CN116367853A - 用于治疗表达波形蛋白的肿瘤的试剂盒和容器 - Google Patents

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CN116367853A CN202180005749.3A CN202180005749A CN116367853A CN 116367853 A CN116367853 A CN 116367853A CN 202180005749 A CN202180005749 A CN 202180005749A CN 116367853 A CN116367853 A CN 116367853A
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Abstract

本文提供了包含组合物的容器，所述组合物包含抗体，所述抗体包含含有SEQ ID NO:1的重链和含有SEQ ID NO:2的轻链。所述容器可以是瓶或小瓶，例如玻璃或聚对苯二甲酸乙二醇酯G(PETG)瓶或小瓶。还提供了包括所述容器的试剂盒以及使用来自所述容器的所述抗体来治疗癌症的方法。

Description

用于治疗表达波形蛋白的肿瘤的试剂盒和容器
背景技术
血脑屏障(BBB)对治疗剂向脑的递送构成了很大的障碍。BBB是CNS周围的保护性内皮组织，对治疗神经系统疾病的治疗剂和诊断剂的全身递送构成主要障碍。例如，对脑癌或其他实体瘤至大脑的转移的治疗的需求远未满足。缺乏良好的治疗方法是由于大脑中的肿瘤的侵袭和浸润特性，以及大多数有效生物制剂无法穿过BBB。如果BBB是渗漏性的或可以容易地被克服，那么新的和有用的药物就可以被递送至大脑组织。以前设计用于克服或绕过BBB的产品难以控制，从而它们的实用性受到限制。本公开通过提供能够穿过BBB的抗体或抗体片段来满足这些和其他需求。
发明内容
本文提供了包含组合物的容器，所述组合物包含抗体，所述抗体包含含有SEQ IDNO:1的重链和含有SEQ ID NO:2的轻链。所述容器可以是瓶或小瓶，例如玻璃或聚对苯二甲酸乙二醇酯G(PETG)瓶或小瓶。还提供了包括所述容器的试剂盒以及使用来自所述容器的所述抗体来治疗癌症的方法。
附图说明
图1是显示储存在PETG血清小瓶中的临床原料药抗体批次比储存在聚丙烯(PP)小瓶中的临床原料药抗体批次更有效的图。
图2是显示在毒理学测定中用作参考标准的原料药抗体批次在PP小瓶与PETG小瓶中具有不同效力的图。储存在PETG小瓶中的抗体比储存在PP小瓶中的抗体更有效。
图3是显示普立木单抗与U251胶质瘤细胞的细胞表面结合的流式细胞术的直方图。左峰是未染色的细胞，右移的峰是普立木单抗染色。
图4是显示重组人波形蛋白可以竞争普立木单抗与胶质瘤细胞结合的图。该图是显示最左侧峰中描绘的未染色的细胞、最右侧峰中描绘的单独普立木单抗(160nM)、最右侧峰中描述的普立木单抗(160nM)+波形蛋白(45nM)与单独的普立木单抗的峰重叠、以及左侧第二个峰中描述的普立木单抗(160nM)+波形蛋白(450nM)的直方图。
图5A和5B是来自全载玻片扫描的图像照片，它显示了中枢神经系统(CNS)赘生物中的代表性区域。
图6A和6B是来自全载玻片扫描的图像照片，它显示了正常小脑中的代表性区域。
具体实施方式
在不脱离本公开的精神的情况下，可以使用已经描述的若干实例构型、各种修改、替代性构造和等同物。例如，上述要素可以是更大系统的组件，其中其他规则可以优先于或者修改本发明的应用。此外，可以在考虑上述要素之前、期间或之后进行多个步骤。
应当理解，本发明不限于特定的方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，当然它们可以变化。还应当理解，本文所用的术语仅出于描述特定方面的目的，并不旨在进行限制。如说明书和所附权利要求所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括多个指代物，除非内容清楚表明并非如此。
如本文所用的术语“约”在提及可测量值诸如量、持续时间等等时，旨在涵盖指定值的±20％或±10％、更优选地±5％、甚至更优选地±1％，另外更优选地±0.1％的变化，因为这种变化适合于进行所公开的方法。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。虽然与本文所述的那些相似或等同的任何方法和材料都可以用于实践以测试本发明，但是本文描述了优选的材料和方法。
