CN116334208A - 适用于miRNA检测的内参基因及其相关产品和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了适用于miRNA检测的内参基因及其相关产品和应用，涉及生物检测领域。本发明通过发热对照组和KD患儿组体内的miRNA进行实验测试和不同方法的数据分析，发现了微小核糖核酸miR‑30d‑5p可作为川崎病血小板microRNA检测标准化的内参基因，并且具有较好的稳定性和准确性。

Description

适用于miRNA检测的内参基因及其相关产品和应用
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体而言，涉及适用于miRNA检测的内参基因及其相关产品和应用。
背景技术
川崎病(KD)是一种急性、自限性血管炎，主要发生于儿童的炎症综合征。该病主要累及中小动脉，尤其是冠状动脉，是获得性疾病的主要病因。川崎病可能偶尔导致死亡，尤其是当漏诊或未给予及时治疗。KD临床表现为发热持续时间长，至少具有以下4-5项临床特征：发热五天以上、肢体改变(手脚硬肿、蜕皮)、皮疹、非渗出性结膜炎、口腔改变和颈部淋巴结肿大(通常为单侧)。大约四分之一的KD患者的临床表现不完全，即患者没有充分的主要临床表现而且会延迟诊断造成更高的患病风险。因而导致川崎病目前临床诊断标准尚不完整。虽然目前对诊断的可靠性、多种新的生物标志物和分类工具进行了研究，但迄今为止未发现KD特异性的生物标志物。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供适用于miRNA检测的内参基因及其相关产品和应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了miR-30d-5p的检测试剂在制备适用于miRNA检测的内参基因的检测试剂中的应用。
第二方面，本发明实施例提供了miR-30d-5p的检测试剂在制备用于检测川崎病的产品中的应用。
第三方面，本发明实施例提供了一种试剂或试剂盒，其包括：miRNA的检测试剂和内参基因的检测试剂；所述内参基因包括miR-30d-5p。
第四方面，本发明实施例提供了一种检测样本目标miRNA表达水平的方法，所述方法包括将miR-30d-5p作为内参基因，用于分析目标miRNA的表达水平。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过发热对照组和KD患儿组体内的miRNA进行实验测试和不同方法的数据分析发现了微小核糖核酸miR-30d-5p可作为川崎病血小板microRNA检测标准化的内参基因，并且具有较好的稳定性和准确性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为4个miRNA的平均表达Ct值比较；
图2为4个miRNA的变异系数比较；
图3为geNorm分析4个miRNA基因表达稳定值；
图4为NormFinder分析4个miRNA基因表达稳定值；
图5为miR-126-3p标准化的let-7g-5p相对表达(A)和miR-30d-5p标准化的let-7g-5p相对表达(B)；
图6为miR-126-3p标准化的miR-26a-5p相对表达(A)和miR-30d-5p标准化的miR-26a-5p相对表达(B)；
图7为miR-126-3p和miR-30d-5p分别标准化let-7g-5p的ROC曲线图；
图8为miR-126-3p和miR-30d-5p分别标准化miR-26a-5p的ROC曲线图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
miRNA(microRNA)一类在转录后水平调控基因表达的内源性非编码小分子RNA，长度约为22个核苷酸。越来越多的研究显示，miRNA在各种生物的调控机制中发挥着重要作用，包括发育时机和宿主-病原体相互作用，以及细胞生长、分化、增殖和凋亡。miRNA还与许多疾病的发生发展相关，包括癌症、糖尿病、心脏衰竭、急性心肌梗死、过敏炎症反应和组织损伤等。大量研究证实了miRNA的表达在正常的生理条件和疾病状态下有显著的变化，显示了在疾病诊断和预后中miRNA作为非侵入式分子诊断标志物的巨大潜力和广阔前景。
