CN116334030B - 一种经修饰的CfM HL4解旋酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种经修饰的CfMHL4解旋酶及其应用，涉及基因测序技术领域。本发明提供的CfMHL4解旋酶包括在野生型CfMHL4解旋酶的1A结构域和/或2A结构域和/或1B结构域和/或2B结构域中引入了至少一个半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸；其中所述经修饰的CfMHL4解旋酶保留其控制多核苷酸移动的能力。本发明解决了核酸从容易解旋酶上脱落的问题，且经修饰的CfMHL4解旋酶耐盐性能也得到了很大提高，明显提高了核酸测序的长度和精确性。

Description

一种经修饰的CfM HL4解旋酶及其应用
技术领域
本发明涉及基因测序技术领域，尤其涉及一种经修饰的CfM HL4解旋酶及其应用。
背景技术
纳米孔测序基于电信号检测原理，核酸链穿过纳米孔时，不同碱基堵塞孔道产生不同的堵孔电流信号，通过算法解析信号特征，获得核酸序列信息。相较于二代测序技术，这种测序技术的优势在于：建库简单，无需进行核酸扩增；测序速度快，单个分子可以达到每秒数百个碱基的读取速度，而且可以边测序边分析；读长长，单次可以达到数百万个碱基；可以实现对DNA甲基化的直接测量。
但是，这一技术面临的挑战之一是多核苷酸过孔易位速度过快，超过了目前电子学的检测极限。因此，为了提高纳米孔测序准确率，降低核酸穿孔速度并防止多核苷酸脱落是关键。目前，主流的方案是通过加入解旋酶控制核酸的运动，从而增加核酸在纳米孔中的停留时间及增加核酸与跨膜孔的相互作用，提高电信号的分辨率。例如，专利CN104039979B公开了一种新的表征目标多核苷酸的方法，所述的方法包括通过Hel308解旋酶或分子马达控制目标多核苷酸穿过孔的移动。专利CN104136631B公开了一种使用XPD解旋酶表征目标多核苷酸的方法，所述的方法包括通过XPD解旋酶控制目标多核苷酸穿过孔的移动。专利CN107109380A公开了一种经修饰的酶，该酶为可以控制目标多核苷酸穿过孔的移动的经修饰的Dda解旋酶。专利CN113930406A公开了一种经修饰的Pif1-like解旋酶，以及其在表征目标多核苷酸或控制多核苷酸穿过孔的移动中的应用。专利WO2022213253公开了经修饰的Prp43解旋酶可用于纳米孔测序技术。上述方法可以一定程度上控制目标多核苷酸穿过孔的移动。
但是，上述方法仍存在改进空间。一方面，在核酸序列很长的情况下，例如超过500个核苷酸，解旋酶可能从核酸序列上脱落而不受控的迅速穿过纳米孔。因此，如何保证长链核酸不从分子马达上脱落，对于发挥纳米孔测序技术读长长优势是非常重要的。另一方面，纳米孔测序需要使用可导电的电解质溶液，出于提高电流信号降低信噪比的考虑，一般测序须在高盐缓冲液的环境下运行，这对解旋酶的耐盐能力提出了很大挑战。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是核酸穿过纳米孔易位过快以及分子马达容易从多核苷酸上脱落，导致测序准确率低。
为了解决上述问题，本发明提出以下技术方案：
本发明的第一方面，提供了一种经修饰的CfMHL4解旋酶，包括在野生型CfMHL4解旋酶的1A结构域和/或2A结构域和/或1B结构域和/或2B结构域中引入了至少一个半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸或天然氨基酸；其中所述经修饰的CfMHL4解旋酶保留其控制多核苷酸移动的能力。
优选地，可以在每个结构域中引入任意数量的半胱氨酸残基和/或非天然氨基酸。例如，可以引入1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多个半胱氨酸残基，和/或可以引入1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多个非天然氨基酸。可以仅引入一个或多个的半胱氨酸残基。可以仅引入一个或多个的非天然氨基酸。可以引入一个或多个的半胱氨酸残基和一个或多个的非天然氨基酸的组合。
优选所述至少一个半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸通过取代引入。进行取代的方法为本领域已知的。
这些修饰不会阻止解旋酶结合多核苷酸。这些修饰降低多核苷酸从解旋酶解旋或解脱的能力。换句话，所述一个或多个修饰通过防止解旋酶从多核苷酸链上解离来提高解旋酶的进行性。所述酶的热稳定性通常也通过所述一个或多个修饰而提高，使得其具有提高的结构稳定性，这对于链测序是有利的。
也就是说，引入半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸后使得该解旋酶与多核苷酸的结合更稳定，并增强了控制其移动的能力。
需要说明的是，本发明中，野生型CfMHL4解旋酶来源于柠檬酸杆菌噬菌体，生存环境为动物肠道，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，长度443，NCBI编号为YP_009146450.1。
本发明提供了修饰的CfMHL4解旋酶。一个或多个具体修饰在下文详细讨论。所述修饰允许修饰的解旋酶更长时间保持与多核苷酸的结合。所述修饰的解旋酶保留其控制多核苷酸移动的能力。换句话，所述修饰的解旋酶仍能控制多核苷酸的移动。所述解旋酶控制多核苷酸的移动的程度通常由所述修饰改变，如下文所详述的。
CfMHL4解旋酶(SEQ ID NO:1)属于SF1B家族分支Pif1-likeFamily。其结构域分为1A(RecA型马达)结构域，2A(RecA型马达)结构域，1B结构域，2B结构域。进一步地，1B结构域又称为销结构域，2B结构域又分为塔结构域和钩结构域(XiaopingHe等，2012，Structure；20：1189-1200)。其中，经鉴定，构成CfMHL4解旋酶(SEQ ID NO:1)各结构域的残基为：1A结构域的残基为(M1-L87,V105-R180)；2A结构域的残基为(S181-T261,L393-V443)；1B结构域的残基为(K88-E104)；2B结构域中塔结构域为(E262-E275,N295-A392)，钩结构域为(P276-N294)。
优选地，本发明中，所述经修饰的CfMHL4解旋酶包括：
SEQ ID NO:1的变体，其中，在1A结构域(残基M1-L87和V105-R180)和/或2A结构域(残基S181-T261和L393-V443)和/或1B结构域(残基K88-E104)和/或2B结构域(残基E262-E275、N295-A392和P276-N294)中引入了至少一个半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸或天然氨基酸。
