CN116359323A - 一种卵泡液代谢指纹谱图、生物标志物组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种卵泡液代谢指纹谱图、生物标志物组合物及其应用，涉及生物检测技术领域，建立指纹谱图包括配制样本和基质溶液、样品和基质制备，使用基质辅助激光解吸电离傅里叶变换离子回旋共振质谱仪采集；卵巢储备功能预测包括将指纹谱图转为m/z信号，得到模型；构建卵巢储备功能生物标志物组合物包括收集样品、代谢的检测，得到精准分子量，鉴定出生物标志物组合；包括乳酸、琥珀酸、丙酮酸、葡萄糖和葡萄糖‑6‑磷酸；卵泡液代谢指纹谱图、卵巢储备功能预测的方法和卵巢储备功能生物标志物组合在预测卵巢储备功能的应用。本发明使用纳米颗粒增强激光解吸电离飞行时间质谱，检测卵泡液代谢指纹谱图，构建了机器学习模型，实现对卵巢储备功能减退的准确预测。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种卵泡液代谢指纹谱图、生物标志物组合物及其应用。
背景技术
卵巢储备(OR)和生育潜力反映了生殖潜能，这对女性的医疗保健至关重要。准确编码OR和生育潜力对于确定适当的治疗方法至关重要。据估计美国国家辅助生殖技术协会(SART)系统的数据估计，这将影响10-32％的育龄妇女。目前临床上对于编码OR和生育潜力的分析方法主要依赖于多种测试的组合，包括生化分析和超声成像。这些方法通常是基于选定的蛋白质生物标志物(例如作为促卵泡激素(FSH)和抗缪勒管激素(AMH))或物理测量(窦状卵泡计数(AFC))。由于此种方法从特定生物体液(如卵泡液(FF))获得的信息有限，因此无法作为多功能平台对OR和生育潜力进行编码。因此，建立一种能够提供全面代谢信息，并且通过单一测试实现编码OR和生育潜力的平台非常的重要，以便用于守护女性健康。
在生物流体中选择合适的生物标志物能够显著提升诊断性能，尤其是对于编码OR和生育潜力。在生物标志物的选择过程中，代谢物与核酸和蛋白质不同，它能够实时表征生物体的生理和病理过程。值得注意的是，大多数编码OR和生育能力的生物标志物是血液中的激素(例如FSH和AMH)。这些激素通过依赖垂体或卵泡的反馈间接评估卵巢储备功能。而卵巢中的卵泡液与OR、卵母细胞发育能力和胚胎活力的变化直接相关。因此，考虑到代谢物是代谢的终产物，FF中新的代谢生物标志物有望编码OR和生育能力。迄今为止，在FF中使用代谢生物标志物进行的编码OR和生育潜力的研究仍处于初步阶段，仅处理小队列(40～150)和只具备单一功能，如卵巢储备功能减退(dOR)的诊断。因此，在定义明确的队列中构建具有多功能的代谢生物标志物组，能够成为下一代的检测工具，显著提高诊断准确性和预测性能。
质谱(MS)是代谢生物标志物检测的一项基本技术，能够以无标记的方式测量化合物。使用传统MS技术，如色谱法(液相色谱或气相色谱，LC/GC)的需要预处理和样品富集以克服生物流体的高度复杂性和代谢物的低丰度，阻碍了其广泛应用。更重要的是，激光解吸/电离(LDI)MS可通过微阵列芯片上特定的基质材料来选择性捕获代谢物，以最少的样品预处理(低至分钟/样品)和高灵敏度(低至pmol)处理生物流体，从而实现高效分析。迄今为止，基于LDI MS的代谢指纹分析方案已经用于检测各种生物流体(例如血清、尿液和泪液)的检测。然而，目前尚未开发出使用LDI MS构建卵泡液代谢指纹图谱(MFFF)的方案。此外，另一个挑战是MFFF在编码OR和生育能力方面的具体应用。因此，使用基于LDI MS构建MFFF，将提供一个有效的多功能平台来表征OR和生育能力，从而支持女性的医疗保健。
现有技术的缺点是常规检测代谢卵泡液代谢指纹图谱的方法样本用量大，预处理复杂。常规编码卵巢储备功能和生育能力的检测繁琐，检测性能受限；目前尚缺乏能够有效编码卵巢储备功能的代谢标志物组合。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种纳米颗粒增强激光解吸电离飞行时间质谱得到的卵泡液代谢指纹图谱，能够提供全面代谢信息，并且通过单一测试实现编码OR和生育潜力的预测，且样本用量小，预处理简单；以及有效编码卵巢储备功能的代谢标志物组合。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何利用纳米颗粒增强激光解吸电离飞行时间质谱得到卵泡液代谢指纹图谱，提供全面代谢信息，并且通过单一测试实现编码OR和生育潜力的预测，且样本用量小，预处理简单；以及获得有效编码卵巢储备功能的代谢标志物组合。
