CN116334216B - Cldn5基因在调控认知障碍中的功能及应用 - Google Patents

Cldn5基因在调控认知障碍中的功能及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及Cldn5基因在调控认知障碍中的功能及应用。具体地，本发明实验证明了Cldn5基因和/或其表达产物是认知障碍的风险因子；提供了增加Cldn5基因表达水平在制备和筛选治疗认知障碍的产品中的应用。

Description

Cldn5基因在调控认知障碍中的功能及应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及Cldn5基因在认知障碍诊断和治疗中的应用。
背景技术
认知障碍(Cognitive disorders，简称CDs)，也称为神经认知障碍(neurocognitive disorders，简称NCDs)，是一种主要影响认知能力(包括学习、记忆、感知和问题解决等)的心理健康障碍。一般被定义为：执行功能、学习和记忆、感知运动功能、语言、复杂注意力和社会认知等6种认知能力缺陷，通常代表为衰退，并可能有潜在的脑病理。后天形成的有阿尔茨海默病、亨廷顿氏舞蹈症、创伤性脑损伤(TBI)、帕金森症、朊病毒疾病和由于艾滋病毒感染所引起的神经认知障碍等；先天形成的则多见于发育迟缓（如自闭症谱系）。
诱导认知障碍的机制十分复杂，目前临床上尚不能够完全预防和治疗认知功能异常。内环境稳态是维护脑结构和功能的基本条件，而血脑屏障 (Blood-brain barrier,BBB)则是维持该条件的重要结构基础。应激负荷人群和认知障碍患者均呈现一定程度的BBB泄漏；应激引起的BBB损伤可进一步影响氨基酸转运、免疫细胞迁移或炎性因子积聚，引发脑内环境稳态失衡，导致不同类型细胞及不同脑区间的交流与连接异常。然而，目前对于应激致认知损伤过程中下BBB功能发生异常的调控机制仍未完全阐明。找到并修复BBB损伤的关键节点分子是揭示应激性认知障碍致病机制和探索应激性认知障碍的临床治疗手段的关键所在。相邻内皮细胞之间彼此融合构成的闭锁结构即紧密连接 (Tight junction,TJ) 是BBB发挥正常生理功能的结构基础。之前的研究发现，Cldn5等TJ分子对于维持TJ结构的完整性和BBB的低通透性至关重要，TJ蛋白的表达失调或活性异常可导致BBB损伤。然而上述研究对TJ蛋白-BBB-应激性认知障碍之间的内在机制缺少深刻的解释。
因此，针对认知障碍相关疾病的研究还需要进一步改进。
发明内容
本发明的第一方面，提供了一种认知障碍相关疾病的生物标志物，所述的生物标志物为紧密连接分子Claudin-5（Cldn5分子）。
优选的，所述的Cldn5分子包括CLDN5蛋白、Cldn5基因。
优选的，所述的生物标记物的样本来源于血液、脑脊液或脑组织。
进一步优选的，所述的生物标志物的样本来源于脑组织中的前额叶皮层（Prefrontal cortex，PFC）。
优选的，所述的认知障碍相关疾病包括但不限于应激性认知障碍、阿尔茨海默病、亨廷顿氏舞蹈症、创伤性脑损伤(TBI)、帕金森症、朊病毒疾病或由于艾滋病毒感染所引起的神经认知障碍。
本发明的第二方面，提供了一种上述第一方面所述的生物标志物的检测试剂，所述的检测试剂包括：
1）检测CLDN5蛋白表达水平的试剂；
2）检测Cldn5基因表达水平的试剂。
根据具体实施方式的需要，所述的试剂可以是现有技术中任一试剂，只要能检测Cldn5基因，例如Cldn5的mRNA表达水平和/或CLDN5蛋白表达水平即可。
优选的，所述的检测CLDN5基因表达水平的试剂包括引物和探针，和/或，所述的检测Cldn5蛋白表达水平的试剂包括抗体或酶的底物。
优选的，所述的检测CLDN5蛋白表达水平包括使用CLDN5蛋白抗体（购买自thermofisher scientific，货号35-2500）、酶的底物，或者，使用ELISA试剂盒（购买自华美生物，货号CEB-EL005507MO）。
优选的，所述的检测Cldn5基因的mRNA的引物包括正向引物（SEQ ID NO：1）：5’-ACTCTTTGTTACCTTGACCGG-3’和/或反向引物（SEQ ID NO：2）：5’-CAGCTCGTACTTCTGTGACAC-3’。
优选的，所述的检测Cldn5基因的mRNA的探针（SEQ ID NO：3）：5’-TGAGTGCTACCCGTGCCTTAACTG-3’。
本发明的第三方面，提供了一种上述第二方面所述的检测试剂在制备诊断认知障碍相关疾病的产品中的应用。
优选的，所述的产品包括但不限于诊断试剂盒、基因芯片、抗体，引物和（或）探针。
本发明的第四方面，提供了一种诊断产品，所述的诊断产品包括上述第二方面的检测试剂。
优选的，所述诊断产品包括诊断试剂盒、基因芯片、抗体，引物和（或）探针。
本发明的第五方面，提供了一种上述第一方面的生物标志物的调节试剂，所述的调节试剂提高CLDN5蛋白表达水平，和/或，Cldn5基因表达水平。
根据具体实施方式的需要，所述的调节试剂可以是现有技术中任一试剂，只要能调节Cldn5基因的mRNA表达水平和/或CLDN5蛋白表达水平即可。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的调节试剂包括：
1）CLDN5蛋白；
2）包含Cldn5基因的过表达载体；促进Cldn5基因表达的调节因子。
进一步优选的，所述的促进Cldn5基因表达调节因子包括但不限于增强子、启动子等等。
本发明的第六方面，提供了一种上述第五方面的调节试剂在制备治疗认知障碍相关疾病的产品中的应用。
