以通过体内成像仪活体观察癌细胞的生长状况。荧光强度越高表明癌细胞越多。我们取10只小鼠同时腹腔注射50万SKOV3细胞，一周后（2020-08-28）小鼠分为2组，对照组5只不做治疗，测定并记录每只小鼠的荧光强度，同时拍照。处理组也有5只小鼠，也在同一时间记录荧光强度和拍照。处理组每只小鼠当天经腹腔注射100万UNKT细胞。每隔一天再注射同样数量的UNKT细胞，共注射3次。UNKT处理后7天后（2020-09-03），再测定每只小鼠的荧光强度并拍照。图22左图为对照组，5只小鼠荧光强度7天后均明显增强。右图为处理组，注射UNKT后其中4只小鼠荧光全部消失，仅一只小鼠还有微量荧光残留，即只有少量癌细胞存在。这些数据表明，在短短的7天时间内，UNKT可以有效地清除小鼠腹腔内的癌细胞。
实施例6 UNKT的衍生细胞具备更强的抗癌能力
我们利用靶向间皮素（MSLN）的单链抗体基因对UNKT进行基因修饰，构建的CAR-UNKT在体外和小鼠模型的测试中发现CAR-UNKT都比UNKT更有杀伤力，更有趣的时我们还发现CAR-UNKT的抗癌效果比CART更好。其实也不难理解，由于CAR-UNKT具有双重杀伤机制，一种时NKG2D受体介导的，另一种时CAR介导的，所以和UNKT和CART相比，CAR-UNKT的杀伤力时两者的叠加。
CAR分子的构建按照CAR-T中CAR分子的策略进行克隆，UNKT的加工主要利用慢病毒载体把CAR基因整合到NKT细胞的染色体中，MSLN-CAR分子的结构如图23A所示，包括EF-1α核心启动子、CD8 A前导体、MSLN scFv、CD8 A铰链、CD8 A TM，其次是共刺激4-1BB和CD3Z的细胞内结构域。MSLN scFv 来源于1998年ChowdhuryP.S.等发表的文献（P S Chowdhury, J L Viner, R Beers, I Pastan Isolation of a high-affinity stable single-chain Fv specific for mesothelin from DNA-immunized mice by phage display andconstruction of a recombinant immunotoxin with anti-tumor activity. Proc NatlAcad Sci U S A.1998 Jan 20; 95(2):669-74）。其中最重要的MSLN scFv的基因序列在SEQ ID No.2中显示，其它部分的序列参照常规技术。
用MSLN特异性CAR载体转导T和UNKT细胞以产生CAR-T和CAR-UNKT细胞。使用生物素化的人MSLN蛋白染色，通过细胞流式仪可以测定MSLN-CAR在活化的T和UNKT细胞上的表面表达。我们发现慢病毒感染后55.7%T细胞和46.7%的UNKT细胞为MSLN-CAR阳性（图23B，C）。该阳性率也得到了多个实验的证实，表明CAR-T和CAR-UNKT细胞可以特异性靶向MSLN（图23D，E）。蛋白质印迹结果进一步证实CAR序列在T细胞和UNKT细胞中被引入和表达（图23F）。
实施例7 CART、UNKT、CAR-UNKT抗癌效果比较
所有实验程序均经哈尔滨医科大学动物护理和使用委员会批准，并符合所有监管标准。雌性NCG小鼠（品系NO.T001475），4-5周龄，购自集萃药康生物公司（南京）。小鼠在特定的无病原体条件下进行维护和治疗，并在哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心（中国黑龙江）提供高压食物和水。对于异种移植测定，将5×105个SKOV-3-Luc细胞腹膜内注射到NCG小鼠中。注射后5天进行生物发光成像并将小鼠随机分为4组（n = 3）。NC为对照组，CAR-T处理组，UNKT处理组和CAR-UNKT处理组。PBS（NC）或2×106 CAR-T，UNKT或CAR-UNKT细胞悬液（200μL PBS）在第0，2和4天给药。在第6、14、21和28天使用锐珂医疗影像站系统（多模式专业光源，锐珂医疗公司，CA）进行生物发光成像，每3天测量一次体重。在实验结束后所有小鼠都被安乐死。
