CN116370607A - 人重组hmgb1在制备治疗胶质瘤化疗增敏剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及的一种人重组HMGB1在制备治疗胶质瘤化疗增敏剂中的应用。本专利以胶质瘤为模型深入探究高迁移率族蛋白HMGB1在替莫唑胺治疗中的作用及机制，研究发现HMGB1在GB肿瘤微环境中发挥了重要作用，其对于提高替莫唑胺治疗敏感性，重塑肿瘤微环境以及激发抗肿瘤免疫反应具有重要的病理生理学意义；并且替莫唑胺与外源性重组HMGB1蛋白联合治疗可降低肿瘤增殖能力、促进凋亡坏死。本专利为治疗胶质母细胞瘤提供了一种新的思路，具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及的一种人重组HMGB1在制备治疗胶质瘤化疗增敏剂中的应用。
背景技术
胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GB)是最常见的原发恶性脑肿瘤，占脑恶性肿瘤的比例约为82％，发病率约为5.26/100,000，且有逐年递增的趋势。GB患者的预后差，中位生存期约12-14个月，五年生存率仅为4.7％。目前针对GB的治疗方式主要是肿瘤大部切除术后行局部放疗并伴6个周期替莫唑胺化疗，但未明显延长GB患者的总体生存期。GB仍是世界上最具挑战性的恶性肿瘤之一。因此，研发能够改善此病预后的新方法、新机制是目前研究的重点。
替莫唑胺是目前用于临床治疗GB的单功能烷基化剂，是一线临床用药，与单纯放疗相比，加用替莫唑胺改善了GB患者的总生存期和无进展生存期，但随着替莫唑胺的长期大量使用，其治疗敏感性逐渐下降，治疗抵抗性逐渐增强，因此开发更为有效的治疗手段显著提升患者预后是当前GB治疗的重点与难点。随着自噬在肿瘤的起源与发展中的作用被不断阐明与探索，这一神秘过程所扮演的角色也不断明确，因此研究者针对其促肿瘤作用开发了众多抑制靶点，并联合替莫唑胺协同治疗扩大其杀伤作用，如替莫唑胺联合自噬抑制剂氯喹与羟氯喹联合治疗，但临床实验结果表明其并没有显著提高患者生存期，并没有显著延长患者的生存期，因此针对目前治疗困境继续发展有效的治疗方式至关重要。
高迁移率族蛋白B1(High mobility group box 1，HMGB1)结构特殊，是无前导序列蛋白，也是一种高度保守的核蛋白，可作为结构性的染色质结合因子弯曲DNA起到维持染色质稳定的作用，越来越多的研究表明其具有特殊的功能，如在调节细胞间的相互作用，塑造肿瘤微环境，激活抗肿瘤免疫以及肿瘤微环境(Tumor microenvironment，TME)与炎症反应的关系中发挥重要作用。
James F.Curtin等人发现HMGB1在肿瘤微环境中作为配体与浸润的DC细胞表面TLR2相结合，并激活抗肿瘤免疫反应促进肿瘤的消退；Qun Gao等人的研究中发现非小细胞肺癌在紫杉醇的治疗下促进了HMGB1和CXCL11的分泌，并通过HMGB1-CXCL11轴诱导CD8+T细胞募集到肿瘤免疫微环境中，激活肿瘤免疫反应从而显著提高了抗肿瘤效果，且有助于提高NSCLC的治疗效果。以上研究表明，在肿瘤的治疗过程中HMGB1在肿瘤免疫微环境发挥了重要作用，因此针对其免疫调节作用开发相关治疗佐剂具有临床应用前景。
结合高迁移率族蛋白B1的特殊生物学特性，本研究认为高迁移率族蛋白B1在GB中的研究具有重要病理生理学意义，因此本专利以胶质瘤为模型深入探究高迁移率族蛋白HMGB1在替莫唑胺治疗中的作用及机制，试图为进一步提高替莫唑胺治疗效果，改善GB患者预后，提供新视角与理论基础。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种HMGB1在制备用于增强胶质母细胞瘤替莫唑胺治疗敏感性的增敏剂中的应用，本专利研究发现静脉应用重组HMGB1蛋白可提高胶质母细胞瘤经替莫唑胺治疗的敏感性。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
