CN116368149A - 重组胰岛素样生长因子i的制造方法 - Google Patents
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Abstract
作为用于相对于错误折叠的重组胰岛素样生长因子I(rIGF‑1)以高纯度获得正确折叠的rIGF‑1的得到改善的方法，提供一种重组胰岛素样生长因子I(rIGF‑1)的制造方法，包括如下的工序：(1)将rIGF‑1作为与泛素样蛋白SUMO(小分子泛素相关修饰物)的融合蛋白(SUMO‑IGF‑1)而获得的工序，(2)利用SUMO蛋白酶对SUMO‑IGF‑1进行处理的工序，(3)将工序(2)的处理液应用于阳离子交换色谱，通过梯度洗脱得到含有rIGF‑1的洗脱液的工序。
Description
技术领域
本发明涉及重组胰岛素样生长因子I(rIGF-1)的制造方法。
背景技术
使用大肠杆菌的重组蛋白质的生产存在所表达的蛋白质的不溶化和错误折叠的问题。关于重组胰岛素样生长因子I(rIGF-1)，为了应对不溶化的问题，报告了使rIGF-1表达为与泛素样蛋白SUMO(小分子泛素相关修饰物)的融合蛋白(SUMO-rIGF-1)的技术(参照非专利文献1)。另外，为了将正确折叠的rIGF-1与错误折叠的rIGF-1分离，使用反相高效液相色谱(HPLC)(参照专利文献1)。
在非专利文献1中记载的通过SUMO-rIGF-1的表达生产rIGF-1时，利用镍柱(Ni-NTA树脂柱)进行rIGF-1的纯化。具体而言，将利用SUMO蛋白酶对所表达的SUMO-rIGF-1进行处理而得的溶液(含有SUMO-rIGF-1、SUMO蛋白酶、SUMO和rIGF-1)应用于Ni-NTA(镍-次氮基三乙酸)亲和色谱，使具有组氨酸标签的SUMO-rIGF-1、SUMO蛋白酶和SUMO吸附于柱，仅使rIGF-1洗脱，由此对rIGF-1进行纯化。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表平07-501704号公报
非专利文献
非专利文献1：“Soluble expression of human insulin-like growth factor-1with theassistance of SUMO fusion partner”，Journal of Chemical andPharmaceutical Research，2014，6(4):1059-1066
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种用于相对于错误折叠的rIGF-1以高纯度获得正确折叠的rIGF-1的得到改善的方法。
为了解决上述课题，本发明提供以下的[1]-[11]。
[1]一种重组胰岛素样生长因子I(rIGF-1)的制造方法，包括如下的工序：
(1)将rIGF-1作为与泛素样蛋白SUMO(小分子泛素相关修饰物)的融合蛋白(SUMO-IGF-1)而获得的工序，
(2)利用SUMO蛋白酶对SUMO-IGF-1进行处理的工序，
(3)将工序(2)的处理液应用于阳离子交换色谱，通过梯度洗脱得到含有rIGF-1的洗脱液的工序。
[2]根据[1]的制造方法，其中，上述梯度洗脱包括：
(i)用盐浓度200mM以上且小于300mM的洗脱液进行的1柱容积以上的洗脱工序，
(ii)用盐浓度300mM以上且小于500mM的洗脱液进行的1柱容积以上的洗脱工序，
(iii)用盐浓度500mM以上的洗脱液进行的洗脱工序，
将rIGF-1回收到上述洗脱工序(ii)的洗脱液中。
[3]根据[2]的制造方法，其中，洗脱工序(i)的洗脱条件如下。
