CN116356003A - 一种高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法，本发明涉及细胞谱系追踪技术领域，具体包括以下步骤：选取序列完全不同的单向RNA1、单向RNA2、单向RNA3和单向RNA4备用，选取单细胞克隆扩增制备具有13个编辑位点的谱系条形码备用；采用细胞谱系条形码技术对单向RNA1、单向RNA2、单向RNA3和单向RNA4分别与谱系条形码的13个编辑位点匹配。该高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法，增加谱系条形码在所有细胞中的平均表达量，降低了编辑位点被消耗的速度，增加了可追踪时间，同时降低了跨位点缺失突变的比例，获得的细胞谱系树单个叶子的比例高，实现了分辨率为单个细胞级别的谱系树测定方法，降低克隆扩增中细胞的死亡率，以及细胞消化中的损失率。
Description
技术领域
本发明涉及细胞谱系追踪技术领域，具体为一种高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法。
背景技术
追踪细胞间表型差异及进化趋势，是细胞生物学和演化生物学的基本目标之一。高通量单细胞测序的最新进展，已经使得我们能从百万个单细胞的级别描述人正常组织和肿瘤/癌症的全转录组图谱。从演化生物学的角度重新进行思考，依赖于基因表达差异比较分析得到的是细胞类型之间的相似性，而不能代表细胞有丝分裂的历史，将生物群体演化思想的“物种演化树”进一步拓展到细胞群体演化的“细胞谱系树”方法，则能够将细胞间的有丝分裂关系对应到全转录组图谱，并实现基因表达差异和有丝分裂历史间的详细比较，因而，能准确的揭示生命过程中一般规律和模式的有力武器，是细胞谱系树技术，而非单纯的单细胞全转录组图谱技术。
基于追踪细胞间有丝分裂历史而建立的细胞谱系树技术第一次在线虫中成功测定，距今已有40年左右。细胞谱系树技术发展至今，大致可以分为两类：依据光学显微镜的分析方法，依据DNA谱系条形码测序结果重构的分析方法。光学显微镜分析方法主要包括：直接观察记录绘图的方法、基于示踪染料(活体示踪染料和右旋糖酐/碳菁染料)标记的方法，基于荧光显微镜的Brainbow系列等。这类技术的优势主要是观察结果直观，但缺点也较为明显，如分辨率较低，难以对非透明的组织进行直接观察等。依据DNA谱系条形码测序结果重构的分析方法，则不受组织/胚胎透明度的限制，且由于DNA条形码的多样性非常高，故而分辨率通常远超前者。DNA条形码技术又可以分为两类：不依赖DNA突变的Clonalbarcode技术和依赖DNA突变的Lineage barcode技术。Clonal barcode技术主要应用于高通量的追踪单个祖细胞的增殖速率或分化命运，而不关心其后代细胞之间的谱系关系。Lineage barcode技术应用于追踪同一起源的后代细胞之间的谱系关系，其中较成功的是基于CRISPR/Cas9随机插入和缺失突变的GESTALT、CARLIN技术等。虽然Clonal barcode和Lineage barcode技术相结合，成功在肺癌细胞增殖和转移过程中实现了高通量追踪单细胞级别的细胞谱系关系图谱，然而过低的分辨率/覆盖度使得该数据不足以应用树的比对方法(排除共同祖先对子细胞间基因表达相关性及表型相关性的影响)来进行基因表达差异和有丝分裂历史的详细比较。
根据上述说明，现有技术谱系树的精度及对原始细胞群体的覆盖度均较低，对整个细胞群体的有丝分裂历史的追踪存在较大程度的缺失，其导致原因为：用于测序的细胞数量太少，降低谱系树对细胞群体的覆盖度；用于谱系追踪的lineage barcode表达量过低，在单细胞测序中丢失，进一步降低了谱系树的覆盖度；大部分lineage barcode含有跨越编辑位点的长缺失突变，这将降低可以继续编辑的位点数目，并可能剪掉已经发生的编辑事件，降低了谱系树的精度；大部分位点通常在2-4天内被编辑完毕，谱系追踪时间过短；lineage barcode的大部分基因型均存在于多个细胞中，无法区分，这限制了依赖树的单细胞表达差异比较。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法，解决了现有技术谱系树的精度及对原始细胞群体的覆盖度均较低，对整个细胞群体的有丝分裂历史的追踪存在较大程度的缺失问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法，具体包括以下步骤：