HMGB1在制备用于增强胶质母细胞瘤替莫唑胺治疗敏感性的增敏剂中的应用。
进一步，所述胶质母细胞瘤为原发性胶质母细胞瘤。
本发明的目的之二在于提供一种HMGB1在制备胶质母细胞瘤肿瘤微环境调控剂中的应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
HMGB1在制备胶质母细胞瘤肿瘤微环境调控剂中的应用。
进一步，所述HMGB1由分泌型自噬释放，分泌型自噬释放的HMGB1诱导肿瘤微环境中的TAM向M1样表型极化。
分泌型自噬释放的HMGB1蛋白可以诱导TME中的TAM向M1样表型极化，并使其分泌大量促炎细胞因子，可在一定程度上增强抗肿瘤免疫反应，使GB从一个“冷”肿瘤微环境向“热”肿瘤微环境转变以提高替莫唑胺治疗的敏感性。
本发明的目的之三在于提供一种HMGB1在制备用于促进GB肿瘤相关巨噬细胞分泌促炎细胞因子的促进剂中的应用
本发明的目的之四在于提供一种HMGB1联合替莫唑胺在制备用于降低肿瘤增殖能力、促进凋亡坏死的药物组合物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
HMGB1联合替莫唑胺在制备用于降低肿瘤增殖能力、促进凋亡坏死的药物组合物中的应用。
进一步，所述HMGB1优选为外源性人重组HMGB1蛋白。
进一步，所述替莫唑胺通过激活分泌型自噬释放HMGB1至肿瘤微环境中。
进一步，所述HMGB1与所述替莫唑胺联合应用促进凋亡相关蛋白Cleavedcaspase-3的表达。
本发明的目的之五在于提供一种用于治疗胶质母细胞瘤的药物组合物。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
用于治疗胶质母细胞瘤的药物组合物，所述药物组合物包括HMGB1和替莫唑胺。
进一步，所述胶质母细胞瘤为原发性胶质母细胞瘤。
进一步，所述HMGB1优选为外源性人重组HMGB1蛋白。
进一步，通过静脉注射外源性人重组HMGB1蛋白提高胶质母细胞瘤经替莫唑胺治疗的敏感性。
本发明的目的之六在于提供一种联合药物。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种联合药物，所述联合药物的活性成分为目的五所述的药物组合物。
进一步，所述联合药物还包含药学上可接受的辅料或载体。
进一步，所述药物剂型包括注射剂、胶囊剂。
本发明的有益效果在于：
本专利研究发现，分泌型自噬释放的HMGB1蛋白可以诱导TME中的TAM向M1样表型极化，并使其分泌大量促炎细胞因子，可在一定程度上增强抗肿瘤免疫反应，使GB从一个“冷”肿瘤微环境向“热”肿瘤微环境转变以提高替莫唑胺治疗的敏感性，进而提高替莫唑胺治疗效果；本专利为改善GB患者预后提供了新视角与理论基础。
附图说明
图1为CCK8法检测外源性HMGB1对U251细胞的作用的结果图，n＝6，ns＝无统计学差异；
图2为CCK8法检测外源性HMGB1对GB2细胞的作用的结果图，n＝6，ns＝无统计学差异；
图3为CCK8法检测外源性HMGB1联合替莫唑胺对U251细胞的作用的结果图，n＝6，ns＝无统计学差异；
图4为CCK8法检测外源性HMGB1联合替莫唑胺对GB2细胞的作用的结果图，n＝6，ns＝无统计学差异，**P<0.01；
图5为GEO数据库中数据集GSE84465中HMGB1受体TLR2、TLR4、TLR9、RAGE的mRNA表达水平的结果图；
图6为免疫荧光染色GB样本中肿瘤相关巨噬细胞上HMGB1受体TLR2、TLR4、TLR9、RAGE的共定位情况的结果图；标尺＝10μm；