以盐浓度200mM进行1.5-6柱容积(CV)的洗脱，接着以盐浓度250mM进行3-12CV的洗脱，进一步以盐浓度250mM～300mM的线性浓度梯度进行1.5-3CV的洗脱。
[4]洗脱工序(ii)
以盐浓度300mM进行1.5-6CV的洗脱，接着以盐浓度300mM～400mM的线性浓度梯度进行1.5-3CV的洗脱。
[5]根据[2]-[4]中任一项的制造方法，其中，洗脱工序(iii)的洗脱条件如下。
以盐浓度1M进行1.5-6CV的洗脱。
[6]根据[1]-[5]中任一项的制造方法，其中，工序(1)包括：使表达SUMO-IGF-1的宿主细胞溶解而得到第1试样溶液的工序(1-1)、以及将第1试样溶液应用于Ni-NTA(镍-次氮基三乙酸)亲和色谱而得到含有SUMO-IGF-1的第1洗脱液的工序(1-2)，
工序(2)是利用SUMO蛋白酶对上述第1洗脱液进行处理而得到含有SUMO-IGF-1、SUMO蛋白酶、SUMO和rIGF-1的第2试样溶液的工序，
工序(3)是将第2试样溶液应用于阳离子交换色谱，通过梯度洗脱从SUMO-IGF-1、SUMO蛋白酶和SUMO中分离出rIGF-1而得到含有rIGF-1的第3试样溶液的工序。
[7]根据[1]-[6]中任一项的制造方法，其中，在工序(2)之后的阶段不包括利用Ni-NTA亲和色谱进行的分离工序。
[8]根据[1]-[7]中任一项的制造方法，其中，不包括利用反相高效液相色谱进行的错误折叠蛋白质的分离工序。
[9]根据[1]-[8]中任一项的制造方法，其中，在上述第3试样溶液中，蛋白质总量中所占的正确折叠的rIGF-1量的比率为60％以上，优选为70％以上，更优选为80％以上，进一步优选为90％以上，特别优选为95％以上。
[10]根据[1]-[9]中任一项的制造方法，其中，上述宿主细胞为大肠杆菌。
[11]一种纯化方法，是重组胰岛素样生长因子I(rIGF-1)的纯化方法，包括如下的工序：
(1)将rIGF-1作为与泛素样蛋白SUMO(小分子泛素相关修饰物)的融合蛋白(SUMO-IGF-1)而获得的工序，
(2)利用SUMO蛋白酶对SUMO-IGF-1进行处理的工序，
(3)将工序(2)的处理液应用于阳离子交换色谱，通过梯度洗脱得到含有rIGF-1的洗脱液的工序。
本发明中“梯度洗脱”是指盐浓度梯度洗脱。梯度洗脱只要一部分包括使盐浓度发生线性(liner)或阶段性(stepwise)变化而进行洗脱的工序即可，无需在其全部工序中进行盐浓度变化的洗脱。即，梯度洗脱的一部分可以包括使盐浓度恒定进行洗脱的工序。
根据本发明，提供一种用于相对于错误折叠的rIGF-1以高纯度获得正确折叠的rIGF-1的得到改善的方法。
附图说明
图1表示实施例1中得到的第3试样溶液的色谱图。图中，横轴表示洗脱时间，纵轴表示吸光度(OD 220nm)。黑色的箭头表示rIGF-1(正确折叠的rIGF-1)的峰，空心的箭头表示错误折叠的rIGF-1(错误折叠的异构体)。
图2表示实施例2的洗脱工序(i)中得到的洗脱液的色谱图。图中，横轴表示洗脱时间，纵轴表示吸光度(OD 220nm)。黑色的箭头表示rIGF-1的峰，空心的箭头表示错误折叠的异构体。
图3表示实施例2的洗脱工序(ii)中得到的洗脱液(第3试样溶液)的色谱图。图中，横轴表示洗脱时间，纵轴表示吸光度(OD 220nm)。黑色的箭头表示rIGF-1的峰。
图4表示比较例1的洗脱·清洗工序中得到的试样溶液的色谱图。图中，横轴表示洗脱时间，纵轴表示吸光度(OD 220nm)。黑色的箭头表示rIGF-1的峰，空心的箭头表示错误折叠的异构体，斜线的箭头表示SUMO。
具体实施方式
