CN116350665A

CN116350665A - 杂萜化合物在制备抗炎药物或预防保健品中的应用

Info

Publication number: CN116350665A
Application number: CN202111575075.9A
Authority: CN
Inventors: 唐金山; 吴斌; 姚新生; 田丹妹; 陈玫; 丁文娟
Original assignee: Zhejiang University ZJU; Jinan University
Current assignee: Zhejiang University ZJU; Jinan University
Priority date: 2021-12-21
Filing date: 2021-12-21
Publication date: 2023-06-30
Anticipated expiration: 2041-12-21
Also published as: CN116350665B

Abstract

本发明公开一类杂萜化合物在制备抗炎药物或预防保健品中的应用。本发明提供一种海洋真菌，名称为Aspergillus sp.TW58‑5，保藏编号：GDMCC No：62093。本发明利用杂萜化合物的极性差异从海洋真菌的发酵培养物中提取、分离获得一类杂萜化合物，该方法操作简便、提取得率高、产物纯度高，适合规模化生产。通过体外NO产生抑制活性评价，表明杂萜化合物，尤其式(1)、式(4)～(5)所示化合物能够显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NO的产生，且在测试浓度下未表现出细胞毒性，提示其具有潜在的抗炎活性，可用于制备抗炎药物及预防保健食品，具有良好的开发前景。

Description

杂萜化合物在制备抗炎药物或预防保健品中的应用

技术领域

本发明涉及海洋真菌代谢产物作为新的炎症抑制剂领域，具体涉及一类杂萜化合物在制备抗炎药物或预防保健品中的应用。

背景技术

炎症的发生、发展是一个高度复杂的过程，用以抵御外来刺激或组织损伤。巨噬细胞作为炎症的关键参与者，直接对抗有害刺激。在炎症刺激物如脂多糖 (LPS)刺激下巨噬细胞分泌各种促炎介质介导炎症反应，包括肿瘤坏死因子-α(TNF-alpha)、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、一氧化氮(NO)和前列腺素E2 (PGE2)等。当这些促炎介质过度产生时，就会引起过度的炎症反应，甚至导致关节炎、急性感染性休克、哮喘、动脉粥样硬化等多种炎症性疾病的发生。 NO主要由诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)合成，是一个关键的信号分子，被认为是许多生理机制的调节因子。研究显示控制NO的过量产生可有效缓解有害的炎症反应。RAW 264.7，小鼠巨噬细胞细胞系，是一个极好的抗炎药物筛选模型，可用于寻找炎症刺激物介导的促炎介质释放及激活的炎症相关酶及通路的抑制剂。

草酸(oxalicine)和啶南平(pyripyropene)类天然产物，具有独特的吡啶-α- 吡喃酮结构片段，是由烟酸、聚酮和萜类前体产生的杂合天然产物，属于杂萜类化合物范畴。该类化合物主要存在于曲霉属(Aspergillus sp.)和青霉属 (Penicillium sp.)真菌中，是一种强选择性的酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶-2 (ACAT-2)抑制剂。目前草酸(oxalicine)和啶南平(pyripyropene)类杂萜化合物的研究主要集中在该类化合物的合成、修饰[发明专利申请， KR20190140711A，20191220、WO2014111398A1，20140724]，以及该类化合物在ACAT-2抑制[US9187492B2，20151117、JP5554330B2，20140723]和杀虫[WO2018055479A1，20180329、CN106117231A，20161116]方面的活性，未见其在抑制NO释放及发挥抗炎作用方面的报道。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一类杂萜化合物在制备抗炎药物或预防保健品中的应用。

本发明中的草酸(oxalicine)和啶南平(pyripyropene)类杂萜化合物是从海洋曲霉属真菌TW58-5(Aspergillus sp.TW58-5)中提取获得具有药用价值的天然活性物质。并发现其能够显著抑制LPS激活的RAW264.7细胞NO的释放，且在测试浓度下未表现出细胞毒活性，提示该类化合物可用于抗炎药物或预防保健品中的开发。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一类杂萜化合物或其药学上可接受的盐在制备抗炎药物或预防保健品中的应用，所述杂萜化合物的结构式如式(1)、式(4)～(5)所示：