根据具体实施方式的需要，所述的应用还包括治疗认知障碍相关疾病的并发症。
本发明的第七方面，提供了一种药物或药物组合物，所述的药物或药物组合物包括上述第五方面的调节试剂。
本发明的第八方面，提供了一种阿尔兹海默症（AD）的治疗药物在制备治疗应激性认知障碍的产品中的应用。
优选的，所述治疗药物提高CLDN5蛋白表达水平，和/或，Cldn5基因表达水平。
更优选的，所述治疗药物包括多奈哌齐。
本发明的第九方面，提供了一种上述第一方面的生物标志物作为靶点在筛选诊断、治疗和/或预后评估认知障碍相关疾病的产品中的应用。
优选的，所述的筛选包括筛选CLDN5蛋白表达水平和/或Cldn5基因表达水平的检测试剂作为诊断和/或预后评估认知障碍相关疾病的产品，或者，所述的筛选包括筛选提高CLDN5蛋白表达水平、和/或Cldn5基因表达水平的调节试剂作为治疗认知障碍相关疾病的产品。
本发明的第十方面，提供了一种治疗认知障碍相关疾病的方法。
优选的，所述的方法包括向患病个体施用治疗有效量的上述第五方面的调节试剂，和/或，药物或药物组合物。
本发明的第十一方面，提供了一种Cldn5基因表达的抑制剂，所述的抑制剂包括抑制Cldn5表达的shRNA，或者包含所述shRNA的载体，所述shRNA包含针对4、7和/或10设计的shRNA。
优选的，所述的shRNA包含针对SEQ ID NO：4设计的shRNA。
进一步优选的，所述的shRNA包含SEQID NO：5和/或6所示的核酸。
优选的，所述的shRNA包含针对SEQ ID NO：7设计的shRNA。
进一步优选的，所述的shRNA包含SEQID NO：8和/或9所示的核酸。
优选的，所述的shRNA包含针对SEQ ID NO：10设计的shRNA。
进一步优选的，所述的shRNA包含SEQID NO：11和/或12所示的核酸。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的shRNA包含针对SEQ ID NO：4设计的shRNA，所述的shRNA包含SEQID NO：5和/或6所示的核酸。
本发明的第十二方面，提供一种包含上述shRNA的载体。
优选的，所述载体包括抑制Cldn5表达的shRNA腺相关病毒。
优选的，所述的腺相关病毒中克隆有针对SEQ ID NO：4设计的shRNA。
进一步优选的，所述的shRNA包含SEQID NO：5和/或6所示的核酸。
优选的，所述的腺相关病毒中克隆有针对SEQ ID NO：7设计的shRNA。
进一步优选的，所述的shRNA包含SEQID NO：8和/或9所示的核酸。
优选的，所述的腺相关病毒中克隆有针对SEQ ID NO：10设计的shRNA。
进一步优选的，所述的shRNA包含SEQID NO：11和/或12所示的核酸。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的腺相关病毒中克隆有针对SEQ ID NO：4设计的shRNA，所述的shRNA包含SEQID NO：5和/或6所示的核酸。
本发明的第十三方面，提供一种上述shRNA腺相关病毒或shRNA在抑制Cldn5表达中的用途。
本发明的第十四方面，提供一种上述shRNA腺相关病毒或shRNA在制备认知障碍相关疾病模型中的用途。
本发明的第十五方面，提供了一种筛选治疗认知障碍相关疾病的药物的方法。
优选的，所述的方法包括将候选药物施用于认知障碍相关疾病的动物模型，筛选能够使Cldn5基因或蛋白表达升高的候选药物。
该方法可以为治疗目的，也可以为非治疗目的，该方法只是筛选哪些药物可以用于治疗认知障碍相关疾病，即治疗效果不是必然的。药物的筛选只是一种可能性。
在本发明的第十六方面，提供了一种诊断试剂盒。
优选的，所述的诊断试剂盒包括特异性检测Cldn5基因和/或其表达产物的试剂，可用于认知障碍相关疾病的监测。
根据本发明的实施例，所述试剂包括特异性引物和/或探针，可用于检测Cldn5或其表达产物的含量。除引物和/或探针之外，还配有检测基因或蛋白表达的其他常用试剂，包括用于聚合酶链式反应的缓冲液，用于蛋白表达量检测的SDS-PAGE检测溶液等。
本发明所述的“产品”包含检测生物标志物的试剂。包括但不限于药物、试剂盒、设备等等。
本发明术语“诊断”是指以查明患者过去、诊断时或将来是否患有疾病或病症，或者是查明疾病的进展或将来可能的进展。
本发明所述的“预后评估”指评估患者对治疗的反应，及将来患病的风险度。
本发明所述的“治疗”，表示在疾病已开始发展后减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。
本发明所述“有效量”是指在以单个或多个剂量给予至个体或器官之后提供所希望的治疗或预防的本发明的药物的量或剂量。
本发明术语“包括”或“包含”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。
本发明所述的“和/或”包含该术语所连接的项目的所有组合，应视为各个组合已经单独地在本文列出。例如，“A和/或B”包含了“A”、“A和B”以及“B”。又例如，“A、B和/或C”包含了“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。
本发明所述的“个体”可以为人或非人动物，所述的非人动物可以为鼠、牛、羊、兔、猪、猴等非人哺乳动物。
本发明的有益技术效果：
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种Cldn5基因在认知障碍相关疾病诊断和治疗中的用途。
