CN116355847A - 调节性t细胞外泌体的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种调节性T细胞外泌体的制备方法及应用，包括如下步骤：从脐血中提取调节性T细胞，对提取的调节性T细胞进行扩增，得到扩增后的脐血调节性培养液；取扩增后的脐血调节性培养液的上清，在200～10000×g的离心力下进行至少一次离心处理，收集离心后的上清；取所得上清，在3000～20000×g的离心力下进行至少一次离心处理，收集离心后的上清；取所得上清，对所得上清进行过滤和离心处理，获得调节性T细胞外泌体；或使所得上清经纳米孔通过，以去除其中杂蛋白，获得调节性T细胞外泌体。所得调节性T细胞外泌体具有抑制糖尿病患者的炎症细胞的增殖能力，可应用于糖尿病药物中。

Description

调节性T细胞外泌体的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及细胞治疗技术领域，特别地，涉及一种调节性T细胞外泌体的制备方法及应用。
背景技术
调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)是一类CD4+CD25+T细胞亚群，具有重塑免疫平衡和诱导自身耐受的功能。Treg细胞是近年来免疫学领域研究的热点，其在治疗移植物抗宿主病等免疫性疾病中的安全性及有效性已得到证实。免疫性疾病由于患者自身免疫系统紊乱导致机体多种器官组织功能受损。免疫性疾病谱分布广泛，包括多种疾病，如糖尿病、系统性红斑狼疮等。其治疗现多依赖于免疫抑制剂等传统治疗方法，但疾病的主因—免疫调节机制紊乱并未得到解决。调节性T细胞疗法的应用为这类疾病的治疗提供了新的思路。脐血中含有大量的调节性T细胞，具有免疫原性低、数量多、易获取等优点，通过静脉输入可以进入体内发挥其免疫调节作用，有希望重建免疫性疾病患者的免疫平衡。
脐血调节性T细胞作为异体来源细胞，在受体中只能存活14天左右而被受体免疫细胞清除。细胞外泌体是由细胞分泌的具有双层磷脂膜结构的囊泡小体，它可以携带蛋白质、脂肪和核酸等多种生物活性成分，具有免疫原性低和生物安全性高等优势。现有技术在利用脐血制备调节性T细胞外泌体时，采用离心处理获得调节性T细胞之外的上清，一般被当作废物丢弃，由此导致对脐血的利用率不够，造成资源浪费。
发明内容
本发明提供了一种调节性T细胞外泌体的制备方法及应用，以解决现有技术用脐血制备调节性T细胞时对脐血的利用率不够，造成资源浪费的技术问题。
根据本发明的一个方面，提供一种调节性T细胞外泌体的制备方法，包括如下步骤：
(1)从脐血中提取调节性T细胞，对提取的调节性T细胞进行扩增，得到扩增后的脐血调节性培养液；
(2)取所述扩增后的脐血调节性培养液的上清，在200～10000×g的离心力下进行至少一次离心处理，收集离心后的上清；
(3)取步骤(2)所得上清，在3000～20000×g的离心力下进行至少一次离心处理，收集离心后的上清；
(4)取步骤(3)所得上清，对所得上清进行离心处理，获得调节性T细胞外泌体，其中，离心处理的离心力为100000～200000×g；
或使步骤(3)所得上清通过纳米孔，以去除其中杂蛋白，获得调节性T细胞外泌体，其中，纳米孔为30nm。
进一步地，步骤(2)中的至少一次离心处理包括：取所述扩增后的脐血调节性培养液的上清，采用200～500×g的离心力进行第一次离心处理，去除沉淀，收集上清；取第一次离心处理所得上清，采用500～10000×g的离心力进行第二次离心处理，去除凋亡体和细胞碎片，再次获得上清。
进一步地，所述第一次离心处理的温度为0～10℃，时间为10～20min。
进一步地，所述第二次离心处理的温度为4～25℃，时间为10～30min。
进一步地，步骤(3)中的至少一次离心处理包括：取步骤(2)中最后一次离心所得上清，采用3000～20000×g的离心力进行第N次离心处理，去除沉淀，收集上清，其中，N为大于等于2的整数。
进一步地，步骤(3)中的至少一次离心处理还包括：取第N次离心处理所得上清，采用3000～20000×g的离心力进行第N+1次离心处理，再次去除沉淀，收集上清。