实时荧光定量PCR(RT-qPCR)由于具备灵敏度高、特异性强、重复性好及高通量等优点，已经成为研究miRNA基因表达分析的常用方法。实时荧光定量PCR分为绝对定量和相对定量，在进行相对定量分析时不需要已知量的标准品，因而该方法被经常运用，但该方法需要用内参基因对目的基因进行数据校正，才能获得精确的结果。目前虽然已有相关研究对血清miRNA标准化的最佳参照基因进行了鉴定和评估(比如申请号为201210065684.4的专利申请)，但在某种条件下稳定表达的内参基因，在其他的实验条件下可能是变化的，在任何的实验条件下都能够稳定表达的内参基因几乎不存在。因此，应从众多的内参基因中筛选出在各自实验条件下和实验项目中稳定表达的内参基因。
目前miRNA的标准化检测有使用外源性人工合成的非人源miRNA(如线虫)作为外部参照，但是外参只能作为样本提取检测有效性的质控，并不能反应检测样本内源miRNA的表达情况和样本采集的差异。常用的miRNA检测的内参基因有：5SrRNA、18SrRNA、U6和miRNA，但这些miRNA并不相同，不属于同一基因家族，在反转录和PCR扩增效率上与miRNA可能有差异，因此对miRNA的标准化检测并不合适。
本发明提取KD样本和发热对照血小板样本中长度小于200nt的小RNA分子，并使用特异性和灵敏度更高的茎环反转录引物结合荧光探针法(RT-PCR)分析差异表达的miRNA，通过一系列数据分析筛选出了血小板miRNA内参基因miR-30d-5p，相较于其他内参基因(如miR-126-3p，The Platelet microRNA Profile of Kawasaki Disease:Identificationof Novel Diagnostic Biomarkers)，miR-30d-5p在血小板miRNA的检测中具有更好的稳定性和更高的表达量，对于KD组和发热对照组样本中差异表达的miRNA检测具有更高的准确性和区分性。
具体地，本发明实施例提供了miR-30d-5p的检测试剂在制备适用于miRNA检测的内参基因的检测试剂中的应用。
在一些实施例中，所述miR-30d-5p的检测试剂包括用于检测miR-30d-5p的引物对、探针和芯片中的至少一种。
可以理解的是，检测miR-30d-5p的引物对、探针的具体序列可基于常规引物和探针的设计方法获得，本申请的贡献在于发现用miR-30d-5p作为检测川崎病的miRNA标志物表达水平的内参基因，能提高川崎病检测的稳定性和有效性。
在一些实施例中，检测miR-30d-5p的引物对包括：反转录引物和/或检测引物对。反转录引物的核苷酸序列可以如SEQ ID NO:1所示，检测引物对的核苷酸序列可以如SEQID NO:2～3所示，探针的核苷酸序列可以如SEQ ID NO:4所示。
在一些实施例中，所述miRNA包括：血小板miRNA。
在一些实施例中，所述miRNA包括：用于检测川崎病的miRNA标志物。
另一方面，本发明实施例提供了miR-30d-5p的检测试剂在制备用于检测川崎病的产品中的应用。
在一些实施例中，所述产品选自：试剂、试剂盒、芯片和预测模型中的任意一种。
在一些实施例中，所述miR-30d-5p的检测试剂可以同前述任意实施例所述。
另一方面，本发明实施例提供了一种试剂或试剂盒，其包括：miRNA的检测试剂和内参基因的检测试剂；所述内参基因包括miR-30d-5p。
在一些实施例中，所述miRNA的检测试剂包括：用于检测川崎病的miRNA标志物的检测试剂。
在一些实施例中，所述用于检测川崎病的miRNA标志物包括：let-7g-5p和miR-26a-5p。
在一些实施例中，所述let-7g-5p的检测试剂包括用于检测let-7g-5p的引物对、探针和芯片中的至少一种。可选地，检测let-7g-5p的引物对包括：反转录引物和/或检测引物对。反转录引物的核苷酸序列可以如SEQ ID NO:9所示，检测引物对的核苷酸序列可以如SEQ ID NO:10～11所示，探针的核苷酸序列可以如SEQ ID NO:12所示。