本发明发现，认知障碍相关疾病（例如应激性认知障碍）模型小鼠PFC内皮细胞中，Cldn5 mRNA及表达产物水平发生了明显的缺陷，且Cldn5基因表达与认知功能呈正相关性；使用特异性靶向Cldn5的重组腺相关敲减病毒（AAV-shCldn5）可显著特异性抑制内皮细胞Cldn5的表达，加速认知功能障碍的进程；在小鼠PFC表达外源性Cldn5可对抗应激的认知损伤作用，在治疗应激致认知功能损伤方面具有潜在应用价值。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，各附图中或#表示P＜0.05；/>或##表示P＜0.01；/>或###表示P＜0.001，具体如下：
图1A：经慢性不可预知温和应激（CUMS）后，对照组和应激性认知障碍组水迷宫实验中的寻台潜伏期，n = 6。
图1B：经慢性不可预知温和应激（CUMS）后，对照组和应激性认知障碍组水迷宫实验中穿越目标象限的次数，n = 6。
图1C：经慢性不可预知温和应激（CUMS）后，对照组和应激性认知障碍组新物体识别指数，n = 6。
图2A：对照组和应激性认知障碍组的血清Cldn5 mRNA相对水平，n = 6。
图2B：对照组和应激性认知障碍组的血清Cldn5 mRNA相对水平变化的百分比，n =6。
图3A：对照组和应激性认知障碍组的PFC中Cldn5 mRNA相对水平，n = 6。
图3B：对照组和应激性认知障碍组的PFC中Cldn5 mRNA相对水平变化的百分比，n= 6。
图4A：对照组和应激性认知障碍组血清Cldn5蛋白水平与水迷宫实验的寻台潜伏期的相关性分析结果，n=6。
图4B：对照组和应激性认知障碍组血清Cldn5蛋白水平与水迷宫实验的穿越目标象限次数的相关性分析结果，n=6。
图4C：对照组和应激性认知障碍组血清Cldn5蛋白水平与新物体识别指数的相关性分析结果，n=6。
图5A：对照组和应激性认知障碍组PFC中Cldn5基因表达和水迷宫实验的寻台潜伏期的相关性分析结果，n=6。
图5B：对照组和应激性认知障碍组PFC中Cldn5基因表达和水迷宫实验的穿越目标象限次数的相关性分析结果，n=6。
图5C：对照组和应激性认知障碍组PFC中Cldn5基因表达和新物体识别指数的相关性分析结果，n=6。
图6：Cldn5shRNA的腺相关病毒对Cldn5表达的调控效果；其中，Cldn5-shRNA-1、Cldn5-shRNA-2和Cldn5-shRNA-3表示三段不同的Cldn5shRNA序列对PFC中Cldn5基因表达的影响，n=5。
图7A：经过2、4、6和8周CUMS后，小鼠的水迷宫实验的寻台潜伏期，n = 6。
图7B：经过2、4、6和8周CUMS后，小鼠的水迷宫实验的穿越目标象限次数，n = 6。
图7C：经过2、4、6和8周CUMS后，小鼠的新物体识别指数，n = 6。
图8A：颅内注射AAV-Cldn5shRNA后，小鼠的水迷宫实验的寻台潜伏期，n = 6。
图8B：颅内注射AAV-Cldn5shRNA后，小鼠的水迷宫实验的穿越目标象限次数，n =6。
图8C：颅内注射AAV-Cldn5shRNA后，小鼠的新物体识别指数，n = 6。
图9A：颅内注射Cldn5基因表达产物后，小鼠的水迷宫实验的寻台潜伏期，n = 7。
图9B：颅内注射Cldn5基因表达产物后，小鼠的水迷宫实验的穿越目标象限次数，n= 7。
图9C：颅内注射Cldn5基因表达产物后，小鼠的新物体识别指数，n = 7。
图10A：多奈哌齐对应激性认知障碍小鼠水迷宫实验的寻台潜伏期的影响，n = 8。
图10B：多奈哌齐对应激性认知障碍小鼠水迷宫实验的穿越目标象限次数的影响，n = 8。
图10C：多奈哌齐对应激性认知障碍小鼠新物体识别能力的影响，n = 8。
图11A：多奈哌齐对小鼠脑微血管内皮细胞b.End3细胞株Cldn5基因水平的影响，n= 5。
图11B：多奈哌齐对小鼠脑微血管内皮细胞b.End3细胞株Cldn5基因表达产物的影响，n = 5。
图11C：多奈哌齐对小鼠脑微血管内皮细胞b.End3细胞株Cldn5基因表达产物的定量分析结果，n = 5。
图12：多奈哌齐对小鼠血清Cldn5基因表达产物的调控作用，n=6。
图13A：多奈哌齐对对照组和应激性认知障碍组小鼠PFC中Cldn5基因水平的影响，n = 6。
图13B：多奈哌齐对对照组和应激性认知障碍组小鼠PFC中Cldn5基因表达产物水平的影响，n = 6。
图13C：多奈哌齐对对照组和应激性认知障碍组小鼠PFC中Cldn5基因表达产物的定量分析结果，n = 6。
图14A：多奈哌齐对接受阈下应激的对照组和Cldn5敲减小鼠的水迷宫实验的寻台潜伏期的影响，n = 8。
图14B：多奈哌齐对接受阈下应激的对照组和Cldn5敲减小鼠的水迷宫实验的穿越目标象限次数的影响，n = 8。
图14C：多奈哌齐对接受阈下应激的对照组和Cldn5敲减小鼠的新物体识别指数的影响，n = 8。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。以下实施例中的方法中如无特别说明，所用的生化试剂均为市售试剂；未记载详述步骤的方法均为常规方法。
本发明涉及的部分实验方法如下：
一、慢性不可预知温和应激模型具体实施步骤如下：
选取健康的成年雄性C57BL/6J小鼠，连续8周每天随机给予其如下干预方式：束缚6小时，禁食水23小时，笼具倾斜17小时，昼夜颠倒24小时，潮湿垫料12小时，空瓶禁水16小时，并保证相邻2天干预方式不同。
二、水迷宫实验具体实施步骤如下：