为实现上述目的，本发明提供了一种建立卵泡液代谢指纹谱图的方法，包括以下步骤：
步骤1、将卵泡液样本用去离子水稀释，得到样本溶液。
步骤2、将无机纳米颗粒用去离子水配成基质溶液。
步骤3、在质谱靶板上进行样品制备，将每个步骤1得到的样本溶液点样1μL，室温下干燥，得到点样后的质谱靶板；
步骤4、在步骤3得到的点样后的质谱靶板上用步骤2得到的基质溶液点样1μL，室温下干燥，进行基质制备，得到制备好的质谱靶板；
步骤5、将步骤4得到的制备好的质谱靶板在基质辅助激光解吸电离质谱仪中进行卵泡液代谢指纹采集，得到卵泡液代谢指纹谱图。
进一步地，步骤1中稀释倍数为10倍，步骤2中基质溶液的浓度为1mg/mL。
进一步地，使用纳米颗粒增强激光解吸电离飞行时间质谱，检测卵泡液代谢指纹谱图。
本发明还提供了一种卵巢储备功能预测的方法，包括以下步骤：
步骤⑴、收集卵泡液样品；
步骤⑵、使用纳米颗粒增强激光解吸电离飞行时间质谱技术，对步骤⑴得到的卵泡液样品进行卵泡液代谢的检测，得到卵泡液代谢指纹谱图；
步骤⑶、对步骤⑵得到的卵泡液代谢指纹谱图通过MATLAB软件进行数据预处理，得到样品的m/z信号；
步骤⑷、将步骤⑶得到的m/z信号通过Orange软件进行岭回归算法的机器学习，得到训练好的模型，并进行卵巢储备功能的预测。
进一步地，步骤⑴中卵泡液样品包括健康对照样本和卵巢储备功能减退的样本；步骤⑶还包括将m/z信号分为训练集和测试集。
进一步地，步骤⑶还包括卵泡液代谢指纹谱图的数据预处理，数据预处理包括谱线平滑、基线校正和谱峰联配。
进一步地，对344个卵巢储备功能减退样本和健康对照卵泡液代谢指纹谱图进行机器学习，构建了机器学习模型，实现了卵巢储备功能减退以及获取高质量卵子/胚胎的能力的预测。
本发明还提供了一种构建卵巢储备功能生物标志物组合物的方法，包括以下步骤：
步骤1)、收集卵泡液样品；
步骤2)、使用纳米颗粒增强激光解吸电离飞行时间质谱技术，对步骤1)得到的卵泡液样品进行卵泡液代谢的检测，得到生物标志物的精准分子量；
步骤3)、对质谱检测结果进行分析，鉴定出卵巢储备功能生物标志物组合。
进一步地，构建卵巢储备功能减退诊断代谢物组合(包含5个代谢物)，实现对卵巢储备功能减退的准确预测。
本发明还提供了一种卵巢储备功能生物标志物组合，包括5个代谢物，分别为乳酸、琥珀酸、丙酮酸、葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸。
本发明还提供了一种建立卵泡液代谢指纹谱图的方法在预测卵巢储备功能的应用。
本发明还提供了一种卵巢储备功能预测的方法在预测卵巢储备功能的应用。
本发明还提供了一种卵巢储备功能生物标志物组合在预测卵巢储备功能的应用。
在本发明的较佳实施方式1中，详细说明使用纳米颗粒增强激光解吸电离飞行时间质谱技术，进行卵泡液代谢指纹谱图成像的过程；
在本发明的另一较佳实施方式2中，详细说明对卵巢储备功能减退病人和健康对照组卵泡液样本代谢指纹谱图进行机器学习，实现编码储备功能和生育潜力的过程；
在本发明的另一较佳实施方式2中，详细说明构建卵巢储备功能减退诊断代谢物组合，实现对卵巢储备功能减退的准确预测的过程。
本发明有益的技术效果如下：
1、应用纳米颗粒增强激光解吸电离飞行时间质谱获得卵泡液样本代谢指纹谱图，以快的检测速度(约30s/样本)，高灵敏度(低至pmol)以及高可重复性(CV<15％)直接检测卵泡液中的代谢物，能够快速、高零度和直接检测卵泡液中的代谢标志物。
2、采用机器学习对卵泡液中代谢指纹图谱进行分析，构建了准确诊断卵巢储备功能减退的模型。此模型挖掘了卵泡液中代谢信息，还能进行生育能力的预测。进而有助于实现预测卵巢储备功能是否减退和能否获得优质卵子和优质胚胎的潜力。
3、通过特征筛选，筛选出机器学习模型中性能最好的标志物，构建卵巢储备功能减退诊断代谢物组合(包含5个代谢物)，实现对卵巢储备功能减退的准确预测，即以少量标志物就能实现预测卵巢储备功能是否减退。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的一个较佳实施例2的卵巢储备功能减退和健康对照的卵泡液代表性代谢指纹谱图；
图2是本发明的一个较佳实施例2的344个卵巢储备功能减退样本及健康对照卵泡液代谢指纹谱图预处理后304个m/z信号对应热图；