在一些实施例中，所述miR-26a-5p的检测试剂包括用于检测miR-26a-5p的引物对、探针和芯片中的至少一种。可选地，检测miR-26a-5p的引物对包括：反转录引物和/或检测引物对。反转录引物的核苷酸序列可以如SEQ ID NO:13所示，检测引物对的核苷酸序列可以如SEQ ID NO:14～15所示，探针的核苷酸序列可以如SEQ ID NO:16所示。
在一些实施例中，所述内参基因的检测试剂包括：用于检测miR-30d-5p的引物对、探针和芯片中的至少一种。
此外，本发明实施例提供了一种检测样本目标miRNA表达水平的方法，所述方法包括将miR-30d-5p作为内参基因，用于分析目标miRNA的表达水平。
在一些实施例中，所述目标miRNA包括：用于检测川崎病的miRNA标志物。
在一些实施例中，所述miRNA标志物包括；let-7g-5p和miR-26a-5p；
在一些实施例中，所述方法包括：获取样本的血小板miRNA反转录后的cDNA模板，采用用于检测所述目标miRNA和所述内参基因的引物对所述cDNA模板进行荧光定量PCR扩增，通过比较内参基因和目标miRNA的Ct值，获得目标miRNA的表达水平。
在一些实施例中，所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
样本收集流程及验证试验已通过医院伦理委员会认可。
实施例采用的相关的检测引物和探针序列：
miR-30d-5p检测的反转录引物及荧光定量PCR检测的引物和探针，序列如下。
Figure BDA0004067799650000061
miR-126-3p检测的反转录引物及荧光定量P CR检测的引物和探针，序列如下。
Figure BDA0004067799650000071
let-7g-5p检测的反转录引物及荧光定量P CR检测的引物和探针，序列如下。
Figure BDA0004067799650000072
miR-26a-5p检测的反转录引物及荧光定量P CR检测的引物和探针，序列如下。
Figure BDA0004067799650000073
实施例1
1、样本及血小板RNA提取
采用EDTA(乙二胺四乙酸盐)抗凝管收集KD和发热患儿外周血2.0ml，然后将外周血4℃、120g离心20min后取上层淡黄色液体，转移至2.0ml无核酸酶的离心管中，再放入离心机中4℃、360g离心20min后弃上清，用1×PBS洗涤2次血小板沉淀，洗涤完后弃掉PBS上清。按照miRNA提取试剂盒说明书操作提取血小板中的miRNA，并使用Qubit和Nanodrop测定血小板miRNA的浓度和纯度，合格的样本可长期储存于-80℃冰箱或者样本直接进行后续的操作。
2、miRNA反转录及实时荧光定量PCR的检测
使用miRNA反转录试剂盒、茎环反转录引物将所有临床KD样本和发热对照样本的miRNA(每例样本取8μl)反转录成cDNA，然后使用PCR Mix反应液、相应的引物、探针和荧光定量PCR仪器(ABI 7500)进行PCR检测，所有样本都重复检测3次，检测结果的阈值统一设置为固定值。反转录和PCR检测的体系如下。
(1)gDNA(基因组DNA)去除
表1 反应体系
组分 体积(μl)
去DNAMix 2
miRNA 8
共计 10
反应体系配好吹打混匀后，42℃孵育2min。
(2)反转录及cDNA合成
表2 反应体系
Figure BDA0004067799650000081
Figure BDA0004067799650000091
反应液配好混匀后，按下列条件进行cDNA合成。
表3 反应条件
反应温度 时间
25℃ 5min
50℃ 15min
85℃ 5min
反转录的cDNA按下列体系配制PCR反应液。
表4 反应体系
组分 体积
Probe qPCR Mix(2x) 10μl
Primer-F(10μm) 0.4μl
Primer-R(10μm) 0.4μl
Probe(10μm) 0.2μl
Template cDNA 1μl
RNase-free water 7.6μl
50×ROX Reference Dye 2 0.4μl
总体积 20μl