Morris水迷宫装置由直径120厘米，深度60厘米的圆柱形水箱构成，水箱中的水与二氧化钛粉末充分混合而呈现不透明的白色，温度约为21 ℃，并配备有直径为10 cm的透明逃生平台，该平台位于水面以下1厘米处。在第0天，平台上安装有可见的旗帜，在不同位置放入小鼠训练其找到平台。在第1-5天，把平台固定在某一位置，撤去旗帜使其隐藏在水下不可见，并把水迷宫分为四个象限，统计每只小鼠每次实验中的寻台潜伏期。第6天进行空间记忆测试，移去平台后将小鼠放入水迷宫中自由探索60秒，统计小鼠在目标象限的停留时间和穿越平台的次数。
三、新物体识别实验具体实施步骤如下：在训练前24小时将动物放于测试的房间内，适应测试环境。在训练阶段，先将两个完全相同物体置于旷场的对角处，动物单独放于场地中心自由探索10分钟。探索完毕后将小鼠取出，放回饲养笼，清理箱体并消除异味。间隔1小时后，在测试阶段，将旧物体之一更换为新物体，另一旧物体不变，再将小鼠放入旷场中探索5分钟。测试阶段小鼠的新物体识别指数=（新物体探索时间-旧物体探索时间）/（新物体探索时间+旧物体探索时间）。
四、组织RNA提取具体实施步骤如下
（1）用无RNA裂解酶的1.5 mL离心管准备适量 TRIZOL，4 ℃静置待用，仿佛新鲜获取的脑组织，通过组织匀浆器充分研磨后，室温静置5分钟；
（2）向前述裂解液中加入氯仿200 μl，剧烈振荡20-40秒，4 ℃静置10分钟；
（3）4 ℃，12000 g离心15分钟；
（4）离心管中的液体分为三层，收集上层水相（约250 μl）并转移至新的无RNA裂解酶的离心管中；
（5）加入250 μl 的异丙醇，混匀，4 ℃静置 15分钟，随后4 ℃，12000 rpm条件离心 15分钟得到沉淀；
（6）加入1 mL在-20 ℃中预冷过的 75%乙醇洗涤沉淀，4 ℃，12000 rpm条件离心15 分钟，得到沉淀；75%乙醇重复洗涤一次；
（7）室温晾干沉淀，加入适量在 65 ℃预热过的 DEPC 水，充分溶解后在-80 ℃中保存；
（8）取溶解后的RNA进行琼脂糖凝胶电泳进行RNA定性分析，紫外下成像应有清晰的28 s、18 s和5 s rRNA的三个条带。如果5 s的条带亮度较低，且28 s的条带亮度约为18s条带的1.5～2.0倍，则RNA未被降解；
（9）在RNA未被降解的前提上进行定量分析，使用分光光度计分别测量样品在波长为260 nm和280 nm处的光密度值并依此计算RNA浓度。
五、实时荧光定量PCR具体实施步骤如下：
（1）按总RNA量为2μg配置反转录反应体系，充分混匀后得室温静置5分钟，以此进行反转录合成；
（2）随后在25 ℃中静置5分钟，随后加热至42 ℃并在其中静置50分钟，最后加热至85 ℃静置5分钟，即可得到目的cDNA，保存于-20 ℃待用；
（3）按表1配置PCR扩增反应体系，反应扩增条件为95℃预变性10分钟，95℃变性5秒，60℃退火30秒，72℃延伸35秒，共进行40个循环；最后72℃反应10分钟；
（4）程序结束后，根据溶解曲线判断引物特异性，以β-actin为内参，根据2-ΔΔCt法计算基因相对mRNA丰度：ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因，ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组，相对mRNA丰度=2-ΔΔCt。
表1 实时荧光定量PCR反应体系
Cldn5基因的mRNA检测引物序列如下：
正向引物（SEQ ID NO：1）：5’-ACTCTTTGTTACCTTGACCGG-3’；
反向引物（SEQ ID NO：2）：5’-CAGCTCGTACTTCTGTGACAC-3’。
Cldn5基因的mRNA的探针序列（SEQ ID NO：3）为：5’-TGAGTGCTACCCGTGCCTTAACTG-3’。
六、Western blot具体实施步骤如下：
（1）动物断头，迅速分离相应组织，加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，使用预冷的组织匀浆器充分进行研磨，4℃混悬1小时；
（2）4 ℃，10, 000 rpm×5分钟离心，取上清；
（3）按照Pierce BCA 蛋白定量试剂盒(Pierce, CAT# 23225)说明书进行蛋白定量;
（4）在洗净的玻璃板中间加入混合均匀的10%分离胶，异丙醇封液面；待分离胶凝固后，倒净上层的异丙醇，加入混匀的5%浓缩胶，迅速插上梳子；
（5）胶凝固后拔梳子，将凝胶放入电泳盒中，加入1×电泳缓冲液约900 mL，使用注射器冲洗加样孔，去除胶丝；
（6）使用移液器加入样品，每孔50 μg蛋白样品，在合适的孔中加蛋白质分子量标记物，记录上样顺序；
（7）样品在浓缩胶中60 V恒压电泳，在分离胶中增至90 V；
（8）1×转膜缓冲液配置完成放置于-20 ℃冰箱中预冷；取硝酸纤维素膜(nitrocellulose，NC)和滤纸，在完成电泳后浸泡在预冷的转膜缓冲液中5-10分钟，切去浓缩胶，将分离胶放入转膜液浸泡；按照滤纸、NC膜、凝胶、滤纸的顺序按正极向负极依次叠放在转移夹上，逐层轻轻赶走气泡；
（9）恒流转膜(150 mA)90 min，并将转膜盒置于冰块中散热；
（10）取出NC膜，使用1×TBST清洗后放入含有5%脱脂奶粉的1×TBST封闭液中，室温缓慢摇动1小时；
（11）取抗体孵育膜裁剪成合适大小，将NC膜剪开后放入孵育膜中，加入含有一抗的封闭液，小心挤走气泡，封闭抗体孵育膜，4℃孵育过夜；
（12）1×TBST洗NC膜3次，每次10分钟；
（13）加入辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）标记的二抗，室温孵育2小时；