以下，对用于实施本发明的适当的形态进行说明。应予说明，以下说明的实施方式表示本发明的代表性实施方式的一个例子，不能由此狭隘地诠释本发明的范围。
本发明所涉及的重组胰岛素样生长因子I(rIGF-1)的制造方法和纯化方法包括以下的工序(1)-(3)。
工序(1)：将rIGF-1作为与泛素样蛋白SUMO(小分子泛素相关修饰物)的融合蛋白(SUMO-IGF-1)而获得的工序。
工序(2)：利用SUMO蛋白酶对SUMO-IGF-1进行处理的工序。
工序(3)：将工序(2)的处理液应用于阳离子交换色谱，通过梯度洗脱得到含有rIGF-1的洗脱液的工序。
[工序(1)]
本工序中，将rIGF-1作为与泛素样蛋白SUMO(小分子泛素相关修饰物)的融合蛋白(SUMO-IGF-1)而获得。本工序包括：使表达SUMO-IGF-1的宿主细胞溶解而得到第1试样溶液的工序(1-1)、以及将第1试样溶液应用于Ni-NTA(镍-次氮基三乙酸)亲和色谱而得到含有SUMO-IGF-1的第1洗脱液的工序(1-2)。
[工序(1-1)]
本工序中，使表达SUMO-IGF-1的宿主细胞溶解而得到第1试样溶液。
用于SUMO-IGF-1表达的基因构建体可以通过一直以来公知的方法(例如非专利文献1中记载的方法)制作。用于制作基因构建体的SUMO-IGF-1基因和表达质粒可以利用市售的DNA合成基因和通用载体。
宿主细胞没有特别限定，优选使用大肠杆菌，可以利用市售的大肠杆菌细胞株。利用基因构建体的宿主细胞的转化和转化体的培养也可以通过一直以来公知的方法进行。
培养后，通过离心分离等从培养液回收细胞，使用高压粉碎机等将细胞粉碎，通过离心分离等除去不溶物，由此得到第1试样溶液。
[工序(1-2)]
本工序中，将第1试样溶液应用于Ni-NTA(镍-次氮基三乙酸)亲和色谱，得到含有SUMO-IGF-1的第1洗脱液。
向经过平衡化的Ni-NTA亲和色谱柱装填第1试样溶液。SUMO-IGF-1介由附加于SUMO的组氨酸标签(His-tag)被保持于柱载体。用适当的缓冲液清洗柱后，进行基于咪唑的浓度梯度的洗脱使保持于柱载体的SUMO-IGF-1洗脱而得到第1洗脱液。咪唑浓度梯度洗脱例如可以通过使用起始缓冲液(50mM Tris、300mM NaCl、8M脲、20mM咪唑、pH 7.8)和洗脱缓冲液(50mM Tris、300mM NaCl、600mM咪唑、pH7.8)的线性浓度梯度洗脱来进行。
[工序(2)]
本工序是利用SUMO蛋白酶对SUMO-IGF-1进行处理的工序。通过利用SUMO蛋白酶对第1洗脱液进行处理，从而得到含有SUMO-IGF-1、SUMO蛋白酶、SUMO和rIGF-1的第2试样溶液。
SUMO蛋白酶处理可以通过一直以来公知的方法(例如非专利文献1中记载的方法)进行。在SUMO蛋白酶处理后，可以对含有SUMO-IGF-1、SUMO蛋白酶、SUMO和rIGF-1的处理液适当地进行浓缩或缓冲液置换而制成第2试样溶液。
[工序(3)]
本工序是将第2试样溶液应用于阳离子交换色谱，通过梯度洗脱得到含有rIGF-1的洗脱液的工序。
现有方法(例如非专利文献1中记载的方法)中，通过将含有SUMO-IGF-1、SUMO蛋白酶、SUMO和rIGF-1的SUMO蛋白酶处理液再次应用于Ni-NTA亲和色谱，使具有His-tag的SUMO-rIGF-1、SUMO蛋白酶和SUMO吸附于柱，仅使rIGF-1洗脱，从而将rIGF-1纯化(参照比较例1)。
本发明所涉及的方法是使用阳离子交换色谱代替Ni-NTA亲和色谱进行rIGF-1的纯化，本工序中，将第2试样溶液应用于阳离子交换色谱，通过梯度洗脱从SUMO-IGF-1、SUMO蛋白酶和SUMO中分离出rIGF-1而得到含有rIGF-1的第3试样溶液。本发明所涉及的方法中，在工序(2)之后的阶段不包括利用Ni-NTA亲和色谱进行的分离工序。
