CN116348800A - 用于在荧光显微镜中进行照明设定的方法和相应的荧光显微镜 - Google Patents

用于在荧光显微镜中进行照明设定的方法和相应的荧光显微镜 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于自动地确定至少两个光源(120k)的待设定的照明亮度(Pk)的方法，至少两个光源用于分别激发在荧光显微镜(100)中待成像的样品(110)中的至少一个荧光团(130j)，其中，至少两个光源(120k)中的每一个关于其照明亮度(Pk)单独地可控制，并且至少两个探测器(140i)分别探测显微成像的样品(110)的图像强度(Ii)，其中，自动地确定至少两个光源(120k)的待设定的照明亮度(Pk)，从而达到每荧光团(130j)的信噪比的预定的额定值，其中，为了确定至少两个光源(120k)的照明亮度(Pk)，考虑用于荧光团(130j)的不同发射光谱的探测器的串扰和/或用于光源(120k)的不同照明光谱的荧光团(130j)的交叉激发。本发明还涉及相应的荧光显微镜(100)。

Description

用于在荧光显微镜中进行照明设定的方法和相应的荧光显 微镜
技术领域
本发明涉及一种用于自动地确定至少两个光源的待设定的照明亮度的方法，至少两个光源用于分别激发在荧光显微镜中待成像的样品中的至少一种荧光团。
背景技术
在荧光显微镜中，对用荧光团染色的样品进行显微成像。荧光团是通过激发光的频率被激发的色素，其在它那方面发出辐射。通常，对于每个荧光团，需要合适波长的光源或者由其发射光谱可过滤出合适的波长的的光源。由样品发出的荧光被合适的探测器接收。在此，通常，分别探测每个荧光团的荧光辐射。这又可以通过具有相应窄带的敏感度的单个探测器或者通过具有前置滤波器的宽带探测器来实现，前置滤波器仅允许相关的荧光辐射的波长通过。关于荧光显微镜的结构和工作方式的其他细节请参考相关文献。荧光显微镜尤其用于检查尤其是活体细胞。
US 10,200,625B2公开了一种用于对培养基中的生物样品进行成像的系统和方法。首先，以预设值拍摄样品的图像。然后系统逐个像素地确定饱和的像素和信噪比。如果饱和像素的数量高于特定的阈值或者相关像素的信噪比低于预定的阈值，则拍摄新的图像，为此设定光子流和/或曝光时间的新值。一直重复该方法，直到不饱和的像素达到了预定义的信噪比阈值，或者直到经过了预定义的最大图像拍摄的持续时间。在所述文献中，光子流指的是光强(“Light Intensity”)。它表示每单位面积和时间到达相机的传感器的光子的数量。曝光时间(“Exposure Time”)是照相机的传感器对信号进行累积的时间。
借助于这种方法或其他已知的方法，用户现在可以在荧光显微镜中设定存在的用于激发相关荧光团的光源的照明亮度。已经表明，这种方法，尤其是对于不熟练的用户来说，其设计复杂而费时，并且通常不会获得所期望的高图像质量。
因此存在对以用户友好的方式、尤其是以自动进行的方式来设定显微镜参数的需求，所述显微镜参数例如是荧光显微镜中的激发光源的照明亮度。
发明内容
发明人已发现，最佳地设定荧光显微镜中的显微镜参数存在困难的原因之一是，在探测不同的探测通道中的多种色素/荧光团时存在串扰，以及由不同的光源引起的多种色素/荧光团的交叉激发。在下文中，不同探测通道中的串扰还将被称为“交叉发射”(也可以被称为探测器的“串音(Cross-Talk)”)，以及由不同的光源引起的荧光团的交叉激发将被称为“交叉激发”。
根据本发明的构思的实施方式包括用于自动地确定至少两个光源的待设定的照明亮度的方法，至少两个光源用于分别激发在荧光显微镜中待成像的样品中的至少一个荧光团，其中至少两个光源中的每一个关于其照明亮度单独地可被控制，并且其中至少两个探测器分别探测显微成像的样品的图像强度，其中自动地确定至少两个光源的待设定的照明亮度，从而达到每荧光团的信噪比的预定的额定值，其中为了确定至少两个光源的照明亮度，考虑了用于荧光团的不同发射光谱的探测器的串扰和/或用于光源的不同照明光谱的荧光团的交叉激发。
在根据本发明的构思中，术语“光源”包括适于激发荧光团(也称为色素)的任何发光的装置。为了激发荧光团，需要在光源的光谱中具备预定的激发波长。因此，根据本申请的“光源”可以包括包含激发波长的宽带光源、包含激发波长的窄带光源、或者具有连接在下游的滤波器的光源，滤波器从光源的光谱过滤包含激发波长的光谱。相对应地，这类比于根据本申请的“探测器”。探测器必须能够探测所涉及的荧光团的所发射的荧光辐射的波长。为此，可以使用相应宽带的探测器或者相应窄带的探测器，其对于荧光辐射的相应波长具有足够的灵敏度。此外，可以使用具有前置的滤波器的宽带的探测器，其中滤波器过滤荧光辐射的相关的波长，并且使探测器的传感器可接近该波长。在光源下游或前置于探测器的上述滤波器可以构造为滤片或滤板，设计为光谱分离层、分光装置或单色仪装置，但也可以例如以声光的或基于液晶的系统的形式。
每个根据本申请的光源都被设置用于直接激发荧光团，在此用户假设，荧光团存在于待成像的样品中。这些光源中的每一个在其照明亮度方面可单独地被设定。因此，可以设定出现在直接被分配的荧光团上的光子流，并且因此也可以设定最终发射到探测器上的荧光辐射所产生的光子流。根据本发明的构思，在该设定中考虑到，特定的光源由于其发射的光谱不仅激发直接分配给它的荧光团，而且还(在一定程度上)激发样品中存在的其他荧光团。如以下进一步说明的那样，该交叉激发可以通过在设定照明亮度的过程期间确定此交叉激发来加以考虑。
