CN106434858A - 一种用于检测Claudin5基因表达水平的引物组合及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测小鼠Claudin5基因表达水平的引物组合物及其应用。所述引物组合物，由引物组1和引物组2组成；所述引物组1用于Claudin5基因检测，所述引物组2用于Actin内参基因检测；所述引物组1和引物组2的序列分别如SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4所示。本发明还涉及所述引物组合物在制备用于检测小鼠Claudin5基因表达水平的试剂中的应用。本发明采用的技术方案，与现有技术相比，能够特异性的检测Claudin5基因的表达水平，避免了同源性基因的干扰；检测的灵敏度非常高；无需使用荧光探针，应用简单；检测过程准确高效，并且检测时间短，应用前景广阔。

Description

一种用于检测Claudin5基因表达水平的引物组合及其应用
技术领域 本发明属基因技术领域，本发明涉及一种用于检测Claudin5基因表达水平的引物组合。
背景技术 Claudin5是Claudin蛋白家族的重要成员，由Cldn5基因编码。Claudin5蛋白是组成细胞间紧密连接的一种主要跨膜蛋白,对维持上皮细胞和内皮细胞正常的结构、功能起着非常重要的作用，并具有调节细胞增殖分化、维持细胞极性及渗透性调节等功能。Claudin5主要存在于血管内皮细胞，在血脑屏障中占主导地位，是脑血管内皮细胞通透性的重要调节因子。已知蛛网膜下腔出血的脑损伤模型中Claudin5的表达水平显著降低,从而使旁细胞通透性增加,产生脑水肿。Claudin5表达水平研究常用于提示脑缺血缺氧性疾病发病机制或药物疗效。实验研究中小鼠是比较常用的实验动物，可利用其制作各种疾病模型用于疾病发病机制或药效机制的研究。例如在缺氧诱导视网膜病变小鼠的模型中，检测到Claudin5表达降低，提示暴露于缺氧环境中的小鼠，血脑屏障受到破坏，小分子物质通透性增加，从而导致视网膜内屏障功能障碍。也有研究者采用体外培养Balb/c小鼠脑微血管内皮细胞模拟缺血损伤研究药物的脑损伤保护作用及其机制，研究结果表明损伤模型中Claudin5基因和蛋白的表达都明显降低，而加入清开灵注射液组Claudin5的基因表达则明显改善，因而推测清开灵通过调节Claudin5的表达,改善血脑屏障通透性从而阻抑脑缺血反应过程。
对Claudin5表达水平的实验研究除采用免疫组化和Western免疫印迹等方法从蛋白水平进行研究外，也可从mRNA转录水平进行研究,可采用的技术方法包括半定量反转录PCR和荧光定量PCR方法等。以蛋白为检测目标的方法通常操作比较繁琐，耗时。半定量反转录PCR需要电泳检测，准确度不够高。荧光定量PCR方法是一种高灵敏度、简便快捷的检测方法，操作简单,可应用SYBR green染料法检测，无需使用荧光探针，采用荧光定量PCR相对定量方法通过与表达水平相对稳定的管家基因比较来反映目的基因的表达水平，能很好的辅助Claudin5表达水平的研究，整个PCR反应过程只需1.2小时即可完成。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于检测小鼠Claudin5基因表达水平的引物组合物。
本发明所提供的用于检测小鼠Claudin5基因表达水平的引物组合物，由引物组1和引物组2组成；所述引物组1用于Claudin5基因检测，所述引物组2用于Actin内参基因检测；所述引物组1和引物组2的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
优选地，上述引物组1的上游和下游引物的浓度均为0.1～0.5μM。
优选地，上述引物组2的上游和下游引物的浓度均为0.1～0.5μM。
本发明的另一个目的是上述的引物组合物在制备用于检测小鼠Claudin5基因表达水平的试剂中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种检测小鼠Claudin5基因表达水平的试剂盒，该试剂盒包括权利要求1-3中所述的引物组合物和荧光染料。
优选地，上述荧光染料是SYBR Green荧光染料。
本发明的第四个目的是提供一种非诊断治疗目的的用于检测小鼠Claudin5基因表达水平的方法，包括如下步骤：
步骤1：提取样品中RNA；
步骤2：将步骤1中提取出来的RNA反转录成cDNA；
步骤3：以权利要求1中所述的引物组为引物，用荧光定量PCR法检测Claudin5基因以及Actin内参基因表达水平。
优选地，上述荧光定量PCR反应条件为95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火34s运行40个循环；最后40℃ 10s结束反应。
步骤4：采用2-△△CT相对定量方法计算与对照组样品比较的Claudin5基因相对表达水平。
技术效果
本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