S1、选取序列完全不同的单向RNA1、单向RNA2、单向RNA3和单向RNA4备用，选取单细胞克隆扩增制备具有13个编辑位点的谱系条形码备用；
S2、采用细胞谱系条形码技术对单向RNA1、单向RNA2、单向RNA3和单向RNA4分别与谱系条形码的13个编辑位点匹配，得到谱系条形码序列；
S3、将S1所述的谱系条形码与绿色荧光蛋白基因及抗性基因组成一个融合基因；
S4、采用单细胞测序平台捕获S3所述具有融合基因的谱系条形码。
优选的，在步骤S1中，单细胞为单个HEK293细胞，单个HEK293细胞连续分裂下克隆扩增10天得到谱系条形码。
优选的，在步骤S2中，所述单向RNA1与谱系条形码的13个编辑位点中2个以上的编辑位点错配，降低了跨位点缺失突变的比例，增加了可追踪的时间；获得的细胞谱系树单个叶子的比例高，实现了分辨率为单个细胞级别的谱系树测定方法。
优选的，在步骤S2中，所述单向RNA2、单向RNA3和单向RNA4分别与谱系条形码的第9、12和13编辑位点匹配，编辑位点第9、12和13的匹配编辑效率较低。
优选的，在步骤S2中，跟据错配碱基数量及碱基类型的差异，单向RNA1、单向RNA2与谱系条形码的13个编辑位点的编辑效率逐渐降低，降低跨位点缺失突变的比例。
优选的，在步骤S2中，依据CFD技术打分策略，谱系条形码跨编辑位点缺失突变的比例为8.8％，且单细胞叶子的比例为90％。
优选的，在步骤S3中，采用高浓度的抗生素筛选融合基因，有利于筛选到融合基因表达更高的细胞克隆。
优选的，在步骤S3中，绿色荧光蛋白基因亮度的观测有利于筛选到该融合基因表达更高的样品。
优选的，在步骤S4中，通过单细胞测序平台捕获具有融合基因的谱系条形码的概率约为90％。
有益效果
本发明提供了一种高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法。与现有技术相比具备以下有益效果：
1、该高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法，提高了谱系树的精度，增加谱系条形码在所有细胞中的平均表达量，谱系条形码的13个编辑位点和单向RNA均存在2个以上的错配，降低了编辑位点被消耗的速度，增加了可追踪时间，同时降低了跨位点缺失突变的比例，获得的细胞谱系树单个叶子的比例高，实现了分辨率为单个细胞级别的谱系树测定方法。
2、该高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法，提高了谱系树的覆盖度，降低克隆扩增中细胞的死亡率，以及细胞消化中的损失率，且所有单细胞均应用于细胞谱系追踪。
附图说明
图1为本发明谱系追踪系统所包含的基因结构示意图；
图2为本发明的单个细胞连续培养的细胞状态观测示意图；
图3为本发明的同时捕获谱系条形码及转录组数据的实验流程图；
图4为本发明的单个细胞中谱系条形码的表达量的谱系树质量参数验证图；
图5为本发明的谱系树精确度示例图；
图6为本发明的祖先条形码示例图；
图7为本发明的祖先条形码表达量的谱系树质量参数验证图；
图8为本发明的细胞间亲缘关系的谱系树质量参数验证图。
图中：1、单向RNA1；2、单向RNA2；3、单向RNA3；4、单向RNA4；5、谱系条形码。
具体实施方式
对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-8，本发明实施例提供一种技术方案：一种高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法，具体包括以下步骤：S1、选取序列完全不同的单向RNA11、单向RNA22、单向RNA33和单向RNA44备用，选取单细胞克隆扩增制备具有13个编辑位点的谱系条形码5备用；S2、采用细胞谱系条形码技术对单向RNA11、单向RNA22、单向RNA33和单向RNA44分别与谱系条形码5的13个编辑位点匹配，得到谱系条形码5序列；S3、将S1的谱系条形码5与绿色荧光蛋白基因及抗性基因组成一个融合基因；S4、采用单细胞测序平台捕获S3具有融合基因的谱系条形码5。