图7为HMGB1增强替莫唑胺治疗的敏感性延长移植瘤小鼠生存期；其中，图7A-7B为小动物活体成像检测替莫唑胺联合rmHMGB1治疗GL261源性的C57BL/6移植瘤的效果图和统计分析结果图；图7C为Kaplan Meier生存分析替莫唑胺联合rmHMGB1治疗GL261源性的C57BL/6移植瘤的效果和统计分析结果图；(n＝8)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns＝无统计学差异；
图8为免疫荧光检测在不同处理组移植瘤中的Ki 67表达和定量统计分析结果图，***P<0.001；
图9为免疫荧光检测在不同处理组移植瘤中的Cleaved caspase-3表达并定量统计分析结果图，***P<0.001；
图10为免疫荧光检测GB样本中Cleaved caspase-3与HMGB1的共表达情况的结果图，***P<0.001。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案进行更进一步地清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。
本发明实施例中，样本来源如下：
收集的3例胶质母细胞瘤组织样本来自陆军军医大学第一附属医院生物样本库，为2019年5月-2022年10月的住院患者，年龄40～88岁，中位年龄58.5岁。入选标准：胶质瘤为原发，且患者行胶质瘤组织切除术前未行放化疗，术后标本经病理组织学检查证实为胶质瘤。排除标准：其他类型的肿瘤。本研究所使用样本均得到患者及其家属同意，且经陆军军医大学第一附属医院伦理委员会审查批准(批件编号：KY2020294)。
本发明实施例中，材料与试剂如下：
人胶质母细胞瘤细胞株U251购于美国典型培养物保藏中心(ATCC)；高糖DMEM培养基、胎牛血清均购于美国Gibco公司；青霉素、链霉素、胰酶购于HyClone公司；替莫唑胺购于Selleck公司；抗HMGB1、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗购于美国CST公司；CCK8试剂购于索莱宝公司；外源性人重组高迁移率族蛋白B1购于RD公司(No.1690-HMB-050)，外源性鼠重组高迁移率族蛋白B1购于义翘神州公司(Cat.50913-M01H)，C57小鼠购于陆军军医大学第一附属医院试验动物中心。HMGB1 gene bank编号：3146。
本发明实施例中，试剂和溶液的配制方法如下：
1.体外细胞培养
(1)DMEM完全培养基的配制方法：向500ml的DMEM基础培养基中加入50ml的胎牛血清(终浓度为10％)、5ml青/链霉素溶液(终浓度为1％)。
(2)PBS磷酸盐缓冲液的配制方法：PBS试剂(2L装)，将其溶解在去离子水中，定容至2L，并持续用玻璃棒搅拌，调整PH至7.2，置于4℃保存。
(3)细胞冻存液的配制方法：细胞培养用的澳洲胎牛血清(FBS)：二甲亚砜(DMSO)按90％：10％比例混合。
2.CCK8工作液的配制方法：每次根据所需孔板数配制CCK8工作液，将CCK8原液用培养基稀释为10％的工作液，注意避光，现配现用。
3.动物实验相关溶液的配制：
(1)替莫唑胺工作液的配制方法：配制终浓度为1mg/ml。其中配制体系为5％ DMSO+30％ PEG300+65％双蒸水；麻醉药物配制：称量2g水合氯醛，8g乌拉坦，定容于100ml双蒸水中，配好后使用0.22μm滤器保存于4℃；
(2)荧光素酶底物的配制方法：将一瓶完整未开封的荧光素酶底物用100ml的不含钙镁的D-PBS溶解充分，然后使用滤器过滤至干净的烧瓶中，分装保存于-20℃。
4.免疫荧光相关试剂的配制：
(1)PBS相关清洗溶液的配：PBS清洗液的配置方法为每袋PBS干粉使用2L双蒸去离子水溶解；PBST的配置方法为已配置好的PBS溶液加入0.5％的吐温20充分混匀。
(2)一抗溶液：使用绿色抗体稀释液或含山羊封闭血清的稀释液稀释相应抗体至相应的浓度。其中包括：HMGB1抗体(1:100)、LC3B抗体(1:100)。
(3)二抗溶液：使用抗体稀释液或含山羊封闭血清的抗体稀释液稀释相应抗体，稀释比例为1:5000。