本发明提供了一种海洋真菌，命名为曲霉属真菌TW58-5(Aspergillus sp. TW58-5)，是从中国台湾东北部龟山岛热液口沉积物分离纯化得到，保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏时间为2021年12月3 日，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号：GDMCC No：62093。

所述曲霉属真菌TW58-5(Aspergillus sp.TW58-5)菌株具有如下微生物学特征：

菌落在PDA培养基28℃培养5天的直径35～40mm，培养10天的直径65～ 70mm；菌落有沟，呈放射状或同心圆状；孢子形成中等；菌落质地柔软棉絮状；分生孢子在菌落中心呈黄绿色，边缘暗绿色；无孢子，边缘2mm；菌丝体白色至黄色，渗出液呈黄色液滴。

所述的曲霉属真菌TW58-5(Aspergillus sp.TW58-5)具有如下分子生物学特征：ITS序列如SEQ ID No.1中所示。

所述的海洋真菌在制备抗炎药物中的应用。

本发明还提供了所述的杂萜化合物的制备方法，杂萜化合物是从曲霉属真菌TW58-5(Aspergillus sp.TW58-5)的发酵物中分离获得的；

具体包括以下步骤：

(1)将所述的曲霉属真菌TW58-5(Aspergillus sp.TW58-5)经活化后接种于发酵培养基中，进行发酵培养；

(2)发酵培养结束后，加入有机溶剂进行浸提，分离得到浸提液，浸提液浓缩得到提取物，提取物经分离、纯化后，制得杂萜化合物；

为了更好地模拟海洋环境，给微生物生长代谢提供足够的营养成分，优选的，步骤(1)中所述的发酵培养基的配方为：

以大米50g计，配方为：50g大米，ddH₂O 75mL，PH自然；

或者，以玉米粒50g计，配方为：50g玉米粒，酵母浸粉0.86g，酒石酸铵 2.37g，MgSO₄ 0.17g，KH₂PO₄ 0.25g，海盐(2％)0.4g，ddH₂O 20mL，PH自然；玉米粒需粉碎成颗粒物；

或者，以体积1L计，配方为：淀粉1～5g、麸皮10～20g、酵母膏3～15g、 KH₂PO₄ 1～8g，MgSO₄·7H₂O 0.1～0.8g，余量为海水；

或者，以体积1L计，配方为：马铃薯200～600g、蛋白胨2～10g、酵母膏1～5g、葡萄糖5～20g、余量为海水；初始pH值为6.0～7.0。

优选的，步骤(1)中所述的发酵培养的条件为20～30℃静态培养10～40 天。所述静态培养方式即不进行摇瓶培养。

进一步的，所述的发酵培养的条件为26～30℃静态培养10～40天。更优选为28℃静态培养20天，该条件下所述杂萜化合物的产量最高。

优选的，步骤(2)中所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、乙酸乙酯和丙酮中的一种或两种。

优选的，步骤(2)中，对发酵物浸提的提取物经正相硅胶柱层析分离后，再进行反相硅胶柱层析/高效液相色谱分离。具体采用硅胶开放柱层析、ODS柱层析以及制备型HPLC等方法进行分离、纯化。

采用正相硅胶柱层析分离时，洗脱剂可采用石油醚、正己烷、乙酸乙酯、醇和水中的一种或多种混合物，对提取物进行梯度洗脱。

作为优选，所述分离、纯化包括：对提取物进行正相硅胶柱层析分离，依次以体积比100：0、98：2、95：5、90：10、80：20、70：30、40：60、0：100 的石油醚/乙酸乙酯混合液和乙酸乙酯进行梯度洗脱，收集各洗脱出的馏分。