优选地，本发明中，所述经修饰的CfMHL4解旋酶包括：
SEQ ID NO:1的变体，其中，在2B结构域中引入了至少一个半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸。
优选地，本发明中，所述经修饰的CfMHL4解旋酶包括：
SEQ ID NO:1的变体，其中，在1B结构域和2B结构域中引入了至少一个半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸。
优选地，本发明中，所述经修饰的CfMHL4解旋酶包括：
SEQ ID NO:1的变体，其中，在1B结构域和2B结构域和/或1A结构域中的每一个结构域中引入了至少一个半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸。
优选地，本发明中，所述经修饰的CfMHL4解旋酶包括：
SEQ ID NO:1的变体，其中，在1B结构域和2B结构域和1A结构域和/或2A结构域中的每一个结构域中引入了至少一个半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸。
优选地，本发明中，在2B结构域中引入了至少一个半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸是指在2B结构域的残基N295-A392中引入了至少一个半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸。
优选地，所述经修饰的CfMHL4解旋酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过下述一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加，且具有与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.9％的同源性并具有控制多核苷酸移动的能力：
1A结构域：M1，G39，H66，T82，I83，H84，S85，D107，M121，E125，E146，V152，P154；
2A结构域：F242，T243，V418，N420；
1B结构域：N90，P91，T93，E96，F100；
2B结构域:E275，F288，E290，N294，N295，T289，D334，A363，H388，K389。
需要说明的是，CfMHL4解旋酶的1A结构域和2A结构域为蛋白在多核苷酸上移动的主要结构域，本发明通过对1A结构域和2A结构域中与多核苷酸作用的关键位点进行突变改造，可以调整蛋白在多核苷酸上的移位能力。CfMHL4解旋酶的1B结构域和2B结构域为附属区域，本发明通过对该附属区域的重要位点进行修饰突变，可以调整解旋酶对蛋白的解旋控制能力。
优选地，所述经修饰的CfMHL4解旋酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过下述一个或多个氨基酸的取代，且具有与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.9％的同源性并具有控制多核苷酸移动的能力：
1A结构域：M1G，G39A，G39R，H66K，H66E，H66I，H66F，T82K，T82A，T82Y，T82Q，T82R，I83M，I83Q，I83K，I83E，H84R，H84Y，H84W，S85K，S85Q，S85T，D107I，D107K，D107M，M121L，M121Y，M121R，M121D，E125R，E125M，E125V，E125Q，E146D，E146K，E146Y，V152L，V152Y，V152T，P154F，P154Y，P154H，P154W，P154E；
2A结构域：F242W，F242P，F242Y，T243Y，T243I，T243H，V418L，V418R，V418E，V418S，N420Q，N420K，N420E；
1B结构域：N90H，N90Q，P91A，P91F，P91S，P91W，T93F，T93N，T93Q，T93W，E96C，E96N，E96K，F100W，F100Y，F100R，F100E；
2B结构域：E275D，E275K，E275Y，E275Q，F288W，F288H，E290D，E290K，E290C，N294Q，N294K，N295R，N295E，T289N，T289K，D334C，D334E，A363C，A363M，A363N，H388W，H388F，K389R，K389M，K389I。
优选地，所述经修饰的CfMHL4解旋酶包括：
下述SEQ ID NO:1变体的任一个：
(i)E96C/A363C；
(ii)(i)中的任一个和1A结构域中的一个或多个氨基酸的取代；
(iii)(i)中的任一个和2A结构域中的一个或多个氨基酸的取代；
(iv)(i)中的任一个、1A结构域中的一个或多个氨基酸的取代和2A结构域中的一个或多个氨基酸的取代；
(v)(i)中的任一个、和N90H，N90Q，P91A，P91F，P91S，P91W，T93F，T93N，T93Q，T93W，F100W，F100Y，F100R，F100E中的一个或多个氨基酸的取代；
(vi)(i)中的任一个，和E275D，E275K，E275Y，E275Q，F288W，F288H，E290D，E290K，E290C，N294Q，N294K，N295R，N295E，T289N，T289K，D334C，D334E，H388W，H388F，K389R，K389M，K389I中的一个或多个氨基酸的取代；
(vii)(i)中的任一个，和N90H，N90Q，P91A，P91F，P91S，P91W，T93F，T93N，T93Q，T93W，F100W，F100Y，F100R，F100E中的一个或多个氨基酸的取代，和E275D，E275K，E275Y，E275Q，F288W，F288H，E290D，E290K，E290C，N294Q，N294K，N295R，N295E，T289N，T289K，D334C，D334E，H388W，H388F，K389R，K389M，K389I中的一个或多个氨基酸的取代；
(viii)(ii)至(iv)中的任一个，和N90H，N90Q，P91A，P91F，P91S，P91W，T93F，T93N，T93Q，T93W，F100W，F100Y，F100R，F100E中的一个或多个氨基酸的取代；
(ix)(ii)至(iv)中的任一个，和E275D，E275K，E275Y，E275Q，F288W，F288H，E290D，E290K，E290C，N294Q，N294K，N295R，N295E，T289N，T289K，D334C，D334E，H388W，H388F，K389R，K389M，K389I中的一个或多个氨基酸的取代；