“脊椎动物”、“哺乳动物”、“受试者”、“哺乳动物受试者”或“患者”可互换使用，是指哺乳动物，诸如人类患者和非人类灵长类动物，以及实验动物，诸如兔、大鼠和小鼠、奶牛、马、山羊和其他动物。动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如小鼠、绵羊、狗、奶牛、禽类、鸭、鹅、猪、鸡、两栖动物和爬行动物。
“治疗”通常是指(i)防止疾病，例如预防，或(ii)减少或消除所关注的疾病的症状，例如治疗。因此，治疗可以在疾病的表现后预防性(以预防或延迟疾病的发作，或者预防它们的临床或亚临床症状的表现)或治疗性抑制或减轻症状。
“预防”是指用本发明的组合物进行预防性施用。
“治疗有效量”或“有效量”是指足以预防疾病或减轻(例如，缓和、减少、降低)至少一种与疾病相关的症状的抗体组合物的量。组合物的施用不必完全消除疾病的症状，只要组合物施用的益处大于害处即可。同样，如本文所用，涉及疾病的术语“治疗”并不意指受试者必须治愈疾病或消除它们的所有临床征象，仅表示受试者的病症的某些缓解或改善通过组合物的施用来实现。
如本文所用，术语“癌症”是指在哺乳动物中发现的所有类型的癌症、赘生物或恶性肿瘤，包括白血病、癌和肉瘤。示例性癌症包括脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、头颈癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌或成神经管细胞瘤。其他实例包括霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑肿瘤、胶质母细胞瘤、恶性胰岛素瘤、恶性类癌、尿道膀胱癌、癌前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌症、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌和外分泌胰腺的赘生物以及前列腺癌。
如本文所用，术语“抗体”是指任何免疫球蛋白或完整分子以及与特定表位结合的它们的片段。此类抗体包括但不限于完全抗体以及它们的变体的多克隆、单克隆、嵌合、人源化、单链、Fab、Fab'、F(ab)'片段和/或F(v)部分。该术语涵盖所有同种型，包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。
完整“抗体”包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链由重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH区和VL区可以进一步细分为高变区(称为互补性决定区(CDR))，所述高变区之间散布有更保守的区(称为框架区(FR))。每个VH和VL由从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。术语抗体包括保留结合能力的完整抗体的抗原结合部分。结合的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人,Nature,341:544-546(1989))，它由VH结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。
术语“CDR”是指主要有助于抗原结合的抗体的可变结构域内的六个高变区之一。六个CDR的最常用的定义之一由Kabat E.A.等人,(1991)Sequences of proteins ofimmunological interest.NIH Publication 91-3242提供。
如本文所用，术语“单链抗体”或“单链Fv(scFv)”是指Fv片段的两个结构域VL和VH的抗体融合分子。虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是可以使用重组方法通过合成接头将它们连接起来，使得它们可以形成单个蛋白链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人,Science,242:423-426(1988)；和Huston等人,Proc Natl Acad Sci USA,85:5879-5883(1988))。此类单链抗体通过提及术语“抗体”片段而包括在内，并且可以通过重组技术或完整抗体的酶促或化学切割来制备。