本发明研究表明，利用上述方法从海洋真菌发酵培养物中分离得到的杂萜化合物具有较好的NO产生抑制活性，因此，本发明还提供了所述的杂萜化合物在制备抗炎药物或预防保健品中的应用。

进一步的，所述的杂萜化合物在制备一氧化氮(NO)生成抑制剂药物中的应用。

所述药物以本发明的杂萜化合物或其药学上可接受的盐为主要活性成分，添加药剂学上可接受的辅料制成，可按照药剂学上记载的制剂制备方法制成制剂。所述的制剂可以为注射液、滴注液、粉针剂、颗粒剂、片剂、冲剂、散剂、口服液、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、口含剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、丹剂、喷雾剂、滴丸剂、崩解剂、口崩片、微丸等。

所述保健品以本发明的杂萜化合物或其药学上可接受的盐为主要活性成分，添加可接受的保健食品辅料制成。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明利用杂萜化合物的极性差异从海洋真菌的发酵培养物中提取、分离获得一类杂萜化合物，该方法操作简便、提取得率高、产物纯度高，适合规模化生产。

(2)通过体外NO产生抑制活性评价，表明本发明提供的杂萜化合物具有较好的抑制脂多糖(LPS)诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7产生一氧化氮的活性，在20μM浓度下式(1)、式(4)和式(5)所示结构的化合物能够显著抑制NO的产生，且在该浓度下未表现出细胞毒性，提示其具有潜在的抗炎活性，可用于制备抗炎药物及预防保健食品，具有良好的开发前景。

附图说明

图1是本发明杂萜化合物的结构式。

图2是菌株TW58-5的ITS基因序列聚类分析图。

图3是本发明实施例4制备的化合物1的HR-ESI-Q-TOF-MS图。

图4是本发明实施例4制备的化合物2的HR-ESI-Q-TOF-MS图。

图5是本发明实施例4制备的化合物3的HR-ESI-Q-TOF-MS图。

图6是本发明实施例4制备的化合物4的HR-ESI-Q-TOF-MS图。

图7是本发明实施例4制备的化合物5的HR-ESI-Q-TOF-MS图。

图8是化合物1-5的化合物抗炎活性评价；其中，A为化合物在20μM浓度下对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7中一氧化氮(NO)产生的抑制作用(阳性药：地塞米松10μM；姜黄素：20μM)；B为化合物在20μM浓度下对巨噬细胞RAW264.7生长抑制作用。^###p<0.01vs.DMSO组；***p<0.001vs.LPS组。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1真菌TW58-5分离

菌株TW58-5分离自中国台湾东北部龟山岛热液口沉积物，先将沉积物样品放在无菌的培养皿中，在自然环境中风干，然后称取1g风干沉积物样品，用 10mL 50％的海水溶解得10^-1溶液，继续稀释到10^-2、10^-3，得三个梯度的样品液。分别取100μL涂布在分离培养基GPY培养基、Martin培养基、CA培养基、 PDA培养基、SDA培养基及真菌2号培养基上，每个不同稀释浓度的分离培养基2个平行，在28℃下培养1～8周。观察并挑取其中的单菌落，接种在真菌2 号培养基上，获得纯培养菌株。

实施例2真菌TW58-5的分子鉴定

基因组DNA的提取：利用生工Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取真菌TW58-5的DNA，具体方法为20mg菌丝用液氮研磨成粉末，加入1.5mL 离心管中。加入200μL BufferDigestion和2μLβ-巯基乙醇，再加入20μL Proteinase K溶液，震荡混匀。56℃水浴1h至细胞完全裂解。加入100μL Buffer PF，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置5min。室温10,000rpm离心5min，将上清转移到新的1.5mL离心管中。加入200μL Buffer BD，充分颠倒混匀。加入200μL的无水乙醇，充分颠倒混匀。将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，再10,000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱放回收集管，加入500μL PW Solution，10,000 rpm离心30s倒掉收集管中的废液。将吸附柱放回收集管，加入500μL Wash Solution，10,000rpm离心30s倒掉收集管中的废液。将吸附柱重新放回收集管中，于12,000rpm室温离心2min，离去残留的Wash Solution。取出吸附柱，放入一个新的1.5mL离心管中，加入50μL TE Buffer静置3min，12,000rpm室温离心2min，收集DNA溶液。