替代地或附加地，为了确定至少两个根据本申请的光源的照明亮度而考虑的是，分配给特定荧光团的根据本申请的探测器基于其灵敏光谱也(在一定程度上)探测源自其他荧光团的荧光辐射。如下文所解释的，通过在设定光源的照明亮度期间确定这种串扰的程度，可以考虑这种“交叉发射”。
总之，因此，按照根据本发明的构思光源的照明亮度被设定成使得在考虑“交叉发射”和/或“交叉激发”的情况下达到每荧光团的信噪比的预定的额定值。因此，根据本发明的构思，对于用户来说，尽可地减少荧光显微镜中的显微镜参数的费时且复杂的设定。借助于快速收敛算法实施该构思也使要采集的图像数量最小化，并且因此，漂白敏感的样品的光负荷和在活体细胞显微术中的光毒性也最小化。
应当注意，术语“确定”旨在包括“计算”和“实验确定”两者以及它们的混合形式。如果数学模型过于复杂并因此估计导致更快地实现目标，则这也可以包括“估计”。也可以指的是在统计估计意义上的“估计”。
在荧光显微镜中例如可以以不同的参数进行工作，这些参数的目标值可以由用户和/或由系统预定并且最后可以由系统本身设定。可能的参数是“速度”，即成像的速度，其尤其是通过曝光时间的设置来影响。此外，可能的参数是“图像质量”，其被图像的信噪比显著地影响。在此，探测到的光子或产生的光电子的数量起到主要作用，其中光子或光电子可以分配给荧光团。由于光子遵循泊松统计，所以信噪比基本上与可分配给荧光团的所探测的光电子的平方根成比例，并且因此与每荧光团的所探测的图像强度的平方根成比例。另一个可能的参数是“样品负荷”。通过照射待检查的样品而施加的样品负荷的象征是漂白。
一种对于根据本发明的构思特别有利的方案是，在恒定的成像速度下优化图像质量并且将样品负荷用作中断标准。对此的其他详细说明在下面的说明书中给出。首先应详细探讨图像质量的优化。
有利的是，根据每荧光团的由至少一个探测器探测到的至少一个图像强度来确定每荧光团的信噪比，其中，由于探测器存在的串扰，引进尽可能多的、尤其是所有的由每荧光团的探测器探测到的图像强度更加有利。换言之，因此，尤其在现有的探测器上对每荧光团的所探测到的图像强度进行累积。
此外特别有利的是，替代探测器的串扰或除了探测器的串扰之外，通过还基于相应荧光团被现有的不同的光源激发而确定每荧光团的由探测器中的一个探测到的图像强度，来在确定每荧光团的信噪比时考虑荧光团的交叉激发。因此，不仅考虑直接分配给所涉及的荧光团的激发光源，而且也考虑其余光源的光谱。换言之，在现有的光源上对每荧光团的所探测到的图像强度进行累积。
下面将以数学方式描述这些根据本发明的构思的有利的设计方案。
系统包括K个光源k，其中k＝0、…、K-1，I个探测器i，其中i＝0、…、I-1，以及J个荧光团j，其中j＝0、…、J-1。通道的数量l，于是，光源与探测器的所有可能的连接的数量则为L＝K*I，其中l＝0、…、L-1。于是，通道l的像素的强度Il为
Figure BDA0004113431260000041
其中，曝光时间为τ、混合矩阵为Mlj以及J个荧光团的荧光团浓度为cj。混合矩阵的大小由交叉激发和交叉发射确定为
Mlj＝∫Emj(λ)·Sensi(l)(λ)dλ·∫Excj(λ′)·Illl(λ′)dλ′ (2)
其中，荧光团j的发射光谱为Emj(λ)，并且荧光团j的激发光谱为Excj(λ′)，以及分配给通道l的探测器i(l)的光谱敏感度为Sensi(l)(λ)，并且通道l的照明光谱为Illl(λ′)。现在，照明光谱可以通过叠加由具有单个的亮度值的K个光源组成，这些光源具有所有各自的光谱IllLEDk(λ′)并且在通道l中以值Pkl被控制。于是，累积的照明光谱为
Figure BDA0004113431260000042
而且，可以计算连续的混合矩阵
Figure BDA0004113431260000043
使得像素的强度为
Figure BDA0004113431260000044
应当实现照明的同时探测，也就是说，仅限于可同时读取的通道。通道的数量由探测器的数量给出，因为探测器同时只可以读取所有到达该探测器的通道，因此人们可以用探测器i识别通道l，并且符号可以缩写为Il≡Ii并且
Figure BDA0004113431260000045
因为这里仅应当关注同时的照明(顺序的照明也始终是可能的并且是包括在内的，所以当然也可以关注通道l的不能同时读取的组合—模型的匹配是简单的，但是在此会使符号的可理解性变复杂)，所以可以在Pkl处省略脚注l，并且使Pk≡Pkl。可以计算/>
Figure BDA0004113431260000046
因此，方程式(5)变为
Figure BDA0004113431260000047
于是，每荧光团的累积地探测到的强度(在所有探测器上)是
Figure BDA0004113431260000048
因此，根据方程式(7)，照明亮度Pk应当被选择成使得每荧光团测量的图像强度Ij与预设值Ij 额定相对应，预设值Ij 额定与每像素的期望的光电子相对应，每像素的期望的光电子基于期望的信噪比是预定的。如同可见的，在方程式(7)中在k-光源的数量上以及也在i-探测器的数量上进行累积，使得在该示例中不仅考虑了探测器的串扰，而且也考虑了荧光团的交叉激发。原则上也可以仅考虑这两种效应中的一种；在这种情况下，仅在k-光源的数量上来累积或者仅在i-探测器的数量上来累积。