本文提供了包含抗体的容器，所述抗体包含含有SEQ ID NO:1的重链和含有SEQID NO:2的轻链。任选地，容器包含含有抗体的药物组合物。任选地，容器包含治疗有效量的抗体。任选地，容器是瓶或小瓶。任选地，容器可以由玻璃或聚对苯二甲酸乙二醇酯G(PETG)制成。任选地，容器是玻璃小瓶或PETG小瓶。任选地，容器是小瓶，并且小瓶包含5mg/ml至15mg/ml的抗体。
所提供的抗体的这些序列如下所示：
SEQ ID NO.1:EVQLLESGGDLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAITPSGGSTNYADSVKGRFTISRDNSQNTLYLQMNSLRVEDTAVYICGRVPYRSTWYPLYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:2:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLAWFQQKPGKAPKSLIYAASSLHSKVPTQFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYSTYPITFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
任选地，抗体具有8.0-9.0的等电点。任选地，抗体具有约8.7的等电点。
任选地，例如瓶或小瓶，抗体具有在8至9ug/ml之间的中位数结合有效浓度(EC50)。任选地，在玻璃容器中，玻璃小瓶中的抗体的EC50在8至9ug/ml之间。任选地，在PETG容器中，玻璃小瓶中的抗体的EC50在9至12ug/ml之间。任选地，抗体的EC50值是使用实例中描述的条件确定的那些。换句话说，抗体在以下实例中描述的条件下可以具有在9至12ug/ml之间的EC50值。
本文提供的包含含有SEQ ID NO:1的重链和含有SEQ ID NO:2的轻链(有时称为普立木单抗)的抗体穿过血脑屏障。参见美国专利号11,028,155，该专利以引用的方式整体并入本文。此外，如实例中所述，抗体结合波形蛋白。任选地，波形蛋白位于癌细胞的表面上或者已经由癌细胞分泌并且位于癌细胞外部。任选地，癌症是脑癌。
含有抗体的容器能够长期储存。任选地，时间期是3、6、9、12、15、18、21或24个月或更长。任选地，抗体可以在-60℃或更低的温度下储存。任选地，抗体历经3个冻融循环保持其活性。
如下文所述，抗体可以与药剂缀合。任选地，药剂是治疗剂或诊断剂。任选地，治疗剂是化学治疗剂。任选地，诊断剂是荧光剂、放射性剂或化学发光剂。
还提供了递送抗体穿过血脑屏障的方法，包括将来自本文所述的容器例如瓶或小瓶的本文提供的抗体施用于受试者，从而递送抗体穿过血脑屏障。任选地，容器是玻璃或PETG容器。
如上文所述，本文公开的所提供的抗体可以缀合至药剂，例如治疗部分，诸如细胞毒素、药物(例如，免疫抑制剂)或放射性毒素。此类缀合物在本文中称为“免疫缀合物”。
本发明的抗体缀合物可以用于修饰给定的生物反应，并且药物部分不应被解释为限于经典化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所期望的生物活性的蛋白质或多肽。此类蛋白质可以包括例如酶活性毒素或它们的活性片段，诸如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，诸如肿瘤坏死因子或干扰素-g；或者，生物反应调节剂，例如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生长因子。
由于普立木单抗可以穿过血脑屏障，因此它可以用作将其他药剂(例如，成像剂或治疗剂)递送至大脑或其他肿瘤组织的递送媒介物。因此，提供了包含抗体和一种或多种药剂的组合物，所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:1的序列，所述轻链包含SEQ ID NO:2的序列，所述药剂是例如成像剂或治疗剂。任选地，药剂与抗体缀合。任选地，治疗剂是化学治疗剂。任选地，缀合物包含与一种或多种药剂缀合的如本文所述的重组抗原结合蛋白。任选地，组合物被配制用于递送至大脑。任选地，组合物能够穿过血脑屏障。任选地，抗体的重链包含SEQ ID NO:1，轻链包含SEQ ID NO:2。任选地，抗体是普立木单抗。