(x)(ii)至(iv)中的任一个，和N90H，N90Q，P91A，P91F，P91S，P91W，T93F，T93N，T93Q，T93W，F100W，F100Y，F100R，F100E中的一个或多个氨基酸的取代，和E275D，E275K，E275Y，E275Q，F288W，F288H，E290D，E290K，E290C，N294Q，N294K，N295R，N295E，T289N，T289K，D334C，D334E，H388W，H388F，K389R，K389M，K389I中的一个或多个氨基酸的取代。
优选地，所述经修饰的CfMHL4解旋酶包括：
下述SEQ ID NO:1变体中的任一个：
(i)E96C/A363C；
(ii)E96C/A363C/S85T/F242W；
(iii)E96C/A363C/T82A/F242Y；
(iv)E96C/A363C/D107K/T289N/H388F；
(v)E96C/A363C/D107M/E275Q；
(vi)E96C/A363C/M1G/H66E；
(vii)E96C/A363C/H66F/M121D；
(viii)E96C/A363C/E125R/K389M；
(ix)E96C/A363C/E125V/D334C；
(x)E96C/A363C/E146K/E290C/N294K；或
(xi)E96C/A363C/G39R。
本发明通过对上述结构位点进行特定突变，使突变体获得稳定保持多核苷酸通过纳米孔的能力。
第二方面，本发明提供一种多肽，包括来自野生型CfMHL4解旋酶的2B结构域并且不包括来自野生型CfMHL4解旋酶的其他结构域，其中在所述2B结构域中引入了至少一个半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸。
优选地，所述多肽包括第一方面所述的2B结构域的任意变体或任意突变。
本发明提供另一种多肽，包括来自野生型CfMHL4解旋酶的1B结构域和2B结构域并且不包括来自野生型CfMHL4解旋酶的其他结构域，其中在所述1B结构域和2B结构域中引入了至少一个半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸。
优选地，所述多肽包括第一方面的1B结构域和2B结构域的任意变体或任意突变。
第三方面，本发明提供一种构建体，其特征在于，包括第一方面所述的经修饰的CfMHL4解旋酶以及额外的多核苷酸结合部分，其中所述经修饰的CfM HL4解旋酶连接到所述多核苷酸结合部分并且所述构建体具有控制多核苷酸移动的能力。
优选地，所述的构建体，还包括两个或更多个第一方面所述的经修饰的CfM HL4解旋酶。
优选的，所述的多核苷酸结合部分可以是与多核苷酸的碱基结合的部分，和/或与多核苷酸的糖环结合的部分，和/或与多核苷酸的磷酸结合的部分。
第四方面，本发明提供一种多核苷酸，包括编码第一方面所述的经修饰的CfMHL4解旋酶、第二方面所述的多肽或第三方面所述的构建体的序列。
第五方面，本发明提供一种载体，包括可操作性连接到启动子的第四方面所述的多核苷酸。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的启动子选自T7、trc、lac、ara或λL。
优选的，所述的表达载体包括但不限于质粒、病毒或噬菌体。
第六方面，本发明提供一种宿主细胞，包括第五方面所述的载体。
优选的，所述的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的宿主细胞选自BL21(DE3)、JM109(DE3)、B834(DE3)、TUNER、C41(DE3)、Rosetta2(DE3)、Origami、OrigamiB等等。
第七方面，本发明还提供一种制备第一方面所述的经修饰的CfMHL4解旋酶的方法，所述的方法包括提供野生型CfMHL4解旋酶，然后对所述的野生型CfMHL4解旋酶进行修饰，获得本发明所述的CfMHL4解旋酶；或者，所述的方法包括培养本发明所述的宿主细胞并进行诱导表达，纯化后获得CfMHL4解旋酶；或者，根据本发明所述CfMHL4解旋酶的氨基酸序列，获得编码CfMHL4解旋酶的核酸序列，酶切连接至表达载体后转化至大肠杆菌中，诱导表达和纯化，获得CfMHL4解旋酶。
第八方面，本发明提供一种控制多核苷酸移动的方法，其特征在于，包括将所述多核苷酸与第一方面所述的CfMHL4解旋酶或第三方面所述的构建体接触，并由此控制所述多核苷酸的移动。
优选的，所述的控制多核苷酸移动为控制多核苷酸穿过孔的移动。所述的孔为纳米孔，所述的纳米孔为跨膜孔。该孔可以是天然的或人造的，包括但不限于蛋白孔、多核苷酸孔或固态孔。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的跨膜孔选自生物孔、固态孔或生物与固态杂交的孔。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的孔包括但不限于衍生自耻垢分枝杆菌孔蛋白A、耻垢分枝杆菌孔蛋白B、耻垢分枝杆菌孔蛋白C、耻垢分枝杆菌孔蛋白D、溶血素、胞溶素、白细胞介素、外膜孔蛋白F、外膜孔蛋白G、外膜磷脂酶A、WZA或奈瑟氏菌自转运脂蛋白等等。
优选的，所述的方法可以包含一个或多个的CfMHL4解旋酶共同控制多核苷酸的移动。
第九方面，本发明提供一种表征目标多核苷酸的方法，包括：
(a)将目标多核苷酸与跨膜孔和第一方面所述的经修饰的CfMHL4解旋酶或第三方面所述的构建体接触，使得所述解旋酶控制所述目标多核苷酸穿过所述孔的移动；以及
(b)随着所述多核苷酸相对于所述孔移动，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征并由此表征所述目标多核苷酸。
优选的，所述的方法中可以使用任意数量的第一方面所述的经修饰的CfM HL4解旋酶。优选可以为一个或多个，更优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个。
其中，所述的两个以上第一方面所述的经修饰的CfMHL4解旋酶可以相同或不同。也可以包含野生型CfMHL4解旋酶或者其他类型的解旋酶。
进一步的，两个以上个解旋酶之间可以连接或者只是通过分别结合在多核苷酸上而排列发挥控制多核苷酸移动的功能。
优选的，当在孔施加一种力(如电压)，目标多核苷酸通过孔的速率被CfM HL4解旋酶或构建体所控制，从而获得一种可识别的稳定的电流水平，用于确定目标多核苷酸的特征。
优选的，重复步骤I)和II)一次或多次。
优选的，所述的方法还包括横跨与所述解旋酶或构建体，和目标多核苷酸接触的孔施加势差的步骤。
优选的，所述的孔是允许水合离子在施加的电势的驱动下从膜的一侧流向膜的另一侧的结构。
进一步优选的，所述的孔为纳米孔，所述的纳米孔为跨膜孔。所述跨膜孔为目标多核苷酸的移动提供了通道。