将第2试样溶液装填到用适当的缓冲液(例如，20mM乙酸铵、200mM咪唑、pH4.0)进行平衡化的阳离子交换色谱柱(S纤维素)。进行盐浓度梯度洗脱，使保持于柱载体的rIGF-1洗脱而得到第3试样溶液。
盐浓度梯度洗脱例如可以通过以上述缓冲液为起始缓冲液且并用洗脱缓冲液(20mM乙酸铵、200mM咪唑、1M NaCl、pH 4.0)的线性浓度梯度洗脱进行。洗脱容积·洗脱速度可以适当地调整。洗脱溶液例如为4柱容积(CV)、1-16CV，优选为2-8CV，更优选为3-6CV。
通过使用阳离子交换色谱柱的盐浓度梯度洗脱，与现有方法(参照比较例1)相比，能够高纯度且高收量地获得没有混入SUMO的rIGF-1(参照实施例1)。
盐浓度梯度洗脱优选由以下的洗脱工序(i)-(iii)构成。
(i)用盐浓度200mM～300mM(或者200mM以上且小于300mM)的洗脱液进行的1柱容积以上的洗脱工序。
(ii)用盐浓度300mM以上且小于500mM的洗脱液进行的1柱容积以上的洗脱工序。
(iii)用盐浓度500mM以上的洗脱液进行的洗脱工序。
洗脱工序(i)中，主要洗脱错误折叠的rIGF-1。
洗脱液例如使用以乙酸铵为缓冲液，以上述浓度含有盐(NaCl等)的洗脱液。洗脱液中的盐浓度在上述浓度范围内可以为恒定的，也可以线性(liner)或阶段性(stepwise)变化。洗脱液可以以适当的浓度(例如200mM)含有咪唑。洗脱容积·洗脱速度可以适当地调整。洗脱溶液例如为12CV、3-48CV、优选为6-24CV、更优选为9-15CV的范围。
洗脱工序(i)具体而言特别是指以盐浓度200mM进行1.5-6柱容积(CV)的洗脱，接着以盐浓度250mM进行3-12CV的洗脱，进一步以盐浓度250mM～300mM的线性浓度梯度进行1.5-3CV的洗脱。
洗脱工序(ii)中，主要洗脱正确折叠的rIGF-1。通过回收该洗脱片段，可高纯度地得到纯化的rIGF-1。
洗脱液例如使用以乙酸铵为缓冲液、以上述浓度含有盐(NaCl等)的洗脱液。洗脱液中的盐浓度在上述浓度范围内可以为恒定的，也可以线性(liner)或阶段性(stepwise)变化。洗脱液可以以适当的浓度(例如200mM)含有咪唑。洗脱容积·洗脱速度可以适当地调整。洗脱溶液例如为6CV、1.5-24CV、优选为3-12CV、更优选为4.5-8CV的范围。
洗脱工序(ii)具体而言特别是指以盐浓度300mM进行1.5-6CV的洗脱，接着以盐浓度300mM～400mM的线性浓度梯度进行1.5-3CV的洗脱。
洗脱工序(iii)中，主要洗脱SUMO-IGF1、SUMO蛋白酶和SUMO。
洗脱液例如使用以乙酸铵为缓冲液、以上述浓度含有盐(NaCl等)的洗脱液。洗脱液中的盐浓度在上述浓度范围内可以为恒定的，也可以线性(liner)或阶段性(stepwise)变化。洗脱液可以以适当的浓度(例如200mM)含有咪唑。洗脱容积·洗脱速度可以适当地调整。洗脱溶液例如为3CV、0.75-12V、优选为1.5-6CV、更优选为2-4CV的范围。
洗脱工序(iii)具体而言特别是指以盐浓度1M进行1.5-6CV的洗脱。
以往，为了将正确折叠的rIGF-1与错误折叠的rIGF-1分离，使用反相高效液相色谱(HPLC)。
根据本发明所涉及的rIGF-1的制造方法和纯化方法，不使用高价的HPLC柱，使用廉价的阳离子交换色谱柱(工序(3))，就能够相对于错误折叠的rIGF-1以高纯度且高回收率取得正确折叠的rIGF-1。应予说明，不排除以除去正确折叠的rIGF-1中尤其是MetO59-IGF-1为目的而接着本发明的工序进一步进行HPLC分离。