图3是本发明的一个较佳实施例2的预测是否能获得优质卵子的概率差异分析图；
图4是本发明的一个较佳实施例2的预测是否能获得优质胚胎的概率差异分析图。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
实施例1使用纳米颗粒增强激光解吸电离飞行时间质谱技术，进行泪卵泡液代谢指纹谱图成像：
步骤1.1：仪器与试剂的准备：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，卵泡液样本，去离子水，基质(无机纳米颗粒)；
步骤1.2：将卵泡液样本用去离子水稀释10倍。
步骤1.3：将无机纳米颗粒用去离子水配成1mg/mL的基质溶液。
步骤1.4：在质谱靶板上进行样品制备，将每个稀释后的卵泡液样本点样1μL，室温下干燥；
步骤1.5：在质谱靶板上进行基质制备，每个基质溶液点样1μL，室温下干燥；
步骤1.6：在基质辅助激光解吸电离傅里叶变换离子回旋共振质谱仪中进行卵泡液代谢指纹采集；
步骤1.7：得到卵泡液代谢指纹谱图，用于后续分析。
实施例2对卵巢储备功能减退病人和健康对照组卵泡液样本代谢指纹谱图进行机器学习，实现编码储备功能和生育潜力：
步骤2.1：仪器、试剂和分析软件的准备：MATLAB(R2022a)，Orange(3.25.0)；
步骤2.2：通过步骤2.1，对141个卵巢储备功能减退的卵泡液液样本和203个健康对照卵泡液样本进行代谢指纹谱图成像。卵巢储备功能减退和健康对照的卵泡液代表性代谢指纹谱图如图1所示，上部分图表示卵巢储备功能减退样本的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱指纹图谱，下部分图表示卵巢储备功能健康样本的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱指纹图谱；
步骤3：在MATLAB(R2022a)上对344个样本的卵泡液代谢指纹进行预处理，包括谱线平滑、基线校正和谱峰联配，得到304个m/z信号。344个卵巢储备功能减退样本及健康对照卵泡液代谢指纹谱图预处理后304个m/z信号对应热图如图2所示，上部分图表示344个卵巢储备功能减退样本卵泡液代谢指纹谱图预处理后304个m/z信号中的141个信号的热图，下部分表示健康对照预处理后203个m/z信号的对应热图；
步骤4：将344个卵泡液样本划分成训练集(203个样本，包括111个卵巢储备功能减退病人和164个健康对照)和测试集(69个样本，包括30个卵巢储备功能减退病人和39个健康对照)；
步骤5：在Orange(3.25.0)上使用岭回归算法在训练集进行模型训练，得到模型在训练集上的性能，如表1左部分所示；
步骤6：在Orange(3.25.0)上使用步骤5中训练好的模型在测试集进行预测，得到岭回归在测试集上对于卵巢储备功能减退样品的性能；如表1右部分所示，其中AUC表示曲线下面积，AUC越接近1.0，检测方法真实性越高。
表1 304个m/z特征训练得到的岭回归在训练集和测试集中的性能
步骤7：计算上述Orange(3.25.0)上获得卵巢储备功能减退病人的患病概率，对123个具有高质量卵子的卵巢储备功能减退病人和16个没有获得卵子的卵巢储备功能减退病人的患病概率进行统计分析，计算两组概率差异。预测是否能获得优质卵子的概率差异分析如图3所示，无卵子组与能获得高质量卵子组之间的概率具有显著的差异，无卵子组的在模型中的患病概率更高，更加接近1；
步骤8：对上述的123个具有高质量卵子的病人根据是否获得优质胚胎进行分组，对80个具有高质量胚胎的病人和40个没有获得高质量胚胎的患病概率进行统计分析，计算两组之间患病概率差异。预测是否能获得优质胚胎的概率差异分析如图4所示，无胚胎组和获得优质胚胎组之间的概率存在显著差异，其中无胚胎组在模型中的患病概率更接近1。
无卵子组与能获得高质量卵子组、无胚胎组和获得优质胚胎组之间，这两组之间的患病概率存在显著差异，即p<0.05,证明两组之间是有差异的。说明本发明提供的卵泡液样本代谢指纹谱图可以用来对后续获取优质卵子和优质胚胎的能力进行预测。
实施例3构建卵巢储备功能减退诊断代谢物组合，实现对卵巢储备功能减退的准确预测：
步骤1：仪器与试剂的准备：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，基质辅助激光解吸电离傅里叶变换离子回旋共振质谱，卵泡液样本，去离子水，基质(无机纳米颗粒)；