进一步地，步骤(3)中的离心处理的温度为4～25℃，时间为10～60min。
进一步地，步骤(4)中的离心处理的温度为4～25℃，时间为60～90min。
进一步地，步骤(4)中利用EXODUS全自动外泌体提取系统完成使所得上清通过纳米孔，以去除所述上清中的杂蛋白，获得调节性T细胞外泌体的步骤。
根据本发明的另一方面，还提供了一种调节性T细胞外泌体的制备方法制得的调节性T细胞外泌体在糖尿病药物中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的调节性T细胞外泌体的制备方法可利用细胞制备过程中废弃的上清经进一步处理得到，得到的调节性T细胞外泌体具有抑制糖尿病患者的炎症细胞的增殖能力，可应用于免疫相关性疾病的治疗。免疫性疾病由于患者自身免疫系统紊乱导致机体多种器官组织功能受损。免疫性疾病谱分布广泛，包括多种疾病，如自身免疫糖尿病、系统性红斑狼疮等，其治疗现多依赖于免疫抑制剂等传统治疗方法，但疾病的主因—免疫调节机制紊乱并未得到解决。脐血调节性T细胞(Treg)是一类CD4+CD25+T细胞亚群，具有重塑免疫平衡和诱导自身耐受的功能。脐血Treg细胞在治疗移植物抗宿主病等免疫性疾病中的安全性及有效性已得到证实。然而，脐血调节性T细胞作为异体来源细胞，在受体中只能存活14天左右而被受体免疫细胞清除。Treg细胞分泌的外泌体是Treg细胞发挥作用的重要功能部分。Treg细胞外泌体是由Treg细胞分泌的具有双层磷脂膜结构的囊泡小体，它可以携带蛋白质、脂肪和核酸等多种生物活性成分，具有免疫原性低和生物安全性高等优势。在移植物抗宿主病等疾病模型中，脐血Treg分泌的外泌体已被证实可以有效调节免疫并对延缓疾病进展有积极作用。脐血Treg外泌体有望解决异体排斥问题，同时有望成为新的治疗自身免疫疾病的药物。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是本发明实施例1的调节性T细胞免疫抑制功能的检测图；
图2是本发明实施例1的不同浓度的调节性T细胞外泌体抑制CFSE标记的PBMC增殖的示意图；
图3是本发明实施例2的不同浓度的调节性T细胞外泌体抑制CFSE标记的PBMC增殖的示意图；
图4是实施例1与实施例2获得的外泌体产量的对比图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
为了简便，本文仅明确地公开了一些数值范围。然而，任意下限可以与任何上限组合形成未明确记载的范围；以及任意下限可以与其它下限组合形成未明确记载的范围，同样任意上限可以与任意其它上限组合形成未明确记载的范围。此外，尽管未明确记载，但是范围端点间的每个点或单个数值都包含在该范围内。因而，每个点或单个数值可以作为自身的下限或上限与任意其它点或单个数值组合或与其它下限或上限组合形成未明确记载的范围。
在本文的描述中，需要说明的是，除非另有说明，“以上”、“以下”为包含本数，“一种或多种”中的“多种”的含义是两种及以上，“一个或多个”中的“多个”的含义是两个及以上。
细胞外泌体是由细胞分泌的双层膜结构，由内体膜向内内陷产生。细胞外泌体转移miRNA和mRNA的能力已在许多细胞类型中得到验证。Treg细胞外泌体富含miRNA，其特征与Th1和Th2细胞不同。在移植物抗宿主病等疾病模型中，Treg分泌的外泌体已被证实可以有效调节免疫并对延缓疾病进展有积极作用。
本申请的第一方面提供一种调节性T细胞外泌体的制备方法，包括如下步骤：
(1)从脐血中提取调节性T细胞，对提取的调节性T细胞进行扩增，得到扩增后的脐血调节性培养液；
(2)取所述扩增后的脐血调节性培养液的上清，在200～10000×g的离心力下进行至少一次离心处理，收集离心后的上清；
(3)取步骤(2)所得上清，在3000～20000×g的离心力下进行至少一次离心处理，收集离心后的上清；
(4)取步骤(3)所得上清，对所得上清进行和离心处理，获得调节性T细胞外泌体，其中，离心处理的离心力为100000-200000×g，其中在离心处理前还可以进行过滤，过滤所用滤网的孔径为100nm-300nm，目的是提高调节性T细胞外泌体的浓度；