基因序列的扩增：分别加入2倍PCR mastermix 12.5μL，引物ITS1(5'-TCC GTAGGT GAA CCT GCG G-3')和ITS4(5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3') 各1μL，模板DNA 1μL，双蒸水9.5μL。扩增的条件为预变性95℃，5min；变性94℃，30s，退火温度57℃，30s，延伸温度72℃，90s，共30个循环；后延伸72℃，10min。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。

切下目的条带(约600bp)用生工SanPre柱式DNA胶回收试剂盒进行回收纯化，具体方法为加入胶块重量3～6倍的Buffer B2，50℃水浴5～10min。将溶胶液移入吸附柱中。8000×g离心30s，倒掉收集管中液体。加入500μL Wash Solution，9000×g离心30s，倒掉收集管中液体，该步骤重复一次。空吸附柱于 9000×g离心1min。将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入15～40μL Elution Buffer，室温静置1min后，离心1min，即得DNA溶液，送生工生物测序。

将ITS序列提交到NCBI上进行比对，选取相似率较高的序列，然后利用 MEGA 6.0构建系统发育树。根据系统发育树推断菌株归属为曲霉属(图2)。

所述真菌TW58-5，命名为曲霉属真菌TW58-5(Aspergillus sp.TW58-5)，保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏时间为2021 年12月3日，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号：GDMCCNo：62093。

所述的曲霉属真菌TW58-5(Aspergillus sp.TW58-5)的ITS序列如SEQ ID No.1所示(578bp)。

实施例3真菌TW58-5的大量发酵培养

将真菌TW58-5于PDA固体培养基中(土豆200g、葡萄糖20g、琼脂20g、 ddH₂O 1L、PH自然)活化，在大米固体培养基(大米50g、ddH₂O 75mL、PH 自然)中进行大量发酵5.0Kg。在室温下静置发酵21天后，用EtOAc过夜浸泡菌丝体进行提取。

实施例4杂萜化合物的制备

海洋真菌TW58-5经大米固体培养基发酵后的发酵物用乙酸乙酯(EtOAc) 浸泡提取3～5次。合并提取液减压浓缩得到提取物70g。提取物经硅胶开放柱层析(φ50×640mm，200～300目，500～700g)，以石油醚-乙酸乙酯(100：0， 98：2、95：5、90：10、80：20、70：30、40：60、0：100)和乙酸乙酯-甲醇 (95：5、90：10)梯度洗脱，共得到20个馏分(Fr.1～Fr.20)。其中Fr.16[4.4g，石油醚/乙酸乙酯(0：100)]经ODS开放柱层析以甲醇-水(30％～100％)梯度洗脱，共得到14个子馏分(Fr.16-1～Fr.16-14)。子馏分Fr.16-6[200.0mg， 60％MeOH-H₂O]通过制备型HPLC(YMC-Pack ODS-A，45％甲醇-水，3ml/min) 得化合物2(40.0mg)和化合物3(5.1mg)。子馏分Fr.16-8[97.9mg， 60％MeOH-H₂O]通过制备型HPLC(YMC-Pack ODS-A，55％甲醇-水，3ml/min) 得化合物1(10.0mg)。子馏分Fr.16-9(204.0mg，60％甲醇-水)通过制备型HPLC (YMC-Pack ODS-A，60％甲醇-水，3ml/min)得化合物4(100.0mg)和化合物5(9.2mg)。