(4)本章所用的抗体稀释配比如下IBA1抗体(1:100)稀释、TLR2抗体(1:200)稀释、TLR4抗体(1:100)稀释、TLR9抗体(1:100)稀释、RAGE抗体(1:100)稀释、HMGB1抗体(1:100)稀释、Ki 67抗体(1:100)稀释、Cleaved Casp-3抗体(1:400)稀释。
本发明实施例中，统计学分析：使用SPSS 22.0软件分析实验中获得的数据，用GraphPad 8.3软件制作实验数据生成的图片。两组样本间比较差异使用Student’s t-test检验，多组样本间差异比较使用ANOVA test方差分析，Kaplan-Meier生存曲线用于分析移植瘤小鼠生存时间。数据表达方式为均数±标准差，其中p<0.05被认为有统计学意义；ns＝无统计学差异；*代表p<0.05；**代表p<0.01；***代表P<0.001。
实施例1.人重组HMGB1蛋白体外试验处理GB细胞，对其生长无直接影响
1.细胞增殖试验(CCK-8法)步骤如下：
(1)处于对数生长期的GBM细胞用冷PBS清洗3次后，用Accutase酶消化下来，800rmp离心5min；
(2)用含有10％ FBS DMED培养基将GBM细胞重悬后，细胞计数，调至U251细胞10个/uL，GB2细胞15个/uL；
(3)将调整好数目的GBM细胞均匀铺入96孔板，每孔200uL；
(4)静置一晚，待96孔板中的细胞贴壁后加入不同浓度的外源性人重组高迁移率族蛋白B1(rhHMGB1)；
(5)连续培养96h，每24h测一次吸光度值；
(6)将CCK-8试剂与完全培养基按照1：9的比例配制成工作液，吸出96孔板中原有培养基后加入100uL CCK-8工作液；
(7)37℃孵育2h后，用Nanodrop 2000微量紫外分光光度计测定细胞在450nm处的吸光度OD值。
2.细胞毒性试验(CCK-8法)步骤如下：
(1)处于对数生长期的GBM细胞用冷PBS清洗3次后，用Accutase酶消化下来，800rmp离心5min；
(2)用含有10％ FBS DMED培养基将GBM细胞重悬后，细胞计数，调至U251细胞20个/uL，GB2细胞30个/uL；
(3)将调整好数目的GBM细胞均匀铺入96孔板，每孔200uL；
(4)静置一晚，待96孔板中的细胞贴壁后加入不同浓度的外源性人重组高迁移率族蛋白B1(rhHMGB1)与替莫唑胺共同处理；
(5)连续培养48h，将CCK-8试剂与完全培养基按照1：9的比例配制成工作液，吸出96孔板中原有培养基后加入100uL CCK-8工作液；
(6)37℃孵育2h后，用Nanodrop 2000微量紫外分光光度计测定细胞在450nm处的吸光度OD值。
结果：本实施例利用CCK-8法检测外源性HMGB1对GB细胞的作用，结果如图1-4所示，GB细胞U251与GB2在外源性添加HMGB1的重组蛋白后发现对其生无显著影响，不存在统计学意义，详见图1；当其在体外细胞试验联合替莫唑胺共同处理时也没有提高替莫唑胺的治疗效果，详见图2，因此外源性人重组HMGB1在体外试验中对GB细胞的生长并无直接促进或抑制作用。
实施例2.生信分析发现HMGB1受体主要表达于肿瘤相关巨噬细胞表面
通过分析癌症和肿瘤基因图谱(the cancer genome atlas，TCGA)生物数据库中已有的单细胞测序数据集(GSE84465)，发现HMGB1的下游受体TLR2、TLR4、TLR9、RAGE主要集中表达于肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages，TAM)表面，详见图5；并且本发明通过免疫荧光染色也证实了这一点，详见图6。结合实施例1中的结果，推测HMGB1发挥作用的下游效应细胞可能为肿瘤中浸润的巨噬细胞，且具有一定的特异性。本分析为实施例1的结论提供了强有力的数据支撑。
实施例3.静脉应用重组HMGB1蛋白可提高胶质母细胞瘤经替莫唑胺治疗的敏感性
