CN116370362A

CN116370362A - 白参菌-三七发酵物、其美容产品和应用

Info

Publication number: CN116370362A
Application number: CN202111432204.9A
Authority: CN
Inventors: 刘平平; 霍彤; 鹿发展; 安全; 王昌涛; 石秀芹; 杨杨; 吴迪
Original assignee: Yunnan Baiyao Group Health Products Co ltd; Yunnan Baiyao Group Shanghai Technology Co ltd; Beijing Technology and Business University
Current assignee: Yunnan Baiyao Group Health Products Co ltd; Yunnan Baiyao Group Shanghai Technology Co ltd; Beijing Technology and Business University
Priority date: 2021-11-29
Filing date: 2021-11-29
Publication date: 2023-07-04

Abstract

本发明提供了一种白参菌‑三七发酵物、其美容产品和应用。所述白参菌‑三七发酵物由白参菌种子菌液与三七混合发酵得到。还提供了一种美容产品在制备用于延缓皮肤衰老的产品中的应用。本发明的白参菌‑三七发酵物在细胞中的安全浓度在1.25％及以下时，对成纤维细胞无刺激性，同时还可以增加成纤维细胞中胶原蛋白含量。

Description

白参菌-三七发酵物、其美容产品和应用

技术领域

本发明属于化妆品领域，涉及一种白参菌-三七发酵物、其美容产品和应用。

背景技术

白参菌(Schizophyllum commune Fr.)别名树花、裂褶菌、白花等。人们对白参菌的食用及药用价值研究较为透彻，其作为一种食药兼用菌，有很高的食用及药用价值，在食用价值方面，其菌菇质嫩，味美，且含锌、铁、钾、钙等微量元素及人体必须的8种氨基酸，营养丰富；在药用价值方面，其性平、味甘、有清肝明目、滋补强身的功效，而未有人发现白参菌在化妆品方向的价值。

发明内容

因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种白参菌-三七发酵物、其美容产品和应用。

在阐述本发明内容之前，定义本文中所使用的术语如下：

术语“PDA培养基”是指：马铃薯葡萄糖琼脂培养基。

术语“MTT”是指：噻唑蓝。

术语“Dextran”是指：葡聚糖，又名右旋糖酐。

术语“PBS”是指：磷酸盐缓冲盐溶液。

术语“DMEM培养液”是指：含各种氨基酸和葡萄糖的培养液。

白参菌本身含多种功效物质，且含有多种酶，如酯酶、纤维素酶。以白参菌为菌种对物质进行发酵，发酵产物中会兼具白参菌及底物的功效成分，且在白参菌作用下，新的功效物质会生成，发酵物会兼具多种美肤功效。但目前并没有以白参菌为菌种对物质进行发酵制备化妆品原料研究其延缓皮肤衰老功效。

为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种白参菌-三七发酵物，其特征在于，所述白参菌-三七发酵物由白参菌种子菌液与三七混合发酵得到，所述发酵提取物通过以下方法制备：

(1)制备白参菌种子菌液；

(2)将三七切片，烘干后进行物理粉碎，过筛得到三七粉；

(3)将步骤(2)中三七与大米、水混合，煮熟晾凉后进行高温灭菌；

(4)在步骤(3)得到的料体中加入(1)中的种子菌液，进行发酵，放置于恒温恒湿培养箱中；

(5)将步骤(4)所得发酵物与水混合，加热搅拌，然后将所得提取物离心取上清液，即得所述白参菌-三七发酵物。

根据本发明第一方面的白参菌-三七发酵物，其中，在步骤(2)中：

所述烘干的温度为30～70℃，优选为35～60℃，更优选为40～55℃，最优选为50℃；和/或

所述过筛的筛子为80～270目，优选为100～230目，更优选为120～170目，最优选为140目。

根据本发明第一方面的白参菌-三七发酵物，其中，步骤(3)中：

所述三七与大米与水的比例为1:50～250:250～550g/g，优选为1:50～200:250～500g/g，更优选为1:50～200:300～550g/g，进一步优选为1:100～150:350～450g/g；