此类治疗部分与抗体缀合的技术是熟知的，参见例如Amon等人,“MonoclonalAntibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”,载于MonoclonalAntibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人(编),第243-56页(Alan R.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等人,“Antibodies For Drug Delivery”,载于Controlled DrugDelivery(第2版),Robinson等人(编),第623-53页(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review",载于Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications,Pinchera等人(编),第475-506页(1985)；“Analysis,Results,And Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”,载于MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等人(编),第303-16页(Academic Press 1985)，以及Thorpe等人,“The Preparation And CytotoxicProperties Of Antibody-Toxin Conjugates,”Immunol.Rev.,62:119-58(1982)。
用于所提供的组合物和方法的合适的治疗剂，例如用于与所提供的抗体缀合的治疗剂包括但不限于选自由以下各项组成的组的治疗剂：镇痛剂、麻醉剂、兴奋剂、皮质类固醇、抗胆碱药剂、抗胆碱酯酶剂、抗惊厥剂、抗肿瘤药剂、变构抑制剂、合成代谢类固醇、抗风湿药剂、精神治疗药剂、神经阻断剂、抗炎剂、驱虫药、抗生素、抗凝血剂、抗真菌剂、抗组胺剂、抗毒蕈碱剂、抗分支杆菌药剂、抗原生动物药剂、抗病毒剂、多巴胺、血液学药剂、免疫学药剂、毒蕈碱药、蛋白酶抑制剂、维生素、生长因子和激素。本领域技术人员可以基于所治疗的给定疾病容易地确定药剂和剂量的选择。
如本文所述，抗体可以连接或缀合至成像剂。成像剂及其用途是已知的。任选地，成像剂是“可检测部分”，它是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理方式检测的组合物。例如，有用的标记包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，如在ELISA中常用的)、生物素、地高辛或半抗原和蛋白质或可例如通过将放射性标记掺入与靶标肽特异性反应的肽或抗体而检测的其他实体。可以使用本领域已知的用于将抗体与标记缀合的任何方法，例如使用Hermanson,Bioconjugate Techniques 1996,Academic Press,Inc.,San Diego中描述的方法。可检测部分可以选自γ-发射体、β-发射体和α-发射体、γ-发射体、正电子发射体、X射线发射体和荧光发射体。合适的荧光化合物包括荧光素钠、异硫氰酸荧光素、藻红蛋白和德克萨斯红磺酰氯、别藻蓝蛋白(APC)、Cy5-PE、CY7-APC和瀑布黄。
任选地，可检测部分可以使用组织化学技术、ELISA样测定法、共聚焦显微镜、荧光检测、细胞分选方法、核磁共振、放射免疫闪烁照相法、X射线照相法、正电子发射断层扫描、计算机轴向断层扫描、磁共振成像和超声检查来显示。
“标记”或“可检测部分”是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理方式检测的组合物。例如，有用的标记包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，如在ELISA中常用的)、生物素、地高辛或半抗原和蛋白质或可例如通过将放射性标记掺入与靶标肽特异性反应的肽或抗体而检测的其他实体。可以使用本领域已知的用于将抗体与标记缀合的任何方法，例如使用Hermanson,Bioconjugate Techniques 1996,AcademicPress,Inc.,San Diego中描述的方法。