我们选择卵巢（SKOV-3）、乳腺癌（MCF-7）和肝脏（HUH-7）癌细胞系来评估MSLN-CAR-UNKT细胞体外的抗肿瘤作用。流式细胞术证实，除HUH-7外，所有细胞系均为MSLN阳性，SKOV-3在三个细胞中表达的MSLN水平最高（图24A）。此外，蛋白质印迹验证了结果。图24B细胞毒性测定显示，MSLN-CAR-UNKT细胞在同一剂量表现出比T，CAR-T和UNKT细胞更强的细胞毒性（图24C-H）。例如在1：4低比例的效靶比情况下，CAR-UNKT细胞的细胞毒性强于T，CAR-T和UNKT细胞（靶细胞为卵巢癌细胞SKOV3时，细胞毒性分别为84.12%、8.06%、16.52%和50.6%，p<0.0001；靶细胞为乳腺癌细胞MCF-7时，细胞毒性分别89.42%、0.68%、19.23%和41.13%，p<0.0001）。当对抗MSLN阴性肝癌细胞HUH-7时，CAR-UNKT细胞的细胞毒性与UNKT细胞相当，而CAR-T细胞与T细胞一样无细胞毒性。这些结果表明，CAR-UNKT细胞在体外对MSLN阳性癌细胞（SKOV-3，MCF-7）的细胞毒性高于UNKT和CAR-T细胞，而UNKT细胞比CAR-T细胞更具细胞毒性。在体外，CAR-UNKT的细胞毒性在裂解MSLN阴性癌细胞（HUH-7）时，其细胞毒性和UNKT细胞相当，两者都比CAR-T高。
为了比较T细胞，CAR-T细胞，UNKT细胞和CAR-UNKT细胞对卵巢癌的治疗效果，我们使用了SKOV-3 CDX小鼠模型（N = 3）。图25给出体内模型细胞治疗的实验结果。细胞治疗6天后，体内影像学检查显示NC对照组组肿瘤信号强度持续增高，CAR-T组肿瘤缩小但未消失，UNKT组和CAR-UNKT组肿瘤全部消除。细胞治疗14 天后，再次进行体内成像，结果显示NC组肿瘤信号持续增强，CAR-T组肿瘤信号增强，UNKT组肿瘤信号部分恢复，提示肿瘤有复发生长，而CAR-UNKT组肿瘤未复发。细胞治疗21 天后，NC组、CAR-T组和UNKT组肿瘤信号持续增强，CAR-UNKT组无肿瘤复发。治疗28 d后，NC、CAR-T和UNKT组肿瘤信号持续升高，CAR-UNKT组仍无肿瘤复发。结果表明，CAR-UNKT细胞在体内表现出比CAR-T和UNKT细胞更强的抗肿瘤效果。这也是第一次发现在实体瘤治疗中CAR-NKT的治疗效果超越了CAR-T的效果。
讨论：
CAR-T的技术已经比较成熟，在肿瘤免疫治疗，特别是血液肿瘤治疗方面效果显著。然而，随着CAR-T细胞疗法临床应用的显著成功，其存在的问题也逐渐显现。CAR-T细胞治疗存在的问题主要体现在以下三个方面：（1）细胞因子释放综合征（CRS），（2）脱靶效应，（3）抗原损失。此外，虽然CAR-T细胞对血液肿瘤有显著的治疗作用，但在实体瘤的治疗中很有限，原因如下：（1）肿瘤的异质性，CAR-T只能靶向某一特定的癌抗原；（2）CAR-T细胞需要穿透各种组织屏障才能到达肿瘤部位；（3）到达肿瘤部位的CAR-T细胞难以浸润到肿瘤中，受肿瘤免疫抑制微环境的影响，抑制其杀伤功能。我们已经获得了ABL-01这样的超级NKT细胞系，它同时表达NK和T细胞表面分子，同时结合了NK和T细胞的优势。它能够在体外和体内杀死肿瘤细胞。因此选择ABL-01细胞作为CAR修饰的效应细胞，有望提高对实体瘤的治疗效果。
多种人类癌症的较高存活率与体内NKT细胞的数量和功能有关。此外，这些细胞在体内活化时取得了优异的临床效果。在这项发明中，我们发现UNKT细胞可以在体外和体内杀死多种肿瘤细胞。然而，我们希望将UNKT细胞固有的抗肿瘤活性与CAR介导的特异性相结合，以进一步增强UNKT细胞的抗肿瘤活性。我们前期实验结果表明，UNKT细胞也可以被靶向CD19或Claudin18.2的CAR分子修饰，从而在UNKT内源性抗肿瘤活性的基础上增加CAR介导的抗肿瘤新机制。通过结合两种抗癌机制，即适应性和先天免疫力，我们可以提供一种新型的功能强大的抗癌药物。
MSLN是一种肿瘤相关抗原，在各种肿瘤群中高表达，但在正常组织中几乎不表达。目前，以MSLN为特异性靶点的靶向治疗未见严重不良反应。在本发明中，我们证明了UNKT细胞可以被靶向MSLN的慢病毒稳定转导，从而MSLN阳性肿瘤提供安全有效的细胞治疗手段。