所述的膜可以为任何现有技术中存在的膜，优选为两性分子层，即一种由具有至少一个亲水性部分和至少一个亲脂性或疏水性部分的两性分子诸如磷脂质形成的层，两性分子可以是合成的或天然存在的。
进一步优选的，所述的膜为脂质双层膜。
所述的目标多核苷酸可以使用任何已知的方法连接到膜上。如果膜是两性分子层，如脂质双分子层，所述多核苷酸优选通过在所述膜中存在的多肽或通过在所述膜中存在的疏水锚被连接到该膜上。其中，疏水锚优选为脂质、脂肪酸、甾醇、碳纳米管或氨基酸。
优选的，所述的孔选自生物孔、固态孔或生物与固态杂交的孔。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的孔包括但不限于衍生自耻垢分枝杆菌孔蛋白A、耻垢分枝杆菌孔蛋白B、耻垢分枝杆菌孔蛋白C、耻垢分枝杆菌孔蛋白D、溶血素、胞溶素、白细胞介素、外膜孔蛋白F、外膜孔蛋白G、外膜磷脂酶A、WZA或奈瑟氏菌自转运脂蛋白等等。
当提供了促进移动的所有必要组分时，CfMHL4解旋酶沿着DNA以5’-3’的方向移动，但DNA在孔中的定向(取决于DNA的哪个末端被捕获)意味着酶可以用于逆着所施加的场的方向将DNA移出孔，或顺着施加的场的方向将DNA移进孔。
优选的，所述的目标多核苷酸为单链、双链或至少一部分是双链的。
进一步优选的，所述的目标多核苷酸可以通过标签、间隔物、甲基化、氧化或损伤的方式进行修饰。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的目标多核苷酸为至少一部分是双链的。
其中所述的双链部分构成Y衔体结构，所述的Y衔体结构包含优先螺入所述孔的前导序列。
进一步优选的，所述的目标多核苷酸的长度可以为10-100000个或更多个。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的目标多核苷酸的长度可以为至少10个、至少50个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少1000个、至少2000个、至少5000个、至少10000个、至少50000个或至少100000个等等。
优选的，第一方面所述的经修饰的CfMHL4解旋酶结合到单链多核苷酸的内部核苷酸中。
优选的，所述的一个或多个特征选自目标多核苷酸的来源、长度、同一性、序列、二级结构或目标多核苷酸是否被修饰。
优选的，所述的一个或多个特征通过电测量和/或光学测量进行。
进一步优选的，通过电测量和/或光测量产生电信号和/或光信号，而每种核苷酸对应一种信号水平，继而将电信号和/或光信号转化为核苷酸的特征。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的电测量包括但不限于电流测量、阻抗测量、隧道测量、风洞测量或场效应晶体管(FET)测量等等。
本发明所述的电信号选自电流、电压、隧穿、电阻、电位、电导率或横向电测量的测量值。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的电信号为穿过所述孔的电流。
本发明的第十方面，提供了一种表征目标多核苷酸的产品，所述的产品包含本发明所述的经修饰的CfMHL4解旋酶、所述的构建体、所述的核酸、所述的表达载体或所述的宿主细胞，和孔。
优选的，所述的产品选自试剂盒、装置或传感器。
进一步优选的，所述的试剂盒中还包括包含脂质双层的芯片。
本发明所述的试剂盒还包括实施表征目标多核苷酸的试剂或装置。优选的，所述的试剂包括缓冲剂、PCR扩增所需的工具。
第十一方面，本发明提供了本发明所述的经修饰的CfMHL4解旋酶、所述的构建体、所述的核酸、所述的表达载体、所述的宿主细胞或所述的产品在表征目标多核苷酸或控制目标多核苷酸穿过孔的移动中的应用。
第十二方面，本发明提供了一种表征目标多核苷酸的试剂盒，所述的试剂盒包含本发明所述的经修饰的CfMHL4解旋酶、所述的构建体或所述的核酸、所述的表达载体或所述的宿主细胞，和孔。
第十三方面，本发明提供了一种表征目标多核苷酸的装置，所述的装置包含本发明所述的经修饰的CfMHL4解旋酶、所述的构建体或所述的核酸、所述的表达载体或所述的宿主细胞，和孔。
优选的，所述的装置包括支撑所述多个孔并可传输孔与多核苷酸相互作用的信号的传感器，和至少一个用于存储目标多核苷酸的存储器，和实施表征过程中所需的溶液。
优选的，所述的装置包括多个经修饰的CfMHL4解旋酶和/或多个构建体，和多个孔。
第十四方面，本发明提供了一种表征目标多核苷酸的传感器，所述的传感器包含在所述孔和本发明所述的经修饰的CfMHL4解旋酶或所述的构建体之间形成复合物。
优选的，在所述目标多核苷酸存在下使所述孔和解旋酶或构建体接触，并跨所述孔施加电势。所述的电势选自电压电势或化学电势。
第十五方面，本发明提供了一种形成表征目标多核苷酸的传感器的方法，包括
在所述孔和本发明所述的经修饰的CfMHL4解旋酶或所述的构建体之间形成复合物，从而形成表征目标多核苷酸的传感器。
第十六方面，本发明提供了一种与多核苷酸连接的两个或多个解旋酶，其中，所述的两个或多个解旋酶中至少一个为本发明所述的经修饰的CfMHL4解旋酶。
第十七方面，本发明提供了一种CfM HL4解旋酶寡聚体，所述的CfM HL4解旋酶寡聚体包含一个或多个的本发明所述的经修饰的CfM HL4解旋酶。
优选的，所述的CfM HL4解旋酶寡聚体还可以包含野生型CfM HL4解旋酶或其他类型的解旋酶。其中，所述的其他类型的解旋酶可以为Hel308解旋酶、XPD解旋酶、Dda解旋酶、TraI解旋酶或者TrwC解旋酶等等。
优选的，所述的经修饰的CfM HL4解旋酶与野生型CfM HL4解旋酶之间、经修饰的CfM HL4解旋酶与经修饰的CfM HL4解旋酶之间、野生型CfM HL4解旋酶与野生型CfM HL4解旋酶、经修饰的CfM HL4解旋酶与其他类型解旋酶之间或者野生型CfM HL4解旋酶与其他类型解旋酶之间，可以通过头对头、尾对尾或者头对尾的方式连接或排列。
优选的，所述的CfM HL4解旋酶寡聚体包含两个以上的本发明所述的经修饰的CfMHL4解旋酶，其中，所述的经修饰的CfM HL4解旋酶可以是不同的或者相同的。
与现有技术相比，本发明所能达到的技术效果包括：本发明提供了一种新的经修饰的CfM HL4解旋酶，其可以控制多核苷酸的易位速度，用于纳米孔测序；同时，解决了核酸从解旋酶上脱落的问题。本发明提供的经修饰的CfM HL4解旋酶耐盐性能也得到了很大提高，明显提高了核酸测序的长度和精确性。
附图说明
图1显示了来源于柠檬酸杆菌噬菌体(Citrobacter freundii Myophage)的野生型CfM HL4解旋酶(SEQ ID NO:1)的3D结构示意图。
图2示出了纯化的野生型CfM HL4解旋酶及经修饰的CfM HL4解旋酶的SDS-PAGE电泳图。其中，M是Marker(kDa)，泳道1为野生型CfM HL4-WT，泳道2为解旋酶M1(SEQ ID NO:2)。