根据本发明所涉及的rIGF-1的制造方法和纯化方法，在工序(3)的洗脱液(第3试样溶液)中，可以使蛋白质总量中所占的正确折叠的rIGF-1量的比率为60％以上，优选为70％以上，更优选为80％以上，进一步优选为90％以上，特别优选为95％以上。
实施例
[实施例1]
(1)材料
(1-1)SUMO-IGF-1DNA合成基因
SUMO-IGF-1基因使用市售的DNA合成基因(MISSION BIOTECH、GS3075)。
(1-2)表达调节用质粒(pET22b)
SUMO-IGF-1的表达质粒使用pET22b(EMD millipore、69744-3CN)。
(1-3)基因表达结构体(pET22b SUMO-IGF-1)
SUMO-IGF-1基因表达结构体(pET22b SUMO-IGF-1)是将SUMO-IGF-1DNA合成基因导入pET22b而构建的。
(1-4)宿主细胞
宿主细胞使用来自大肠杆菌(Escherichia coli)B株的细胞株BL21(DE3)。
(1-5)用于制作主工作细胞库的种细胞株的制备
用大肠杆菌转化法向宿主细胞BL21(BD3)株导入美卡舍明(基因重组)基因表达结构体。用含有氨苄青霉素的LB平板培养基，在37℃培养，选择8个单菌落。将这些单菌落在含有氨苄青霉素的LB培养基于37℃培养直至培养液的浊度(OD 600nm)达到0.6～0.8，用1mM的异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷在28℃诱导2.5小时，选择高表达的细胞株。
(1-6)主工作细胞库的制备
将选择的一个菌落接种于含有氨苄青霉素的LB培养基，在37℃培养直至浊度(OD600nm)达到0.6～0.8。培养后进行离心分离，废弃培养基，以含有氨苄青霉素的LB培养基的浊度(OD 600nm)成为2的方式添加，以最终浓度成为20％的方式添加进行了灭菌的甘油，使其悬浮，将最终浊度(OD 600nm)调节成1.2。将该细胞悬浮液分注到冻存管中各1mL。
(2)SUMO-IGF-1的表达
(2-1)前培养1
将融化的工作细胞库0.5mL加入到前培养培养基5mL中，在37℃以120rpm培养2～8小时。其后，移到195mL的前培养培养基中，在37℃以120rpm培养直至浊度变成5以上。
(2-2)前培养2
在前培养培养基3.1L、葡萄糖溶液400mL、微量金属溶液1025μL和氨苄青霉素溶液3.5mL中加入前培养1中得到的培养液，在37℃培养直至浊度变成10以上。
(2-3)正式培养
在正式培养培养基、葡萄糖溶液、微量金属溶液和氨苄青霉素溶液中加入前培养2中得到的培养液，在37℃培养直至浊度变成50。添加IPTG溶液继续培养，使SUMO-IGF-1在菌体内表达。
(3)菌体回收·溶解
在正式培养结束后，对培养液进行离心分离，回收菌体。对菌体1g加入菌体溶解缓冲液(50mM Tris、300mM NaCl、8M脲、pH 7.8)10mL，使菌体悬浮。利用高压粉碎机(850bar)将菌体粉碎后，进行离心分离而除去不溶物，得到第1试样溶液。
(4)Ni-NTA亲和色谱纯化
向用菌体溶解缓冲液进行了平衡化的Ni-NTA亲和色谱柱(高度25cm)装载全部的第1试样溶液。用菌体溶解缓冲液清洗柱后，通过以镍缓冲液B(50mM Tris、300mM NaCl、8M脲、20mM咪唑、pH 7.8)为起始缓冲液、以镍缓冲液C(50mM Tris、300mM NaCl、600mM咪唑、pH7.8)为洗脱缓冲液的线性浓度梯度洗脱(线速度60cm/h)，得到含有SUMO-IGF-1的第1洗脱液。
(5)SUMO蛋白酶处理