参照附图4，图中B部分表示最大简约算法的36个权重，图中C部分表示采用最大似然算法的190种权重，根据编辑事件发生的概率，确定其权重，权重太少的话，发生概率差异不大的编辑事件就被定义为相同的权重，这样就无法区分，而权重多的优势，就是可以区分相差不大的编辑事件，分辨率更高。最大简约和最大似然建树流程：谱系条形码测序数据质控后，按照中间40bp重合序列连接，和参考序列比对，统计编辑事件的种类及发生频率，依据编辑事件发生的频率，给每个编辑事件定义权重，权重的定义方法有两种：最大简约算法，最大似然算法，依据编辑事件的种类和每种编辑事件的权重，为每条序列生成一个序列文件和一个对应的权重文件，依据权重文件和序列文件分别按照最大简约算法和最大似然算法生成谱系树。
在步骤S1中，单细胞为单个HEK293细胞，单个HEK293细胞连续分裂下克隆扩增10天得到谱系条形码5。在步骤S2中，单向RNA11与谱系条形码5的13个编辑位点中2个以上的编辑位点错配，降低了跨位点缺失突变的比例，增加了可追踪的时间；获得的细胞谱系树单个叶子的比例高，实现了分辨率为单个细胞级别的谱系树测定方法。在步骤S2中，单向RNA22、单向RNA33和单向RNA44分别与谱系条形码5的第9、12和13编辑位点匹配，编辑位点第9、12和13的匹配编辑效率较低。在步骤S2中，跟据错配碱基数量及碱基类型的差异，单向RNA11、单向RNA22与谱系条形码5的13个编辑位点的编辑效率逐渐降低，降低跨位点缺失突变的比例。在步骤S2中，依据CFD技术打分策略，谱系条形码5跨编辑位点缺失突变的比例为8.8％，且单细胞叶子的比例为90％。在步骤S3中，采用高浓度的抗生素筛选融合基因，有利于筛选到融合基因表达更高的细胞克隆。在步骤S3中，绿色荧光蛋白基因亮度的观测有利于筛选到该融合基因表达更高的样品。在步骤S4中，通过单细胞测序平台捕获具有融合基因的谱系条形码5的概率约为90％，基于条形码的单细胞识别，它的主要思想是，给每个细胞加上独一无二的DNA序列，这样在测序的时候，就把携带相同条形码的序列视为来自同一个细胞了，这种策略，可以通过一次建库，测得数百上千个单细胞的信息，将细胞条形码和RT裂解试剂共封装到微流体液滴中，收集到所需数量的细胞后，通过光裂解从水凝胶珠中释放条形码引物，以启动mRNA的逆转录，比例尺为100um，细胞和水凝胶珠粒包封后，使用>350nm紫外光从珠粒中释放条形码cDNA引物，然后进行mRNA捕获和逆转录。
已知谱系条形码的序列特征是决定谱系树精度的第一要素，已有方法通常使用10种序列完全不同的单向RNA，每种单向RNA均100％的匹配谱系条形码的各个编辑位点，这样在细胞增殖的过程中，2个或多个单向RNA同时靶定谱系条形码不同编辑位点的概率较高，因而编辑位点被消耗的速度较快，且多数为跨越编辑位点的长缺失突变，这不仅降低了可应用于谱系追踪的时间，也降低了细胞间的可辨识度，为了解决上述问题，本发明的谱系树中只包括单向RNA11，单向RNA22，单向RNA33和单向RNA44，其中单向RNA11与谱系条形码5的13个编辑位点均有2个以上的错配，单向RNA22、单向RNA33和单向RNA44分别匹配编辑效率较低的第9、12和13编辑位点，依据错配碱基数量及碱基类型的差异，依据CFD技术打分策略，单向RNA11、单向RNA22与谱系条形码5 13个编辑位点的编辑效率逐渐降低，在此基础上，本发明将跨位点缺失突变的比例降低到8.8％，且单细胞叶子的比例提高到90％。谱系条形码的捕获率及细胞捕获率是决定谱系树覆盖度的第一要素，在已有的方法中，谱系条形码通常难以转录出较多的mRNA分子，因而其单细胞测序平台捕获的概率为5％-25％，本发明的方法将谱系条形码5与绿色荧光蛋白基因，抗性基因组成一个融合基因，采用高浓度的抗生素进行筛选，有利于筛选出该融合基因表达更高的细胞克隆，在谱系追踪过程中，绿色荧光蛋白亮度的观测有利于筛选出该融合基因表达更高的样品，以上措施将谱系条形码5被捕获的概率提高到约为90％。