图3示出了野生型CfM HL4解旋酶和经修饰的CfM HL4解旋酶的凝胶迁移实验结果。其中，泳道1是解旋酶M1(SEQ ID NO:2)和T44-Cy-5底物结合的复合物，泳道2是野生型的CfM HL4-WT解旋酶和T44-Cy-5底物结合的复合物。图中，B代表酶与单链底物SEQ ID NO:5(T44-Cy-5)结合条带，A代表单链底物SEQ ID NO:5(T44-Cy-5)条带。
图4为检测Dda-like解旋酶酶活性的荧光分析示意图。如图A所示，猝灭链a具有5’端ssDNA突出部分，以及40个碱基的杂交的dsDNA部分，在3’端具有黑洞淬灭剂(BHQ-1)碱基(d)。杂交的荧光互补链(c)在5’端具有羧基荧光素FAM(e)。还包括，与猝灭链互补的0.5μM的捕获链(b)。如图B所示，在ATP(5mM)和MgCl2(5mM)存在下，添加到所述底物中的解旋酶(200nM)连接到所述猝灭链的5’端部分，沿着所述主链移动，并解开所述互补链后，过量的捕获链优先与互补链DNA退火以防止猝灭链与荧光链重新退火。如图C所示，部分未被解旋的dsDNA由于过量捕获链b的存在而产生链解旋效果，最终所有dsDNA被解旋，荧光值达到最高。
图5：荧光分析检测CfMHL4解旋酶的解开杂交dsDNA的能力，具体为含有400mMNaCl的缓冲液中的时间依赖型dsDNA被解旋比例的变化图。
图6示出了DNA构建体X的示意图，其中Y1链由以下结构组成：iSpC3衔接子-序列SEQ ID NO:9_1的核苷酸-10个碱基T的ssDNA-iSpC3衔接子-序列SEQ ID NO:9_2的核苷酸。该构建体的Y2链和Y3链对应序列SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11，Y2和Y3链分别为Y1链的SEQ ID NO:9_1和SEQ ID NO:9_2的互补配对部分。
图7示出了野生型CfpHL4解旋酶控制DNA构建体X通过MspA(SEQ ID NO:8)纳米孔移动时的电流轨迹(y轴坐标为电流(pA，0到250)，x轴坐标为时间(s))。
图8示出了解旋酶M1(SEQ ID NO:2)控制λDNA通过MspA纳米孔移动时的电流轨迹(y轴坐标为电流(pA，0到180)，x轴坐标为时间(s))；其中，8-1为完整电流信号图，8-2为DNA构建体的Y1部分和λDNA穿孔的起始电流，8-3为DNA构建体的Y3部分和λDNA穿孔的结束电流。
图9示出了解旋酶M2(SEQ ID NO:12)控制定长序列通过MspA纳米孔移动时的电流轨迹(y轴坐标为电流(pA，0到180)，x轴坐标为时间(s))；其中，9-1为完整电流信号图，9-2为DNA构建体的Y1部分和定长序列穿孔的起始电流，9-3为DNA构建体的Y3部分和定长序列穿孔的结束电流，9-4为定长序列穿孔收集信号的速度分布图，9-5为信号与对应序列长度的频数分布图。
图10示出了解旋酶M3(SEQ ID NO:13)控制定长序列通过MspA纳米孔移动时的电流轨迹(y轴坐标为电流(pA，0到180)，x轴坐标为时间(s))；其中，10-1为完整电流信号图，10-2为DNA构建体的Y1部分和定长序列穿孔的起始电流，10-3为DNA构建体的Y3部分和定长序列穿孔的结束电流，10-4为定长序列穿孔收集信号的速度分布图，10-5为信号与对应序列长度的频数分布图。
图11示出了解旋酶M7(SEQ ID NO:17)控制定长序列通过MspA纳米孔移动时的电流轨迹(y轴坐标为电流(pA，0到180)，x轴坐标为时间(s))；其中，11-1为完整电流信号图，11-2为DNA构建体的Y1部分和定长序列穿孔的起始电流，11-3为DNA构建体的Y3部分和定长序列穿孔的结束电流，11-4为定长序列穿孔收集信号的速度分布图，11-5为信号与对应序列长度的频数分布图。
序列表的说明
SEQ ID NO：1显示了野生型CfMHL4解旋酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2显示了经修饰的CfMHL4解旋酶编号为M1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3显示了编码SEQ ID NO：1的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：4显示了编码SEQ ID NO：2的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：5显示了单链多聚胸腺嘧啶底物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：6显示了底物链a的核苷酸序列。
SEQ ID NO：7显示了底物链c的核苷酸序列。
SEQ ID NO：8显示了MspA纳米孔的核苷酸序列。
SEQ ID NO:9_1、SEQ ID NO:9_2分别显示了构建体Y1链的ssDNA的5’端和3’端所连接的核苷酸序列。
SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11分别显示了SEQ ID NO:9_1、SEQ ID NO:9_2互补配对的核苷酸序列。
SEQ ID NO：12到21显示了经修饰的CfMHL4解旋酶编号为M2-11的氨基酸序列。
SEQ ID NO：22显示了用于试验的lambdaDNA-J02459的核苷酸序列。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，以下将描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所述的“经修饰的CfMHL4解旋酶”是经过修饰的，所述的修饰是相对于野生型或天然解旋酶是修饰的。本发明的经修饰的CfMHL4解旋酶是人工的或非天然的。
本发明所述的“经修饰的CfMHL4解旋酶”、“构建体”或“孔”，均可以被修饰以助于鉴定或纯化，例如通过添加组氨酸残基(His标签)，天冬氨酸残基(asp标签)，链霉亲和素标签，Flag标签，SUMO标签，GST标签或MBP标签，或通过添加信号序列以促进它们从细胞中分泌，该细胞中的多肽不天然地含有该信号序列。引入遗传标签的替换方式是通过化学反应将标签连到CfMHL4解旋酶、孔或构建体上的天然或人工位点。
本发明中，非天然氨基酸为不是天然存在于CfMHL4解旋酶中的氨基酸。所述非天然氨基酸优选为不是组氨酸，丙氨酸，异亮氨酸，精氨酸，亮氨酸，天冬酰胺，赖氨酸，天冬氨酸，蛋氨酸，半胱氨酸，苯丙氨酸，谷氨酸，苏氨酸，谷氨酰胺，色氨酸，甘氨酸，缬氨酸，脯氨酸，丝氨酸或酪氨酸。所述非天然氨基酸更优选不是上述20种氨基酸中的任何一个或硒半胱氨酸。