根据本发明的构思，可以共同地并且尤其是在同时读取现有的探测器的情况下对所有光源进行照明亮度的最佳选择。此外，根据本发明的构思还可以在依次地设定不同的光源的情况下和/或在依次地读取不同的探测器的情况下被实施，其中，则将照明亮度的所确定的值简单地顺序地施加到光源上。也可以是在照明亮度不同地叠加的情况下的依次照明的混合形式。
在一种有利的优化方法中，为了确定至少两个光源的照明亮度，首先分别为每个光源预定照明亮度的初始值，并且测量每荧光团的相关联的图像强度，并且计算相应相关联的信噪比，其中，接着在迭代方法中逐步地改变照明亮度的值，直至达到每荧光团的信噪比的相应预定的额定值。在该迭代方法中改变照明亮度包括提高照明亮度或也降低照明亮度。要说明的是，在该优化方法中，亮度的初始值也可以为0或者也可以通过改变而设置为0。
在一种有利的设计方案中，在确定至少两个光源的照明亮度时考虑至少两个探测器的图像增强。为此，在确定照明亮度时以探测器的预定的图像增强为基础，或者相反地在确定照明亮度时输出或设定探测器的合适的图像增强。这同样适用于各个探测器的曝光时间。这些曝光时间尤其是可以地被确定地预先给定并且保持恒定。于是，上面提到的成像的参数“速度”与确定地预先给定的值相对应。曝光时间的值又可以根据探测器的图像增强来确定。相反，探测器的图像增强也可以根据预定的曝光时间来确定。普遍地适用的是，在曝光时间较高时，可以将图像增强选择得较低，而相反地在图像增强较高时，可以将曝光时间选择得较低。一般地，这两个设置确定成像的参数“速度”。尤其是可以使得图像增强的选择取决于探测器的模拟数字转换的动态范围以及基于信噪比预定值所预期的光电子。
如上所述，根据本发明的构思的成像的第三个可能的参数是“样品负荷”。因为成像通常实施在活体样品上，所以要注意的是，不可由于过高的辐射强度而出现热损伤或光化学损伤。用荧光团染色的样品的样品负荷的量度是色素的漂白。
根据另一方面，尤其是作为上述根据本发明的构思的设计方案，但是也独立于其，规定了在确定至少两个光源的照明亮度期间确定每荧光团的漂白系数。注意，这一方面可以与首次提到的考虑“交叉激发”和“交叉发射”的方面无关，因此，它涉及独自地待保护的方面。因此，在本公开的范围内，该第二方面涉及用于自动地确定至少两个光源的待设定的照明亮度的方法，至少两个光源用于分别激发在荧光显微镜中待成像的样品中的至少一个荧光团，其中至少两个光源中的每一个关于其照明亮度单独地可被控制，并且其中至少两个探测器分别探测显微成像的样品的图像强度，其中自动地确定至少两个光源的待设定的照明亮度，从而达到每荧光团的信噪比的预定的额定值，其中在确定至少两个光源的照明亮度期间确定每荧光团的漂白系数。在用于优化照明亮度的设定值的迭代方法中(考虑或不考虑交叉激发和交叉发射)，尤其是可以(至少近似地)以数学方式确定每荧光团的漂白系数。由这样确定的漂白系数可以给出各个荧光团浓度cj的漂白动力学。当浓度下降到预定的最小值时，达到“最大漂白值”。在已知的漂白动力学中，给最小值分配达到最大漂白值的确定的持续时间。一种可能的漂白动力学例如基于荧光团浓度的时间上指数的下降。于是，可以由漂白系数、确定的光照亮度和每荧光团的探测到的强度来计算最大漂白值。
基于所述的关系，可以根据确定的最大漂白值或与之相对应的持续时间，为样品关于相应的荧光团的成像建立中断标准。这样的中断标准例如可以规定，在达到最大漂白值或被分配的持续时间时或者相应地在此之前或更早地降低相应光源的照明亮度，其中可选地可以提高相应探测器的图像增强。对于所关注的荧光团而言，减小直接分配的激发光源通常是足够的，其中为了补偿图像亮度的减小可以提高相应直接分配的探测器的图像增强和/或曝光时间。然而，在实践中，极短波的激发光源尤其是还漂白其他荧光团，其激发还位于红色光谱区域中(“斯托克斯位移”(“Stokes Shift”))。在这种情况下，降低这些光源的照明亮度也可以是有利的。当考虑交叉激发时，存在各个光源的强度对各个荧光团激发的作用矩阵，并且可以单独地或在信噪比设定的过程中通过实验确定对各个荧光团的漂白系数的作用矩阵，使得在此人们可以非常有针对性地进行处理。
利用这样重新设定的照明亮度又可以计算出每荧光团的信噪比以及新的最大漂白值。此外，中断标准可以规定，在达到另一个最大漂白值时，相应的激发光源或相应相关的光源的照明亮度降低到0，以防止样品受损。
在根据本发明的构思中，有利的是，在确定照明亮度期间确定不影响所探测到的图像强度的荧光团和/或不影响荧光团的光源。例如，当尽管用户和/或系统的相对立的指示但在样品或所选择的视野中也不存在特定的荧光团时，或者当出于该原因或其他原因所设置的光源对所探测到的图像强度没有作用时，则可以是这种情况。
此外，特别有利的是，为了确定作为荧光显微镜中物镜更换的结果的至少两个光源的照明亮度，通过考虑到样品中的成像关系，来考虑探测到的图像强度由于该物镜更换而发生的变化，该成像关系涉及照明光的几何流和从系统成像到探测元件上的荧光光的几何流。这尤其是涉及照明光瞳的取决于系统的照明、发光场光阑的放大率、物镜的探测圆锥以及探测器元件的成像到样品中的尺寸。
下面以数学方式简短地描述用于最佳地确定至少两个光源的照明亮度的可能的优化方法。
例如借助根据牛顿-拉夫逊方法(Newton-Raphson-Methode)的迭代方法进行优化：