目前公开的主题提供了包含药物组合物的容器，所述药物组合物包含本公开中提供的抗体。任选地，可以将根据本公开的抗体与一种或多种另外的药剂例如抗病毒或抗癌药物或镇痛剂一起施用于受试者。
药物组合物还可以含有用于施用抗体或抗原结合蛋白的药学上可接受的载剂或佐剂。任选地，载剂是药学上可接受用于人的。载剂或佐剂本身不应诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体并且不应是有毒的。合适的载剂可以是大型、缓慢代谢的大分子，诸如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和灭活病毒颗粒。
可以使用药学上可接受的盐，例如无机酸盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐，或者有机酸盐，诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。
治疗组合物中的药学上可接受的载剂可以另外含有液体，诸如水、盐水、甘油和乙醇。另外，辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂或pH缓冲物质，可以存在于此类组合物中。此类载剂能够将药物组合物配制为片剂、丸剂、锭剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆液剂和混悬剂，以供患者摄取。
本公开主题的组合物可以另外包含促进组合物制备和施用的载剂。可以使用任何合适的递送媒介物或载剂，包括但不限于微胶囊，例如微球或纳米球(Manome等人(1994)Cancer Res 54:5408-5413；Saltzman&Fung(1997)Adv Drug Deliv Rev 26:209-230)、糖胺聚糖(美国专利号6,106,866)、脂肪酸(美国专利号5,994,392)、脂肪乳剂(美国专利号5,651,991)、脂质或脂质衍生物(美国专利号5,786,387)、胶原蛋白(美国专利号5,922,356)、多糖或其衍生物(美国专利号5,688,931)、纳米混悬剂(美国专利号5,858,410)、聚合物胶束或缀合物(Goldman等人(1997)Cancer Res 57:1447-1451和美国专利号4,551,482、5,714,166、5,510,103、5,490,840和5,855,900)以及多核糖体(美国专利号5,922,545)。
可以使用本领域已知的方法将抗体序列与活性剂或载剂偶联，所述方法包括但不限于碳二亚胺缀合、酯化、高碘酸钠氧化然后进行还原烷基化以及戊二醛交联(Goldman等人(1997)Cancer Res.57:1447-1451；Cheng(1996)Hum.Gene Ther.7:275-282；Neri等人(1997)Nat.Biotechnol.15:1271-1275；Nabel(1997)Vectors for Gene Therapy.载于Current Protocols in Human Genetics,John Wiley&Sons,New York；Park等人(1997)Adv.Pharmacol.40:399-435；Pasqualini等人(1997)Nat.Biotechnol.15:542-546；Bauminger&Wilchek(1980)Meth.Enzymol.70:151-159；美国专利号6,071,890；和欧洲专利号0 439 095)。
本发明的治疗组合物在一些实施方案中包含药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载剂。合适的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，它们可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、杀细菌抗生素和使制剂与预期接受者的体液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌混悬剂，它们可以包括助悬剂和增稠剂。制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器，例如密封安瓿瓶和小瓶中，并且可以储存于冷冻或冷冻干燥(冻干)条件下，只需要在使用前立即添加无菌液体载剂，例如注射用水。一些示例性成分是在一些实施方案中在0.1至10mg/ml的范围内，在一些实施方案中，约2.0mg/ml的SDS；以及/或者在一些实施方案中在10至100mg/ml的范围内，在一些实施方案中约30mg/ml的甘露糖醇或另一种糖；以及/或者磷酸盐缓冲盐水(PBS)。考虑到所讨论的制剂类型，可以使用本领域常规的任何其他试剂。在一些实施方案中，载剂是药学上可接受的。在一些实施方案中，载剂是药学上可接受用于人的。