PCR反应程序如下。
表5 反应程序
Figure BDA0004067799650000092
3、结果分析-不同候选基因的表达模式分析
对14例川崎病治疗前、10例川崎病治疗后和18例发热对照样本共计42例样本(见表6)的4个miRNA进行RT-PCR检测结果进行分析，设置固定的阈值，每例样本的重复检测3次，分析各个候选基因的Ct值和变异系数，结果见图1和图2：不同miRNA的表达量差异较大，Ct值范围为24.64-30.3，其中miR-30d-5p表达量最高，Ct值为24.64，let-7g-5p的表达量最低(Ct值为30.3)，miR-30d-5p的变异系数最小，约为0.063，综合高表达量(低Ct值)和低变异系数筛选原则来看：miR-30d-5p更适合作为标准化内参基因。
表6样本信息
Figure BDA0004067799650000101
Figure BDA0004067799650000111
4、基因稳定性分析
分别使用geNorm和NormFinder软件计算候选参照基因表达稳定性。
①geNorm软件专门用于实时荧光定量中筛选内参基因及确定内参基因数目的程序，该程序可以用于筛选任何试验的任意数目的内参基因，并最终挑选出2个或2个以上的内参基因组合来校正数据，可使相对定量的结果更为精确。该程序通过使用HK函数算法对选定的参考基因/管家基因进行排序，即计算所有候选基因的基因稳定性测度M，排除M值最高的基因。然后计算剩余基因的基因稳定性测度M，以此类推。这一过程不断重复，直到分别有两个minNrHK基因保留，判定标准为M值越小的基因越稳定。该软件还可计算引入1个新的内参基因后标准化因子的配对变异V值，并根据Vn/Vn+1值来确定所需最适内参基因的数目。默认的V值为0.15(该值可以人为稍作调整)，如果Vn/Vn+1值<0.15，则最适内参基因的数量是n个；而如果Vn/Vn+1值>0.15，则最适内参基因的数量是n+1个。
geNorm软件在全部临床样本(KD患儿组和发热对照组)的候选基因的稳定性分析结果如下(图3)：综合KD治疗前、KD治疗后和发热对照样本中的平均表达稳定值M来看，稳定性最好的是miR-30d-5p，其次是miR-126-3p和let-7g-5p，即miR-30d-5p的稳定值最小，稳定性最好，且miR-30d-5p稳定性(M值0.81)好于miR-126-3p(M值0.86)，表明miR-30d-5p更适合作为内参。
②NormFinder程序是一种从一组候选基因中识别最优归一化基因的算法。该算法基于基因表达的数学模型，并使用可靠的统计数据框架不仅可以估计候选标准化基因的总体表达变化，而且还可以计算不同样本集之间的差异，例如正常和癌症样本。NormFinder程序为每个基因提供了一个稳定值，其计算原理与geNorm程序相似，也是先获得候选内参基因的表达稳定值，再根据稳定值的大小筛选最合适的内参基因，判定标准为表达值M最小的内参基因为最稳定的内参基因。
NormFinder程序对所有临床样本(KD患儿组和发热对照组)的候选基因稳定性的分析结果如下(图4)：miR-30d-5p的稳定值最小(0.131)，稳定性最好，其次是miR-126-3p(0.167)。该结果与geNorm程序的结果具有一致性，且两种内参筛选软件结果均显示：miR-30d-5p的稳定性优于miR-126-3p，综合两种软件的分析结果：miR-30d-5p具有更好的表达稳定性,表明miR-30d-5p更适合作为内参。
5、不同内参基因的校准对miRNA定量结果影响的比较
已有相关的研究证实let-7g-5p和miR-26a-5p在KD患儿组和发热对照组血小板样本中表达具有差异显著，且这两组miRNA在KD患儿血小板中的表达上调。
本实施例使用荧光定量PCR法检测KD患儿和发热对照组血小板中两种miRNA，使用2-ΔΔCT法分析miRNA的相对表达，分别使用候选内参基因miR-126-3p和miR-30d-5p作为内参基因做标准化校准，结果使用t检验分析统计学意义，P值小于0.05具有统计学差异，P值越小差异越显著，即KD患儿血小板中let-7g-5p和miR-26a-5p表达水平的差异越显著。