1.测量初始的照明设定
Figure BDA0004113431260000071
强度/>
Figure BDA0004113431260000072
这是以用于照明的(良好的)起始值进行的图像拍摄。由仪器光谱和荧光团数据计算/>
Figure BDA0004113431260000073
在最简单的情况下，仪器光谱从设计过程或校准测量中是已知的，就像荧光团数据通过校准数据是已知的并且例如在数据库中是可用的。然而也可以在迭代方法(“飞速写入(on the fly)”)的过程中确定或改善矩阵项，如在拟牛顿方法(如BFSS)中常见的那样。例如由下文解释的勒洛控制(Reuleaux-Control)生成目标值/>
Figure BDA0004113431260000074
并且如果可能，生成与色素相关的数据。
2.以合适的方法估计
Figure BDA0004113431260000075
这可以是从专业文献中原理上已知的线性解混(lineares Unmixing)或者也可以是相量解混(Phasor-Unmixing)。
3.计算每荧光团的累积的强度。
4.估计每种色素的漂白系数。
5.通过将方程式(7)微分成如下，计算与照明设定相关的每荧光团的累积的强度的雅可比矩阵
Figure BDA0004113431260000076
6.检查雅可比矩阵，以便确定无效的光源和荧光团的缺失。如果行是空的，则这意味着相应的荧光团不在图像中。如果列是空的，则相应的光源对探测到的光电子的数量没有影响。
7.作为牛顿步骤计算新的照明设定
Figure BDA0004113431260000077
在此，矩阵逆转可以是穆尔-彭罗斯广义逆(Moore-Penrose-Pseudoinverse)。
8.将
Figure BDA0004113431260000078
限制在控制区域内的正值。如果/>
Figure BDA0004113431260000079
则将光源k从解决方案移除并设置/>
Figure BDA00041134312600000710
9.检验中断标准
(a)
Figure BDA00041134312600000711
小于容许值。设定成功。
(b)
Figure BDA00041134312600000712
小于容许值。设定成功。
(c)雅可比矩阵是不可逆转的。报错，解释原因。通过在步骤6中移除空的行和列，已经找到了不可逆转性的原因。为了解释原因，可以向用户显示错误报告。
(d)漂白太强。
(e)达到迭代的最大次数。
10.进行新的图像采集
Figure BDA0004113431260000081
并且返回到步骤2。
根据本发明的构思还涉及计算单元，计算单元设置用于执行根据本发明的构思的上述实施方式的方法。在该实施方式中，方法可以基于计算单元完全自动地被执行。因此，可以以最高的程度用户友好地确定相应的显微镜参数。可以显示所确定的值和/或在荧光显微镜的相应元件上立刻设定所确定的值。
在另一种实施方式中，根据本发明的构思涉及具有程序代码的计算机程序，当在处理器上、尤其是在提及的计算单元上执行计算机程序时，计算机程序用于执行根据上述的根据本发明的构思的方法。
最后，根据本发明的构思涉及具有至少两个光源的荧光显微镜，至少两个光源用于分别激发借助荧光显微镜成像的样品中的至少一个荧光团，其中，至少两个光源中的每一个关于其照明亮度单独地可被控制，荧光显微镜还具有至少两个探测器，用于分别探测显微成像的样品的图像强度，并且具有计算单元，计算单元设置用于执行根据本发明的构思的上述方法，以便自动地确定至少两个光源的待设定的照明亮度。
当根据每荧光团的探测到的图像强度来确定每荧光团的信噪比时，计算单元与荧光显微镜的探测器处于通信是有利的。
此外，有利的是，计算单元与用于自动地设定至少两个光源的照明亮度的手段处于通信连接中，以便将照明亮度设定成达到每荧光团的信噪比的预定的额定值，其中，为了确定至少两个光源的照明亮度，考虑用于荧光团的不同发射光谱的探测器的串扰和/或考虑用于光源的不同照明光谱的荧光团的交叉激发。
此外，对于根据本发明的方法的实施方案类似地适用于根据本发明的荧光显微镜及其设计方案和由此产生的优点。
上述已提及的、所谓的勒洛元件提供了输入三个提及的参数“速度”、“图像质量”和“样品保护”的可能性。在此，通常涉及多边形形式的输入面，其中坐标原点可以是在各两个相邻的角点之间的角点或棱边中点。优选的是圆弧多边形，即这样的多边形，其中棱边不是直线，而是围绕对置的角点的圆弧。在这里所考虑的三个参数中-不限制一般性地-此元件尤其是设计为圆弧三角形或勒洛三角形。在勒洛三角形中，棱边的每个点距相对置的顶点的距离是恒定的。
定性的参数的选择，例如“速度”、“图像质量”和“样品保护”允许直观的设定，而用户不必知道或理解技术背景。勒洛三角形在两个维度上呈现出三个期望，并且由此表明这些期望不能同时满足。根据本发明的构思，现在在信噪比的意义上对“图像质量”进行量化，并且通过所使用的曝光时间(和/或增益)给出“速度”。探测到的光子的数量强烈地取决于样品和所使用的荧光团以及标记密度，使得优化这种可观察性以达到期望的值。曝光时间在此优选地保持固定并且适配照明。“样品保护”或者“样品保护的成像”的大小被作为中断标准而考虑，以便不超过一定的样品负荷。