本公开的药物组合物可以具有在5.5和8.5之间、优选地在6和8之间、更优选地约7的pH。pH可以通过使用缓冲液来维持。组合物可以是无菌的和/或无热原的。组合物对于人可以是等渗的。本公开主题的药物组合物可以在气密密封容器中提供。
药物组合物可以包含有效量的一种或多种如本文所述的抗体。在一些实施方案中，药物组合物可以包含足以治疗、改善或预防所期望的疾病或病症或者表现出可检测的治疗效果的量。治疗效果还包括减少身体症状。任何特定受试者的精确有效量将取决于他们的体型和健康状况、病症的性质和程度以及选择用于施用的治疗剂或治疗剂组合。给定情况下的有效量由本领域的普通技术人员实施的常规实验确定。
本发明的药物组合物可以取决于施用方法以多种单位剂型施用。典型的抗体药物组合物的剂量是本领域的技术人员熟知的。此类剂量通常在性质上是建议性的，并且根据特定的治疗环境或患者耐受性进行调整。足以实现此目标的抗体量被定义为“治疗有效剂量”。对该用途有效的剂量排程和量，即“给药方案”，将取决于多个因素，包括疾病或病症的阶段、疾病或病症的严重度、患者健康的一般状态、患者的身体状况、年龄、药物制剂和活性剂的浓度等等。在计算患者的剂量方案时，还考虑了施用方式。剂量方案还必须考虑药代动力学，即药物组合物的吸收率、生物利用率、代谢、清除率等等。参见，例如，最新版Remington’s；Egleton,Peptides 18:1431-1439,1997；Langer,Science 249:1527-1533,1990。
本文还提供了治疗受试者的表达波形蛋白的癌症的方法，包括将来自本文提供的容器例如瓶或小瓶的抗体施用于受试者，从而治疗受试者的表达波形蛋白的癌症。任选地，容器是玻璃或PETG容器。任选地，脑癌和胰腺癌。任选地，脑癌是胶质母细胞瘤。任选地，给受试者施用治疗有效量的组合物。
出于本发明的目的，治疗有效量的包含抗体的组合物含有约0.05至1500μg蛋白质，优选地约10至1000μg蛋白质，更优选地约30至500μg，最优选地约40至300pg，或者这些值之间的任何整数。例如，本发明的抗体可以以约0.1μg至约200mg，例如约0.1μg至约5μg、约5μg至约10μg、约10μg至约25μg、约25μg至约50μg、约50μg至约100μg、约100μg至约500μg、约500μg至约1mg、约1mg至约2mg的剂量施用于受试者，任选地在例如1周、2周、3周、4周、两个月、三个月、6个月和/或一年后给予加强剂。应当理解，用于任何特定患者的具体剂量水平取决于多个因素，包括所用的具体抗体的活性、年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、施用时间、施用途径和排泄率、药物组合和经受疗法的特定疾病的严重度。
施用途径包括但不限于口服、局部、皮下、肌肉内、静脉内、皮下、皮内、透皮和皮下。根据施用途径，每剂的体积为优选地约0.001至10ml，更优选地约0.01至5ml，以及最优选地约0.1至3ml。组合物可以在适合受试者的年龄、体重和状况、所用的特定抗体制剂和施用途径的排程和时间期内以单剂量治疗或多剂量治疗施用。
本文还提供了包括包含抗体的容器和使用说明书的试剂盒。任选地，容器具有标签。合适的容器包括例如瓶、小瓶和试管。容器由玻璃或PETG制成。容器容纳有组合物，所述组合物包含本文提供的对治疗应用有效的抗体。容器上的标签指示组合物可用于特定疗法或非治疗性应用，并且还可以指示体内或体外使用的指导。
以下实施本发明的具体方面的实施例仅用于示例性目的，并且不旨在以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1.储存容器和条件影响抗体活性