所述灭菌温度为90～135℃，优选为92～125℃，更优选为100～120℃，进一步优选为100℃；和/或

所述灭菌时间为0.1～3h，优选为0.3～2.5h，更优选为0.8～2h，进一步优选为1h。

根据本发明第一方面的白参菌-三七发酵物，其中，步骤(4)中：

所述料体与种子菌液的比例为3～30:1g/mL，优选为5～25:1g/mL，更优选为8～25:1g/mL，最优选为25:1g/mL；

所述培养温度为20～35℃，优选为22～30℃，更优选为23～25℃，进一步优选为24℃；

所述培养湿度为55～90％，优选为60～85％，更优选为70％～80％，进一步优选为75％；和/或

所述培养时间为4～30天，优选为10～25天，更优选为12～25天，进一步优选为20～25天。

根据本发明第一方面的白参菌-三七发酵物，其中，步骤(5)中：

所述发酵物与水的比例为1:1～20，优选为1:5～15，更优选为1:10～12，进一步优选为1:11；

所述高温为80～120℃，优选为85～115℃，更优选为90～110℃，进一步优选为100℃；

所述搅拌速率为300～1500r/min，优选为500～1300r/min，更优选为700～1100r/min，进一步优选为1000r/min；

所述搅拌时间为0.3～4h,优选为1～3.5h，更优选为1.5～3h，最优选为2.5h；

所述离心转速为100～10000rad/min，优选为300～7000rad/min，更优选为500～5000rad/min，最优选为4000rad/min；和/或

所述离心时间为0.1～3h，优选为0.3～2.5h，更优选为1～2.3h,最优选为2h。

根据本发明第一方面的白参菌-三七发酵物，其中，步骤(1)制备白参菌种子菌液的操作包括：

取平板培养基上的白参菌种于冷却后的培养基中培养2～7天，后将其以匀浆器磨碎，将磨碎所得菌液加入冷却后的培养基中，培养2～7天，得发酵所需的种子菌液；

优选地，所述培养基均为PDA培养基。

本发明的第二方面提供了一种美容产品，所述美容产品包括第一方面所述的白参菌-三七发酵物；

优选地，所述美容产品的剂型选自以下一种或多种：膏霜、乳液、水剂、凝胶、油剂、粉剂、泥、气雾剂、贴、膜。

根据本发明第二方面的美容产品，其中，所述美容产品为美容液、精华液或面膜液。

根据本发明第二方面的美容产品，其中，当所述美容产品为面膜液时，其进一步包含以下一种或多种成分：葛根、植物油、甜菜碱；

优选地，所述植物油选自以下一种或多种：橄榄油、青刺果油、澳洲坚果油、巴巴苏籽油、牡丹花籽油。

本发明的第三方面提供了第一方面所述的白参菌-三七发酵物或第二方面所述的美容产品在制备用于延缓皮肤衰老的产品中的应用。

本发明的白参菌-三七发酵物可以具有但不限于以下有益效果：

1、本发明的白参菌-三七发酵物在细胞中的安全浓度在1.25％及以下时，对成纤维细胞无刺激性。

2、本发明的白参菌-三七发酵物可以增加成纤维细胞中胶原蛋白含量。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1示出了实施例3的未发酵原料的多肽分子量分布图。