信噪比的预定可以直接通过用户来进行。但是也可能的是，用户将信噪比限定在预定的范围内。预定的范围可以例如由优先权信息产生或被参数化，例如考虑荧光团的另外已知的漂白敏感性、预定的曝光时间或其他标准。一般地，信噪比的预定总是包含与曝光时间和漂白性能的折衷，在折中的范畴中第一个应当最大化。
因此，在预定的“速度”(即，在此例如曝光时间)下，用户具有一些“图像质量”的选择，其中，同时在样品的照明期间动态改变的样品负荷必须保持在极限值以下。此外，当存在对漂白尤其敏感的荧光团时，系统自身可以减少目标-SNR-值和/或进行其他调整。关于勒洛三角形的其他实施方案可以从相应的实施例中得出，勒洛三角形有利地实现为用于操作荧光显微镜的GUI(“图形用户界面(graphical user interface)”)。
本发明的其他优点和设计方案由说明书和附图得出。
应当理解，在不脱离本发明的范围的情况下，上述特征和下面将要解释的特征不仅可以在分别说明的组合中使用，而且也可以在其他组合中使用或单独使用。
本发明借助于实施例在附图中示意性地示出并且在下面参照附图进行描述。
附图说明
图1示意性地示出了按照根据本发明的实施方式的荧光显微镜，
图2示出了借助勒洛控制进行参数设定的可能性，以及
图3示出了根据本发明的方法的方法流程的实施方式。
具体实施方式
图1非常示意性地示出了具有用于发射K个不同的激发波长的K个光源120k的荧光显微镜100，k＝0、…、K-1。有利地，这些光源是具有相应光谱的LED或激光器，其中，在需要时可以在下游连接滤波器。原则上也可以使用宽带光源，借助滤片或滤板可以从宽带光源的光谱中依次地滤出所期望的激发波长。然而，根据本发明的构思的主要优点之一是，在存在多个光源的情况下，可以同时对这些光源的照明亮度进行设定，使得不需要依次地操作或依次地设定。
如图1所示，各个光源120k发出照明光路164，照明光路164经由光谱分离元件166被引导到显微镜100的物镜160中。光谱分离元件166是二向色元件，其将相关的激发波长偏转并且对于相应的荧光辐射是透明的。荧光显微镜的光学器件的细节在图1中仅非常示意性地被示出，因为其细节由现有技术充分已知。照明光路164通过物镜160被引导到样品110上，并且激发位于其中的用于发射荧光辐射的荧光团130j,j＝0、…、J-1。所发出的荧光辐射通过物镜160和可能的另外的光学成像元件被成像到相应的探测器140i上,i＝0、…、I-1。给在本申请的意义上发射激发波长的每个光源120k分配相应的荧光团130j，荧光团130j从它那方面发射荧光辐射，荧光辐射又由相应的探测器140i探测。因此，给J个可区分的荧光团相应地分配I个探测器。探测器可以-类似于光源-是多个单个探测器，其中滤波器可以被连接在这些单个探测器前，这尤其是因为本发明的构思允许同时读取I个探测器。然而原则上也可以利用相应的滤片或滤板运行一个或更多个宽带探测器，并且因此完全或部分地依次运行探测器。落到探测器上的探测光路用162标注。
在图1中示例性地示出了荧光显微镜，然而应当理解的是，本发明的构思也可以被实施在其他荧光显微镜系统上，例如片状显微镜、共焦显微镜、多光子显微镜等。
对于每个光源120k来说，每个光源120k的照明亮度Pk(“照明功率”)以及因此所放射的功率可单独地被设定。根据本发明的构思尤其是能够实现同时设定所有K个光源的照明亮度Pk。为此，在在此所观察的实施例中设置了计算单元150，计算单元与用于设定光源的照明亮度Pk的手段处于通信连接或作用连接中。探测器140i探测在样品110被拍摄的图像中的相应的荧光团的分布，并且因此分别探测图像强度Ii。计算单元150与探测器140i处于通信连接或作用连接中，以便能够接收与各个图像强度相对应的信号。根据本发明的构思，可以同时读取I个探测器。
现在，待设定的照明亮度Pk由计算单元150自动地确定成，使得针对每一个可区分的荧光团设定信噪比的预定的额定值，其中，为此考虑对探测器的由于荧光团的未直接分配给该探测器的其他发射光谱引起的串扰以及荧光团的通过光源的未直接分配给该荧光团的其他照明光谱引起的交叉激发。在此，每荧光团的信噪比的数值是根据方程式(7)的每荧光团的在所有探测器上累积地探测到的强度的平方根。
在该实施例中，通过勒洛三角形(Reuleaux-Dreieck)来实现每荧光团的信噪比的预定值Ij 额定的预先确定，如图2所示。图2中所示的勒洛三角形有利地作为GUI(“图形用户界面”)被呈现给荧光显微镜100的用户，以便操作显微镜。在弧形三角形的顶点处有三个参数“速度”、“图像质量”和“样品保护”的坐标原点。这些参数的值在图3中用1、2或3表示并且位于与各自的坐标原点的距离相同的圆弧上。在所示的示例中，参数“速度”由曝光时间τ(“exposure time”)的预定值1和/或增益(“gain”)的预定值固定地预先确定。这里用最小值3来标记参数“样品保护”，这表示所分配的漂白值必须总是小于等于最大漂白值。换言之，参数“样品保护”的所分配的值不允许低于值3。因此，对于参数“图像质量”的值，只剩下位于上圆弧段d2上的值。值2在此是最大可能的值。应当指出，参数“样品保护”的值3可以在成像期间以区域d2减小的方式动态地改变。
由此，构造为GUI的勒洛三角形允许用户直观地输入图像质量的期望的额定值，其中，由输入的位于区域d2(在图2中示出最大值2)中的值2导出信噪比的额定值。如果系统已知样品110中的对漂白尤其敏感的荧光团，则系统可以自行选择图像质量的较低的值2。系统以及计算单元150由预定的值2确定每荧光团Ij的累积地探测到的强度的相应值，该值用作待确定的照明亮度Pk的额定值。