（14）1×TBST洗3次，每次10分钟；
（15）使用化学发光液避光孵育NC膜1-2分钟，暗室曝光或使用化学发光仪拍照。七、脑立体定位注射具体实施步骤如下：
通过腹腔注射的方式按80 mg/kg体重的剂量给予小鼠0.5%戊巴比妥钠的生理盐水溶液进行麻醉，用微量进样器（Hamilton 公司）吸取1 μl病毒放至PFC，使用微量注射泵缓慢注射药物。注射时间和留针时间均为5分钟，之后缓慢撤出进样针，清理创口滴加抗生素，缝合皮肤。
实施例1 Cldn5鉴定为应激性认知障碍的风险因子
慢性不可预知温和应激（CUMS）是模拟长期不良应激的经典范式，CUMS 8周以上即可引起认知障碍，已成为应激性认知障碍模式动物的建立范式（参考文献Wang SD, WangX, Zhao Y, et al. Homocysteine-Induced Disturbances in DNA MethylationContribute to Development of Stress-Associated Cognitive Decline in Rats.Neurosci Bull. 2022;38(8); Liu X, Hao J, Yao E, et al. Polyunsaturated fattyacid supplement alleviates depression-incident cognitive dysfunction byprotecting the cerebrovascular and glymphatic systems. Brain Behav Immun.2020;89；Xie F, Zhao Y, Ma J, et al. The involvement of homocysteine instress-induced Aβ precursor protein misprocessing and related cognitivedecline in rats. Cell Stress Chaperones. 2016;21(5)）。我们按上述文献所述方式连续8周给予小鼠CUMS，并通过水迷宫实验和新物体识别实验对小鼠的认知能力进行行为学评价。水迷宫实验是评价学习记忆能力的经典范式之一，水迷宫测试中动物寻找圆台的潜伏期越长，穿越圆台所在目标象限次数越少，说明动物的认知能力障碍程度越严重；新物体识别实验中是评价机体认知能力的另一经典范式，动物新物体识别指数数值越低，代表其认知障碍越严重（Vorhees CV, Williams MT. Morris water maze: procedures forassessing spatial and related forms of learning and memory. Nat Protoc. 2006;1(2)；Lueptow LM. Novel Object Recognition Test for the Investigation ofLearning and Memory in Mice. J Vis Exp. 2017;(126)；Li C, Shi J, Wang B, Li J,Jia H. CB2 cannabinoid receptor agonist ameliorates novel object recognitionbut not spatial memory in transgenic APP/PS1 mice. Neurosci Lett. 2019;707）。实验结果如图1A、图1B和图1C所示，同对照组相比，CUMS 8周的应激性认知障碍组小鼠水迷宫寻台潜伏期更长（对照组：24.33±4.447 s，应激性认知障碍组：59.83±5.263 s，P=0.0004），穿越目标象限次数更少（对照组：4.000±0.6831，应激性认知障碍组：1.6675±0.2108，P=0.0085），新物体识别指数更低（对照组：0.3824±0.05201，应激性认知障碍组：0.05447±0.05714，P=0.0017），n = 6，即8周的CUMS可成功诱导小鼠产生应激性认知障碍（参见图1A、图1B和图1C）。
随后获取应激性认知障碍组小鼠血清，采用ELISA试剂盒测定其中Cldn5基因表达产物即Claudin-5的含量，结果显示，与对照组相比，应激性认知障碍组小鼠Claudin-5含量显著下降（对照组：34.52±4.677 pg/ml，应激性认知障碍组：16.57 ±2.236 pg/ml，P=0.0061），n = 6（图2A）。同时分析显示，应激性认知障碍小鼠的血清Claudin-5含量可下降至对照组左右（对照组：-1.667×10-6±13.55%，应激性障碍组：-52.00±6.477%，P=0.0061），n = 6（图2B）。同时，使用Trizol法提取对照组和应激性认知障碍组小鼠的PFC的RNA，并通过实时荧光定量PCR实验检测Cldn5mRNA水平。结果显示，与对照组相比，应激性认知障碍组小鼠PFC中Cldn5mRNA水平降低（对照组：0.9703±0.05619，应激性认知障碍组：0.4952±0.04064，P<0.0001），n = 6（图3A）。进一步分析显示，应激性认知障碍组小鼠的PFC中Cldn5基因水平相对于对照组同样下降约50%左右（对照组：3.333×10-6±5.791%，实验组-48.96±4.189%：，P<0.0001），n = 6（图3B）。