本发明中使用的优选的非天然氨基酸包括，但不限于，4-叠氮-L-苯丙氨酸(Faz)，4-乙酰基-L-苯丙氨酸，3-乙酰基-L-苯丙氨酸，4-乙酰乙酰基-L-苯丙氨酸，O-烯丙基-L-酪氨酸，3-(苯基硒烷基)-L-丙氨酸，O-2-丙炔-1-基-L-酪氨酸，4-(二羟基硼基)-L-苯丙氨酸，4-[(乙基硫烷基)羰基]-L-苯丙氨酸，(2S)-2-氨基-3-{4-[(丙烷-2-基硫烷基)羰基]苯基}丙酸，(2S)-2-氨基-3-{4-[(2-氨基-3-硫烷基丙酰基)氨基]苯基}丙酸，O-甲基-L-酪氨酸，4-氨基-L-苯丙氨酸，4-氰基-L-苯丙氨酸，3-氰基-L-苯丙氨酸，4-氟-L-苯丙氨酸，4-碘-L-苯丙氨酸，4-溴-L-苯丙氨酸，O-(三氟甲基)酪氨酸，4-硝基-L-苯丙氨酸，3-羟基-L-酪氨酸，3-氨基-L-酪氨酸，3-碘-L-酪氨酸，4-异丙基-L-苯丙氨酸，3-(2-萘基)-L-丙氨酸，4-苯基-L-苯丙氨酸，(2S)-2-氨基-3-(萘-2-基氨基)丙酸，6-(甲基硫烷基)正亮氨酸，6-氧-L-赖氨酸，D-酪氨酸，(2R)-2-羟基-3-(4-羟基苯基)丙酸，(2R)-2-氨基辛酸酯3-(2，2′-二吡啶-5-基)-D-丙氨酸，2-氨基-3-(8-羟基-3-喹啉基)丙酸，4-苯甲酰-L-苯丙氨酸，S-(2-硝基苄基)半胱氨酸，(2R)-2-氨基-3-[(2-硝基苄基)硫烷基]丙酸，(2S)-2-氨基-3-[(2-硝基苄基)氧基]丙酸，O-(4，5-二甲氧基-2-硝基苄基)-L-丝氨酸，(2S)-2-氨基-6-({[(2-硝基苄基)氧基]羰基}氨基)己酸，O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸，2-硝基苯丙氨酸，4-[(E)-苯基二氮烯基]-L-苯丙氨酸，4-[3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶基-3-基]-D-苯丙氨酸(4-[3-(Trifluoromethyl)-3H-diaziren-3-y1]-D-phenylalanine)，2-氨基-3-[[5-(二甲基氨基)-1-萘基]磺酰基氨基]丙酸，(2S)-2-氨基-4-(7-羟基-2-氧-2H-色烯-4-基)丁酸，(2S)-3-[(6-乙酰基萘烯基-2-基)氨基]-2-氨基丙酸，4-(羧基甲基)苯丙氨酸，3-硝基-L-酪氨酸，O-磺基-L-酪氨酸，(2R)-6-乙酰氨基-2-氨基己酸酯，1-甲基组氨酸，2-氨基壬酸，2-氨基癸酸，L-同质半胱氨酸，5-硫烷基正缬氨酸，6-硫烷基-L-正亮氨酸，5-(甲基硫烷基)-L-正缬氨酸，N6-{[(2R，3R)-3-甲基-3，4-二氢-2H-吡咯-2-基]羰基}-L-赖氨酸，N6-[(苄基氧基)羰基]赖氨酸，(2S)-2-氨基-6-[(环戊基羰基)氨基]己酸，N6-[(环戊基氧基)羰基]-L-赖氨酸，(2S)-2-氨基-6-{[(2R)-四氢呋喃-2-基羰基]氨基}己酸，(2S)-2-氨基-8-[(2R，3S)-3-乙炔基四氢呋喃-2-基]-8-氧基辛酸，N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸，(2S)-2-羟基-6-({[(2-甲基-2-丙烷基)氧基]羰基}氨基)己酸，N6-[(烯丙基氧基)羰基]赖氨酸，(2S)-2-氨基-6-({[(2-叠氮苄基)氧基]羰基}氨基)己酸，N6-L-脯氨酰基-L-赖氨酸，(2S)-2-氨基-6-{[(丙-2-炔-1--基氧基)羧基]氨基}己酸和N6-[(2-叠氮乙氧基)羧基]-L-赖氨酸。最优选的非天然氨基酸为4-叠氮-L-苯丙氨酸(Faz)。
本发明所述的“两个以上”包括两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个等等。
本发明所述的“多个”包括但不限于两个以上、三个以上、四个以上、五个以上、六个以上、七个以上、八个以上或更多个等等。
本发明所述的“至少一个”包括但不限于一个以上、两个以上、三个以上、四个以
上、五个以上、六个以上、七个以上、八个以上或更多个等等。
本发明所述的“和/或”包括择一列出的项目以及任何数量的项目组合。
本发明所述的“包括”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。各实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。测序所使用的测序仪为梅丽科技基因测序仪MePore。
实施例1：
本实施例以SEQ ID NO:2所示的经修饰的解旋酶编号M1为例进行介绍，修饰的结构对应于SEQ ID NO:1的E96C/A363C。
1、材料和方法
将野生型CfM HL4解旋酶(CfM HL4-WT)和经修饰的CfM HL4解旋酶(CfM HL4-M1)人工合成序列分别重组到质粒中(氨基酸序列SEQ ID NO:1-2，其对应核苷酸序列SEQ IDNO:3-4)，通过42℃热激转化到BL21(DE3)感受态细胞中，37℃震荡培养2小时后，将菌液均匀涂抹在含有氨苄青霉素的固体LB平板上，37℃过夜静置培养。选取单克隆菌落接种到3ml含有氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃震荡过夜培养，然后按照千分之一的接种量接种到含有氨苄青霉素的液体LB培养基中37℃进行扩大培养，OD＝0.8左右时，将LB培养基静置冷却到18℃后，添加千分之一的异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-Thiogalactoside,IPTG)诱导蛋白表达，过夜表达16小时后，收集细菌，超声波破碎细胞，通过亲和层析方法进行纯化。
2、结果
图1显示了来源于柠檬酸杆菌噬菌体(Citrobacter freundii Myophage)的野生型CfM HL4解旋酶(SEQ ID NO:1)的3D结构示意图。
图2显示了经纯化后的野生型CfM HL4-WT解旋酶(SEQ ID NO:1)及解旋酶M1(SEQID NO:2)的SDS-PAGE凝胶电泳图。
根据上述方法制备表1中各经修饰的解旋酶，编号为M2-M11突变体。
实施例2：
本实施例通过凝胶迁移电泳实验检测CfMHL4解旋酶突变体M1对单链底物DNA亲和力。
1、材料和方法
在缓冲液体系(20mMHEPES,500mMNaCl,pH＝7.5)中加入终浓度40nM的Cy-5荧光基团标记的单链多聚胸腺嘧啶底物SEQ ID NO:5(T44-Cy-5)，然后分别加入终浓度为4μM的野生型CfMHL4解旋酶及其突变体M1，并分别加入终浓度为酶100倍TMAD交联剂进行催化突变位点半胱氨酸的交联，然后25℃孵育1小时。
2、结果
如图3所示，凝胶迁移实验结果显示了CfMHL4解旋酶在修饰前后对DNA结合能力的影响。野生型的CfMHL4解旋酶与单链DNA底物SEQ ID NO:5结合后电泳条件下酶和核酸底物的脱落情况较为严重，解旋酶突变体M1与单链DNA底物结合后的电泳条件下酶和核酸底物的脱落情况明显好转。
实施例3：