或使步骤(3)所得上清通过纳米孔，以去除其中杂蛋白，获得调节性T细胞外泌体，其中纳米孔的孔径可以为30nm。
在本发明的实施例中，步骤(1)中从脐血中提取调节性T细胞包括如下步骤：
1.对脐血袋进行消毒，制备脐血自体血浆：将脐血袋中的脐血转移至50mL离心管中进行离心：离心条件：20℃，3000rpm，10min，+8，-9。取上清转移至新50mL离心管中进行第二次离心：离心条件：20℃，4000rpm，10min，+8，-9，吸取黄色澄清的血浆，56℃水浴灭活30分钟后放置冰箱备用。用与吸出血浆等体积的生理盐水重悬脐血；
2.将生理盐水重悬的脐血缓慢加至淋巴细胞分离液(脐血体积：淋巴细胞分离液体积＝1:1)离心，离心条件：20℃，*400rcf-*1610rcf，25min，+0，-0。离心结束后，脐血分层，用吸管吸取外周血单个核细胞(PBMC)层，动作缓慢轻柔，尽可能少吸取淋巴细胞液；
3.将PBMC层继续离心，离心条件：20℃，*580rcf，10min，+8，-9。取5mL-10mL 10×红细胞裂解液及45mL灭菌用水配置红裂液。在离心完成后，去上清液，加入红裂液2～10分钟后，加入了0.9％生理盐水至35mL定容终止红裂。离心，去除上清，离心条件：20℃，*290rcf，10min，+8，-9。重复加入0.9％生理盐水定容，离心，去除上清的步骤2～3次；
4.离心完成后，去上清液，弹散细胞，加入0.9％的生理盐水，取10μL进行计数。剩余的加0.9％生理盐水至40mL定容再次离心，离心条件：20℃，*290rcf，10min，+8，-9。其中计数步骤具体为：将所取细胞液置于EP管内，取90μL台盼蓝加于EP管内混匀。取10μL在计数板上，快速操作和计数：(四角数目之和/4)×105个/mL*稀释倍数，线上细胞记上不记下，记左不计右；
5.离心完毕后去上清液，用Easy Buffer将细胞重悬至5×107cell/mL，重悬后液体量为0.5mL-6mL；
6.将重悬后的细胞悬液转移至与磁极配套的无菌管中；
7.加入CD25阳性选择抗体，加入量为重悬体积×50uL，混匀；
8.孵育5min；
9.涡旋可释放的球体30s以上，直至磁珠团块消失；
10.加入可释放的球体:加入量为重悬体积×30uL，混匀；
11.加入CD4+T细胞富集抗体混合物(T cell Enrichment Cocktail):加入量为重悬体积×50uL，混匀；
12.孵育5min；
13.加入Easy Buffer定容至10mL，上下轻柔混匀2-3次；
14.将无菌管放置于磁极上，无需盖子；
15.孵育10min；
16.准备离心管收集CD25-细胞，将磁极连同无菌管一起倾倒管内液体至该管内；
17.从磁极上取下无菌管，向其中加入10mL Easy Buffer，轻柔混匀2-3次后放置于磁极上，孵育5min；
18.重复16-17步操作2次；
19.加入Easy Buffer定容至初始重悬体积，注意将管壁上细胞全部冲下；
20.加入磁珠去除缓冲液(Release Buffer):加入量为重悬体积×100uL，大力混匀5次以上；
21.加入CD127high去除抗体混合物(Depletion Cocktail):加入量为重悬体积×50uL，混匀；
22.孵育5min；
23.加入Easy Buffer定容至10mL，上下混匀2-3次；
24.将无菌管放置于磁极上，孵育5min；
25.准备离心管收集调节性T细胞，将磁极连同无菌管一起将液体倾倒至准备好的离心管内，即得CD4+CD25+CD127-调节性T细胞。
上述获取CD4+CD25+CD127-调节性T细胞的过程可采用EasySepTM人CD4+CD25+CD127-调节性T细胞(Treg)分选试剂盒，品牌：STEMCELL Technologies，货号:18063。
在本发明的实施例中，步骤(1)中对提取的调节性T细胞进行扩增，得到扩增后的脐血调节性培养液的过程如下：
1.按照2-8×105/mL将调节性T细胞种植于48孔板中，第0天每孔加含磁珠(磁珠数：细胞数＝1：1)的扩培液0.5mL(扩培液的配方见表1)，37℃，5％ CO2浓度培养。