步骤2：将卵泡液样本本用去离子水稀释10倍；
步骤3：将无机纳米颗粒用去离子水配成1mg/mL的基质溶液；
步骤4：在质谱靶板上进行样品制备，每个稀释后的房水样本点样1μL，室温下干燥；
步骤5：在质谱靶板上进行基质制备，每个基质溶液点样1μL，室温下干燥；
步骤6：在基质辅助激光解吸电离傅里叶变换离子回旋共振质谱仪中得到生物标志物的精准分子量；
步骤7：对质谱检测结果进行分析，鉴定出5个代谢生物标志物，标志物组合中5个代谢生物标志物相关信息如表2所示；
表2.标志物组合中5个代谢生物标志物相关信息
步骤8：相比于单个标志物，5个标志物组合在诊断卵巢储备功能减退时表现出最好的性能。每个单个生物标志物编码卵巢储备功能减退的AUC值如表3所示。
表3.单个生物标志物编码卵巢储备功能减退的AUC值
生物标志物组合与每个单个生物标志物编码卵巢储备功能减退的能力曲线中乳酸、琥珀酸、丙酮酸、葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸单个生物标志物编码卵巢储备功能减退的能力随特异性的增加敏感性也升高，与之相比，生物标志物组合的编码卵巢储备功能减退的能力强于单个标志物的编码能力。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种建立卵泡液代谢指纹谱图的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1、将卵泡液样本用去离子水稀释，得到样本溶液；
步骤2、将无机纳米颗粒用去离子水配成基质溶液；
步骤3、在质谱靶板上进行样品制备，将每个步骤1得到的样本溶液点样1μL，室温下干燥，得到点样后的质谱靶板；
步骤4、在步骤3得到的点样后的质谱靶板上用步骤2得到的基质溶液点样1μL，室温下干燥，进行基质制备，得到制备好的质谱靶板；
步骤5、将步骤4得到的制备好的质谱靶板在基质辅助激光解吸电离质谱仪中进行卵泡液代谢指纹采集，得到所述卵泡液代谢指纹谱图。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中所述稀释倍数为10倍：所述步骤2中所述基质溶液的浓度为1mg/mL。
3.一种卵巢储备功能预测的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤⑴、收集卵泡液样品；
步骤⑵、使用纳米颗粒增强激光解吸电离飞行时间质谱技术，对步骤⑴得到的卵泡液样品进行卵泡液代谢的检测，得到卵泡液代谢指纹谱图；
步骤⑶、对步骤⑵得到的卵泡液代谢指纹谱图通过MATLAB软件进行数据预处理，得到样品的m/z信号；
步骤⑷、将步骤⑶得到的m/z信号通过Orange软件进行岭回归算法的机器学习，得到训练好的模型，并进行所述卵巢储备功能的预测。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤⑴中卵泡液样品包括健康对照样本和卵巢储备功能减退的样本；所述步骤⑶还包括将所述m/z信号分为训练集和测试集。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤⑶中所述数据预处理包括谱线平滑、基线校正和谱峰联配。
6.一种构建卵巢储备功能生物标志物组合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1)、收集卵泡液样品；
步骤2)、使用纳米颗粒增强激光解吸电离飞行时间质谱技术，对步骤1)得到的卵泡液样品进行卵泡液代谢的检测，得到所述生物标志物的精准分子量；
步骤3)、对质谱检测结果进行分析，鉴定出所述卵巢储备功能生物标志物组合。
7.一种卵巢储备功能生物标志物组合，其特征在于，所述组合包括5个代谢物，分别为乳酸、琥珀酸、丙酮酸、葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸。
8.如权利要求1或2所述的建立卵泡液代谢指纹谱图的方法在预测卵巢储备功能的应用。
9.如权利要求3-5任一项所述的卵巢储备功能预测的方法在预测卵巢储备功能的应用。
10.如权利要求7所述的卵巢储备功能生物标志物组合在预测卵巢储备功能的应用。
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