为了有效鉴定Cldn5基因和/或其表达产物是否为应激性认知障碍的贡献因素，采用Pearson相关系数法分别对血清和PFC中Cldn5基因水平与小鼠应激性认知障碍程度进行相关性分析。结果如图4A、图4B和图4C显示，小鼠的水迷宫寻台潜伏期与血清中Cldn5基因水平呈负性线性相关（R2=0.6663，P=0.0012），小鼠水迷宫穿越目标象限次数（R2=0.6800，P=0.0010）和新物体识别指数（R2=0.5545，P=0.0055）均与血清Cldn5基因水平呈正性线性相关。同样地，PFC中Cldn5基因和小鼠认知障碍程度地相关性分析结果如图5A、图5B和图5C所示，其中，水迷宫寻台潜伏期：R2=0.6466，P=0.0016；水迷宫穿越目标象限次数：R2=0.5973，P=0.0032；新物体识别指数：R2=0.6713，P=0.0011，反映血清和PFC中的Cldn5基因和/或其表达产物水平是小鼠应激性认知障碍的重要风险因子。
实施例2 PFC中Cldn5缺陷加快小鼠应激性认知障碍进程
实施例1已经确定Cldn5基因和/或其表达产物水平是小鼠应激性认知障碍的重要风险因子，为了研究Cldn5在应激性认知障碍中的作用，首先我们通过脑立体定位注射向小鼠PFC区域注射AAV-shRNA（AAV载体名称：GV726，元件顺序：pAAV-ICAM2p-EGFP-MIR155(MCS)-SV40 PolyA）敲减Cldn5基因，注射体积1μl，在4周后取小鼠PFC对Cldn5表达水平进行测定，结果显示，与AAV-Scramble shRNA（shRNA对照）相比，AAV-Cldn5 shRNA-1可以显著降低Cldn5基因水平，但是AAV-Cldn5 shRNA-2和AAV-Cldn5 shRNA-3对Cldn5基因水平没有明显降低作用（AAV-Scramble shRNA：1.001±0.03145，AAV-Cldn5 shRNA-1：0.5371±0.04778，AAV-Cldn5 shRNA-2：0.9678±0.05547，AAV-Cldn5 shRNA-2：0.8642±0.04783，AAV-Scramble shRNA vs AAV-Cldn5 shRNA-1：P<0.0001），n=5（图6）。
Cldn5 shRNA-1干扰靶点序列为：5’-CAATGGCGATTACGACAAGAA-3’（SEQ ID NO：4）；
Cldn5 shRNA-1序列如下：
Top strand：5’- Ccgg CAATGGCGATTACGACAAGAA CTCGAGTTCTTGTCGTAATCGCCATTG TTTTTg-3’（SEQ ID NO：5）；
Bottom strand：5’- aattcaaaaa gcTTCTTGTCGTAATCGCCATTG CTCGAGTTCTTGTCGTAATCGCCATTG-3’（SEQ ID NO：6）；
Cldn5 shRNA-2干扰靶点序列为：5’-GCTCTGCTGGTTCGCCAACAT-3’ （SEQ ID NO：7）；
Cldn5 shRNA-2序列如下：
Top strand：5’- Ccgg GCTCTGCTGGTTCGCCAACAT CTCGAGATGTTGGCGAACCAGCAGAGC TTTTTg-3’（SEQ ID NO：8）；
Bottom strand：5’- aattcaaaaa GCTCTGCTGGTTCGCCAACAT CTCGAGATGTTGGCGAACCAGCAGAGC -3’（SEQ ID NO：9）；
Cldn5 shRNA-3 干扰靶点序列为：5’-TGGCACTCTTTGTTACCTTGA-3’ （SEQ ID NO：10）；
Cldn5 shRNA-3序列如下：
Top strand：5’- Ccgg TGGCACTCTTTGTTACCTTGA CTCGAGTCAAGGTAACAAAGAGTGCCA TTTTTg-3’（SEQ ID NO：11）；
Bottom strand：5’- aattcaaaaa TGGCACTCTTTGTTACCTTGA CTCGAGTCAAGGTAACAAAGAGTGCCA -3’（SEQ ID NO：12）；
Scramble序列如下：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’ （SEQ ID NO：13）；
由于小鼠接受颅内注射后需要恢复一周以上，并且AAV需3周以上才可在体内稳定表达，因此，我们提前进行AAV-Cldn5 shRNA和AAV-Scramble shRNA颅内注射并在小鼠恢复1周后再进行CUMS造模（参考文献 Dang R, Wang M, Li X, et al. Edaravoneameliorates depressive and anxiety-like behaviors via Sirt1/Nrf2/HO-1/Gpx4pathway. J Neuroinflammation. 2022;19(1)；Ma H, Li C, Wang J, et al. Amygdala-hippocampal innervation modulates stress-induced depressive-like behaviorsthrough AMPA receptors. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021;118(6)）。由于我们的行为学结果显示，CUMS造模时间＞8周才可明显诱发小鼠的认知障碍（寻台潜伏期：对照8周组：15.00±2.352 s，CUMS 8周组：27.83±3.341 s，P=0.0035；穿越目标象限次数：对照8周组：4.833±0.6540，CUMS 8周组：2.000±0.5164，P=0.0369；新物体识别指数：对照8周组：0.3683±0.05326，CUMS 8周组：0.09337±0.03960，P=0.0024），n = 6，参见图7A、图7B和图7C。。