表1配置50mL脐血调节性T细胞扩增培养基的配方
Figure BDA0004139324370000061
Figure BDA0004139324370000071
2.种板后第1-2天(24h-48h)后，每孔细胞增加0.5mL-1mL扩培液，同时添加具有100-400U/mL的rhIL-2，在37℃、5％ CO2浓度下培养。
3.种板后第3-4天，第1次传代：吸除0.5mL扩培液，将剩余的扩培液混匀细胞，每1孔传2孔，同时添加具有100-400U/mL的rhIL-2的扩培液至1mL，在37℃、5％ CO2浓度下培养。添加后每孔的扩培液1mL，rhIL-2的加入量以1mL的扩培液的含量加入，其余步骤的rhIL-2加入量与该步骤相同。
4.种板后第5-6天，第2次传代：吸除0.5mL扩培液，将剩余的扩培液混匀细胞，每1孔传2孔，同时添加具有100-400U/mL的rhIL-2的扩培液至1mL，在37℃、5％ CO2浓度下培养。
5.种板后第7-10天，第3次传代：先去除培养皿中的抗CD3CD28磁珠，再添加洗净的新抗CD3CD28磁珠(按照磁珠：调节性T细胞的数目＝1:1)，在37℃、5％ CO2浓度下培养。
6.种板后第10-11天，第4次传代：吸除0.5mL扩培液，将剩余的扩培液混匀细胞，每1孔传2孔，同时添加具有100-400U/mL的rhIL-2的扩培液至1mL，在37℃、5％CO2浓度下培养。
7.种板后第11-12天，第5次传代：吸除0.5mL扩培液，将剩余的扩培液混匀细胞，每1孔传2孔，同时添加具有100-400U/mL的rhIL-2的扩培液至1mL，在37℃、5％CO2浓度下培养。
8.种板后第12-13天，第6次传代：吸除0.5mL扩培液，将剩余的扩培液混匀细胞，每1孔传2孔，同时添加具有100-400U/mL的rhIL-2的扩培液至1mL，在37℃、5％CO2浓度下培养。
9.种板后第13-14天，第7次传代：吸除0.5mL扩培液，将剩余的扩培液混匀细胞，每1孔传2孔，同时添加具有100-400U/mL的rhIL-2的扩培液至1mL，在37℃、5％CO2浓度下培养。
10.按照以上方法扩增至细胞停止生长，时间约为20-40天。
根据本发明的实施例，扩增后的脐血调节性T细胞数目明显增多，扩增得到的脐血调节性T细胞能明显抑制攻击性T细胞的增殖能力。
在本发明的实施例中，步骤(2)中，取所述扩增后的脐血调节性培养液的上清，在200～10000×g的离心力下进行至少一次离心处理，收集离心后的上清。其中，离心次数可以是1次、2次、3次或更多次。步骤(2)的目的是将培养液中的沉淀、凋亡体和碎片去除，保留上清。
在本发明的实施例中，步骤(2)中的至少一次离心处理包括：
取所述扩增后的脐血调节性培养液的上清，采用200～500×g的离心力进行第一次离心处理，去除沉淀，收集上清；取第一次离心处理所得上清，采用500～10000×g的离心力进行第二次离心处理，去除凋亡体和细胞碎片，再次获得上清。
根据本申请的实施例，经过以上两次离心去除杂质(残留细胞、细胞碎片和凋亡小体)进而获得高度纯化的外泌体。
在本发明的实施例中，所述第一次离心处理的温度为0～10℃，时间为10～20min。
在本发明的实施例中，所述第二次离心处理的温度为4～25℃，时间为10～30min。
在本发明的实施例中，步骤(3)中，取步骤(2)所得上清，在3000～20000×g的离心力下进行至少一次离心处理，收集离心后的上清。
在本发明的实施例中，步骤(3)中的至少一次离心处理包括：取步骤(2)中最后一次离心所得上清，采用3000～20000×g的离心力进行第N次离心处理，去除沉淀，收集上清，其中，N为大于等于2的整数。
在本发明的实施例中，步骤(3)中的至少一次离心处理还可以包括：取第N次离心处理所得上清，采用3000～20000×g的离心力进行第N+1次离心处理，再次去除沉淀，收集上清。
在本发明的实施例中，步骤(3)中的离心处理的温度为4～25℃，时间为10～60min。
在本发明的实施例中，步骤(4)中的离心处理的温度为4～25℃，时间为60～90min。