本实施例通过荧光定性检测CfMHL4解旋酶突变体M1对底物dsDNA的解开能力以说明其解旋活性。
1、材料和方法
方法如图4所示，猝灭底物链a(终浓度100nM)在5’端有ssDNA突出的部分，以及拥有碱基互补结合能力的dsDNA部分。3’端结合有黑洞猝灭剂(BHQ-1)碱基(SEQ ID NO:6-BHQ-3’)，并且互补荧光底物链c在5’端结合有羧基荧光素(FAM)(5’FAM-SEQ ID NO:7)。当c链与3’端结合有黑洞猝灭剂(BHQ-1)的a链互补杂交后，荧光素的荧光被BHQ-1猝灭，底物无法检测出荧光。
当加有ATP(5mM)和MgCl2(5mM)的反应液中，加入解旋酶后，a链5’端的dsDNA部分，沿着主链移动，并解开互补链c，过量的捕获链b优先与主链a退火结合，c链被游离出，荧光被检测出。
2、结果
图5所示在含有500mM的KCl的反应液(20mMTris,5mMATP,5mM MgCl2,100nM荧光底物，0.5μM的捕获链b)中，随着时间的变化，dsDNA的解旋变化图。可见，野生型CfMHL4解旋酶以及解旋酶突变体M1具有相当的dsDNA解旋能力。
实施例4：本实施例以解旋酶突变体M1(SEQ ID NO:2E96C/A363C)为例，显示本发明提供的经修饰的CfMHL4解旋酶突变体控制完整的λDNA链穿过MspA纳米孔(SEQ ID NO:8)的运动。
1、材料与方法
制备如图6所示DNA构建体X，其中，Y1链的中间部分为10个碱基T的ssDNA，用来亲和解旋酶，该ssDNA的5’端连接一段序列为SEQ ID NO:9_1的核苷酸，该ssDNA的3’端由20个iSpC3衔接子连接后再连接一段序列为SEQ ID NO:9_2的核苷酸，由此，得到的Y1链的3’突出一个碱基T，用来T4连接酶连接λDNA。同时，本实施例还在序列为SEQ ID NO:9_1的核苷酸5’连接有4个iSpC3衔接子，以确保实验顺利进行。Y2链(SEQ ID NO:10)和Y3链(SEQ ID NO:11)为Y1链的SEQ ID NO:9_1和SEQ ID NO:9_2的互补配对部分。本领域技术人员可以根据实际情况设定iSpC3衔接子的数量，本发明对此不做限定。
在缓冲液(20mMHEPES，100mMNaCl)中加入200nM(dsDNA)接头，4μM突变体蛋白，0.1mMTMAD，使突变体与如图6所示DNA构建体X连接，形成测序接头，将制备的测序接头与经过末端修复的λDNA连接得到待测样品。在25℃的高盐缓冲液(150mM黄赤血盐，0.2MNaCl，10mMHEPES，1mMMgCl2，pH＝8.0)中，使用1,2-二乙醇酰基-甘油-3-胆碱磷脂(DPhPC)在芯片50um的直径孔穴上形成磷脂双分子层，将MspA加入缓冲液中，在膜上形成单孔。
在所述双分子层实现单孔之后，将顺式腔液体更换为低盐缓冲液(360mMKCl,16.8mMHEPES,90mMNH4Cl,50mMMgCl2,10.3mMEDTA,20mMATP,33.3uMTether,pH＝7.67)，加入50ng上述制备的待测样品，在缓冲液中孵育20min，由嵌入DPhPC磷脂双分子层的MspA纳米孔获得电测量信号。换液及孵育使用+20mV电压，其余实验在+180mV恒定电压下实施。
2、结果
如图7和图8所示，观测到与野生型CfMHL4解旋酶相比，解旋酶突变体M1可以更稳定地控制λDNA穿过MspA纳米孔移动，产生持续170s左右稳定的电流信号，耐盐性能得到了很大的提升。其中，8-1为完整电流信号图，8-2为DNA构建体的Y1部分和λDNA穿孔的起始电流，8-3为DNA构建体的Y3部分和λDNA穿孔的结束电流。
需要说明的是，解旋酶突变体M2(SEQ ID NO:12E96C/A363C/T82A/F242Y)或解旋酶突变体M10(SEQ ID NO:20E96C/A363C/G39R)或解旋酶突变体M11(SEQ ID NO:21E96C/A363C/S85T/F242W与解旋酶突变体M1(SEQ ID NO:2E96C/A363C)在结构和解旋原理上有相同功能。同时发明人通过对突变区域进行蛋白质结构学模拟，可以预测出其也同样具有完整控制多核苷酸通过纳米孔的能力，且在通过纳米孔时不会像野生型那样出现从多核苷酸上脱落的现象.
实施例5：本实施例以解旋酶突变体M2(SEQ ID NO:12E96C/A363C/T82A/F242Y)为例，显示本发明提供的经修饰的CfMHL4解旋酶突变体控制定长序列lambdaDNA(SEQ ID NO:22)穿过MspA纳米孔(SEQ ID NO:8)的运动。
1、材料与方法
制备如图6所示DNA构建体X，其中，Y1链的中间部分为10个碱基T的ssDNA，用来亲和解旋酶，该ssDNA的5’端连接一段序列为SEQ ID NO:9_1的核苷酸，该ssDNA的3’端由iSpC3衔接子连接后再连接一段序列为SEQ ID NO:9_2的核苷酸，由此，得到的Y1链的3’突出一个碱基T，用来T4连接酶连接SEQ ID NO:23。同时，本实施例还在序列为SEQ ID NO:9_1的核苷酸5’连接有iSpC3衔接子，以确保实验顺利进行。Y2链(SEQ ID NO:10)和Y3链(SEQID NO:11)为Y1链的SEQ ID NO:9_1和SEQ ID NO:9_2的互补配对部分。本领域技术人员可以根据实际情况设定iSpC3衔接子的数量，本发明对此不做限定。
其中，SEQ ID NO:23为以lambdaDNA-J02459为模版，使用Taq酶PCR出末端加A的6034bp的定长序列，使用T4DNA连接酶直接与DNA构建体X连接。
在缓冲液(20mMHEPES，100mMNaCl)中加入200nM(dsDNA)接头，4μM突变体蛋白，0.1mMTMAD，使突变体与如图6所示DNA构建体X连接，形成测序接头，将制备的测序接头与经过末端修复的λDNA连接得到待测样品。在25℃的高盐缓冲液(150mM黄赤血盐，0.2MNaCl，10mMHEPES，1mMMgCl2，pH＝8.0)中，使用1,2-二乙醇酰基-甘油-3-胆碱磷脂(DPhPC)在芯片50um的直径孔穴上形成磷脂双分子层，将MspA加入缓冲液中，在膜上形成单孔。
在所述双分子层实现单孔之后，将顺式腔液体更换为低盐缓冲液(360mMKCl,16.8mMHEPES,90mMNH4Cl,50mMMgCl2,10.3mMEDTA,20mMATP,33.3uMTether,pH＝7.67)，加入50ng上述制备的待测样品，在缓冲液中孵育20min，由嵌入DPhPC磷脂双分子层的MspA纳米孔获得电测量信号。换液及孵育使用+20mV电压，其余实验在+180mV恒定电压下实施稳定测序8小时。
2、结果
如图9所示，观测到解旋酶突变体M2(SEQ ID NO:12)可以控制定长序列lambdaDNA-J02459(SEQ ID NO:23)穿过MspA纳米孔移动，产生持续25s左右的电流信号，9-1为完整电流信号图，9-2为DNA构建体的Y1部分和定长序列穿孔的起始电流，9-3为DNA构建体的Y3部分和定长序列穿孔的结束电流，9-4为定长序列穿孔收集信号的速度分布图，9-5为信号与对应序列长度的频数分布图。