为了明确PFC中Cldn5缺陷对应激性认知障碍病程进展的影响，我们选择提前在慢性应激干预4周时进行认知相关行为学检测，并将CUMS 4周定义为“阈下应激”。行为学结果显示，对于对照组小鼠，敲减小鼠PFC中Cldn5基因表达并不会引起认知行为异常（寻台潜伏期：对照+AAV-Scramble shRNA：16.83±1.869 s，对照+AAV-Cldn5 shRNA-1 18.50±1.910s：，P=0.9969；穿越目标象限次数：对照+AAV-Scramble shRNA：5.617±0.7032，对照+AAV-Cldn5 shRNA-1：4.500±0.5627，P=0.9719；新物体识别指数：对照+AAV-Scramble shRNA：0.4402±0.04901，对照+AAV-Cldn5 shRNA-1：0.4290±0.06145，P＞0.9999）；但是对于接受了阈下应激的小鼠，PFC中Cldn5基因缺陷可使其水迷宫实验寻台潜伏期延长（阈下应激+AAV-Scramble shRNA：21.00±1.653 s，阈下应激+AAV-Cldn5 shRNA-1：38.50±3.423 s，P=0.0002），穿越目标象限次数减少（阈下应激+AAV-Scramble shRNA：4.500±0.6708，阈下应激+AAV-Cldn5 shRNA-1：1.833±0.4773，P=0.0341），新物体识别指数降低（阈下应激+AAV-Scramble shRNA：0.4591±0.04554，阈下应激+AAV-Cldn5 shRNA-1：0.09453±0.02944，P=0.0002），n = 6，即，PFC中Cldn5基因缺陷可诱发应激性认知障碍的提前出现，加速病程的发展（参见图8A、图8B和图8C）。
实施例3 PFC中Cldn5基因表达产物可治疗小鼠应激性认知障碍
为了进一步确定Cldn5基因和应激性认知障碍的关系，首先我们通过脑立体定位注射向小鼠PFC区域注射包含Cldn5基因的编码区序列（NM_013805.4）的AAV载体（载体名称：GV726，元件顺序：pAAV-ICAM2p-EGFP-MIR155(MCS)-SV40 PolyA）和AAV空白载体，注射体积为1 μl，于小鼠接受注射10天后进行8周CUMS，并通过水迷宫实验和新物体识别实验评估Cldn5基因表达产物对应激性认知障碍的治疗效果结果所示，通过向小鼠PFC中注射Claudin-5升高Cldn5基因表达产物水平的治疗组可显著性缩短应激小鼠的水迷宫寻台潜伏期（应激性认知障碍+空白载体组：57.52±4.942 s，应激性认知障碍+Claudin-5组：21.40±2.421 s，P＜0.0001），显著增加其穿越目标象限次数（应激性认知障碍+空白载体组：1.200±0.3742，应激性认知障碍+Claudin-5组：4.400±0.5099，P=0.0253），并显著升高其新物体识别指数（应激性认知障碍+空白载体组：-0.03440±0.06029，应激性认知障碍+Claudin-5组：0.3309±0.07554，P=0.0122），而向对照组中注射Claudin-5则不会产生显著影响（寻台潜伏期：对照+空白载体组：16.2±3.184 s，对照+Claudin-5组：18.20±2.154s，P=0.9989；穿越目标象限次数：对照+空白载体组：4.800±1.241，对照+Claudin-5组：4.000±0.6325，P=0.9779；新物体识别指数：对照+空白载体组：0.4148±0.07087，对照+Claudin-5组：0.3901±0.07353，P＞0.9999），n = 7，说明了Cldn5基因表达产物可对应激性认知障碍发挥一定的治疗效果（参见图9A、图9B和图9C）。
实施例4 AD治疗药物可改善小鼠应激性认知障碍
为了观察AD治疗的相关药物是否对应激性认知障碍也能发挥同样的治疗效果，我们使用多奈哌齐对应激性认知障碍小鼠进行处理，并观察动物认知行为，具体给药方式为在应激干预同时每天给予小鼠一次腹腔注射多奈哌齐，注射剂量为1mg.kg-1，同样持续8周，结果所示，与对照组相比，应激性认知障碍组的小鼠水迷宫寻台潜伏期增加（对照组：20.40±5.066 s，应激性认知障碍组：50.20±4.727 s，P=0.0010），穿越目标象限次数减少（对照组：5.333±0.8433，应激性认知障碍组：1.333±0.4216，P=0.0013），新物体识别实验中新物体识别指数降低（对照组：0.4320±0.05809，应激性认知障碍组：0.1022±0.04200，P=0.0026）；而在多奈哌齐作用下的应激性认知障碍组小鼠相较于未经药物治疗的应激性认知障碍组水迷宫寻台潜伏期减少（应激性认知障碍+多奈哌齐组：27.40±2.694 s，P=0.0071），穿越目标象限次数增加（应激性认知障碍+多奈哌齐组：4.000±0.5774，P=0.0251），新物体识别实验中新物体识别指数升高（应激性认知障碍+多奈哌齐组：0.3500±0.05941，P=0.0174），n=8，表明多奈哌齐对应激性认知障碍具有明显的治疗效果（参见图10A、图10B和图10C）。
实施例5 AD治疗药物可显著提高Cldn5基因和/或其表达产物的的水平