接着，例如通过上面已经阐述的迭代方法以初始的照明设定开始通过n个步骤确定K个光源的最优的照明设定。在每个步骤中，还确定或测量每荧光团的图像强度Ij(在探测器上累积)。上面解释的迭代步骤2至8一直执行，直到满足在第9点中提到的中断标准之一。对此，包括：每荧光团的测量的图像强度与预定的额定值的差异小于容许值。此外：光源的待新设定的照明亮度与在先前步骤中设定的照明亮度的差异小于容许值。此外：在方程式(8)中给出的雅可比矩阵(Jacobi-Matrix)是不可逆的。这导致报错并且有利地导致向用户输出可能的错误原因。此外：已经实现了预先确定数量的迭代。最后：样品的漂白过强；换言之，在参数“样品保护”的值3的动态发展中，值域d2缩小，使得必须降低照明亮度以便排除对样品的损坏。在这种情况下，可以引进另一个中断标准，其中，降低相关光源的相应的照明亮度，并且有利地，同时提高相关探测器的增益或者至少提高直接探测所涉及的荧光团的探测器的增益。
图3以流程图的形式阐述了用于优化照明亮度的根据本发明的构思的实施方式。
图3示出用于设定荧光显微镜100中K个现有的光源120k的照明亮度的根据本发明的构思的实施方式的概览，荧光显微镜100用于检查具有J个可区分的荧光团130j的样品110，其中每个荧光团被I个探测器140i中的一个以样品的图像的形式探测。为此，请参考结合图1和图2的上述实施方式。在步骤S1中，部分通过用户部分通过系统为计算单元150(参见图1)尤其是实施如下预先规定：例如根据制造商的预先规定或者学习到的算法预定照明亮度的初始值。由光源的光谱、探测器的探测光谱和荧光团数据计算联接矩阵M。例如由所提及的勒洛输入(参见图2)和/或通过相应的系统预设参数(与色素相关的数据)生成在探测器上累积的每荧光团的图像强度Ij的目标值。此外，定义了以上提及的中断标准。
在初始化步骤S1之后，系统开始对各个探测器图像进行图像采集，各个探测器图像分别针对每个荧光团探测显微成像的样品110的图像强度Ii。
在步骤S3中，估计各个荧光团130j在样品110中的浓度cj，并且根据方程式(7)计算累积的亮度Ij。这由荧光团浓度cj、所设定的曝光时间τ、相应地设定的照明亮度Pk以及所提到的联接矩阵M来得出。对此的细节已经在上面阐述。
在所提及的步骤S3中，还有利地计算漂白系数κj。如同上面已经强调的，这是可以附加于但也可以独立于“交叉激发”或“交叉发射”而使用的方面，以便确定最佳的照明亮度。这可以通过比较在优化期间拍摄的连续的图像中探测到的cj来进行，这些连续的图像根据数学模型被评估。因此，根据模型的构造，例如由两个连续的图像采集和与此相关的照明亮度，可以基于cj彼此间的相对测量来参数化0.级模型，或者由N次连续的图像采集和照明亮度参数化N-2.级模型。线性的模型是特别重要的，其可以借助于常用的数学方法由三次连续的图像采集和照明亮度被参数化。在最终设定照明亮度之后，可以由相应确定的漂白系数计算每荧光团的特定的漂白动力学，然后从漂白动力学中又可以确定最大漂白值，参数“样品保护”以该最大漂白值为基础。
在随后的步骤S4中，根据方程式(8)计算每荧光团的累积的强度的雅可比矩阵。随后，在步骤S5中检验雅可比矩阵是否具有空的行(相应的荧光团不在图像中)或空的列(相应的光源对所探测到的光电子的数量没有影响)。如果是这种情况，则消除相应的行(荧光团)或列(光源)，也就是说，为了简化计算消耗不再进一步考虑它们。如果步骤S5不得到结果，则继续进行步骤S7，在步骤S7中，根据方程式(9)对照明亮度进行新的设定。
然后，在步骤S8中检验提出的中断标准，如其在上面已经详细阐述的那样。如果不满足中断标准，则进入迭代方法的下一个步骤n+1，即，根据图3的流程图返回到步骤S2。而如果满足中断标准之一，则在步骤S9中以光源120k的所确定的和所设定的照明亮度Pk开始主图像采集。
在此提出的用于在荧光显微镜中设定所提到的参数的方法是非常用户友好的，因为方法直观地工作并且不要求技术的基础知识并且自动地进行相应的设定。方法也基于生物实验的对于用户重要的参数呈现出调节参数的技术的参数空间。
术语“和/或”包括一个或更多个相关联所列举的项目的所有组合，并且可以缩写为“/”。
尽管已经在装置的范围内描述了一些方面，但是清楚的是，这些方面也表示对相应方法的描述，其中块或装置对应于方法步骤或方法步骤的功能。与此类似地，在方法步骤的范围内描述的方面也表示对相应的块或元件或相应装置的特性的描述。
一些实施例涉及包括系统的显微镜，如结合一个或更多个附图所描述的那样。替代地，显微镜可以是系统的一部分或连接到系统。图1示出了配置用于执行本文所描述的方法的系统的示意图。系统包括显微镜100和计算机系统或计算单元150。显微镜100配置用于拍摄图像，并且连接到计算机系统150。计算机系统配置用于执行本文描述的方法的至少一部分。计算机系统可以配置用于执行机器学习算法。计算机系统和显微镜可以是分离的单元，但也可以一起集成在共同的壳体中。计算机系统可以是显微镜的中央处理系统的一部分，和/或计算机系统可以是显微镜的子部件的一部分，例如显微镜的传感器、致动器、照相机或照明单元等。