在第1洗脱液中添加1/2000倍容量的SUMO蛋白酶溶液，在15℃以上反应1小时。将反应液用超滤膜(片段分子量2kDa)浓缩。用浓缩液的7倍量以上的TFF缓冲液B(20mM乙酸铵、200mM咪唑、pH 4.0)进行缓冲液置换。其后，再次浓缩。利用TFF缓冲液B回收浓缩物，得到含有SUMO-IGF-1、SUMO蛋白酶、SUMO和rIGF-1的第2试样溶液。
(6)阳离子交换色谱纯化
将第2试样溶液全部装载到用SP缓冲液A(20mM乙酸铵、200mM咪唑、pH 4.0)进行了平衡化的阳离子交换色谱柱(SP纤维素，高度20cm)中。
通过以SP缓冲液A为起始缓冲液、以SP缓冲液B(20mM乙酸铵、200mM咪唑、1M NaCl、pH 4.0)为洗脱缓冲液的线性浓度梯度洗脱(4柱容积(CV)、线速度60cm/h)，得到含有IGF-1的第3试样溶液。
将得到的第3试样溶液的色谱图示于图1。图中，横轴表示洗脱时间，纵轴表示吸光度(OD 220nm)。黑色的箭头为rIGF-1(正确折叠的rIGF-1)的峰，空心的箭头为错误折叠的rIGF-1(错误折叠的异构体)。由峰强度算出的蛋白质总量中所占的rIGF-1和错误折叠的异构体的比率分别为64.2％和28.9％(参照表1)。另外，相对于第2试样溶液中的rIGF-1量的、第3试样溶液的rIGF-1量(回收率)为80％。第3试样溶液中以高纯度(64.2％)且高回收率(80％)取得没有混入SUMO的rIGF-1。
[表1]
| IGF-1 | 错误折叠的异构体 | SUMO | 其它的峰 | 回收率 | |
| 实施例1 | 64.2％ | 28.9％ | 0％ | 6.9％ | 80％ |
| 实施例2 | 95.7％ | 0.4％ | 0％ | 3.9％ | 70％ |
| 比较例1 | 49.6％ | 21.5％ | 21.7％ | 7.2％ | 31％ |
[实施例2]
(1)阳离子交换色谱纯化
将与实施例1同样得到的第2试样溶液全部装载到用SP缓冲液A进行了平衡化的阳离子交换色谱柱(SP纤维素，高度20cm)中。其后，进行由以下的洗脱工序(i)-(iii)构成的梯度洗脱。
洗脱工序(i)
用SP缓冲液A 33％/SP缓冲液B1(20mM乙酸铵、200mM咪唑、300mM NaCl、pH 4.0)67％的洗脱液(盐浓度200mM)3CV进行洗脱(线速度60cm/h)。
接着，用SP缓冲液A17％/SP缓冲液B183％的洗脱液(盐浓度250mM)6CV进行洗脱(线速度60cm/h)。
进而从SP缓冲液A17％/SP缓冲液A83％的条件(盐浓度250mM)到SP缓冲液A0％/SP缓冲液B1 100％的条件(盐浓度300mM)进行线性浓度梯度洗脱(3CV，线速度60cm/h)。
将得到的洗脱液的色谱图示于图2。图中，横轴表示洗脱时间，纵轴表示吸光度(OD220nm)。黑色的箭头为rIGF-1的峰，空心的箭头为错误折叠的异构体。由峰强度算出的蛋白质总量中所占的rIGF-1的比率为27.6％。
洗脱工序(ii)
接着，用SP缓冲液B1 100％的洗脱液(盐浓度300mM)3CV进行洗脱(线速度60cm/h)，得到含有IGF-1的第3试样溶液。
进而，从SP缓冲液A70％/SP缓冲液B2(20mM乙酸铵、200mM咪唑、1M NaCl、pH 4.0)30％的条件(盐浓度300mM)到SP缓冲液60％/SP缓冲液B2 40％的条件(盐浓度400mM)，进行线性浓度梯度洗脱(3CV，线速度60cm/h)。
将得到的第3试样溶液的色谱图示于图3。图中，横轴表示洗脱时间，纵轴表示吸光度(OD 220nm)。黑色的箭头为rIGF-1。由峰强度算出的蛋白质总量中所占的rIGF-1和错误折叠的异构体的比率分别为95.7％和0.4％(参照表1)。另外，rIGF-1回收率为70％。