超速离心法的原理是通过外泌体与其他细胞器的沉降系数不同，将细胞、细胞碎片以及其他细胞器等，分离出去，从而得到纯净的外泌体。这种方法的优点就是外泌体提取方法简单，提取过程中不会引入其他的标记物，适合大剂量的样品处理，缺点是操作比较繁琐。
在本发明的实施例中，步骤(4)中利用EXODUS全自动外泌体提取系统完成所得上清通过纳米孔，以去除所述上清中的杂蛋白，截留获得脐血调节性T细胞外泌体的步骤。
所述EXODUS全自动外泌体提纯系统的纯化原理是负压震荡系统结合双藕和谐波震荡系统作用于纳米超滤芯片；样本中的游离核酸与蛋白质杂质通过纳米孔快速去除并截留外泌体，从而纯化富集外泌体。利用EXODUS全自动外泌体提取系统能获得高产量的外泌体，有望解决异体排斥问题，同时有望成为新的治疗自身免疫疾病的药物。
本发明第二方面的实施例提供一种上述调节性T细胞外泌体的制备方法制得的调节性T细胞外泌体在糖尿病药物中的应用。
实验表明，上述调节性T细胞外泌体的制备方法制得的调节性T细胞外泌体具有抑制糖尿病患者的炎症细胞的增殖能力，可用于糖尿病药物中治疗糖尿病。
实施例
下述实施例更具体地描述了本申请公开的内容，这些实施例仅仅用于阐述性说明，因为在本申请公开内容的范围内进行各种修改和变化对本领域技术人员来说是明显的。除非另有声明，以下实施例中所报道的所有份、百分比、和比值都是基于重量计，而且实施例中使用的所有试剂都可商购获得或是按照常规方法进行合成获得，并且可直接使用而无需进一步处理，以及实施例中使用的仪器均可商购获得。
实施例1
一、本实施例提供一种调节性T细胞外泌体的制备方法，包括如下步骤：
(1)从脐血中提取调节性T细胞，对提取的调节性T细胞进行扩增至细胞停止生长，得到扩增后的脐血调节性培养液；
(2)收集脐血调节性培养上清，4℃条件下采用200-500×g离心10-20分钟，去除沉淀，收集上清。
(3)4℃条件下采用500-10000×g离心10-30分钟，去除凋亡体和细胞碎片。
(4)在4-25℃条件下采用3000-20000×g离心10-60min后，去除沉淀，收集上清。
(5)在4-25℃条件下采用100000-200000g离心60-90min，获得管底脐血调节性T细胞外泌体沉淀。
(6)PBS重悬外泌体，立即使用或-80℃冻存备用。
二、将制得的调节性T细胞及外泌体进行如下实验：
(一)、自身免疫糖尿病患者单个核细胞(PBMC)的提取。
1.对脐血袋进行消毒，脐血袋中患者自体的脐血转移至50mL离心管中，将脐血缓慢加至淋巴细胞分离液(脐血体积：淋巴细胞分离液体积＝1:1)离心，离心条件：20℃，*400rcf-*1610rcf，25min，+0，-0。离心结束后，脐血分层，用吸管吸取外周血单个核细胞(PBMC)层，动作缓慢轻柔，尽可能少吸取淋巴细胞液。
2.将PBMC层继续离心，离心条件：20℃，*580rcf，10min，+8，-9。取5mL-10mL10×红细胞裂解液及45mL灭菌用水配置红裂液。在离心完成后，去上清液，加入红裂液2～10分钟后，加入了0.9％生理盐水至35mL定容终止红裂。离心，去除上清，离心条件：20℃，*290rcf，10min，+8，-9。重复加入0.9％生理盐水定容，离心，去除上清的步骤2～3次。
3.离心完成后，去上清液，弹散细胞，加入0.9％的生理盐水，取10μl进行计数。剩余的加0.9％生理盐水至40mL定容再次离心，离心条件：20℃，*290rcf，10min，+8，-9。其中计数步骤具体为：将所取细胞液置于EP管内，取90μl台盼蓝加于EP管内混匀。取10μl在计数板上，快速操作和计数：(四角数目之和/4)×105个/mL*稀释倍数，线上细胞记上不记下，记左不计右。
(二)、调节性T细胞抑制糖尿病患者单个核细胞(PBMC)的增殖实验。
1.采集自身免疫糖尿病患者单个核细胞(PBMC)细胞，取1×106个细胞。
2.无血清培养基1mL重悬细胞(1×106个细胞)。