需要说明的是，解旋酶突变体M10(SEQ ID NO:20E96C/A363C/G39R)或解旋酶突变体M11(SEQ ID NO:21E96C/A363C/S85T/F242W)与解旋酶突变体M2(SEQ ID NO:12E96C/A363C/T82A/F242Y)在结构和解旋原理上有相同功能，同时对突变区域进行蛋白质结构学模拟，可以预测出其也同样具有完整控制多核苷酸通过纳米孔的能力,在通过纳米孔时不会像野生型那样出现从多核苷酸上脱落的现象。
实施例6：本实施例以解旋酶突变体M3(SEQ ID NO:13E96C/A363C/D107K/T289N/H388F)为例，显示本发明提供的经修饰的CfMHL4解旋酶突变体控制定长序列lambdaDNA(SEQ ID NO:22)穿过MspA纳米孔(SEQ ID NO:8)的运动。
本实施例涉及的材料和方法与实施例5相同。
结果如图10所示，观测到解旋酶突变体M3或解旋酶突变体M6可以控制定长序列lambdaDNA-J02459(SEQ ID NO:23)穿过MspA纳米孔移动，产生持续25s左右的电流信号，如10-1为完整电流信号图，10-2为DNA构建体的Y1部分和定长序列穿孔的起始电流，10-3为DNA构建体的Y3部分和定长序列穿孔的结束电流，10-4为定长序列穿孔收集信号的速度分布图，10-5为信号与对应序列长度的频数分布图。
需要说明的是，解旋酶突变体M4(SEQ ID NO:14(E96C/A363C/D107M/E275Q)或解旋酶突变体M5(SEQ ID NO:15(E96C/A363C/M1G/H66E)或解旋酶突变体M6(SEQ ID NO:16(E96C/A363C/H66F/M121D)与解旋酶突变体M3(SEQ ID NO:13E96C/A363C/D107K/T289N/H388F)在结构和解旋原理上有相同功能，同时对突变区域进行蛋白质结构学模拟，可以预测出其也同样具有完整控制多核苷酸通过纳米孔的能力,在通过纳米孔时不会像野生型那样出现从多核苷酸上脱落的现象。另外，解旋酶突变体M4、M5、M6拥有和M3一样的和野生型相比降低多核苷酸过孔速度的能力，并且与M10、M11相比，从多核苷酸过孔电流信号波形信号分析可知(见10-1)，M3、M4、M5、M6拥有更加稳定的控制多核苷酸通过纳米孔的能力。
实施例7：本实施例以解旋酶突变体M7(SEQ ID NO:17E96C/A363C/E125R/K389M)为例，显示本发明提供的经修饰的CfMHL4解旋酶突变体控制定长序列lambdaDNA(SEQ IDNO:22)穿过MspA纳米孔(SEQ ID NO:8)的运动。
本实施例涉及的材料和方法与实施例5相同。
结果如图11所示，观测到解旋酶突变体M7可以控制定长序列lambda DNA-J02459(SEQ ID NO:23)穿过MspA纳米孔移动，产生持续22s左右的电流信号，11-1为完整电流信号图，11-2为DNA构建体的Y1部分和定长序列穿孔的起始电流，11-3为DNA构建体的Y3部分和定长序列穿孔的结束电流，11-4为定长序列穿孔收集信号的速度分布图，11-5为信号与对应序列长度的频数分布图。
需要说明的是，解旋酶突变体M8(SEQ ID NO:18E96C/A363C/E125V/D334C)或解旋酶突变体M9(SEQ ID NO:19E96C/A363C/E146K/E290C/N294K)与解旋酶突变体M7(SEQ IDNO:17E96C/A363C/E125R/K389M)在结构和解旋原理上具有相同功能，同时对突变区域进行了蛋白质结构学模拟，可以预测出其也同样具有完整控制多核苷酸通过纳米孔的能力,在通过纳米孔时不会像野生型那样出现从多核苷酸上脱落的现象。根据结构可知，M8、M9拥有和M7一样的与野生型相比提高多核苷酸过孔速度的能力，能够在测序过程中提高测序通量。
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详细描述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。
以上所述，为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种经修饰的CfM HL4解旋酶，其特征在于，所述经修饰的CfM HL4解旋酶为SEQ IDNO: 1的突变，所述突变选自以下氨基酸替代：
（i）E96C/A363C；
（iii）E96C/A363C/T82A/F242Y；
（iv）E96C/A363C/D107K/T289N/H388F；
（viii）E96C/A363C/E125R/K389M；
所述经修饰的CfM HL4解旋酶保留其控制多核苷酸移动的能力。
2.一种构建体，其特征在于，包括权利要求1所述的经修饰的CfM HL4解旋酶以及额外的多核苷酸结合部分，其中所述经修饰的CfM HL4解旋酶连接到所述多核苷酸结合部分并且所述构建体具有控制多核苷酸移动的能力。
3.如权利要求2所述的构建体，其特征在于，还包括两个或更多个权利要求1所述的经修饰的CfM HL4解旋酶。
4.一种多核苷酸，包括编码如权利要求1所述的经修饰的CfM HL4解旋酶、如权利要求2或3所述的构建体的序列。
5.一种载体，包括可操作性连接到启动子的根据权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种宿主细胞，包括权利要求5所述的载体。
7.一种控制多核苷酸移动的方法，其特征在于，包括将所述多核苷酸与权利要求1所述的CfM HL4解旋酶或权利要求2或3所述的构建体接触，并由此控制所述多核苷酸的移动。
8.一种表征目标多核苷酸的方法，包括：
(a)将目标多核苷酸与跨膜孔和权利要求1所述的经修饰的CfM HL4解旋酶或根据权利要求2或3所述的构建体接触，使得所述解旋酶控制所述目标多核苷酸穿过所述孔的移动；以及
(b)随着所述多核苷酸相对于所述孔移动，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征并由此表征所述目标多核苷酸。
9.一种表征目标多核苷酸的产品，其特征在于，所述的产品包括权利要求1所述的CfMHL4解旋酶、权利要求2或3所述的构建体、权利要求4所述的核苷酸、权利要求5所述的载体或权利要求6所述的宿主细胞，和孔。
10.如权利要求1所述的CfM HL4解旋酶、权利要求2或3所述的构建体、权利要求4所述的核苷酸、权利要求5所述的载体或权利要求6所述的宿主细胞，或权利要求9所述的产品在表征目标多核苷酸或控制目标多核苷酸穿过孔的移动中的应用。
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