为了确定含有抗体普立木单抗的商业化储存小瓶是否能够影响抗体的效力，对三个不同的抗体批次进行结合测定法。第一原料药(DS)抗体批次包含(i)在Wheaton(#223739)透明玻璃血清瓶(具有20mm顶部压接螺口(10ml大小)(低碱硼硅酸盐模制玻璃))中，浓度为10mg/ml(约4.5ml体积)或者(ii)在透明PETG血清小瓶(#1-0456-81P；ThermoFisher Scientific)(瓶盖内衬有连续螺纹(5ml大小))中，浓度为10mg/ml(约4ml体积)。第二DS抗体批次包含在Nalgene冷冻小瓶(#5000-1020)(1.5ml尺寸聚丙烯(PP)螺旋盖小瓶)中，浓度为9.9mg/ml(1ml体积)。用于效力测定法的第三抗体批次和参考标准是在PETG血清小瓶(#1-0456-81P；ThermoFisher Scientific)(瓶盖内衬有连续螺纹(5ml大小；聚对苯二甲酸乙二醇酯G(PETG)))中的9.72mg/ml浓度(4ml体积)。
将储存在PP冷冻小瓶中的第二抗体批次的效力与储存在透明PETG血清小瓶中的第一抗体批次的效力进行比较。图1中的结果显示，储存在PP冷冻小瓶和PETG血清小瓶中的原料药(DS)之间的效力存在显著差异。来自PETG小瓶的临床DS的EC50为9.6ug/ml，而PP冷冻小瓶的EC50为20ug/ml。储存在PETG血清小瓶中的临床DS批次的效力(9.6ug/ml)与玻璃血清容器中包含的临床DS批次的效力(8.25ug/ml)相似。此结果表明，临床原料药和临床药物产品之间EC50值的差异是由于储存在不同容器中的结果。储存在PP冷冻小瓶中的临床DS批次显示出效力较弱，可以不代表储存在玻璃血清容器中的药物产品材料效力。
进行结合效力测定法以比较第三抗体DS批次和储存在PP冷冻小瓶中和储存在PETG血清小瓶中的参考标准。对来自PP冷冻小瓶的3个单独的第三抗体DS批次和来自PETG血清小瓶的第三抗体DS批次进行ELISA结合测定法。图2的结果显示，储存在PP冷冻小瓶中的DS批次未显示出与储存在PETG血清小瓶中的相同的效力。与来自PETG血清小瓶的DS批次(EC50为11ug/ml)相比，PP冷冻小瓶储存的DS批次具有显著较低的结合(EC50范围为37ug/ml至40ug/ml)。
结合ELISA测定法比较了储存在PP冷冻小瓶中的临床DS批次和储存在PETG血清小瓶中的临床DS批次。这些样品之间的效力存在显著差异。储存在PETG血清小瓶中的DS的EC50值与玻璃容器中的临床DS批次的报告值和用于此前结合测定法的批次DS参考标准相似。储存在PP冷冻小瓶中的临床DS和储存在PP冷冻小瓶中的参考标准DS在效力方面都不代表药物产品材料(储存在玻璃血清小瓶中)。然而，PETG血清小瓶中储存的临床DS和毒理学DS均显示出与药物产品材料相似的EC50值，并且在效力方面代表药物产品。
除用于储存抗体的容器之外，还测试了抗体的储存条件和配方。已经确定产品在5℃下储存会导致抗体降解。在温度<-60℃下储存超过3个冻融循环不会导致降解。据推荐/记载，该抗体可在低于-60℃的温度下长期储存。此外，临床产品小瓶中的抗体的优选浓度和配方被确定为在10mM磷酸钠、150mM氯化钠pH7.0(磷酸盐缓冲盐水(PBS))中大约10mg/ml。
实施例2.普立木单抗特异性结合至胶质瘤细胞的细胞表面并且显示出对波形蛋白的特异性。
为了确定普立木单抗是否能够结合胶质瘤细胞的表面，进行测定法以确定普立木单抗是否可以与重组人波形蛋白竞争。实验的基本原理是进一步展示普立木单抗抗体对胞外波形蛋白的特异性。
图1和2显示了流式细胞术实验的结果。表1汇总了结合竞争实验。将160nM普立木单抗与45nM重组波形蛋白一起温育不会超过U251细胞的结合。然而，将160nM普立木单抗与2.5摩尔/升过量重组波形蛋白(450nM)一起温育可以防止普立木单抗与U251细胞表面结合。
表1.普立木单抗的染色阳性细胞百分比。
Figure BDA0003580125340000131
结论是重组波形蛋白能够与普立木单抗竞争与胶质瘤细胞的细胞表面的结合。这进一步展示了普立木单抗结合波形蛋白的特异性。
为了确定抗体普立木单抗对波形蛋白的结合亲和力。将Octet HTX用于测量与人波形蛋白结合的抗体。在25℃下对Octet HTX进行结合实验。将普立木单抗(10ug/ml)加载到抗人Fc(AHC)生物传感器上。将负载传感器浸入一系列抗原稀释液(重组人波形蛋白)中(300nM开始，1:3稀释，7个点)。使用单价(1:1)模型来计算动力学常数。抗体普立木单抗与波形蛋白的结合亲和力被确定为7.55E-9M。
表2.普立木单抗的结合动力学