3.每1mL中加入1μl cell trace stock solution(CellTraceTMCFSE细胞增殖试剂盒(CellTraceTMCFSE Cell Proliferation Kit)，货号：C34554；Thermofisher scientific公司。此试剂盒包含十份一次性瓶装的CellTraceTMCFSE(Component A)，CFSE(羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯)和1份瓶装的DMSO(Component B)，DMSO(二甲基亚砜)，cell tracestock solution是指按照试剂盒说明书配置的混合液用于对细胞进行CFSE染色：18ulDMSO+1份瓶装CellTraceTMCFSE。
4.37℃避光孵育20min。
5.加入5mL洗涤液(无血清培养液+10％FBS(牛胎血清))。
6.37℃避光孵育5min。
7.离心20℃，*290rcf，10min，+8，-9。
8.37℃预热的培养基(无血清培养液+10％FBS)重悬细胞。
9.取一孔调节性T细胞(Treg细胞)，去除磁珠，计数，离心，20℃，*290rcf，10min，+8，-9。
10.1×106个Treg细胞在37℃预热的培养基(无血清培养液+10％FBS)重悬细胞。
11.将单个核细胞(PBMC)细胞数目:调节性T细胞数目分别按照1:1、2:1、4:1、8:1(每孔供200μl，加3μl磁珠)的密度种植于96孔板中进行共培养。单独羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)处理(不加入调节性T细胞)的PBMC细胞设为阴性对照组，加入1μlcell trace stock solution进行CFSE染色处理(不加入调节性T细胞)的PBMC细胞组(磁珠刺激)设为阳性对照组。
12.流式检测脐血调节性T细胞的抑制功能。如图1所示：脐血调节性T细胞免疫抑制功能的检测。其中，1:1为PBMC细胞数：调节性T细胞数＝1:1组的抑制作用图；2:1为PBMC细胞数：调节性T细胞数＝2:1组的抑制作用图；4:1为PBMC细胞数：调节性T细胞数＝4:1组的抑制作用图；8:1为PBMC细胞数：调节性T细胞数＝8:1组的抑制作用图。Positivecontrol(磁珠刺激，只有CFSE染PBMC，未加Treg细胞)设为对照。CFSE标记PBMC后，PBMC细胞增殖的越多，CFSE阴性的PBMC细胞就会越多，其占所有PBMC的比例也会越大，结果表明脐血调节性T细胞具有明显抑制PBMC的增殖能力。
(三)、调节性T细胞外泌体抑制糖尿病患者单个核细胞(PBMC)的增殖实验。
1.采集自身免疫糖尿病患者单个核细胞(PBMC)细胞，取1×106个细胞。
2.无血清培养基1mL重悬细胞(1×106个细胞)。
3.每1mL中加入1μl cell trace stock solution(CellTraceTMCFSE细胞增殖试剂盒(CellTraceTMCFSE Cell Proliferation Kit)，货号：C34554；Thermofisher scientific公司。此试剂盒包含十份一次性瓶装的CellTraceTMCFSE(Component A)，CFSE(羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯)和1份瓶装的DMSO(Component B)，DMSO(二甲基亚砜)，cell tracestock solution是指按照试剂盒说明书配置的混合液用于对细胞进行CFSE染色：18ulDMSO+1份瓶装CellTraceTMCFSE。
4.37℃避光孵育20min。
5.加入5mL洗涤液(无血清培养液+10％FBS(牛胎血清))。
6.37℃避光孵育5min。
7.离心20℃，*290rcf，10min，+8，-9。
8.37℃预热的培养基(无血清培养液+10％FBS)重悬细胞。
9.取一孔调节性T细胞(Treg细胞)，去除磁珠，计数，离心，20℃，*290rcf，10min，+8，-9。
10.1×106个Treg细胞在37℃预热的培养基(无血清培养液+10％FBS)重悬细胞。