为了确定Cldn5基因在筛选临床治疗应激性认知障碍药物中的作用，我们在细胞水平和动物水平分别分析了多奈哌齐对Cldn5基因和/或其表达产物的水平影响。首先，我们使用不同剂量的多奈哌齐（0 μM，10 μM，20 μM）处理小鼠微血管内皮细胞株b.End3，并于处理24小时后检测b.End3细胞Cldn5基因和其表达产物Claudin-5蛋白的水平，实验结果如图11A、图11B和图11C所示，10 μM和20 μM的多奈哌齐可显著升高b.End3细胞Cldn5基因的含量（0 μM 组：1.007±0.04387，10 μM组：1.316±0.04131，20 μM 组：1.667±0.07661，0μM组 vs 10 μM组：P=0.0191，0 μM组 vs 20 μM组：P=0.0107）和其表达产物Claudin-5蛋白的含量（0 μM 组：1.009±0.02098，10 μM组：1.328±0.03596，20 μM 组：1.570±0.02469，0 μM组 vs 10 μM组：P=0.0005，0 μM组 vs 20 μM组：P＜0.0001），n = 5（参见图11A、图11B和图11C）。
随后，在给予应激性认知障碍组小鼠每天注射多奈哌齐（1 mg.kg-1）持续8周后，取小鼠血清进行Claudin-5蛋白含量测定。结果显示，多奈哌齐可以明显恢复应激性认知障碍组的血清Claudin-5水平，达到和对照组相同的水平（对照组：27.81±3.709 pg/ml，应激性认知障碍组：14.84±1.627 pg/ml，应激性认知障碍组+多奈哌齐组：26.85±2.963 pg/ml，对照组 vs 应激性认知障碍组：P=0.0067，应激性认知障碍组 vs 应激性认知障碍组+多奈哌齐组：P=0.0223），n =6（图12）。此外同时提取小鼠PFC的RNA和蛋白，进行Cldn5基因和Claudin-5蛋白水平分析，结果显示，与对照组相比，应激性认知障碍组的相对Cldn5 mRNA水平显著降低（对照组：0.9989±0.03731，应激性认知障碍组：0.5073±0.07914，P=0.0009），相对Claudin-5蛋白水平也显著降低（对照组：0.9699±0.08001，应激性认知障碍组：0.4200±0.04163，P=0.0034），n = 6（参见图13A、图13B和图13C）。与未经药物治疗的应激性认知障碍组相比，给予小鼠多奈哌齐治疗的应激性认知障碍+多奈哌齐组可防止其PFC中Cldn5 mRNA水平的降低（应激性认知障碍+多奈哌齐组：0.9011±0.05892，P=0.0041），也可避免Claudin-5蛋白含量减少（应激性认知障碍+多奈哌齐组：0.8913±0.08034，P=0.0073），n = 6 （参见图13A、图13B和图13C）。
实施例6 AD治疗药物可阻止Cldn5敲减小鼠应激性认知障碍病程加速
为了进一步明确Cldn5基因水平与应激性认知障碍治疗药物疗效之间的关系，我们首先采用实施例2中的AAV-Cldn5 shRNA-1构建Cldn5敲减小鼠，在病毒感染10天后同时给予阈下应激刺激和多奈哌齐干预。按上述方式接续处理4周后，观察小鼠认知行为的改变，实验结果显示，与接受阈下应激的Scramble shRNA组相比，AAV-Cldn5 shRNA-1可致使阈下应激组的寻台潜伏期显著升高（Scramble shRNA组：17.40±3.076 s，Cldn5 shRNA-1组：42.20±3.007 s，P＜0.0001），显著减少其穿越目标象限次数（Scramble shRNA组：5.800±0.9695，Cldn5 shRNA-1组：1.400±0.4000，P=0.0020），显著降低其新物体识别指数（Scramble shRNA组：0.4300±0.04970，Cldn5 shRNA-1组：0.1880±0.03917，P=0.0088），n = 8（参见图14A、图14B和图14C）。与接受阈下应激的Cldn5 shRNA-1组相比，多奈哌齐（Cldn5 shRNA-1+多奈哌齐组）可显著缩短应激的Cldn5敲减小鼠水迷宫寻台潜伏期（Cldn5 shRNA-1+多奈哌齐组：20.40±1.939 s，P=0.0003），显著增加其穿越目标象限次数（Cldn5 shRNA-1+多奈哌齐组：4.200±0.5831，P=0.0357），显著提升其新物体识别指数（Cldn5 shRNA-1+多奈哌齐组：0.4100±0.0128，P=0.0151），n = 8，即AD治疗药物可显著缓解应激性认知障碍的病程进展（参见图14A、图14B和图14C）。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (3)

1.一种提高CLDN5蛋白表达水平，和/或，Cldn5基因表达水平的调节试剂在制备治疗认知障碍相关疾病的产品中的应用；
所述的认知障碍相关疾病为应激性认知障碍；
所述的应激性认知障碍由慢性不可预知温和应激引起；
所述的调节试剂包括：
1）CLDN5蛋白；和/或，
2）包含Cldn5基因的过表达载体。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的调节试剂包括多奈哌齐。
3.Cldn5分子作为靶点在筛选治疗认知障碍相关疾病的产品中的应用，所述的CLDN5分子包括CLDN5蛋白或Cldn5基因，
所述的筛选包括筛选提高CLDN5蛋白表达水平，和/或，Cldn5基因表达水平的调节试剂作为治疗认知障碍相关疾病的产品；
所述的认知障碍相关疾病为应激性认知障碍；
所述的应激性认知障碍由慢性不可预知温和应激引起。
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