图2示出了实施例3的白参菌-三七发酵物的多肽分子量分布图。

图3示出了实施例3的未发酵原料的多糖分子量分布图。

图4示出了实施例3的白参菌-三七发酵物的多糖分子量分布图。

图5示出了试验例1的不同浓度发酵物原料对成纤维细胞增殖的影响。

图6示出了试验例2的不同浓度发酵物原料对I型胶原蛋白的影响。

具体实施方式

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

以下实施例中使用的试剂和仪器如下：

材料：

大米，购自中粮建三江米业有限公司；

成纤维细胞，购自赛百慷(上海)生物技术股份有限公司。

试剂：

PDA培养基，购自北京拜尔迪生物科技有限公司；

含MTT的培养液，购自ScienCell公司；

I型胶原蛋白(CoL-I)测试盒检，购自南京建成生物工程研究所。

仪器：

玻璃匀浆器，5mL，购自北京拜尔迪生物科技有限公司；

恒温恒湿培养箱型号，型号HWS-250B，购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂；

数显测速电动搅拌器，型号JJ-1A，购自常州荣华仪器制造有限公司；

水浴锅，型号HHS-11-2，购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂；

高效液相色谱仪(配2487紫外检测器和Empower工作站GPC软件)，型号Waters1525，购自赛默飞世尔科技公司；

高效液相色谱仪(配2410示差折光检测器和Empower工作站)，型号Waters 1525，购自赛默飞世尔科技公司。

实施例1:

本实施例用于说明本发明的一个具体示例性白参菌-三七发酵物和未发酵原料的制备方法。

本实施例的制备方法具体包括以下步骤：

1.制备白参菌种子菌液：

(1)将PDA培养基与水按质量比2.6:100混合，高温灭菌后取出冷却至室温。

(2)取PDA平板培养基上的白参菌种于冷却后的培养基中培养5天，然后将其以匀浆器磨碎，将磨碎所得菌液加入冷却后的PDA培养基中，培养5天，得到发酵所需的白参菌种子菌液。

2.原料处理：

新鲜三七洗净切片，50℃烘箱中烘干，粉碎后140目过筛备用。

3.制备白参菌-三七发酵物：

(1)将三七粉与大米与水按质量比为1:150:450的比例混合，煮熟晾凉后100℃灭菌1h。

(2)将步骤(1)所得混合物与白参菌种子菌液按20:1g/mL的比例混合，于温度为24℃，湿度为75％的恒温恒湿培养箱中培养20天得到发酵物。

(3)将步骤(2)中培养物取出与水按1:10g/mL的比例混合，100℃加热，1000r/min搅拌1.5h，然后以3500rad/min离心取上清液，即得所述白参菌-三七发酵物。

4.制备未发酵原料：未发酵原料制备步骤同2和3，与制备白参菌-大米发酵提取物步骤的区别在于未发酵原料的步骤中不添加白参菌种子菌液。

实施例2：

本实施例用于说明本发明另一个具体示例性的白参菌-三七发酵物的制备方法。

本实施例的制备方法具体包括以下步骤：

1.制备白参菌种子菌液：

2.原料处理：

3.制备白参菌-三七发酵物：

(1)将三七粉与大米与水按质量比为1:100:350的比例混合，煮熟晾凉后100℃灭菌1h。

(2)将步骤(1)所得混合物与白参菌种子菌液按25:1g/mL的比例混合，于温度为24℃，湿度为75％的恒温恒湿培养箱中培养25天得到发酵物。

(3)将步骤(2)中培养物取出与水按1:5g/mL的比例混合，100℃加热，800r/min搅拌1.5h，然后以4000rad/min离心取上清液，即得所述发酵原料。

表1白参菌-三七发酵物的添加比例及培养天数表

实施例3:

本实施例用于说明实施例1中制得的未发酵原料与白参菌-三七发酵物中的活性物质含量的变化及差异。

1.多肽分子量检测

(1)色谱条件：

色谱柱：TSKgel 2000SWXL 300mm×7.8mm；

波长：UV220nm；

流动相：乙腈/水/三氟乙酸，45/55/0.1(V/V)；

柱温：30℃

流速：0.5ml/min；

分子量校正曲线所用标准品：细胞色素C(MW12384)；抑肽酶(Mw6500)；杆菌肽(MW1422)；乙氨酸－乙氨酸－酪氨酸－精氨酸(MW451)；乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸(MW189)。