11.使用不同浓度的调节性T细胞(0g/L,0-0.1g/L,0.1-5g/L)与单个核细胞(PBMC)细胞在96孔板(每孔供200μl，加3μl磁珠)中进行共培养。CFSE处理的PBMC细胞组(磁珠刺激)设为阳性对照组。
12.流式检测脐血调节性T细胞外泌体的抑制功能，如图2所示，不同浓度(Group1、Group2和Group3)的脐血调节性T细胞外泌体抑制CFSE标记的PBMC增殖的示意图，未经外泌体处理组设为对照组(Control)。图2表示对三组的结果进行作图分析。结果表明脐血调节性T细胞外泌体具有抑制炎症细胞的增殖能力，抑制能力具有浓度依赖性。
实施例2
一、本实施例提供一种调节性T细胞外泌体的制备方法，包括如下步骤：
(1)从脐血中提取调节性T细胞，对提取的调节性T细胞进行扩增至细胞停止生长，得到扩增后的脐血调节性培养液；
(2)收集脐血调节性培养上清，4℃条件下采用200-500×g离心10-20分钟，去除沉淀，收集上清。
(3)4℃条件下采用500-10000×g离心10-30分钟，去除凋亡体和细胞碎片。
(4)在4-25℃条件下采用3000-20000×g离心10-60min后，去除沉淀，收集上清。
(5)使用EXODUS全自动外泌体提取系统进行分离纯化外泌体：装载上清样本与芯片，点击设置启动纯化，获得纯化的外泌体。
其中，在本实施例中EXODUS全自动外泌体提取系统(深圳汇芯生物医疗科技有限公司，型号H600)。
二、将制得的调节性T细胞及外泌体进行如下实验：
(一)、EXODUS全自动外泌体提取系统获得的调节性T细胞外泌体抑制糖尿病患者单个核细胞(PBMC)的增殖实验。
1.采集自身免疫糖尿病患者单个核细胞(PBMC)细胞，取1×106个细胞。
2.无血清培养基1mL重悬细胞(1×106个细胞)。
3.每1mL中加入1μl cell trace stock solution(CellTraceTMCFSE细胞增殖试剂盒(CellTraceTMCFSE Cell Proliferation Kit)，货号：C34554；Thermofisher scientific公司。此试剂盒包含十份一次性瓶装的CellTraceTMCFSE(Component A)，CFSE(羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯)和1份瓶装的DMSO(Component B)，DMSO(二甲基亚砜)，cell tracestock solution是指按照试剂盒说明书配置的混合液用于对细胞进行CFSE染色：18ulDMSO+1份瓶装CellTraceTMCFSE。
4.37℃避光孵育20min。
5.加入5mL洗涤液(无血清培养液+10％FBS(牛胎血清))。
6.37℃避光孵育5min。
7.离心20℃，*290rcf，10min，+8，-9。
8.37℃预热的培养基(无血清培养液+10％FBS)重悬细胞。
9.取一孔调节性T细胞(Treg细胞)，去除磁珠，计数，离心，20℃，*290rcf，10min，+8，-9。
10.1×106个Treg细胞在37℃预热的培养基(无血清培养液+10％FBS)重悬细胞。
11.使用不同浓度的调节性T细胞(0g/L,0-0.1g/L,0.1-5g/L)与单个核细胞(PBMC)细胞在96孔板(每孔供200μl，加3μl磁珠)中进行共培养。CFSE处理的PBMC细胞组(磁珠刺激)设为阳性对照组。
12.流式检测脐血调节性T细胞外泌体的抑制功能，如图3所示，不同浓度(Group1、Group2和Group3)的脐血调节性T细胞外泌体抑制CFSE标记的PBMC增殖的示意图，未经外泌体处理组设为对照组(Control)。图2右表示对三组的结果进行作图分析。结果表明脐血调节性T细胞外泌体具有抑制炎症细胞的增殖能力，抑制能力具有浓度依赖性。
最后，将实施例1与实施例2获得的外泌体的量进行比较，结果如下：
取相同脐血调节性T细胞上清样本分别使用超速离心法和EXODUS全自动外泌体提纯系统制备外泌体，结果表明，超速离心法制备的外泌体的产量要明显少于EXODUS全自动外泌体提纯系统所获得的外泌体的产量(平均产量4.13μg/mL vs 402μg/mL)，每mL上清所提外泌体的量＝外泌体总量/来源上清毫升数)，详见图4(左图为实施例1的产量，右图为实施例2的产量)。