肿瘤治疗效果与肿瘤微环境有密切的相关性，GB肿瘤微环境包括多种成分，主要有肿瘤实质细胞、可溶性因子、血管以及浸润的免疫细胞。研究表明，在TME浸润的大量免疫细胞中，TAMs占据明显优势，TAMs在功能上可分为肿瘤支持型(M2型)巨噬细胞和肿瘤抑制型(M1型)巨噬细胞。M1型TAMs具有免疫监测功能，可以协同抗肿瘤免疫反应；M2型TAMs通常具有免疫抑制作用，并促进GB恶性行为、促进肿瘤生长，最近Leila等人的研究表明集落刺激因子受体抑制剂(CSF-1R)靶向GB微环境中的TAM并联合放疗可以显著提高肿瘤模型的生存期。因此如何使GB中浸润的大量TAM向M1型转化是肿瘤治疗中的一个新思路。
鉴于在体外试验中HMGB1表现出的使巨噬细胞向M1表型极化的作用，假设HMGB1或许在GB肿瘤微环境中发挥重要作用来增强抗肿瘤免疫反应。为了明确HMGB1在GB进展中的作用，本实施例构建了GL261源性的小鼠原位移植瘤模型，分别设置了对照组(Ctrl)、替莫唑胺治疗组(TMZ)、外源性HMGB1治疗组(rmHMGB1)、以及联合治疗组(TMZ+rmHMGB1)，从第8天开始连续静脉给药5天。
小鼠原位移植瘤模型的构建方法如下：
(1)首先选取年龄为4-6周的小鼠进行实验，控制其体重在18-22g之间；
(2)收集进行移植瘤的肿瘤细胞，将其制成单细胞悬液，然后调整其浓度为50000个/25μl后装入离心管中暂存；
(3)使用已配制好的麻醉药物将小鼠麻醉，麻药用量为(小鼠体重×8+10)μl，待小鼠完全昏迷后实施操作；
(4)首先用专用剃毛器将小鼠的颅顶的毛发剃净，然后用胰岛素针将重悬好的单细胞悬液注入小鼠颅内(约5万个细胞)，位置在两眼外眦连线中点向后向右各3mm处，注射完毕后停针30s，然后缓慢将胰岛素针拔起；
(5)使用医用粘合胶将小鼠的颅顶皮肤粘合，并将其置于头高脚低位，减轻麻醉带来的副作用；
(6)将荷瘤小鼠分为4组，分别为对照组、替莫唑胺治疗组、外源性HMGB1治疗组、联合治疗组；并在荷瘤后第七天开始给予其治疗连续五天，替莫唑胺剂量为5mg/kg/天、外源性HMGB1剂量为50μg/kg/天；并分别在7、14、21天进行小动物活体成像拍照记录；
(7)当移植瘤小鼠出现明显的神经系统症状时将其安乐死并统计生存期，并取移植瘤进行下一步实验。
结果：如图7所示，小动物活体成像结果显示rmHMGB1显著增强了TMZ的抗肿瘤效果，与对照组相比显著抑制了移植瘤的生长，详见图7A和图7B，同时rmHMGB1延长了小鼠总体生存期，详见图7C。然而rmHMGB1单独治疗对肿瘤的生长影响甚微，因此这也提示TMZ在GB治疗中的重要作用。
本实施例的研究结果表明，分泌型自噬释放的HMGB1蛋白可以诱导TME中的TAM向M1样表型极化，并使其分泌大量促炎细胞因子，可在一定程度上增强抗肿瘤免疫反应，使GB从一个“冷”肿瘤微环境向“热”肿瘤微环境转变以提高替莫唑胺治疗的敏感性。由此可见，HMGB1在GB肿瘤微环境中发挥了重要作用，其对于提高替莫唑胺治疗敏感性，重塑肿瘤微环境以及激发抗肿瘤免疫反应具有重要的病理生理学意义。
实施例4.替莫唑胺与外源性重组HMGB1蛋白联合治疗可降低肿瘤增殖能力、促进凋亡坏死
免疫荧光染色方法如下：
(1)将处理好的组织样本使用切片机切片处理，得到8μm的冰冻切片；
(2)将切片置于冰丙酮溶液中进行固定10min，将切片取出后至于-20℃冰箱中冷冻保存；
(3)用已配置好的1ml PBS缓冲液冲洗冰冻切片，重复三次；
(4)将已置于常温的4％多聚甲醛加入洗脱盒当中，室温固定20分钟；
(5)将多聚甲醛吸弃，然后用1ml PBS缓冲液冲洗三次；
(6)将含有曲拉通X-100的山羊封闭血清加入共聚焦小皿中，37℃，封闭30分钟；
(7)1ml PBS缓冲液冲洗三次后，加入事先已配置好的一抗工作液，4℃孵育过夜；
(8)37℃复温30分钟，后将小皿用PBS缓冲液冲洗3次；