计算机系统可以是具有一个或更多个处理器和一个或更多个存储装置的当地的计算机装置(例如，个人计算机、膝上电脑、平板计算机或移动电话)，或者可以是分布式的计算机系统(例如，具有分布在不同位置的一个或更多个处理器或一个或更多个存储装置的云计算系统，例如，分布在当地的客户端和/或一个或更多个远程服务器场和/或数据中心处)。计算机系统可以包括任何电路或电路的组合。在一种实施例中，计算机系统可以包括一个或更多个处理器，其可以是任何类型。根据本文的使用，处理器可以意指任何类型的计算电路，例如但不限于微处理器、微控制器、复杂指令集微处理器(CISC)、精简指令集微处理器(RISC)、超长指令字(Very Long Instruction Word；VLIW)微处理器、图形处理器、数字信号处理器(DSP)、多核处理器、诸如显微镜或显微镜部件(例如，相机)的现场可编程门阵列(FPGA)或任何其他类型的处理器或处理电路。可包括在计算机系统中的其他类型的电路可以是定制电路、专用集成电路(ASIC)等，例如用于无线装置(例如，移动电话、平板计算机、膝上电脑、无线电收发器和类似电子系统)的一个或更多个电路(例如，通信电路)。计算机系统可以包括一个或更多个存储装置，存储装置可以包括适合于特定应用的一个或更多个存储元件，例如随机存取存储器(RAM,Random Access Memory)形式的主存储器、一个或更多个硬盘和/或处理可移除的介质(例如CD、闪存卡、DVD等)的一个或更多个驱动器。计算机系统还可以包括显示装置、一个或更多个扬声器、以及键盘和/或控制器，控制器可以包括鼠标、轨迹球、触摸屏、语音识别装置、或允许系统用户向计算机系统输入信息和从计算机系统接收信息的任何其他装置。
方法步骤的一些或全部可以通过硬件装置或在使用硬件装置的情况下来执行，例如，硬件装置可以是例如处理器、微处理器、可编程计算机或电子电路。在一些实施例中，最重要的方法步骤中的一个或更多个可以由这样的装置执行。
根据特定的实施要求，本发明的实施例可以以硬件或软件来实施。该实施可以利用非易失性存储介质来执行，例如数字存储介质，其例如软盘、DVD、蓝光、CD、ROM、PROM和EPROM、EEPROM或闪存，其上存储有电子可读的控制信号，它们与可编程计算机系统协作(或能够与其协作)，使得执行相应方法。因此，数字存储介质可以是计算机可读的。
根据本发明的一些实施例包括具有电子可读的控制信号的数据载体，其可以与可编程计算机系统协作，使得执行本文描述的方法之一。
一般地，本发明的实施例可以被实施为具有程序代码的计算机程序产品，其中，当计算机程序产品在计算机上运行时，程序代码对于执行方法之一是起作用的。程序代码例如可以被存储在机器可读的载体上。
另一种实施例包括用于执行本文描述的方法之一的计算机程序，计算机程序被存储在机器可读的载体上。
换言之，因此，本发明的实施例是具有程序代码的计算机程序，当计算机程序在计算机上运行时，计算机程序用于执行本文描述的方法之一。
因此，本发明的另一种实施例是存储介质(或数据载体或计算机可读的介质)，存储介质包括存储在其上的计算机程序，当计算机程序由处理器执行时，计算机程序用于执行本文描述的方法之一。数据载体、数字存储介质或记录的介质通常是有形的和/或非瞬时的。本发明的另一种实施例是如本文所述的装置，装置包括处理器和存储介质。
因此，本发明的另一种实施例是数据流或信号序列，数据流或信号序列是用于执行本文所描述的方法之一的计算机程序。数据流或信号序列例如可以配置为，使得其通过数据通信连接、例如因特网来传输。
另一种实施例包括处理手段，例如计算机或可编程的逻辑装置，处理手段配置为或适于执行本文描述的方法之一。
另一种实施例包括计算机，计算机上安装有用于执行本文描述的方法之一的计算机程序。
根据本发明的另一种实施例包括装置或系统，装置或系统配置为将用于执行本文描述的方法之一的计算机程序(例如，以电子方式或以光学方式)传输至接收器。接收器例如可以是计算机、移动装置、存储装置等。装置或系统例如可以包括用于将计算机程序传输至接收器的数据服务器。
在一些实施例中，可编程的逻辑装置(例如，现场可编程门阵列，FPGA)可以用于执行本文描述的方法的一些或全部功能。在一些实施例中，现场可编程门阵列可以与微处理器协作，以便执行本文描述的方法之一。一般地，这些方法优选地由每个硬件装置执行。
附图标记列表
100 荧光显微镜
110 样品
120k 光源；k＝0、…、K-1
130j 荧光团；j＝0、…、J-1
140i 探测器；i＝0、…、I-1
150 计算单元
160 物镜
162 探测光路
164 照明光路
166 光谱分离元件
Pk 照明亮度
cj 荧光团浓度；j＝0、…、J-1
d2 参数“图像质量”的区域
S1-S9 方法步骤

Claims (20)

1.一种用于自动地确定至少两个光源(120k)的待设定的照明亮度(Pk)的方法，至少两个光源(120k)用于分别激发在荧光显微镜(100)中待成像的样品(110)中的至少一个荧光团(130j)，
其中，至少两个光源(120k)中的每一个关于其照明亮度(Pk)单独地可控制，并且
其中，至少两个探测器(140i)分别探测显微成像的样品(110)的图像强度(Ii)，
其中，自动地确定至少两个光源(120k)的待设定的照明亮度(Pk)，从而达到每荧光团(130j)的信噪比的预定的额定值，