实施例5杂萜化合物的结构鉴定

实施例4所得的化合物1-5为黄色或棕色固体，采用TLC和HPLC对制备得到的化合物进行纯度鉴定，纯度大于98％的样品。运用质谱及核磁共振进行结构鉴定，核磁共振用Bruker AV-300NMR Spectrometer测定，TMS作内标；高分辨质谱采用Waters Synapt G2质谱仪进行测定。

化合物1-5的HR-ESI-Q-TOF-MS图，依次如图3～7所示。

根据化合物的一维和二维NMR分析结果(见表1及表2)，确定化合物结构如图1所示。

表1化合物1-3的¹H和¹³C-NMR数据归属

其中，^ain CDCl₃ ^b in DMSO-d₆(300MHz for ¹H and 75MHz for ¹³C)。

表2化合物4和5的¹H和¹³C-NMR数据(CDCl₃,300MHz for ¹H and 75MHz for ¹³C)

实施例6杂萜化合物NO产生抑制活性分析

6.1细胞：小鼠单核巨噬细胞RAW264.7(常规市售)。

6.2主要试剂、耗材与仪器：DMEM培养基(Gibico)、胎牛血清(依科赛生物)、DMSO(阿拉丁生物有限公司)、姜黄素(TargetMol)、地塞米松(MYM Biological TechnologyCompany Limited)、脂多糖(LPS)(Sigma)。

6.3阳性药及待测化合物溶液的配置：称取阳性药地塞米松(DXM)、姜黄素(CUR)以及待测化合物1～2mg，加入适量DMSO配置成所需浓度溶液(地塞米松10mM，其它阳性药及待测化合物为20mM)。

6.4实验过程：小鼠单核巨噬细胞RAW264.7加入含10％胎牛血清的DMEM 培养基，并置于5％CO₂培养箱中在37℃进行培养。每1～2天传代一次，细胞到达对数期后，进行后续实验。

RAW264.7细胞接种于96孔板中，每孔约2×10⁵个细胞，37℃，5％CO₂培养过夜，弃去培养基，每孔加入100μL含药(地塞米松10μM，其它20μM) 及LPS(500ng/mL)培养基，培养24h，然后取上清液用一氧化氮检测试剂盒检测一氧化氮浓度。

在考察待测化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞NO产生影响的同时，还通过MTT方法考察待测化合物在20μM浓度下对RAW264.7细胞的细胞毒性。具体流程为RAW264.7细胞接种于96孔板中，每孔约2×10⁵个细胞，37℃，5％CO₂培养过夜，弃去培养基，每孔加入100μL含药(20μM)及LPS(500ng/mL) 培养基，培养24h，每孔避光加入20μL MTT溶液，培养2h，弃去培养基，每孔加入150μL DMSO，振摇15min，570nm检测吸光度。

6.5结果分析：NO产生抑制实验结果显示式(1)、式(4)和式(5)结构所示化合物(分别对应化合物1、4和5)在20μM浓度下能显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NO的产生(图8A)。同时，细胞毒性检测发现，式(1)- (5)结构所示化合物(分别对应化合物1-5)在20μM浓度下对RAW264.7细胞并未表现出细胞毒性(图8B)。以上结果说明在20μM浓度下化合物1、4和 5能显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞一氧化氮产生，且在该浓度下并未表现出细胞毒性，提示这些化合物具有潜在的抗炎活性，可应用于制备抗炎药物或预防保健品。

实施例7杂萜化合物滴丸制剂的制备

取0.5g杂萜化合物与10.5g聚乙二醇-6000混合均匀，加热熔融，化料后移至滴丸滴灌中，药液滴至6～8℃液体石蜡中，除油，制得滴丸300粒。

实施例8杂萜化合物冻干粉针剂的制备

取杂萜化合物0.5g、葡萄糖4.5g、硫代硫酸钠0.9g和蒸馏水1000mL，上述组分混合均匀后，冷冻干燥，分装400支，即得。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 暨南大学