（1）特异性强
本发明设计Claudin5基因和Actin基因的引物，通过比对分析设计的引物之间的二聚体、发夹结构等，最终设计出了2对引物组，能够特异性的检测Claudin5基因的表达水平，避免了同源性基因的干扰，通过对Claudin5的表达水平进行研究有助于明确疾病的发病机制和药物的疗效判断。
（2）检测敏感性高
常规对Claudin5表达水平的研究，通常采用免疫组化和Western免疫印迹等方法从蛋白水平进行研究，以蛋白为检测目标的方法通常操作比较繁琐，耗时。此外，也可以检测Claudin5的mRNA量，但通常半定量反转录PCR需要电泳检测，准确度不够高。本发明建立的SYBR green实时荧光定量RT-PCR方法对样品中的Claudin5表达水平进行定量，其检测的灵敏度非常高，用该技术建立的试剂盒可用于对Claudin5的表达水平进行准确定量。
（3）操作方便简单
本发明采用染料法检测，无需使用荧光探针，应用简单，采用荧光定量PCR相对定量方法通过与表达水平相对稳定的管家基因比较来反映目的基因的表达水平，能很好的辅助Claudin5表达水平的研究。
（4）检测时间短
本发明建立的SYBR green实时荧光定量RT-PCR方法无需进行电泳，可直接通过电脑来观察反应结果，整个PCR反应过程只需1.2小时即可完成。而常规的RT-PCR方法至少需要3.5个小时来完成扩增反应，然后还需要花2个小时进行凝胶电泳来观察结果。
根据NCBI公布的Mus musculus Cldn5的mRNA序列（序列号：NM_013805.4）设计Claudin5引物序列见表1：
表1.Claudin5引物设计
引物名称 序列 SEQ ID NO.
F-Cldn CAGTTAAGGCACGGGTAGCA SEQ ID NO:1
R-Cldn CAACGATGTTGGCGAACCAG SEQ ID NO:2
根据NCBI公布的Mus musculus Actin的mRNA序列（序列号：NM_007393.5）设计引物序列见表2：
表2.Actin引物设计
引物名称 序列 SEQ ID NO.
F-acti GATCAGCAAGCAGGAGTACGA SEQ ID NO:3
R-actin AAACGCAGCTCAGTAACAGT SEQ ID NO:4
附图说明
图1.为本发明实施例一中的Claudin5和Actin基因扩增产物熔解曲线，其中A为Claudin5基因扩增产物熔解曲线，B为Actin基因扩增产物熔解曲线。
图2.为本发明实施例二中c-MET单抗对小鼠脑梗模型Claudin5基因表达水平的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例一 本实施例为引物组合物的使用方法，具体包括以下步骤：
步骤1：组织或细胞RNA提取
用商品化试剂盒来提取组织或细胞RNA，紫外分光光度计测定RNA浓度，并控制提取质量，OD260/280测定值为2.0。本实施例用天根总RNA提取试剂盒来提取组织或细胞RNA，具体操作按说明书进行。
步骤2：cDNA反转录
取大约500ng RNA，用商品化试剂盒来PrimeScriptTM RT Master Mix（Perfect RealTime）进行cDNA的反转录，具体操作按说明书进行。
步骤3：荧光定量PCR反应
实验中每种模板分别加入两种荧光定量PCR反应体系，分别进行GRP78和RPL19基因检测，一种反应体系包含组分如下：
另一种反应体系包含组分如下：
荧光定量PCR反应条件为95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火34s运行40个循环；最后40℃ 10s结束反应。退火时检测荧光信号。可在运行结束后进行熔解曲线分析,检测引物扩增的特异性。
本发明实施例中采用诺唯赞的Acetaq SYBR supermix，采用25微升反应体系。荧光定量PCR仪采用ABI7500。
步骤4：检测并分析结果
根据系统自动基线和对数期阈值设置获得各个反应的CT值。
计算2-△△CT值，即实验组Claudin基因mRNA表达水平与对照组比较的倍数。
△△CT=（CTcldn（实验组）-CTactin（实验组））-（CTcldn（对照组）-CTactin（对照组））。
实施例二 本实施例为通过检测Claudin5表达水平研究C-met单抗对小鼠脑梗塞的保护作用，具体包含以下步骤：
步骤1.实验动物及分组 健康雄性昆明小鼠15只，平均体重（32.40±4.28）g。在自然光线下饲养1周后，随机分为假手术组（Sham），模型组（Vehicle），C-met单抗给药组（1H9D6），共3组，每组5只动物；