结果显示如图5和6，使用miR-126-3p校准后的let-7g-5p在发热对照组和KD治疗前(KDSB)表达具有统计学意义(差异显著，P值0.02)且在KD治疗前表达水平上调。
使用miR-30d-5p校准后的let-7g-5p在发热对照组和KD治疗前(KDSB)表达水平具有统计学意义(差异显著，P值0.0043)，和miR-126-3p校准结果比，miR-30d-5p校准后具有更小的P值，表示let-7g-5p在两组别之间的差异更显著，在KD治疗前(KDSB)患儿中表达上调的趋势更显著。
使用miR-30d-5p校准后的miR-26a-5p(P值5.4e-05)比miR-126-3p校准后的miR-26a-5p(P值3.9e-05)在发热对照组和KD治疗前(KDSB)的表达差异更显著，miR-26a-5p区分KD病例和发热患者的能力越强。
实施例2
2.miR-30d-5p作为检测川崎病的miRNA标志物表达水平的内参基因，能提高川崎病检测的稳定性和有效性。此处的稳定性和有效性通过let-7g-5p和miR-26a-5p这2个KD相关的标志物分别使用内参miR-126-3p和miR-30d-5p标准化后的ROC曲线(接受者操作特性曲线)的AUC面积(ROC曲线所覆盖的区域面积，AUC越大分类器分类效果越好，预测价值越高)进行比较。
从ROC曲线(图7～图8)可以看出，let-7g-5p和miR-26a-5p用miR-30d-5p标准化后，AUC面积均比miR-126-3p标准化后的AUC面积大。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.miR-30d-5p的检测试剂在制备适用于miRNA检测的内参基因的检测试剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miR-30d-5p的检测试剂包括用于检测miR-30d-5p的引物对、探针和芯片中的至少一种；
优选地，所述miRNA包括：血小板miRNA；
优选地，所述miRNA包括：用于检测川崎病的miRNA标志物。
3.miR-30d-5p的检测试剂在制备用于检测川崎病的产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品选自：试剂、试剂盒、芯片和预测模型中的任意一种；
优选地，所述miR-30d-5p的检测试剂包括用于检测miR-30d-5p的引物对、探针和芯片中的至少一种。
5.一种试剂或试剂盒，其特征在于，其包括：miRNA的检测试剂和内参基因的检测试剂；所述内参基因包括miR-30d-5p。
6.根据权利要求5所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述miRNA的检测试剂包括：用于检测川崎病的miRNA标志物的检测试剂；
优选地，所述用于检测川崎病的miRNA标志物包括：let-7g-5p和miR-26a-5p；
优选地，所述内参基因的检测试剂包括：用于检测miR-30d-5p的引物对、探针和芯片中的至少一种。
7.一种检测样本目标miRNA表达水平的方法，其特征在于，所述方法包括将miR-30d-5p作为内参基因，用于分析目标miRNA的表达水平。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述目标miRNA包括：用于检测川崎病的miRNA标志物；
优选地，所述miRNA标志物包括；let-7g-5p和miR-26a-5p。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括：获取样本的血小板miRNA反转录后的cDNA模板，采用用于检测所述目标miRNA和所述内参基因的引物对所述cDNA模板进行荧光定量PCR扩增，通过比较内参基因和目标miRNA的Ct值，获得目标miRNA的表达水平。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
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