(2)标准曲线的绘制

将标准样品按5mg/ml配制，按照上述色谱条件制作标准曲线，采用最小二乘法，求出直线回归方程为：Y＝7.03–0.24T，R²＝0.986839。

关系式中T代表洗脱时间，Y代表分子量对数。这样当样品进行GPC分析时，即可通过洗脱图谱中每种物质洗脱峰的出现时间计算其对应的分子量。

(3)样品的处理与测定

a.样品处理：样品以滤膜过滤。

b.样品测定：用测定标准系列的操作条件测定实施例1制得的白参菌-三七发酵物和未发酵原料，根据出峰时间及峰面积，由标准曲线测得白参菌-三七发酵物和未发酵原料中多肽的分子量及占比。

表2未发酵原料与白参菌-三七发酵物的多肽分子量分布

由图1及表2可知：未发酵原料中，分子量为12630Da的多肽含量为6.89％，分子量为7271Da多肽含量为14.89％，分子量为4130Da的多肽含量为12.29％，分子量为2480Da的多肽含量为5.52％，分子量为1475Da的多肽含量为8.00％，分子量为744Da的多肽含量为4.79％，分子量为283Da的多肽含量为10.02％，分子量为114Da的多肽含量为37.41％。

由图2及表2可知白参菌-三七发酵物中，分子量为11947Da的多肽含量为0.14％，分子量为6820Da的多肽含量为0.93％，分子量为3893Da的多肽含量为1.75％，分子量为2442Da的多肽含量为1.96％，分子量为1397Da的多肽含量为5.7％，分子量为696Da的多肽含量为9.45％，分子量为261Da的多肽含量为42.56％，分子量为91Da的多肽含量为38.04％。

结果表明：与未发酵原料相比，白参菌发酵所得的原料中，分子量为1000Da以下的多肽占比显著增加，且整体的分子量都有降低趋势，由此说明，白参菌发酵能够将大米中的高分子量多肽降解为较低分子量多肽，说明本发明实施例1所制得的白参菌-三七发酵物有降低多肽分子量的效果。

2.多糖分子量检测

(1)色谱条件：

色谱柱：Ultrahydrogel^TMLinear 300mm×7.8mmid×2；

流动相：0.1N硝酸钠；

柱温：45℃

流速：0.9ml/min；

分子量校正曲线所用标准品：Dextran T-2000(MW2000000)；Dextran T-300(MW300600)；DextranT-150(MW135030)；Dextran T-10(MW9750)；Dextran T-5(MW2700)；葡萄糖180。

(2)标准曲线的绘制

将标准样品按5mg/ml配制，按照上述色谱条件制作标准曲线，采用最小二乘法，求出直线回归方程为：Y＝13.2–0.516T，R²＝0.995704。

(3)样品的处理与测定

a.样品处理：样品以滤膜过滤。

b.样品测定：用测定标准系列的操作条件测定实施例1制得的白参菌-三七发酵物和未发酵原料，根据出峰时间及峰面积，由标准曲线测得白参菌-三七发酵物和未发酵原料中多糖的分子量分布及占比。

由图3及表3可知：未发酵原料中，分子量为3130333Da的多糖含量为88.95％，分子量为560Da多糖含量为11.05％。

由图4及表3可知白参菌-三七发酵物中，分子量为39436657Da的多糖含量为0.96％，分子量为773064Da的多糖含量为6.14％，分子量为13050Da的多糖含量为26.28％，分子量为258Da的多糖含量为66.62％。

结果表明：与未发酵原料相比，白参菌-三七发酵物中增加了分子量为500Da以下多糖。由此说明，白参菌发酵可将高分子量多糖降解为较低分子量多糖，说明本发明实施例1所制得的白参菌-三七发酵物有降低多糖分子量的效果。