其中，为了确定至少两个光源(120k)的照明亮度(Pk)，考虑用于荧光团(130j)的不同发射光谱的探测器的串扰和/或用于光源(120k)的不同照明光谱的荧光团(130j)的交叉激发。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，根据每荧光团(130j)的由至少一个探测器(140i)探测到的至少一个图像强度(Ij)确定每荧光团(130j)的信噪比。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，基于通过至少两个光源(120k)激发相应的荧光团(130j)，根据每荧光团(130j)的由至少两个探测器(140i)中的至少一个探测到的图像强度(Ij)，确定每荧光团(130j)的信噪比。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，根据每荧光团(130j)的由至少两个探测器(140i)探测到的图像强度(Ij)确定每荧光团(130j)的信噪比。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中，为了确定至少两个光源(120k)的照明亮度(Pk)，首先对于每个光源(120k)分别预定照明亮度的初始值(Pk°)，并且测量相关联的图像强度(Ij°)，并且计算每荧光团的相关联的信噪比，其中，接着在迭代方法中逐步地改变照明亮度(Pk)的值，直到达到每荧光团的信噪比的预定的额定值。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，在确定至少两个光源(120k)的照明亮度(Pk)时考虑至少两个探测器(140i)的图像增强。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，为了确定至少两个光源(120k)的照明亮度(Pk)，考虑针对每个探测器(140i)曝光时间(τ)。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，针对每个探测器(140i)的曝光时间(τ)保持恒定。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中，曝光时间(τ)根据探测器(140i)的图像增强来确定。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，同时读取探测器(140i)。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在确定至少两个光源(120k)的照明亮度(Pk)期间确定每荧光团(130j)的漂白系数(κj)。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，由所确定的漂白系数(κj)确定最大漂白值和/或直到达到每荧光团(130j)的最大漂白值的持续时间。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，根据确定的最大漂白值，为样品(110)关于相应的荧光团(130j)的成像建立中断标准。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，中断标准规定，降低相应光源(120k)的照明亮度(Pk)，其中可选地提高相应探测器(140i)的图像增强。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在确定照明亮度(Pk)期间，确定不影响所探测到的图像强度(Ij)的荧光团(130j)和/或光源(120k)。
16.根据前述权利要求中与权利要求2相关的任一项所述的方法，其中，为了确定作为荧光显微镜(100)中物镜更换的结果的至少两个光源(120k)的照明亮度(Pk)，考虑探测到的图像强度(Ii)由于所述物镜更换而发生的变化。
17.一种计算单元(150)，其设置成用于执行根据权利要求1至16中任一项所述的方法。
18.一种具有程序代码的计算机程序，当在处理器上、尤其是在根据权利要求17所述的计算单元(150)上执行计算机程序时，计算机程序用于执行根据权利要求1至16中任一项所述的方法。
19.一种荧光显微镜(100)，包括：
至少两个光源(120k)，用于分别激发在借助于荧光显微镜(100)待成像的样品(110)中的至少一个荧光团(130j)，其中，至少两个光源(120k)中的每一个关于其照明亮度(Pk)单独地可控制，
至少两个探测器(140i)，用于分别探测显微成像的样品(110)的图像强度(Ij)，以及
根据权利要求17所述的计算单元(150)，用于确定待设定的照明亮度(Pk)，从而达到每荧光团(130j)的信噪比的预定的额定值，其中，为了确定至少两个光源(120k)的照明亮度(Pk)，考虑用于荧光团(130j)的不同发射光谱的探测器的串扰和/或用于光源(120k)的不同照明光谱的荧光团(130j)的交叉激发。
20.根据权利要求19所述的荧光显微镜(100)，包括：
用于设定至少两个光源(120k)的照明亮度(Pk)的手段，
其中，计算单元(150)与至少两个探测器(140i)和用于设定照明亮度(Pk)的手段处于通信连接中，以便设定至少两个光源(120k)的所确定的照明亮度(Pk)。
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