浙江大学

<120> 杂萜化合物在制备抗炎药物或预防保健品中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 578

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 曲霉属真菌TW58-5（Aspergillus sp. TW58-5）的ITS序列

<400> 1

gacctgcgga aggatcatta ccgagtgagg gccctctggg tccaacctcc cacccgtgtc 60

tattgtacct tgttgcttcg gcgggcccgc cgtttcgacg gccgccgggg aggcctcgcg 120

cccccgggcc cgcgcccgcc gaagacccca acatgaacgc tgttctgaaa gtatgcagtc 180

tgagttgatt atcataatca gttaaaactt tcaacaacgg atctcttggt tccggcatcg 240

atgaagaacg cagcgaaatg cgataagtaa tgtgaattgc agaattcagt gaatcatcga 300

gtctttgaac gcacattgcg ccccctggta ttccgggggg catgcctgtc cgagcgtcat 360

tgctgccctc aagcacggct tgtgtgttgg gccgccgtcc ccggtttccc ccggggacgg 420

gcccgaaagg cagcggcggc accgcgtccg gtcctcgagc gtatggggct ttgtcacccg 480

ctctgtaggc ctggccggcg ccagccgaca cccaacttta tttctaaggt tgacctcgga 540

tcaggtaggg atacccgctg aacttaagca tatcaata 578

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ITS1

<400> 2

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ITS4

<400> 3

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims

1.海洋真菌在制备抗炎药物中的应用，其特征在于：所述海洋真菌的名称为曲霉属真菌TW58-5(Aspergillus sp.TW58-5)，于2021年12月3日保藏于广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCCNo：62093。

2.杂萜化合物或其药学上可接受的盐在制备抗炎药物或预防保健品中的应用，其特征在于：

所述杂萜化合物的结构式如式(1)、式(4)～(5)所示：

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：

所述的杂萜化合物或其药学上可接受的盐在制备一氧化氮生成抑制剂药物中的应用。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：

所述的杂萜化合物的制备方法，杂萜化合物是从权利要求1中所述海洋真菌的发酵物中分离获得的。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：

所述的杂萜化合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将权利要求1中所述的曲霉属真菌TW58-5经活化后接种于发酵培养基中，进行发酵培养；

(2)发酵培养结束后，加入有机溶剂进行浸提，分离得到浸提液，浸提液浓缩得到提取物，提取物经分离、纯化后，制得杂萜化合物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：

步骤(1)中所述的发酵培养基的配方为：

以大米50g计，配方为：50g大米，ddH₂O 75mL，PH自然；

或者，以玉米粒50g计，配方为：50g玉米粒，酵母浸粉0.86g，酒石酸铵2.37g，MgSO₄0.17g，KH₂PO₄ 0.25g，2％的海盐0.4g，ddH₂O 20mL，PH自然；玉米粒需粉碎成颗粒物；

或者，以体积1L计，配方为：淀粉1～5g、麸皮10～20g、酵母膏3～15g、KH₂PO₄ 1～8g，MgSO₄·7H₂O 0.1～0.8g，余量为海水；

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：

步骤(1)中所述的发酵培养的条件为20～30℃静态培养10～40天；

步骤(2)中所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、乙酸乙酯和丙酮中的一种或两种。

8.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：

所述药物是以所述的杂萜化合物或其药学上可接受的盐为主要活性成分，添加药剂学上可接受的辅料制成，按照药剂学上记载的制剂制备方法制成制剂。

9.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：

所述药物的剂型为注射液、滴注液、粉针剂、颗粒剂、片剂、冲剂、散剂、口服液、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、口含剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、丹剂、喷雾剂、滴丸剂、崩解剂、口崩片或微丸。

10.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：

所述保健品以所述的杂萜化合物或其药学上可接受的盐为主要活性成分，添加可接受的保健食品辅料制成。