表3实施例1中未发酵原料与白参菌-三七发酵物多糖分子量分布情况

试验例1

本试验例用于说明实施例1所制备白参菌-三七发酵物对成纤维细胞增殖的影响。

本试验例的对成纤维细胞增殖的影响通过对成纤维细胞毒性实验(MTT)的检测实现的，检测方法具体包括以下步骤：

(1)收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μL(96孔板),铺板使待测细胞调密度至5000个/孔，(边缘孔用无菌PBS填充)，5％CO₂，37℃孵育，至细胞生长至一定密度，换液加入不同浓度梯度的待测样品，以不含待测药品的培养液为对照。

(2)5％CO₂，37℃孵育24小时，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL，即0.5％MTT四唑盐)，继续培养4h。使药物与MTT充分反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。终止培养，小心吸去孔内培养液。

(3)每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD值490nm处测量各孔的吸光值。通过公式计算出细胞活率。

细胞活率＝(测定孔OD值-空白对照OD值)/(细胞对照组OD值-空白对照OD值)*100％。

结果：对比样品不同浓度梯度的试验结果，考察不同浓度的面膜液对成纤维细胞的毒性，结果如图2所示，当白参菌-三七发酵物原料浓度高于1.25％时，对成纤维细胞有刺激性，而0.15％.至1.25％的白参菌-三七发酵物作用于成纤维细胞后，在此浓度范围内细胞存活率均高于80％，说明白参菌-三七发酵物在此浓度下对成纤维细胞无毒，即本发明的白参菌-三七发酵物在细胞中的安全浓度为1.25％及以下。

试验例2

本试验例用于说明实施例2所制备白参菌-三七发酵物对成纤维细胞胶原蛋白含量的影响。

本试验例中采用南京建成生物工程研究所I型胶原蛋白(CoL-I)测试盒检测成纤维细胞中胶原蛋白的含量。

具体步骤如下：

(1)取对数生长期状态良好的人成纤维细胞计数并接种于6cm培养皿中，控制每皿细胞数2×10⁵个细胞。

(2)在37℃，5％CO₂环境下培养过夜，弃培养基，加入不同浓度的样品作用细胞6小时(模型组以及空白对照组加入无血清DMEM培养液)，加入少量1mL的PBS(pH＝7.4)以刚好覆盖细胞为宜，以UVA刺激细胞，UV辐射量为7J/cm²，照射时间2h，空白组不照射。每个样品做三个平行(每个平行样品检测三次结果)，取出，置于冰上，PBS洗涤2次。

(3)加入500μL裂解液裂解细胞，12000rmp 4℃下离心5min，取上清得到细胞裂解上清液。上清液中CoL-I的含量测定参考ELISA试剂盒检测步骤，结果以BCA含量校正。

(4)ELISA试剂盒检测步骤：

a.实验准备用标准品稀释液将标准品冻干粉定容至150μl(160ng/ml)，然后混匀30s。取五只干净的EP管，每管加150μl标准品稀释液，分别标记上80ng/ml，40ng/ml，20ng/ml，10ng/ml，5ng/ml。取150μl标准品原液加入标记为80ng/ml的管中，混匀后同样取出150μl，加入下一管，以此类推至最后一管。(零孔直接加标准品稀释液)将浓缩型生物素抗原于6000-10000rpm离心30s，然后取生物素抗原稀释液1ml到浓缩型生物素抗原中，混匀15s至完全溶解，然后将所有液体倒入稀释液瓶中，混匀即为生物素抗原工作液。将浓缩型生物素抗原于6000-10000rpm离心30s，将浓缩亲和素-HRP全部转移到稀释液瓶中，混匀后即为亲和素-HRP工作液。

b.样品处理：将试剂盒中25倍浓缩液倒入500ml容量瓶中，用蒸馏水定容至500ml即为工作液。洗板方法：先吸去酶标孔中的液体，在吸水纸上拍干，每孔加入300μl洗涤液，轻轻摇晃30s，然后甩掉，在吸水纸上拍干，重复4-5次。