首先，CAR-T细胞疗法的一个主要副作用是CRS。肿瘤患者输注CAR-T细胞后，CAR-T细胞在体内增殖活化，伴随着大量细胞因子的释放，过量的细胞因子会产生严重的不良反应。主要表现为高热、恶心、低血压和呼吸困难，这一过程中的关键细胞因子是IL-6。相比之下，我们转导CAR-UNKT细胞产生少量IL-6，明显少于转导的CAR-T细胞。同时，我们发现UNKT细胞具有很强的抗肿瘤作用，修饰后的UNKT对肿瘤细胞具有更强的杀伤作用。因此，在治疗小鼠腹部肿瘤的模型中，给予小鼠的免疫细胞较少，这将大大减少引起CRS的细胞因子的产生，并且CRS的风险将显着降低。癌症治疗中最重要的功能是转染细胞对肿瘤细胞的直接裂解活性。与CAR-T细胞相比，CAR-UNKT细胞产生的影响因子（如穿孔素和颗粒酶B）的量显着增加。总之，这些数据表明我们的CAR-UNKT细胞可能比传统CAR-T细胞更安全，更有效。
其次，CAR-T细胞疗法的另一个主要副作用是脱靶效应。CAR-T细胞强大的靶向性使其对抗原表达低的正常组织敏感，导致正常细胞死亡和脱靶效应。CD19-CAR-T细胞疗法在血液恶性肿瘤中取得了良好的临床效果，而健康CD19+细胞的损失可以通过静脉注射免疫球蛋白来补偿。但对于其他抗原，它可能更危险，如一项碳酸肝酶IX的临床试验所示，其中正常碳酸肝酶IX丢失会导致严重的抗原特异肝毒性。然而，这些症状的发展相对缓慢，可能需要数周到数月才能出现。我们对小鼠UNKT细胞药代动力学的研究表明，UNKT细胞在小鼠中的存活时间非常短，从而可以及时停止治疗以降低风险。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种NKT细胞，命名为ABL-01，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2023年1月11日，保藏编号为C202314。
2.根据权利要求1所述的NKT细胞，其特征在于，所述NKT细胞含有基因序列同源性等于或高于90%的SEQ ID NO.1所示的基因序列。
3.根据权利要求1所述的NKT细胞，其特征在于，所述NKT细胞来源于口腔癌术后康复的肿瘤患者的外周血。
4.权利要求1所述的NKT细胞的衍生细胞，其特征在于，将所述NKT细胞经过嵌合抗原受体修饰，构建CAR-UNKT细胞，即为所述衍生细胞。
5.根据权利要求4所述的衍生细胞，其特征在于，所述衍生细胞是利用靶向间皮素（MSLN）的单链抗体基因对NKT细胞进行基因修饰。
6.根据权利要求4所述的衍生细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括依序连接的EF-1α核心启动子、CD8 A前导体、MSLN scFv、CD8 A铰链、CD8 A跨膜结构域、共刺激域4-1BB和CD3Z的细胞内结构域。
7.根据权利要求4所述的衍生细胞，其特征在于，所述MSLN scFv基因序列为SEQ IDNO.2所示序列。
8.权利要求1所述的NKT细胞、权利要求4所述的衍生细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括卵巢癌、肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌、胆管癌、前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、皮肤癌、胶质瘤、膀胱癌、食管癌、纤维肉瘤、B淋巴细胞白血病或T淋巴细胞白血病。
10.一种NKT细胞，其含有如SEQ ID NO.1所示的基因序列，或者含有与该序列同源性等于或高于90%的基因序列。
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Non-Patent Citations (1)
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Also Published As
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