步骤2.小鼠大脑中动脉栓线模型的制作 用10%水合氯醛（0.03ml/10g体重）腹腔注射麻醉动物后，仰卧位固定于手术台上，沿颈前正中剪开约1cm长的切口。在SXP-1B手术显微镜下，依次暴露右侧颈总动脉，颈外动脉起始部，翼腭动脉。结扎颈外动脉和翼腭动脉起始部。然后将颈总动脉近心端结扎，靠近分叉部套一结扎线，并上一微型动脉夹。于两线之间，将颈总动脉剪一小口，根据动物大小选择0.2号、0.3号或0.4号尼龙单丝线，迅速经切口插入，松开动脉夹，继续插入。当丝线进入约9mm时，即有轻微的阻挡感，立即停止送线。此时线的头端恰好抵达大脑前中动脉分叉部。结扎分叉部位的丝线。剪除多余的单丝线。碘伏消毒后后，逐层缝合软组织及皮肤，再消毒后，置于红外灯下保温。待动物苏醒后对其进行功能评价，小鼠提尾可见对侧前肢内旋，肩内收，出现中度神经功能缺损；
步骤3.给药方法 给药组术后经尾静脉c-MET抗体给药1次，对照组给予相应溶剂；
步骤4.各组小鼠手术后6h，处死取脑组织，置液氮冷冻后-80度冰箱保存备用；
步骤5.采用组合引物检测小鼠脑组织Claudin5基因表达水平，方法参照实施例一；
步骤6.统计方法：各组所得数据均以均数±标准差来表示，组间比较采用t检验；
步骤7.实验结果分析：两对引物检测的荧光定量PCR扩增熔解曲线均为单一熔解峰（见图1），说明引物具有较好的扩增特异性；各实验组小鼠脑组织Claudin5基因表达检测结果（见图2）表明模型对照组小鼠脑组织Claudin5基因表达水平明显高于假手术组,差异有统计学意义（p<0.05），c-MET给药组Claudin5基因表达水平明显高于模型对照组，差异有统计学意义（p<0.05），说明c-MET单抗可通过增加小鼠脑组织的Claudin5表达水平发挥其对小鼠梗死脑组织的保护作用。
通过上述的实施例可以知道，本发明的特异性引物组合及相应的方法，可以特异性检测Claudin5基因的表达水平，避免同源性基因的干扰，提高了Claudin5基因表达水平的检测准确性，检测过程简单、高效。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 同济大学苏州研究院
<120> 一种用于检测Claudin5基因表达水平的引物组合及其应用
<130> 2016
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> PCR扩增引物
<400> 1
cagttaaggc acgggtagca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> PCR扩增引物
<400> 2
caacgatgtt ggcgaaccag 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> PCR扩增引物
<400> 3

Claims (9)

1.一种用于检测小鼠Claudin5基因表达水平的引物组合物，其特征在于：由引物组1和引物组2组成；所述引物组1用于Claudin5基因检测，所述引物组2用于Actin内参基因检测；所述引物组1和引物组2的序列分别如SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3, SEQ IDNO:4所示。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测小鼠Claudin5基因表达水平的引物组合物，其特征在于，所述的引物组1的上游和下游引物的浓度均为0.1μM-0.5μM。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测小鼠Claudin5基因表达水平的引物组合物，其特征在于，所述的引物组2的上游和下游引物的浓度均为0.1μM-0.5μM。
4.根据权利要求1-3所述的引物组合物在检测小鼠Claudin5基因表达水平的试剂中的应用。
5.根据权利要求1-3所述的引物组合物的应用，其特征在于，采用2-△△CT相对定量方法计算不同样品的Claudin5基因相对表达水平。
6.一种用于检测小鼠Claudin5基因表达水平的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3所述的引物组合物和荧光染料。
7.根据权利要求6所述的一种用于检测小鼠Claudin5基因表达水平的试剂盒，其特征在于，所述的荧光染料是SYBR Green荧光染料。
8.一种非诊断治疗目的的用于检测小鼠Claudin5基因表达水平的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：提取样品中RNA；
步骤2：将步骤1中提取出来的RNA反转录成cDNA；
步骤3：以权利要求1中所述的引物组为引物，用荧光定量PCR法检测Claudin5基因以及Actin内参基因表达水平。
9.根据权利要求8所述的一种用于检测小鼠Claudin5基因表达水平的方法，其特征在于，步骤3中荧光定量PCR反应条件为95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火40s运行40个循环；最后40℃ 10s结束反应。
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