(9)将配制好的二抗工作液在避光条件下滴加入小皿中，37℃孵育30分钟；
(10)将小皿用PBS缓冲液冲洗3次，加入DAPI染液，室温染色5分钟；
(11)使用中性树脂封片处理，同时在避光孵育盒中；
(12)使用共聚焦显微镜采集图像，每张切片采集视野不少于10个。
结果：通过对不同处理组中的移植瘤进行免疫荧光染色Ki67发现，联合治疗组(TMZ+rmHMGB1)相较于其他处理组显示出更低的Ki67比例，说明其增殖能力明显减弱，与此同时联合治疗组中的凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3的表达水平明显增加，表明联合治疗显著增加了凋亡坏死水平。此外，本实施例还通过免疫荧光染色经TMZ治疗后GB样本中Cleaved caspase-3与HMGB1的关系，结果表明在胞外HMGB1富集的区域，Cleaved caspase-3的表达也明显增加，这也说明HMGB1在体内与促进凋亡坏死相关，详见图8-图10。
Claims (10)
1.HMGB1在制备用于增强胶质母细胞瘤替莫唑胺治疗敏感性的增敏剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述胶质母细胞瘤为原发性胶质母细胞瘤。
3.HMGB1在制备胶质母细胞瘤肿瘤微环境调控剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述HMGB1由分泌型自噬释放，分泌型自噬释放的HMGB1诱导肿瘤微环境中的TAM向M1样表型极化。
5.HMGB1在制备用于促进GB肿瘤相关巨噬细胞分泌促炎细胞因子的促进剂中的应用。
6.HMGB1联合替莫唑胺在制备用于降低肿瘤增殖能力、促进凋亡坏死的药物组合物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述替莫唑胺通过激活分泌型自噬释放HMGB1至肿瘤微环境中。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述HMGB1与所述替莫唑胺联合应用促进凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3的表达。
9.用于治疗胶质母细胞瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括HMGB1和替莫唑胺。
10.一种联合药物，其特征在于，所述联合药物的活性成分为权利要求9所述的药物组合物。
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| CA3063715A1 (en) * | 2017-05-18 | 2018-11-22 | Tesaro, Inc. | Combination therapies for treating cancer |
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- 2023-03-20 CN CN202310268993.XA patent/CN116370607A/zh active Pending
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ZHUANG LI等: "Autophagy-based unconventional secretion of HMGB1 in glioblastoma promotes chemosensitivity to temozolomide through macrophage M1-like polarization", J EXP CLIN CANCER RES, vol. 41, no. 1 * |
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