洗脱工序(iii)
最后，用SP缓冲液B2 100％的洗脱液(盐浓度1M)3CV进行洗脱(线速度60cm/h)。
在洗脱工序(ii)的洗脱液(第3试样溶液)中，相对于错误折叠的异构体(0.4％)，以高纯度(95.7％)且高回收率(70％)取得rIGF-1。
[比较例1]
(1)Ni-NTA亲和色谱纯化2
将与实施例1同样得到的第2试样溶液全部装载到Ni-NTA亲和色谱柱中(线速度60cm/h)。取得全部装载中洗脱的洗脱液和其后的清洗(20mM Tris缓冲液、300mM NaCl、pH7.8)得到的洗脱液作为含有IGF-1的试样溶液。
将得到的试样溶液的色谱图示于图4。图中，横轴表示洗脱时间，纵轴表示吸光度(OD 220nm)。黑色的箭头为rIGF-1(正确折叠的rIGF-1)的峰，空心的箭头为错误折叠的rIGF-1(错误折叠的异构体)，斜线的箭头为SUMO。由峰强度算出的蛋白质总量中所占的rIGF-1和错误折叠的异构体的比率分别为49.6％和21.5％，SUMO为21.7％，以高比率含有(参照表1)。另外，rIGF-1回收率为31％，也较低。
Claims (6)
1.一种重组胰岛素样生长因子I即rIGF-1的制造方法，包括如下的工序：
(1)将rIGF-1作为与泛素样蛋白SUMO即小分子泛素相关修饰物的融合蛋白即SUMO-IGF-1而获得的工序，
(2)利用SUMO蛋白酶对SUMO-IGF-1进行处理的工序，
(3)将工序(2)的处理液应用于阳离子交换色谱，通过梯度洗脱得到含有rIGF-1的洗脱液的工序。
2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，所述梯度洗脱包括：
(i)用盐浓度200mM～300mM的洗脱液进行的1柱容积以上的洗脱工序，
(ii)用盐浓度300mM以上且小于500mM的洗脱液进行的1柱容积以上的洗脱工序，
(iii)用盐浓度500mM以上的洗脱液进行的洗脱工序，
将rIGF-1回收到所述洗脱工序(ii)的洗脱液中。
3.根据权利要求1或2所述的制造方法，其中，工序(1)包括：使表达SUMO-IGF-1的宿主细胞溶解而得到第1试样溶液的工序(1-1)、以及将第1试样溶液应用于Ni-NTA亲和色谱即镍-次氮基三乙酸亲和色谱而得到含有SUMO-IGF-1的第1洗脱液的工序(1-2)，
工序(2)是利用SUMO蛋白酶对所述第1洗脱液进行处理而得到含有SUMO-IGF-1、SUMO蛋白酶、SUMO和rIGF-1的第2试样溶液的工序，
工序(3)是将第2试样溶液应用于阳离子交换色谱，通过梯度洗脱从SUMO-IGF-1、SUMO蛋白酶和SUMO中分离出rIGF-1而得到含有rIGF-1的第3试样溶液的工序。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的制造方法，其中，在工序(2)之后的阶段不包括利用Ni-NTA亲和色谱进行的分离工序。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的制造方法，其中，不包括利用反相高效液相色谱进行的错误折叠蛋白质的分离工序。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的制造方法，其中，在所述第3试样溶液中，蛋白质总量中所占的正确折叠的rIGF-1量的比率为60％以上，优选为70％以上，更优选为80％以上，进一步优选为90％以上，特别优选为95％以上。
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