虽然已经参考优选实施例对本申请进行了描述，但在不脱离本申请的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件，尤其是，只要不存在结构冲突，各个实施例中所提到的各项技术特征均可以任意方式组合起来。本申请并不局限于文中公开的特定实施例，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。

Claims (10)

1.一种调节性T细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)从脐血中提取调节性T细胞，对提取的调节性T细胞进行扩增，得到扩增后的脐血调节性培养液；
(2)取所述扩增后的脐血调节性培养液的上清，在200～10000×g的离心力下进行至少一次离心处理，收集离心后的上清；
(3)取步骤(2)所得上清，在3000～20000×g的离心力下进行至少一次离心处理，收集离心后的上清；
(4)取步骤(3)所得上清，对所得上清进行离心处理，获得调节性T细胞外泌体，其中，离心处理的离心力为100000-200000×g；
或使步骤(3)所得上清通过纳米孔，以去除其中杂蛋白，获得调节性T细胞外泌体。
2.根据权利要求1所述的调节性T细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中的至少一次离心处理包括：
取所述扩增后的脐血调节性培养液的上清，采用200～500×g的离心力进行第一次离心处理，去除沉淀，收集上清；
取第一次离心处理所得上清，采用500～10000×g的离心力进行第二次离心处理，去除凋亡体和细胞碎片，再次获得上清。
3.根据权利要求2所述的调节性T细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述第一次离心处理的温度为0～10℃，时间为10～20min。
4.根据权利要求2所述的调节性T细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述第二次离心处理的温度为4～25℃，时间为10～30min。
5.根据权利要求1所述的调节性T细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中的至少一次离心处理包括：
取步骤(2)中最后一次离心所得上清，采用3000～20000×g的离心力进行第N次离心处理，去除沉淀，收集上清，其中，N为大于等于2的整数。
6.根据权利要求5所述的调节性T细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中的至少一次离心处理还包括：
取第N次离心处理所得上清，采用3000～20000×g的离心力进行第N+1次离心处理，再次去除沉淀，收集上清。
7.根据权利要求5或6所述的调节性T细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中的离心处理的温度为4～25℃，时间为10～60min。
8.根据权利要求1所述的调节性T细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤(4)中的离心处理的温度为4～25℃，时间为60～90min。
9.根据权利要求1所述的调节性T细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤(4)中利用EXODUS全自动外泌体提取系统完成使所得上清通过纳米孔，以去除所述上清中的杂蛋白，获得调节性T细胞外泌体的步骤。
10.一种由权利要求1～9中任一项所述的调节性T细胞外泌体的制备方法制得的调节性T细胞外泌体在糖尿病药物中的应用。
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