c.使用前将试剂盒在室温下平衡半个小时，空白孔不加样，只加显色剂A，B和终止液用于调零。

d.标准品孔和样品孔：每孔加入稀释好的标准品50μl，零孔加入标准品/样品稀释液50μl，然后加入生物素抗原工作液50μl。样品孔：加入样品50μl，然后加入生物素抗原工作液50μl。轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育30min。

e.将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水25倍稀释后备用。第一次洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加入200μl洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，排干。加入50μl亲和素-HRP到标准品孔和样品孔中，轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育30min。第二次洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。

f.显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。每孔加终止液50μl终止反应(此时蓝色立转黄色)

g.测定：以空白孔调零，450nm波长依次测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在终止液后10min内进行。

h.计算：根据浓度和OD值算出标准曲线和回归方程，用专用软件进行计算，拟合模型选用logistic曲线(四参数)。标曲示意图如下表4所示：

表4标曲示意图

浓度

Blank

S5

S4

S3

S2

S1

S0

OD值

VB

V5

V4

V3

V1

V0

校准值

VB-VB

V5-VB

V4-VB

V3-VB

V2-VB

V1-VB

V0-VB

结果如图3所示，发酵物原料对成纤维细胞内胶原蛋白含量的影响测试结果为：空白组CoL-I含量处于较高状态，模型组CoL-I含量显著低于空白组的CoL-I含量，说明建模成功，1％、0.5％的发酵物处理建模后的细胞，CoL-I含量较模型组有显著增加。，模型组是只通过UVA照射、未添加样品的细胞组，空白组为未照射且未添加样品的细胞组，阳性对照组为UVA照射后，添加阳性对照样品的细胞组(阳性对照样品中添加VC，VC浓度为1g/L),发酵物原料在试验浓度下，1％及0.5％的浓度都可增加成纤维细胞中的CoL-I的分泌，且当发酵物原料浓度为1％时，其促进作用优于1g/L的阳性对照VC，表明本发明的白参菌-三七发酵物作用于UVA照射后的成纤维细胞后，可以对成纤维细胞有一定的修护作用，降低照射对成纤维细胞的影响，有潜在的皮肤抗衰老功效。

尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims

1.一种白参菌-三七发酵物，其特征在于，所述白参菌-三七发酵物由白参菌种子菌液与三七混合发酵得到，所述发酵提取物通过以下方法制备：

(1)制备白参菌种子菌液；

(2)将三七切片，烘干后进行物理粉碎，过筛得到三七粉；

(4)在步骤(3)得到的料体中加入(1)中的种子菌液，进行发酵；放置于恒温恒湿培养箱中；

2.根据权利要求1所述的白参菌-三七发酵物，其特征在于，在步骤(2)中：

3.根据权利要求1或2所述的白参菌-三七发酵物，其特征在于，步骤(3)中：

4.根据权利要求1至3中任一项所述的白参菌-三七发酵物，其特征在于，步骤(4)中：

5.根据权利要求1至4中任一项所述的白参菌-三七发酵物，其特征在于，步骤(5)中：

6.根据权利要求1至5中任一项所述的白参菌-三七发酵物，其特征在于，步骤(1)制备白参菌种子菌液的操作包括：

优选地，所述培养基均为PDA培养基。

7.一种美容产品，其特征在于，所述美容产品包括根据权利要求1至7中任一项所述的的白参菌-三七发酵物；

8.根据权利要求7所述的美容产品，其特征在于，所述美容产品为美容液、精华液或面膜液。

9.根据权利要求8所述的美容产品，其特征在于，当所述美容产品为面膜液时，其进一步包含以下一种或多种成分：葛根、植物油、甜菜碱；

10.根据权利要求1至6中任一项所述的白参菌-三七发酵物或根据权利要求7至9中任一项所述的美容产品在制备用于延缓皮肤衰老的产品中的应用。