已有的方法通常对斑马鱼胚胎或小鼠某个组织所有细胞进行消化，之后仅取少量细胞进行单细胞测序，由于单细胞测序的细胞捕获率约60％，获得谱系树对细胞群体的覆盖度更低，这样相当于从完整的谱系树中进行低丰度的随机抽样，无法较准确的描述生命发生过程中的一般规律，而本发明的方法，主要应用与单个细胞开始的谱系追踪，在经过细胞培养条件优化和质控，消化条件优化和质控，单细胞上机条件优化和质控后，本发明成功获得了占单细胞克隆扩增10天过程中约50％细胞的谱系树。本发明提高了谱系树的精度，增加谱系条形码5在所有细胞中的平均表达量，谱系条形码5的13个编辑位点和单向RNA均存在2个以上的错配，降低了编辑位点被消耗的速度，增加了可追踪时间，同时降低了跨位点缺失突变的比例，获得的细胞谱系树单个叶子的比例高，实现了分辨率为单个细胞级别的谱系树测定方法；提高了谱系树的覆盖度，降低克隆扩增中细胞的死亡率，以及细胞消化中的损失率，且所有单细胞均应用于细胞谱系追踪。
同时本说明书中未作详细描述的内容均属于本领域技术人员公知的现有技术。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (9)
1.一种高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
S1、选取序列完全不同的单向RNA1(1)、单向RNA2(2)、单向RNA3(3)和单向RNA4(4)备用，选取单细胞克隆扩增制备具有13个编辑位点的谱系条形码(5)备用；
S2、采用细胞谱系条形码技术对单向RNA1(1)、单向RNA2(2)、单向RNA3(3)和单向RNA4(4)分别与谱系条形码(5)的13个编辑位点匹配，得到谱系条形码(5)序列；
S3、将S1所述的谱系条形码(5)与绿色荧光蛋白基因及抗性基因组成一个融合基因；
S4、采用单细胞测序平台捕获S3所述具有融合基因的谱系条形码(5)。
2.根据权利要求1所述的一种高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法，其特征在于：在步骤S1中，单细胞克隆扩增时长为10天。
3.根据权利要求1所述的一种高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法，其特征在于：在步骤S2中，所述单向RNA1(1)与谱系条形码(5)的13个编辑位点中2个以上的编辑位点错配。
4.根据权利要求1所述的一种高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法，其特征在于：在步骤S2中，所述单向RNA2(2)、单向RNA3(3)和单向RNA4(4)分别与谱系条形码(5)的第9、12和13编辑位点匹配。
5.根据权利要求1所述的一种高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法，其特征在于：在步骤S2中，跟据错配碱基数量及碱基类型的差异，单向RNA1(1)、单向RNA2(2)与谱系条形码(5)的13个编辑位点的编辑效率逐渐降低。
6.根据权利要求1所述的一种高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法，其特征在于：在步骤S2中，谱系条形码(5)跨编辑位点缺失突变的比例为8.8％，且单细胞叶子的比例为90％。
7.根据权利要求1所述的一种高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法，其特征在于：在步骤S3中，采用高浓度的抗生素筛选融合基因，有利于筛选到融合基因表达更高的细胞克隆。
8.根据权利要求1所述的一种高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法，其特征在于：在步骤S3中，绿色荧光蛋白基因亮度的观测有利于筛选到该融合基因表达更高的样品。
9.根据权利要求1所述的一种高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法，其特征在于：在步骤S4中，通过单细胞测序平台捕获具有融合基因的谱系条形码(5)的概率约为90％。
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