Figure BDA0003580125340000141
实施例3.CNS组织的免疫组织化学染色
本实施例的目的是确定普立木单抗人单克隆抗体是否能够对中枢神经系统(CNS)赘生物，特别是多形性胶质母细胞瘤和星形细胞瘤进行染色。这些是最常见和浸润性原发性CNS恶性肿瘤。为此，对80个人体组织核心进行免疫组织化学染色。七十个核心来自胶质母细胞瘤和星形细胞瘤患者，而10个来自正常大脑。
获得含有正常人和猴受试者的未染色的TMA核心的载玻片。从组织块上切下石蜡切片载玻片，然后在60度烘箱中干燥过夜。使用Dako靶标修复溶液ph 9.0EDTA(Dako目录#S2367)结合压力蒸煮30分钟，通过热诱导表位修复技术对载玻片进行脱蜡。然后将载玻片在DAKO自动染色仪(型号#S3800)中暴露于3％H2O2中10分钟，然后在室温下暴露于1:10稀释的原代普立木单抗抗体2小时。然后将载玻片暴露于聚合物-辣根过氧化物酶抗人lg/兔抗体30分钟，然后将载玻片暴露于DAB 10分钟并且用苏木精复染一分钟，然后将它们脱水并添加盖玻片。使用Aperio ST Turbo扫描仪来扫描TMA核心，并且连接到可用于组织形态学检查和评分的图像。查看软件是HistoWiz专有的。
TMA核心来自人大脑(CNS)组织，由胶质母细胞瘤、星形细胞瘤和正常大脑的实例组成。人胶质母细胞瘤TMA核心均显示出核或细胞质阳性。染色强度存在差异，但是这与胶质母细胞瘤的等级或类型无关。一个罕见的情况显示出强烈细胞质染色(参见图5A和5B)。具有饲肥星形细胞模式的胶质母细胞瘤均显示出中度细胞质染色。低等级星形细胞瘤也表现出核染色。正常大脑核心显示出星形胶质细胞染色。神经元表现出一定的颗粒状细胞质染色。参见图6A和6B。
总之，普立木单抗在所有星形细胞瘤和胶质母细胞瘤中均显示出阳性。不同情况下的染色强度存在差异。主要定位是核。细胞质染色通常较弱或不存在，但是有一个细胞质染色较强的情况。
Figure IDA0003580125380000011
Figure IDA0003580125380000021
Figure IDA0003580125380000031
Figure IDA0003580125380000041
Figure IDA0003580125380000051

Claims (21)

1.一种玻璃或聚对苯二甲酸乙二醇酯G(PETG)小瓶，其包含抗体，所述抗体包含含有SEQ ID NO:1的重链和含有SEQ ID NO:2的轻链。
2.如权利要求1所述的小瓶，其中所述小瓶是玻璃小瓶。
3.如权利要求1所述的小瓶，其中所述小瓶是PETG小瓶。
4.如权利要求1-5中任一项所述的小瓶，其中所述抗体具有8.0-9.0的等电点。
5.如权利要求4所述的小瓶，其中所述抗体具有约8.7的等电点。
6.如权利要求1-5中任一项所述的小瓶，其中所述抗体能够穿过血脑屏障。
7.如权利要求1-6中任一项所述的小瓶，其中所述抗体结合波形蛋白。
8.如权利要求7所述的小瓶，其中所述波形蛋白位于癌细胞的表面上。
9.如权利要求7所述的小瓶，其中所述波形蛋白由癌细胞分泌。
10.如权利要求8或权利要求9所述的小瓶，其中所述癌症选自脑癌和胰腺癌。
11.如权利要求1-10中任一项所述的小瓶，其中所述小瓶包含5mg/ml至15mg/ml的所述抗体。
12.如权利要求1-11中任一项所述的小瓶，其中所述抗体缀合至药剂。
13.如权利要求12所述的小瓶，其中所述药剂是治疗剂或诊断剂。
14.如权利要求13所述的小瓶，其中所述治疗剂是化学治疗剂。
15.如权利要求13所述的小瓶，其中所述诊断剂是荧光剂、放射性剂或化学发光剂。
16.如权利要求1-15中任一项所述的小瓶，其中所述小瓶能够长期储存。
17.如权利要求1至16中任一项所述的小瓶，其中所述抗体历经3个冻融循环保持其活性。
18.如权利要求1-17中任一项所述的小瓶，其中所述抗体能够在低于-60℃的温度下储存。
19.一种试剂盒，其包括如权利要求1-18中任一项所述的小瓶以及使用说明书。
20.一种递送抗体穿过血脑屏障的方法，其包括将来自如权利要求1-18中任一项所述的小瓶的所述抗体施用于受试者，从而递送所述抗体穿过所述血脑屏障。
21.一种治疗受试者的表达波形蛋白的癌症的方法，其包括将来自如权利要求1-18中任一项所述的小瓶的所述抗体施用于所述受试者，从而治疗所述受试者的所述表达波形蛋白的癌症。
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